CN111196876B - 具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法及其应用 - Google Patents

具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法及其应用。合成方法包括以下步骤：(1)分别合成如下式所示的链长递增的有机配体II、III和IV：
Figure DDA0002384585150000011
(2)选择金属Co分别与有机配体II、III和IV制备同拓扑结构，得到孔径递增的MOFs材料；(3)将制备的MOFs材料进行活化，得到Co基MOF材料：Co‑IRMOF‑74‑II、Co‑IRMOF‑74‑III和Co‑IRMOF‑74‑IV。本发明合成的MOF材料对多种类型的二级结构的核酸分子的快速分离都适用，具有普适性，根据分离核酸结构的类型不同选择不同孔径大小的MOF材料。

Description

具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法及 其应用
技术领域
本发明涉及合成金属有机框架材料的技术领域和选择性分离不同二级结构核酸的技术领域，具体涉及一种具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法及其应用。
背景技术
大多数核酸,包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，他们以线性和柔性的结构存在，但它们中的一些也可以形成各种刚性的二级结构，如双螺旋、G四链体(G4)1-4、发夹结构、三螺旋和i-motif结构。RNA分子的二级结构对其生物学功能和细胞调节至关重要。RNA的构象动态变化是RNA调控机制的基础，也是其复杂功能的起源。RNA分子能够在不同的次级结构之间转换，动态变化使得难以捕捉到RNA的结构信息，特别是当大量和多种RNA分子共存时。特异性的抗体和特异性小分子配体已被用于特异性分离特定的一种结构的RNA分子，但它们一次仅适用于有限的RNA类型，而难以获得二级结构的整体信息。电泳迁移分离方法(EMSA)可以对多种不同结构的核酸分子进行分离，但是其低分离效率和低的分辨率使得在实际分离过程中不能满足大量的多种类结构的分离。DMS足迹方法和DNA聚合酶终止分析方法被成功地应用于识别广泛的不同结构RNA分子。随着研究和工业对核酸全基因组结构测量的需求不断增加，满足复杂结构多样、样本量大的样品处理要求仍然具有挑战性。这主要是由于在RNA测序过程中，缺乏有效的方法根据样品的二级结构来分离样品，导致高的背景信号。
金属有机骨架(MOFs)是一类具有分子定域孔隙环境的多孔晶体材料，非常适合于大分子的识别和分离。MOFs已应用于小分子分离、储气、催化、成像、药物输送等领域，但其与生物大分子相互作用的研究尚处于起步阶段。MOF材料具有一维纳米孔径材料，巨大的比表面积使得其对线性分子具有很好的吸附效率。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法，制备的这一系列MOF材料具有高的晶态和比表面积，孔径可精确调控。
本发明的目的之二在于提供一种具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法及其应用，在不同二级结构的核酸分子的分离领域并且达到高效的分离效率，这种分离方法具有易操作，处理量大，多种类型结构都适用的特性。
本发明实现目的之一所采用的方案是：一种具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法，包括以下步骤：
(1)分别合成如下式所示的链长递增的有机配体II、III和IV：
Figure BDA0002384585130000021
(2)选择金属Co分别与有机配体II、III和IV制备同拓扑结构，得到孔径递增的MOFs材料；
