CN111195246A - 聚醚类抗生素k-41b、k-41a在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明首次公开K‑41B、K‑41A具有抗HIV‑1活性。发明人采用三种病毒感染细胞系统验证其抗HIV活性，结果表明：在TZM‑b1细胞、MT2细胞和人外周血单个核细胞(PBMCs)中，K‑41B、K‑41A均表现出较好的抗HIV活性，对HIV‑1的复制具有一定的抑制作用。进一步研究显示，K‑41B和K‑41A对HIV‑1逆转录酶和整合酶有一定的抑制作用，可能是抗HIV‑1的双靶点抑制剂。因此，聚醚类抗生素K‑41B、K‑41A可用于治疗或预防艾滋病毒，成为具有潜力的抗HIV药物。综上，本发明充分利用了南海海洋活性物的丰富资源，为今后深入研究其药用价值和临床意义提供了更为有力的理论基础，可应用于的进一步开发应用。
Description
技术领域
本发明属于艾滋病治疗技术领域，尤其涉及聚醚类抗生素K-41B、K-41A在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用。
背景技术
艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是一种为人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的获得性免疫缺陷综合征。人类免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus，HIV)属于反转录病毒科，慢病毒属，感染人类免疫系统细胞，可最终导致艾滋病的发生。自1983年发现首例艾滋病例以来，由于尚未研制出有效根治的疫苗或者药物，艾滋病至今仍然是世界性的公共卫生问题。我国艾滋病疫情也较为严峻，截至2018年7月31日，全国报告现存活艾滋病病毒(HIV)感染者/AIDS病人831，225例，报告死亡225，995例，现存活HIV感染者486，890例，AIDS病人344，335例。
HIV为RNA病毒，在HIV的感染过程中，HIV-1外膜糖蛋白gp120与T4淋巴细胞表面的CD4受体特异性结合而吸附于细胞，在辅助性受体CCR5或CXCR4的协助下，HIV-1外膜糖蛋白gp41与宿主细胞膜融合而使病毒粒进入细胞内，并继而脱去衣壳裸露出核酸。在病毒逆转录酶和核糖核酸酶H的催化下，HIV-1单股RNA逆转录成单股DNA，并进而在细胞核内由细胞多聚酶催化成双股DNA。HIV-1的整合酶使双股DNA原病毒整合于宿主细胞的染色体内，形成HIV-1的潜伏感染。以整合的病毒DNA为模板而合成的病毒的mRNA翻译出大的融合聚蛋白，进而在病毒蛋白酶作用下，这些聚蛋白被剪接及加工，形成成熟的病毒结构蛋白。最后，病毒核酸与结构蛋白结合，装配出新的病毒颗粒，并以出芽的方式释放到细胞外。
根据作用机制目前已上市的抗HIV药物可分为6类：核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、进入抑制剂和整合酶抑制剂。自从1987年第一个HIV核苷类逆转录酶抑制剂齐多夫定(zidovudine，AZT)被批准以来，27年间有36个抗HIV药物先后进入临床使用。在尚无有效HIV/AIDS疫苗的情况下，这些药物的联合使用，可以明显将病人体内的病毒抑制到极低，大大降低了艾滋病的死亡率，显著延长了患者的生命。近年的研究表明，特异性的HIV抑制剂其抗病毒谱通常较窄，并且容易导致耐药性的发生。因此，开发使用方便、毒性小、耐药率低的新型药物是大势所趋。
聚醚类抗生素是一类由链霉素产生的I类聚酮类化合物，因其分子中有很多环醚结构而得名，多数是四连环或者五连环，不含氮、磷、硫，主要是碳氢氧化合物。聚醚类抗生素的特征是含有一个羧酸盐基团和2～5个醚氧原子，醚氧原子一般位于四氢呋喃和四氢吡喃结构中，这些氧原子作为配合体可以鳌合一个碱性金属离子，然后携带这些金属离子通过细胞膜，使得细胞膜两边的渗透压发生改变，从而使细胞发生去极化而死。这类抗生素含有多个醚基和一个一元有机酸基，在溶液中由氢链连接可形成特殊构型，其中心有并列的氧原子而带负电，可以捕获阳离子，外部由烃类组成，具有中性或疏水性。这种构型的分子能与生理上重要的阳离子如Na+、K+、Ca2+等结合成为脂溶性而通过生物膜，进而发挥其药理作用。聚醚类抗生素即聚醚酯类抗生素，因能与阳离子形成脂溶性的可逆复合物，从而使特异性的离子通过生物膜，故又称离子载体抗生素。由于其含有一个末端的羧基，故属于羧基离子载体。
