CN111189868B - 一种应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法 - Google Patents

一种应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法 Download PDF

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    • G01N24/00Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance

Abstract

本发明公开了一种应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法,该方法以特定的测试参数对待测油样的弛豫信号进行测定,并以特定参数下的反演得到的T2横向弛豫时间谱图信息为基础进行主成分分析,即可快速地通过待测样品在PCA图上的相对位置来判别待测油样是否存在地沟油掺假,进一步通过特征参数值与掺假比例构建预测模型,通过预测模型可计算出待测油样中的掺假比例。以本发明提供的方法为基础,通过不同种合格食用油样品的替换可实现地沟油掺假多种食用油的鉴别,而通过选用不同型号及规格的低场核磁分析仪可满足地沟油及其掺假油样的现场快速以及低检出限高灵敏度检测的需求,为不同场合及条件下的分析鉴别提供了有效的解决方案。

Description

一种应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法
技术领域
本发明属于食品检测领域,涉及一种应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法。
背景技术
地沟油,泛指在生活中存在的各类劣质油,根据其来源主要可分为狭义上的地沟油(厨余垃圾)、劣质动物油脂以及煎炸老油。
较之于正常食用油,地沟油的主要成分虽仍为甘油三酯,但由于其经过长时间的空气暴露与高温处理,油脂发生一系列的水解、氧化酸败及热聚合反应,生成一些醛、酮、酸等小分子物质导致风味劣变的同时,产生一些氢氧化物及自由基,加剧人体衰老及诱导肿瘤等疾病的发生,更会生成如多氯联苯(PCBs)和二恶英等多环芳烃类物质,导致胃癌、肠癌、肾癌等疾病。此外,由于地沟油的产生环境恶劣,其重金属及微生物污染的问题同样严重,一旦摄入将带来一系列的健康问题。虽然我国政府制定了严格的食品安全相关律法对地沟油的不法生产、贸易及使用行为进行了严厉的查处,但是依旧难以对其实现彻底根除。
未经精炼的地沟油,可通过其基本理化指标(碘价、酸价、过氧化值、总砷、总铅及黄曲霉毒素等)进行定性鉴别,其中,根据油脂酸价指标而采用的试纸条法可以实现对地沟油的初步判别,广泛应用于地沟油的快速现场检测。但传统理化方法的检测局限性较大,由于地沟油来源复杂且成分不一,各项理化指标很难实现对地沟油掺假的准确定量分析,对于各项基本理化指标均符合《食品安全国家标准植物油(GB 2716-2018)》的精炼地沟油难以实现鉴别。
为解决传统理化检测方法存在的缺陷,基于地沟油不同组分特征差异的仪器分析法迅速发展并得到广泛应用,如中国专利文献CN 102297908A公开了一种基于静态顶空分析—气相色谱—质谱仪联用的方法,利用气相色谱-质谱联用仪对未知油样进行测定,得到相应谱图并以五种特征性挥发性成分(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸)为定性分析对象,可实现对地沟油的检测分析,且具有较高的检测灵敏度。此外,如电导率法、紫外分光光度,酶联免疫等技术也相继被应用于地沟油掺假的检测,这些方法均可通过针对地沟油中某一种或一类特征性物质实现对地沟油的鉴别分析,但仍有一些经过特殊精炼处理的地沟油难以简单通过一种或一类特征性组分进行定性定量判别。而核磁共振波谱技术则基于不同物质分子中具有磁共振现象的原子(主要为氢原子)所处的化学环境不同实现对物质组分的整体分析,特别在油脂这类主要组分较为明确的物质(油脂主要由各种形式的脂肪酸甘油三酯组成)的分析中具有较高的应用价值,经过长期的空气暴露或者高温煎炸处理以及劣质的动物油脂类的地沟油,其与正常油脂的多组分差异可以清楚地利用核磁共振谱图进行表征。