(3)将制备的MOFs材料进行活化，得到Co基MOF材料：Co-IRMOF-74-II、Co-IRMOF-74-III和Co-IRMOF-74-IV。
本发明的合成方法选择非穿插体系的MOF材料结构；通过选择非穿插的MOFs结构，发现Co-IRMOF-74体系具有可拓展的潜力和良好的稳定性，这是目前没有报道的材料，已报道的Mg和Zn体系稳定性比Co体系低。延长配体的方式为增加苯环数目。
优选地，所述步骤(1)中，合成链长递增的有机配体II、III和IV的具体方法为，将2,5-二羟基对苯二甲酸的结构进行轴向的延伸，利用Suzuki偶联反应实现梯度为一个苯环长度的增幅，合成所述有机配体II,III和IV。
步骤(1)中合成的方法为Suzuki偶联反应，利用钯催化剂，在氩气保护氛围中反应，通过柱层析的方式纯化产物，实现苯环的依次递增。
优选地，所述步骤(2)中，分别将有机配体II、III、IV和六水硝酸钴溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入水和乙醇的混合溶液，室温反应一定时间即得到孔径递增的MOFs材料，其中N,N-二甲基甲酰胺、水和乙醇的体积比为(1-5):1:1，有机配体与六水硝酸钴的当量比为1：(1-2)。
步骤(2)配体中分别为两个苯环链长，三个苯环链长和四个苯环链长的产物。将配体和六水硝酸钴溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入水和乙醇按一定比例混合的溶液，加热反应一定时间后得到Co基MOF材料。
优选地，所述步骤(3)中，Co-IRMOF-74-II、Co-IRMOF-74-III和Co-IRMOF-74-IV材料的孔径以0.6nm的幅度递增，所述Co-IRMOF-74-II的孔径为1.8nm。
步骤(3)中多次用N,N-二甲基甲酰胺洗涤Co-IRMOF-74(II-IV)材料，然后多次用乙醇洗涤，通过超临界二氧化碳活化样品。
本发明实现目的之二所采用的方案是：一种具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法合成的Co基MOF材料的应用，采用所述Co基MOF材料对不同结构的核酸分子进行分离。
优选地，具体包括以下步骤：
a)确定分离不同结构的核酸类型，根据不同结构的核酸类型选择不同种类的Co基MOF材料；
b)将不同结构的核酸分子退火形成其二级结构；
c)采用所述步骤a)选择的Co基MOF材料对所述步骤b)中的退火后的核酸分子进行选择性吸附；
d)吸附完成后，反应体系离心，将Co基MOF材料和溶液分开，其中有二级结构的核酸分子在上层溶液中，吸附了线性、柔性的核酸分子的Co基MOF材料在下层沉淀中。
优选地，所述步骤b)中，二级结构包括单链核酸、双链核酸、G四链体结构的核酸、DNA扭结，发卡结构、三链结构。
单链核酸(ssDNA/RNA)，双链核酸(dsDNA/RNA)，G四链体结构的核酸(G4-DNA/RNA)，DNA扭结(i-motif结构)，发卡结构(hairpin结构)，三链结构(Three-strandedtriplex DNA/RNA)。
优选地，当分离单链核酸和双链核酸时，选择Co-IRMOF-74-II材料；当分离单链核酸和其他类型的二级结构时，选择Co-IRMOF-74-II，Co-IRMOF-74-III、Co-IRMOF-74-IV中的任何一种；当分离双链核酸和其他类型的二级结构时，选择Co-IRMOF-74-III、Co-IRMOF-74-IV中的任何一种。
优选地，所述步骤b)中，采用小PCR管为退火反应容器，对于DNA核酸分子，退火过程的温度从95℃降低到25℃，降温速率为1-10℃/min；对于RNA核酸分子，退火过程的温度从65℃降低到25℃，降温速率为5-10℃/min；DNA核酸分子和RNA核酸分子在特殊的溶液中完成退火，溶液条件为：水溶液包含50-200mM的钾离子，pH为5-7。
优选地，所述步骤c)中，退火后核酸分子的质量为Co基MOF材料的质量的4％-8％，将二者混合在50-200mM、pH为5-7的钾盐水溶液中，在20-37℃下振荡0.5-5h。