聚醚类抗生素目前主要应用于以下几个方面：一是治疗家禽的球虫病；二是作为牲畜饲料添加剂提高反刍动物的饲料利用率(通常推荐剂量的离子载体抗生素对靶动物是安全而有效的，但由于这类抗生素的治疗指数低，安全范围窄，在饲料中若拌混不匀则容易导致中毒)；三是对乳腺癌细胞活性的抑制作用；四是对疟疾的致病原疟原虫有杀灭作用；五是对人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制有抑制作用。在这类抗生素应用的早期即发现他们不能与其他某些抗生素和磺胺药联合应用，易产生中毒。有研究表明聚醚类抗生素的中毒与组织器官的自由基的产生及生物膜的脂质过氧化有关。
链霉菌NO.80分离自南海北部沉积物，其可生产聚醚类天然产物，聚醚类抗生素K-41B、K-41A即来自海洋放线菌链霉菌NO.80。据报道，K-41B、K-41A具有抗菌活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种聚醚类抗生素K-41B、K-41A在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
聚醚类抗生素在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用，聚醚类抗生素为K-41B或K-41A。
K-41B的结构为
K-41A的结构为
治疗或预防艾滋病毒药物为逆转录酶和整合酶双靶点抑制剂。
治疗或预防艾滋病毒药物为口服制剂或注射制剂。
艾滋病毒为HIV-1。
HIV-1为HIV-1 IIIB或HIV-1 Bal。
在对聚醚类天然产物的研究过程中，发明人首次发现K-41B、K-41A具有抗HIV-1活性。发明人采用三种病毒感染细胞系统验证其抗HIV活性，结果表明：在TZM-bl细胞、MT2细胞和人外周血单个核细胞(PBMCs)中，K-41B、K-41A均表现出较好的抗HIV活性，对HIV-1的复制具有一定的抑制作用。进一步研究显示，K-41B和K-41A对HIV-1逆转录酶和整合酶有一定的抑制作用，可能是抗HIV-1的双靶点抑制剂。因此，聚醚类抗生素K-41B、K-41A可用于治疗或预防艾滋病毒，成为具有潜力的抗HIV药物。综上，本发明充分利用了南海海洋活性物的丰富资源，为今后深入研究其药用价值和临床意义提供了更为有力的理论基础，可应用于的进一步开发应用。
附图说明
图1是K-41B在TZM-bl细胞中的细胞毒性以及抗HIV-1活性示意图。
图2是K-41A在TZM-bl细胞中的细胞毒性以及抗HIV-1活性示意图。
图3是K41-B在MT2细胞中的细胞毒性以及抗HIV-1活性示意图。
图4是K41-A在MT2细胞中的细胞毒性以及抗HIV-1活性示意图。
图5是K41-B在PBMCs细胞中的细胞毒性示意图。
图6是K41-A在PBMCs细胞中的细胞毒性示意图。
图7是K41-B在PBMCs细胞中30h、96h、120h的抗HIV-1活性示意图。
图8是K41-A在PBMCs细胞中30h、96h、120h的抗HIV-1活性示意图。
图9是K41-A和K41-B体外抗HIV-1逆转录酶活性示意图。
图10是K41-A和K41-B体外抗HIV-1蛋白酶活性示意图。
图11是K41-A和K41-B体外抗HIV-1整合酶活性示意图。
具体实施方式
为证明K-41B、K-41A用于治疗艾滋病病毒感染的可能性，发明人进行了以下药效学和作用机制实验。其中，实验所用K-41B、K-41A药物由中国科学院南海海洋研究所鞠建华课题组提供。
实验一、K41-B和K41-A在TZM-b1细胞中的细胞毒性以及抗HIV-1活性