目前,现有的利用核磁共振波谱技术检测地沟油及其掺假油多使用高场核磁共振仪,如中国专利文献CN 103344661A公开的一种使用氢核磁共振法鉴定掺假油及地沟油的方法,该法采用主频为300-800MHz的高场核磁共振仪,分别取多种合格油脂样品及地沟油样品,加入氘代氯仿作为溶剂摇匀后进行1H NMR检测,获取相应标准谱图并计算出谱图中各共振峰的积分面积以确定各种标准油脂样品的中四种脂肪酸甘油三酯(饱和脂肪酸甘油三酯、油酸甘油三酯、亚油酸甘油三酯、亚麻酸甘油三酯)的质量分数,进而根据四种脂肪酸甘油三酯物质的量分数的比例的不同来鉴定所测油脂样品是合格油还是掺假油或地沟油。该法所用仪器为高场核磁共振仪,具有较高的检测灵敏度,但需使用有机溶剂,且仪器体积庞大,价格昂贵,仪器操作及谱图求解需专业人员完成,难以实现地沟油及其掺假的现场快速检测。
相较于高场核磁,低场核磁虽不具备同样的检测灵敏度,但其因检测成本较低,无需使用化学试剂,操作及分析简单快速等的特点,越来越被广泛地应用于农业及食品的检测分析领域,目前已公开的使用低场核磁共振仪进行油品品质相关分析的专利文献中,中国专利文献CN 101975788A公开了一种低场核磁共振鉴别食用油品质的方法,该方法使用低场核磁共振分析仪在特定参数下通过PGSE-CPMG序列测定纯大豆油以及加入不同比例的煎炸样品后的大豆油样品弛豫时间谱,进而利用二维反拉普拉斯算法得到相应的横向弛豫时间谱,发现加入劣质油样的大豆油的横向弛豫时间谱中均发现了特征小峰,且峰面积与掺入煎炸老油比例呈现一定的线性关系,实现对于食用油品质的快速便捷测试。该法利用煎炸老油特征小峰满足了对于一类地沟油的定性定量分析,充分体现了低场核磁共振在油品分析中简单快速,无需使用化学试剂等的特点,但该法对于一些在相同弛豫时间仍有弛豫信号的油样以及无该特征峰的其他种类地沟油难以实现鉴别。究其原因,主要在于纯正食用油、纯地沟油及混合油的多特征信号的挖掘和表征方法不足,亟需开发新的食用油掺假的多特征信号快速判别方法。
发明内容
本发明的目的是突破现有的低场核磁共振食用油掺假检测方法的瓶颈,提供一种应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法;本发明通过对测定和反演参数的优选,快速获得有差异的T2弛豫时间图谱和参数,进一步应用化学计量法中的主成分分析方法对获得的T2弛豫时间数据进行分析,通过对多特征数据的综合分析,可快速鉴别出含有掺假油的样品。该方法可满足不同场景及使用条件,适用于地沟油及其掺假油的快速检测与筛查。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:在预先校正及合适的仪器参数背景下,将待测油样、纯食用油样、以及来源明确的纯地沟油在特定的低场核磁共振参数下采集核磁共振信号,根据样品的T2横向弛豫图谱和特征数据(T21,T22,T23,A21,A22,A23,P21,P22,P23,W21,W22,W23),根据图谱和特征数据即可初步判断食用油是否掺假地沟油;再将特征数据进行主成分分析,得到PCA图,根据待测样品与标准样品在PCA图上的相对位置(聚合离散情况)进一步以判断待测样品中是否存在地沟油掺假;将添加不同地沟油的食用油的特征信号数据与添加量做多元回归分析,构建预测模型,将待测油样测得的特征数据带入模型中,即可计算出掺假比例。
进一步的,本发明实施的具体步骤如下:
(1)仪器校正:由于低场核磁共振仪采用永磁体作为磁场来源,导致磁场极易受到外界环境温度波动的影响,因此在正式实验之前需要对LF-NMR仪器进行磁场均匀化和寻找中心频率等校正操作。一般采用核磁信号的自由感应衰减(Free Induction Decay,FID)实验来校正,具体仪器校正流程如下:
首先打开核磁仪器,并将磁体温度开关打开,预热24h,使磁体温度恒定在32℃进行磁场均匀化校正,将直径为25mm的核磁线圈安装到仪器的磁体腔中,然后将标准油样放入磁体线圈,在软件的参数设置界面选择Q-FID序列,开启仪器射频单元电源,将RG1,GRG1,PRG分别设置为15,2和1,单击软件界面中的自动匀场按钮,进行磁场均匀化操作,匀场完成后,继续寻找磁场中心频率,单击软件界面中的自动寻找中心频率按钮,仪器将自动寻找中心频率SF及漂移频率O1,当信号的实部、虚部和模均呈平滑曲线时,表明中心频率已经找到,进而继续寻找90°和180°脉宽,单击软件界面中的设置脉冲脉宽按钮,设置起始脉冲宽度为3μs,结束脉冲宽度为21μs,累加步长为0.5μs。仪器将按照设定的参数自动寻找90°脉宽(P1)和180°脉宽(P2),当给出的信号图只出现一个波峰和一个波谷时,表明仪器参数已正确设定,可以开始测试。
(2)样品准备:室温下,移取2.5mL待测油样和混有不同比例地沟油的食用油至4mL的螺口玻璃瓶内,旋上瓶盖,涡流震荡器震摇至均匀,等待测定。
(3)测试参数设置:通过CPMG序列对待测油样进行横向弛豫分析,在采集低场核磁信号时,应该确保在一致且合理的CPMG序列参数条件下完成,以保证测试结果的准确性和可靠性。因此,需要确定一个适用于所有样品测试要求的测试参数。在前期预实验的基础上,用于食用油中地沟油掺假鉴别的低场核磁共振仪器的CPMG序列参数为:SW=250kHz,质子共振频率SF=21MHz,RFD=0.08ms,Tw为2000~4000ms,模拟增益RG1为15~20db,数字增益DRG1为0~5,前置放大增益PRG为0~3,累加次数NS为4~32,DR=1,回波时间TE为0.2~0.25ms,回波个数NECH为8000~10000。
(4)样品测试:在完成仪器校准及参数设定后,将装有待测油样和混有不同比例地沟油的食用油的样品瓶置于25mm核磁套管内,将核磁套管置于磁场中心位置,平衡1min后,点击累加采样,对样品的信号进行采集,得到相应的弛豫衰减曲线。
(5)结果反演和初步判别:为获得样品的T2横向弛豫时间图谱,在完成对所有样品的信号采集后,在结果查询选项中选中所有测试序列进行批量反演,运用二维反拉普拉斯算法获取横向弛豫时间谱,此时,不同的反演参数及模式的设置同样会对测试结果产生影响,在预实验基础上,设置反演参数:选择基底为采集的空样品瓶的信号,抽样点数400~600,抽样范围0.1~1000ms,迭代次数106,在此条件下获取各油样的横向弛豫时间谱图,根据图谱中不同峰的位置、峰的大小等可初步判断食用油中是否存在掺假地沟油。
(6)主成分分析:根据反演结果,分别提取出谱图中各峰的特征参数T21,T22,T23,A21,A22,A23,P21,P22,P23,W21,W22,W23,利用SIMCA软件对结果进行主成分分析(结果见图1),根据待测样品与已知样品在PCA图上的相对位置,可进一步判断出待测油样是否掺假。
(7)掺假比例预测:根据测得的特征参数T21,T22,T23,A21,A22,A23,P21,P22,P23,W21,W22,W23,通过与食用油与地沟油的混合比例进行多元线性拟合,获得回归方程。将待测样品的特征参数值带入回归方程,即可计算出相应的掺假比例。
与现有的地沟油掺假食用油的快速无损检测方法相比,本方法具有以下优点:
1.本发明提供的方法中,无需对样品进行前处理,无需使用化学试剂,对样品不造成污染,操作简单易懂,且单个样品的测试时间及反演时间均小于1min,易于实现地沟油掺假的现场快速检测,具有广泛的应用前景。
2.本发明提供了适用于地沟油掺假检测的低场核磁共振的测试参数及反演参数,提高了检测结果的准确性与可靠性。
3.本发明将低场核磁共振的结果与主成分分析法相结合,同时可快速无损地实现对于地沟油掺假食用油的定性与定量检测。
4.本发明所提供的方法具有较强的适用性,在实现多种类型地沟油分析鉴别的同时,可通过调整标准食用油种类实现地沟油掺假的多种食用油的检测分析,同时,也可通过不同型号类型低场核磁共振分析仪的选择以实现不同场景及条件下的地沟油及其掺假油样的检测分析。
附图说明
图1为花生油及不同比例地沟油掺假的花生油的低场核磁共振弛豫衰减曲线。