本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明利用MOF自身的可设计性，通过配体链中苯环数目的增加来精确调节配体的长度，从而精确调节孔径的大小，通过选择合适的金属节点，合成了高稳定性的Co基MOF材料，材料的制备工艺简便，易于调节；
(2)本发明合成的MOF材料对多种类型的二级结构的核酸分子的分离都适用，具有普适性，根据分离核酸结构的类型不同选择不同孔径大小的MOF材料；
(3)本发明的应用方法操作简单，费用低廉，通过离心分离，即可分理出二级结构。
(4)本发明的应用方法的分离效果好，对于有多种不同结构的核酸同时存在的情况下，会优先的选择性吸附线性、柔性的核酸链，留有结构的核酸链在溶液中。
附图说明
图1是本发明Co基IRMOF-74-II的粉末晶体衍射图，其中自上而下分别是实际测试数据，晶面指标(竖线)；
图2是本发明Co基IRMOF-74-III的粉末晶体衍射图，其中自上而下分别是实际测试数据，晶面指标(竖线)；
图3是本发明Co基IRMOF-74-IV的粉末晶体衍射图，其中自上而下分别是实际测试数据，晶面指标(竖线)；
图4是本发明Co基IRMOF-74-II的氮气吸附曲线图，图中右下角为孔径分布计算结果；
图5是本发明Co基IRMOF-74-III的氮气吸附曲线图，图中右下角为孔径分布计算结果；
图6是本发明Co基IRMOF-74-IV的氮气吸附曲线图，图中右下角为孔径分布计算结果；
图7是MOF材料对不同空间尺寸结构的核酸的选择性吸附；
图8是MOF材料对不同长度或者分子量的核酸的选择型吸附；
图9是MOF材料对不同稳定性有二级结构的核酸的选择性吸附；
图10是在不同结构的混合体系中，MOF材料对不同结构的选择性吸附。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
MOF配体的合成
(1)：将4-溴-2-甲氧基苯甲酸甲酯和频哪醇联硼酸酯按照1:1.5当量加入到N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在无水无氧条件下加热至85度反应5小时，通过柱层析分离得到产物，旋蒸干燥后得到中间体1。
(2)：将4-溴-2-甲氧基苯甲酸甲酯和中间1按照1:1当量比加入到1,4-二氧六环和水溶液中，其中1,4-二氧六环和水体积比为4:1，在无水无氧条件下加热至90度反应24小时，通过柱层析分离得到产物，旋蒸干燥后，加入到50当量的二氯甲烷溶液中，在-78度条件下加入8当量的三溴化硼溶液，反应12小时，然后用过量水淬灭，再加入5当量的1M氢氧化钠溶液，加热至75度反应24小时，最后用过量盐酸酸化，过滤干燥得到配体II。
(3)将中间1和2，5-二溴对二甲苯按照2:1当量比加入到1,4-二氧六环和水溶液中，其中1,4-二氧六环和水体积比为4:1，在无水无氧条件下加热至90度反应24小时，通过柱层析分离得到产物，旋蒸干燥后，加入到50当量的二氯甲烷溶液中，在-78度条件下加入8当量的三溴化硼溶液，反应12小时，然后用过量水淬灭，再加入5当量的1M氢氧化钠溶液，加热至75度反应24小时，最后用过量盐酸酸化，过滤干燥得到配体III。
(4)将中间体1与2，5-二溴对二甲苯按照1:5当量比加入到1,4-二氧六环和水溶液中，其中1,4-二氧六环和水体积比为4:1，在无水无氧条件下加热至90度反应1小时，通过柱层析分离得到主产物，旋蒸干燥后，得到中间体2。
(5)将中间体2按照1:1.5当量加入到N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在无水无氧条件下加热至85度反应5小时，通过柱层析分离得到产物，旋蒸干燥后得到中间体3。