使用HIV-1 IIIB病毒感染TZM-bl细胞(由中国人民解放军军事医学科学院惠赠)。HIV-1 IIIB毒株是野生型参考病毒株，该毒株属于类似泰国B’基因亚型T嗜性毒株。TZM-b1细胞又称为JC57BL-13细胞，来源于HeLa细胞系，TZM-b1细胞稳定表达HIV-1受体CD4，以及共受体CXCR4和CCR5，并且在基因组中整合有受HIV-1启动子长末端重复序列(LongTerminal Repeat，LTR)控制的报告基因萤火虫荧光素酶。病毒感染后报告基因的表达水平可以指示病毒的复制水平。实验中，使用Cell TiterGlo(Promega公司产品)试剂来对细胞活性进行定量检测从而确定K41-B和K41-A的细胞毒性，Bright-Glo(Promega公司产品)来检测被感染细胞中报告基因的表达水平。
1.细胞毒性实验
用胰酶消化对数生长期TZM-b1细胞，新鲜无酚红DMEM完全培养基调整TZM-bl细胞至10万/mL，每孔100μL细胞悬液加入96孔板。第二天，加入5倍梯度稀释的药物40μL，每浓度3个重复，对照组不加任何药物，补加培养液至总体积200μL。培养板置培养箱48h后，加入细胞活性检测试剂Cell Titer 6lo 20μL，水平震荡3min，37℃、5％CO2培养箱孵育10min后，用BioTek(Synergy H1)多功能酶标仪检测化学发光信号。
相对细胞活性计算方法为：
细胞活性(％)＝(药物处理-无细胞对照)×100％/(细胞对照-无细胞对照)
2.抗病毒活性实验
用胰酶消化对数生长期TZM-b1细胞，新鲜无酚红DMEM完全培养基调整TZM-b1细胞至10万/mL，每孔100μL细胞悬液加入96孔板。第二天，加入5倍梯度稀释的药物40μL，每浓度3个重复，对照组不加任何药物。再加入适当稀释的HIV-1 IIIB病毒储存液60μL，保证感染复数为1，未感染对照组不加病毒。培养板置培养箱48h后，加入荧光素酶活性检测试剂Bright-Glo(Promega公司产品)20μL，水平震荡3min后，BioTek(Synergy H1)多功能酶标仪检测化学发光信号。
相对病毒复制水平计算方法为：
病毒复制(％)＝(药物处理-未感染对照)×100％/(病毒感染对照-未感染对照)
3.实验结果
如图1所示，K41-B的8个浓度对TZM-b1细胞平均相对细胞活力均大于85％，如图2所示，K41-A的8个浓度中6个对TZM-b1细胞平均相对细胞活力均大于90％，在不影响细胞活性的浓度下，K41-B和K41-A分别可以剂量依赖地抑制HIV-1 IIIB在TZM-b1中的复制，且随着药物浓度的增加，相对病毒量降低，即抑制率增加，K41-B和K41-A在TZM-bl细胞中IC50分别为0.4153μM、0.7497μM，CC50分别为＞5.787μM、4.360μM。
实验二、K41-B和K41-A在MT2细胞中的细胞毒性以及抗HIV-1活性。
使用HIV-1 IIIB感染MT2细胞(由中国人民解放军军事医学科学院惠赠)。MT2细胞是人类T淋巴细胞白血病病毒I型转化的人淋巴瘤细胞，用于HIV-1的扩大培养。K41-B和K41-A的抗HIV-1活性前期采用MT2细胞与药物病毒共培养，后期转上清至TZM-b1细胞板里，使用Bright-Glo(Promega公司产品)来检测被感染细胞中报告基因的表达水平。细胞毒性实验中，使用Cell TiterGlo(Promega公司产品)试剂来对MT2细胞活性进行定量检测从而确定K41-B和K41-A的细胞毒性。
1.细胞毒性实验
取对数生长期MT2细胞，调整细胞密度至2×105/mL，每孔160μL细胞悬液加入96孔板。同时加入5倍梯度稀释的药物40μL，每浓度3个重复，对照组不加任何药物，补加培养液至总体积200μL。培养板置培养箱72h后，加入细胞活性检测试剂Cell TiterGlo 20μL，水平震荡3min，37℃、5％CO2培养箱孵育10min后，用BioTek(Synergy H1)多功能酶标仪检测化学发光信号。
相对细胞活性计算方法为：
细胞活性(％)＝(药物处理-无细胞对照)×100％/(细胞对照-无细胞对照)
2.抗病毒活性实验
取对数生长期MT2细胞，加入适当稀释的HIV-1 IIIB病毒储存液60μL，保证感染复数为1，未感染对照组不加病毒。调整细胞密度至2×105/mL，每孔160μL细胞悬液加入96孔板。同时加入5倍梯度稀释的药物40μL，每浓度3个重复，对照组不加任何药物。培养板置培养箱72h后，加入荧光素酶活性检测试剂Bright-Glo(Promega公司产品)20μL，水平震荡3min后，BioTek(Synergy H1)多功能酶标仪检测化学发光信号。