(6)将中间2和中间体3按照2:1当量比加入到1,4-二氧六环和水溶液中，其中1,4-二氧六环和水体积比为4:1，在无水无氧条件下加热至90度反应24小时，通过柱层析分离得到产物，旋蒸干燥后，加入到50当量的二氯甲烷溶液中，在-78度条件下加入8当量的三溴化硼溶液，反应12小时，然后用过量水淬灭，再加入5当量的1M氢氧化钠溶液，加热至75度反应24小时，最后用过量盐酸酸化，过滤干燥得到配体IV。
Figure BDA0002384585130000051
MOF材料的制备
(1)：将配体II与六水硝酸钴按照1:2当量比一起加入到N,N-二甲基甲酰胺中，超声分散再加入乙醇和水，三种溶剂体积比为1:1:1，加热反应，溶剂交换，室温干燥，再将样品加热至130度真空加热，得到Co基IRMOF-74-II样品。
(2)：将配体III与六水硝酸钴按照1:2当量比一起加入到N,N-二甲基甲酰胺中，超声分散再加入乙醇和水，三种溶剂体积比为1:1:1，加热反应，溶剂交换，室温干燥，再将样品加热至130度真空加热，得到Co基IRMOF-74-III样品。
(3)：将配体IV与六水硝酸钴按照1:2当量比一起加入到N,N-二甲基甲酰胺中，超声分散，再加入乙醇和水，三种溶剂体积比为5:1:1，加热反应，溶剂交换，室温干燥，再将样品加热至130度真空加热，得到Co基IRMOF-74-IV样品。
实施例2
粒径分布的测试：
将干燥好的样品用单晶硅零背景样品台制样，然后在粉末X射线衍射的仪器上测试结构。
实验结果分析：
图1是实施例1中Co基IRMOF-74-II和模拟的Co基IRMOF-74-II的粉末晶体衍射图，由图可知合成的Co基IRMOF-74-II结构符合匹配模拟的结构；
图2是实施例1中Co基IRMOF-74-III和模拟的Co基IRMOF-74-II的粉末晶体衍射图，由图可知合成的Co基IRMOF-74-III结构符合匹配模拟的结构；
图3是实施例1中Co基IRMOF-74-IV和模拟的Co基IRMOF-74-IV的粉末晶体衍射图，由图可知合成的Co基IRMOF-74-IV结构符合匹配模拟的结构；
将样品在真空加热干燥后装入氮气吸附仪器，在液氮浴环境中测试低压至常压下的氮气吸附量，通过NLDFT模型分析，实验结果分析：
图4是实施例1中Co基IRMOF-74-II的氮气吸附曲线图，说明Co基IRMOF-74-II的孔径为1.8纳米左右；
图5是实施例1中Co基IRMOF-74-III的氮气吸附曲线图，说明Co基IRMOF-74-III的孔径为2.4纳米左右；
图6是实施例1中Co基IRMOF-74-IV的氮气吸附曲线图，说明Co基IRMOF-74-IV的孔径为3.0纳米左右；
本发明使用的Co-IRMOF-74体系比Mg和Zn的体系稳定，通过增加配体中苯环的数量，精确调控了合成的MOF材料的孔径，实现了在同一个拓扑体系孔径连续的调节。粉末X射线衍射实验和低温氮气吸附实验说明X射线衍射的数据说明结构与模拟的结构相符，其结构为二维六方孔道，孔道直径分别为1.8nm，2.4nm和3.0nm。
实施例3
MOF材料对不同空间尺寸结构的核酸的选择性吸附
(步骤1)设计不同结构的核酸：ssDNA,dsDNA,G4-DNA,ssRNA,G4-RNA,hairpin-RNA.并且对这些核酸序列进行末端荧光分子的标记。
(步骤2)分别测试MOF材料对这些不同结构核酸的吸附效率
(步骤2a)将4μL退火的不同结构的DNA/RNA(10μM)分别与4μL Co-IRMOF-74-II、-III、IV(2mg/mL)混合于50μL水溶液(包含100mM KCl和20mM KAc，pH6.8)中，在混匀仪中恒温37℃反应2小时。
(步骤2b)离心后测定上清液的荧光强度。利用以下公式计算得到吸收效率。
Figure BDA0002384585130000071
Figure BDA0002384585130000072
(FIoriginal是纯荧光标记的DNA/RNA在无MOF物质的缓冲溶液中的荧光强度)
结果如图7所示，对线性的核酸分子(ssDNA和ssRNA)的效率要高于其的有结构的核酸分子，说明MOF材料可以的优先吸附线性分子，让有结构的核酸分子留在溶液中，因此可以达到分离线性核酸分子和有二级结构的核酸分子。
实施例4