相对病毒复制水平计算方法为：
病毒复制(％)＝(药物处理-未感染对照)×100％/(病毒感染对照-未感染对照)
3.实验结果
如图3所示，K-41B的8个浓度中，除了最高浓度，其余浓度对MT2细胞相对细胞活力均大于80％，K-41A药物有6个浓度相对细胞活力均大于80％(见图4)，在不影响细胞活性的浓度下，K41-B和K41-A分别可以剂量依赖地抑制HIV-1 IIIB在MT2中的复制，随着药物浓度的增加，相对病毒量降低，即抑制率增加，K41-A和K41-B在MT2细胞中IC50分别为0.1910μM、0.07340μM，CC50分别为1.634μM、＞6.59872μM。
实验三、K41-A和K41-B在外周血单个核细胞(PBMCs)中的细胞毒性以及抗HIV-1活性。
使用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque PREMIUM1.073(GE公司产品)分离获得健康人PBMC。细胞在含有50ng/mL IL-2(Sigma-Aldrich公司产品)和10％FBS(Gibco公司产品)的RMPI1640(Gibco公司产品)中培养。实验前，PBMCs经植物凝集素(5μg/mL，Sigma-Aldrich公司产品)刺激72h。HIV-1Bal感染PBMCs，MOI＝0.01。细胞以20万/孔的密度接种于96孔板，加入适当稀释的药物至总体积200μL。分别在培养30h、96h、120h后，取出100μL上清用于p24检测，并补加100μL新鲜培养液继续培养。在平行测定化合物毒性的实验中，细胞不经病毒感染，其它处理条件同上。培养至第120h时，使用CellTiter Glo检测细胞活性。
结果显示：K41-B和K41-A在PBMC细胞中的细胞毒性以及抗HIV-1活性与PBMCs共培养120h后，如图5所示，K41-B中5.787μM以下浓度对细胞的存活影响不大，如图6所示，K41-A当浓度达到1.7596μM时，细胞活性受到抑制，为无药物对照的76.8％。检测病毒复制水平(p24)发现：K41-B和K-41A均能剂量依赖得抑制HIV-1的复制。在病毒复制的高峰(第5天)，K41-B中5.787μM以及K-41A中1.7596μM可以完全抑制病毒复制。在无毒性浓度下，HIV-1的p24产生也受到了一定抑制。
实验四、K41-A和K41-B体外抗HIV-1逆转录酶活性
采用Roche公司的Reverse Transcriptase Assay，colorimetric试剂盒(Cat.No.11468120910)检测药物对逆转录酶活性的抑制，操作如下：
1)干预先用Streptadidin包被的MP(小crotiter plate)中加入20μL重组HIV-RT(2ng/well，裂解缓冲液稀释)，20μL待测化合物和20μL的反应混合液(46mM Tris-HCL，266mM KCL，27.5mM MgCL2，9.2mM DTT，10μM dUTP/dTTP，template/primer hybrid)，37℃作用2小时。不含RT的反应孔作为阴性对照，AZT作为阳性药物对照，药物用Lysis Buffer稀释，5倍梯度，5个浓度。
2)弃反应液，每孔加入250μL Washing Buffer洗涤5次，每次30秒。
3)每孔加入200μL anti-DIG-POD工作液(200mU/mL)，37℃作用1小时。
4)弃去反应液，250μL Washing Buffer洗涤5次，每次30秒。
5)加入200μL ABTS底物反应液，室温下反应，至出现充足颜色。
6)BioTek Synergy H1多功能酶标仪检测405处0D值(参考波长490nm)。
对RT活性的抑制率(％)＝[1-(实验孔0D值-空白孔0D值)/(对照孔0D值-空白孔0D值)]×100
结果如图9所示，K-41B和K-41A药物浓度从低到高，对于HIV-1逆转录酶的抑制活性呈现由低到高的浓度梯度，说明K-41B和K-41A对逆转录酶有一定的抑制活性。
实验五、K41-A和K41-B体外抗HIV-1蛋白酶活性
采用BioVision HIV-1 Protease Activity Assay Kit(Fluorometric)试剂盒(Cat.No.K-825-100)检测HIV-1蛋白酶活性，具体实验方法如下：