MOF材料对不同长度或者分子量的核酸的选择型吸附
(步骤1)设计不同长度的dsDNA和ssDNA分子，不同长度的dsDNA的长度分别是10bp，16bp，22bp，28bp，34bp，40bp，46bp；不同长度的ssDNA的长度分别是10nt，16nt，22nt，28nt，34nt，40nt，46nt。并且对这些核酸序列进行末端荧光分子的标记。
(步骤2)分别测试MOF材料对这些不同结构核酸的吸附效率
(步骤2a)将4μL退火的不同结构的DNA(10μM)分别与4μL Co-IRMOF-74-IV(2mg/mL)混合于50μL水溶液(包含100mM KCl和20mM KAc，pH6.8)中，在混匀仪中恒温37℃反应2小时。
(步骤2b)离心后测定上清液的荧光强度。利用以下公式计算得到吸收效率。
Figure BDA0002384585130000073
Figure BDA0002384585130000074
(FIoriginal是纯荧光标记的DNA/RNA在无MOF物质的缓冲溶液中的荧光强度)
结果如图8所示，对相同结构的dsDNA分子，MOF材料对链短的dsDNA分子的吸附效率更高。相同长度的链长情况下，MOF材料对ssDNA的吸附效率高于dsDNA.说明MOF材料可以根据分子量的不同优先的吸附分子量小的DNA分子。
实施例5
MOF材料对不同稳定性有二级结构的核酸的选择性吸附
(步骤1)选取了i-motif序列，序列如下：5’-CCCTAACCCTAACCCTAACCC-3’，这个序列在酸性条件下形成稳定的i-motif结构，但是随着pH升高i-motif结构稳定性降低。并且对这些核酸序列进行末端荧光分子的标记。
(步骤2)分别测试MOF材料对这条核酸序列在不同pH条件下的的吸附效率。
(步骤2a)将4μL退火的不同结构的DNA(10μM)分别与4μL Co-IRMOF-74-IV(2mg/mL)混合于50μL水溶液((50mM KCl，20mM KAc，pH分别是5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0)中，在混匀仪中恒温37℃反应2小时。
(步骤2b)离心后测定上清液的荧光强度。利用以下公式计算得到吸收效率。
Figure BDA0002384585130000081
Figure BDA0002384585130000082
(FIoriginal是纯荧光标记的DNA/RNA在无MOF物质的缓冲溶液中的荧光强度)
结果如图9所示，对相同i-motif序列，其在低pH条件下i-motif结构稳定，随着pH升高稳定性逐渐降低。MOF材料在不同的pH条件下对i-motif的吸附效率结果显示，MOF材料优先的吸附稳定性低的序列，表现为在高pH条件下的吸附效率最高。
实施例6
在不同结构的混合体系中，MOF材料对不同结构的选择性吸附
(步骤一)选择不同结构的RNA序列，分别有RNA G4结构(NARS),单链RNA(MUT-TERRA),RNA发卡结构(hairpin RNA)，将以上序列退火形成二级结构。将10μM的以上的三种结构混合在50μL水溶液中(100mM KCl与20mM KAc缓冲，pH 6.8)。然后将15μL的Co-IRMOF-74-II、-III、IV(2mg/mL)与混合样品在37℃的震荡仪中反应2小时。在12000rpm下离心15分钟后，将10μL上清液装入20％中性聚丙烯酰胺凝胶中，在250V下电泳2小时。然后用荧光模式下的Pharos-FX分子成像仪(Bio-Rad，USA)扫描聚丙烯酰胺凝胶，用Bio-Rad定量软件定量分析FAM标记的DNA/RNA含量。
结果如图10，说明在多种结构同时存在的情况下MOF材料优先选择性的吸附单链的RNA,将有结构的RNA留在溶液中，说明MOF材料的选择性吸附的特异性非常好。以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的应用，其特征在于：采用所述Co基MOF材料对不同结构的核酸分子进行分离，具体包括以下步骤：
a）确定分离不同结构的核酸类型，根据不同结构的核酸类型选择不同种类的Co基MOF材料；
b）将不同结构的核酸分子退火形成其二级结构；
c）采用所述步骤a）选择的Co基MOF材料对所述步骤b）中的退火后的核酸分子进行选择性吸附；
d）吸附完成后，反应体系离心，将Co基MOF材料和溶液分开，其中有二级结构的核酸分子在上层溶液中，吸附了线性、柔性的核酸分子的Co基MOF材料在下层沉淀中；
具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的合成方法包括以下步骤：
（1）分别合成如下式所示的链长递增的有机配体II、III和IV：
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE001
；
（2）选择金属Co分别与有机配体II、III和IV制备同拓扑结构，得到孔径递增的MOFs材料；
（3）将制备的MOFs材料进行活化，得到Co基MOF材料：Co-IRMOF-74-II、Co-IRMOF-74-III和Co-IRMOF-74-IV；
所述步骤b）中，二级结构包括单链核酸、双链核酸、G四链体结构的核酸、DNA扭结，发卡结构、三链结构；
当分离单链核酸和双链核酸时，选择Co-IRMOF-74-II材料；当分离单链核酸和其他类型的二级结构时，选择Co-IRMOF-74-II，Co-IRMOF-74-III、Co-IRMOF-74-IV中的任何一种；当分离双链核酸和其他类型的二级结构时，选择Co-IRMOF-74-III、Co-IRMOF-74-IV中的任何一种。
2.根据权利要求1所述的具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的应用，其特征在于：所述步骤（1）中，合成链长递增的有机配体II、III和IV的具体方法为，将2,5-二羟基对苯二甲酸的结构进行轴向的延伸，利用Suzuki偶联反应实现梯度为一个苯环长度的增幅，合成所述有机配体II, III和IV。
3.根据权利要求1所述的具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的应用，其特征在于：所述步骤（2）中，分别将有机配体II、III、IV和六水硝酸钴溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入水和乙醇的混合溶液，室温反应一定时间即得到孔径递增的MOFs材料，其中N,N-二甲基甲酰胺、水和乙醇的体积比为（1-5）:1:1，有机配体与六水硝酸钴的当量比为1：（1-2）。
4.根据权利要求1所述的具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的应用，其特征在于：所述步骤（3）中， Co-IRMOF-74-II、Co-IRMOF-74-III和Co-IRMOF-74-IV材料的孔径以0.6 nm的幅度递增，所述Co-IRMOF-74-II的孔径为1.8 nm。
5.根据权利要求1所述的具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的应用，其特征在于：所述步骤b）中，采用小PCR管为退火反应容器，对于DNA核酸分子，退火过程的温度从95℃ 降低到25℃ ，降温速率为1-10℃/min；对于RNA核酸分子，退火过程的温度从65℃ 降低到25℃ ，降温速率为5-10℃/min；DNA核酸分子和RNA核酸分子在特殊的溶液中完成退火，溶液条件为：水溶液包含50-200 mM的钾离子，pH为5-7。
6.根据权利要求1所述的具有核酸筛分功能的孔径可调的Co基MOF材料的应用，其特征在于：所述步骤c）中，退火后核酸分子的质量为Co基MOF材料的质量的4%-8%，将二者混合在50-200 mM、pH为5-7的钾盐水溶液中，在20-37℃ 下振荡0.5-5h。
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