用HIV-1Protease Assay Buffer配制标准品浓度，得到标准品最终浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1nmol/孔；
样本组：20μL细胞培养上清+78μL HIV-1Protease Assay Buffer+2μL HIV-1Protease Substrate；
阳性对照组：5μL HIV-1Protease+93μL HIV-1Protease Assay Buffer+2μL HIV-1 Protease Substrate
背景组：98μL HIV-1Protease Assay Buffer+2μL HIV-1 Protease Substrate
37℃作用1小时，测量荧光值：激发荧光/发射荧光＝330/450nm，获得相应的荧光强度值RFU。
结果如图10所示，HIV-1蛋白酶所产生的荧光值始终处于一个相对稳定的水平，并未出现浓度梯度趋势，说明K41-A和K41-B对蛋白酶活性并未产生抑制作用，说明蛋白酶不是K41-A和K41-B的作用靶点。
实验六、K41-A和K41-B体外抗HIV-1整合酶活性
HIV整合酶可以将HIV DNA整合入宿主细胞DNA，因此，整合酶成为艾滋病研究的潜在靶标。按照EZ-1700试剂盒说明书操作方案，具体试验方法如下：
向预包被链霉亲和素的96孔板依次加入：
a)DS DNA(double-stranded HIV-1LTR U5 donor substrate DNA，末端生物素标记)；
b)全长的重组HIV-1整合酶；
c)实验样品；
d)TS DNA(double-stranded target substrate，3’-末端修饰)；
e)TMB底物；
f)加入TMB终止液；
催化反应：HIV-1整合酶催化从DS DNA向TS DNA的核酸链转移重组反应；
检测反应产物：加入HRP-标记的抗体+TMB底物。
结果如图11所示，K-41B和K-41A对HIV-1整合酶的有一定的抑制活性，K一41B五个浓度的抑制活性始终大于K-41A的抑制活性，五个浓度从小到大，对整合酶的抑制活性增加，说明整合酶是K41-A和K41-B的作用靶点。
Claims (6)
1.聚醚类抗生素在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用，其特征在于：所述聚醚类抗生素为K-41B或K-41A。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述K-41B的结构为
所述K-41A的结构为
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗或预防艾滋病毒药物为逆转录酶和整合酶双靶点抑制剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗或预防艾滋病毒药物为口服制剂或注射制剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述艾滋病毒为HIV-1。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述HIV-1为HIV-1 IIIB或HIV-1 Bal。
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| Title |
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| DION A KEVIN II，等: "Polyether ionophores: broad-spectrum and promising biologically active molecules for the control of drug-resistant bacteria and parasites", 《EXPERT OPIN DRUG DISCOV.》 * |
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