图2为花生油及不同比例地沟油掺假花生油的低场核磁共振横向弛豫时间曲线。
图3为基于主成分分析的低场核磁检测不同浓度地沟油掺假花生油的结果。
图4为所测地沟油掺假样品的模型预测值及实际掺假比例值的拟合结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
本实施例中,待测油样为掺假不同浓度(5%、10%、20%、30%、50%、70%)地沟油的金龙鱼花生油以及纯地沟油和金龙鱼花生油样品。
本实验目的主要为:①测试纯花生油、地沟油以及不同浓度掺假油样在低场核磁共振下的信号差别,获得回归方程;②结合主成分分析法对地沟油及不同浓度的掺假油样进行鉴别。
本实施例的具体操作步骤如下:
(1)仪器校正:首先打开核磁仪器,并将磁体温度开关打开,预热24h,使磁体温度恒定在32℃进行磁场均匀化校正,将标准油样放入磁体线圈,在软件的参数设置界面选择Q-FID序列,开启仪器射频单元电源,将RG1,GRG1,PRG分别设置为15,2和1,单击软件界面中的自动匀场按钮,进行磁场均匀化操作,匀场完成后,单击软件界面中的自动寻找中心频率按钮,仪器将自动寻找中心频率SF及漂移频率O1,单击软件界面中的设置脉冲脉宽按钮,设置起始脉冲宽度为3μs,结束脉冲宽度为21μs,累加步长为0.5μs。仪器将按照设定的参数自动寻找90°脉宽(P1)和180°脉宽(P2),信号图出现只有一个波峰和一个波谷,仪器参数设定正确,可以开始测试。
(2)样品准备:室温下,按照(0%、5%、10%、20%、30%、50%、70%、100%)的比例,用地沟油及花生油进行配置,涡流震荡器震摇至均匀,移取2.5ml待测油样至4mL的螺口玻璃瓶内,旋上瓶盖,等待测定。
(3)测试参数设置:低场核磁共振仪器的CPMG序列参数为:SW=250kHz,质子共振频率SF=21MHz,RFD=0.08ms,Tw=2000ms,模拟增益RG1=15db,采样点数TD=50032,数字增益DRG1=2,前置放大增益PRG=1,累加次数NS=8,DR=1,回波时间TE=0.2ms,回波个数NECH=10000。
(4)样品测试:在完成仪器校准及参数设定后,将装有待测油样的样品瓶至于25mm核磁套管内,将核磁套管置于磁场中心位置,平衡1min后,点击累加采样,对样品的信号进行采集,单个样品采集时间约为1min。测试结果见附图1,由图可见,随着花生油中掺入该种地沟油比例的提高,弛豫衰减趋势减慢,到达弛豫平衡的时间延长,但整体变化较小。
(5)结果反演和初步判断:设置反演参数:选择基底为采集的孔样品瓶的信号,抽样点数400,抽样范围0.1~1000ms,迭代次数106,在此条件下,如附图2所示,样品的横向弛豫时间图谱呈现三个峰,从纯花生油到地沟油,随着掺假浓度的不断增加,油样的横向弛豫时间谱图有右移趋势,这是由于花生油与地沟油之间的组分差异造成的,这推测是由于地沟油经长时间环境暴露而发生一定程度的水解,释放出游离的甘油及脂肪酸分子,而这些小分子组分弛豫衰减较慢,弛豫时间较长,故随着食用油中掺入地沟油比例的增加,样品弛豫衰减变慢,横向弛豫时间变长,即发生谱图右移现象。但我们发现当掺假比例差距较小时,谱图变化微弱且难以通过谱图局部峰的变化进行判别。
(6)主成分分析:根据反演结果,分别提取出三个峰的特征参数T21,T22,T23,A21,A22,A23,P21,P22,P23,W21,W22,W23,利用SIMCA 14.1软件对结果进行主成分分析,根据纯花生油样品、地沟油样品以及不同比例掺假油样品在PCA图(附图3)上的相对位置,可以直观地看出,不同组别的油样可以得到明显的区分,这表明低场核磁共振结合主成分分析法可以实现对地沟油掺假的有效判别,由附图3可以看出,从纯花生油到地沟油,随着掺假比例的不断增加,对应样品点的位置呈规律性的右移,这进一步地提示低场核磁共振技术结合主成分分析法可用于对地沟油掺假的判别。
(7)掺假比例预测:根据测得的特征参数T21,T22,T23,A21,A22,A23,P21,P22,P23,W21,W22,W23,通过与食用油与地沟油的混合比例进行多元线性拟合,获得最优的回归方程:
Y=43.06P21+0.72W23-0.17T23a-8.56T22s-7.15T21a+6.50T21s+1.92W22+9.30P23-352.85(Y:地沟油掺假比例预测值;P21:第一个峰的峰面积占比;W23:第二个峰的峰宽;T23a:第三个峰的峰顶点时间;T22s:第二个峰的峰起始时间;T21a第一个峰的峰峰顶点时间;T21s:第一个峰的峰起始时间;W22:第二个峰的峰宽;P23:第三个峰的峰面积占比)所得回归方程R2=0.971,进而可将待测样品的特征参数值带入回归方程,即可计算出掺假的比例。
为验证所得回归模型的可靠性及准确性,选取一定数量的地沟油掺假样品进行测定,将相应特征参数带入回归模型计算出理论掺假比例值,与已知真实掺假比例进行对比并计算相应误差,结果如附图4所示,进而将实际添加值与理论值进行线性回归分析,得到决定系数R2=0.9986,这表明该模型可以实现对地沟油掺假的比例的准确定量。
综上,在本例中,在特定的检测及反演参数下,低场核磁共振结合主成分分析法在实现对地沟油及其掺假的花生油样品的定性鉴别同时,可对地沟油掺假浓度进行准确的定量判别,操作过程简单快速,结果可靠性强。
以上所述例仅为针对本方法的所供实例,并非用于对本专利要求保护的范围进行限制,及凡以本专利的所述方法特征而进行的等效变化均在本发明专利要求保护的范围内。特别指出,本发明中所使用仪器型号为MesoMR 23型低场核磁分析仪,可更换其他型号的低场核磁共振分析仪以实现不同的检测需求,例如使用便携式小核磁可满足执法部门现场快速鉴别地沟油及其掺假油的目的。本发明专利以地沟油掺假的花生油为检测对象,可经等效变化应用于其他种食用油中地沟油掺假的检测,因此也应视为本发明专利的保护范围。
本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。

Claims (6)

1.一种应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法,其特征在于,在预先校正及合适的仪器参数背景下,将待测花生油样、纯花生油样、以及来源明确的纯地沟油置于低场核磁共振仪的磁场中心位置,根据样品的T2横向弛豫时间图谱和特征数据,并根据反演结果得到的图谱和特征数据即可初步判断待测花生油样是否掺假地沟油;再将特征数据进行主成分分析,得到PCA图,根据待测花生油样与纯花生油样在PCA图上的相对位置进一步判断待测花生油样中是否存在地沟油掺假;之后通过多元回归分析计算掺假比例;其中所述特征数据包括T21, T22, T23, A21, A22, A23, P21, P22, P23, W21, W22, W23;根据测得的特征数据T21, T22, T23, A21, A22, A23, P21, P22, P23, W21, W22, W23,通过与食用油与地沟油的混合比例进行多元线性拟合,获得回归方程:Y=43.06P21+0.72W23-0.17T23a-8.56T22s-7.15T21a+6.50T21s+1.92W22+9.30P23-352.85
式中,Y:地沟油掺假比例预测值;P21:第一个峰的峰面积占比;W23:第二个峰的峰宽;T23a:第三个峰的峰顶点时间;T22s:第二个峰的峰起始时间;T21a第一个峰的峰峰顶点时间;T21s:第一个峰的峰起始时间;W22:第二个峰的峰宽;P23:第三个峰的峰面积占比;将待测样品的特征数据值带入回归方程,即可计算出相应的掺假比例。
2.根据权利要求1所述的应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)仪器校正:a、仪器的预热及场强的均匀化;b、磁场中心频率寻找及漂移频率的确定;c、仪器90 °脉宽和 180 °脉宽的寻找;
(2)样品准备:移取适量待测花生油样、纯花生油样、以及来源明确的纯地沟油至样品瓶内,涡旋至均匀,待测;
(3)测试参数的设置:设置满足于待测花生油样测试要求的CPMG序列参数;
(4)样品测试:待测样于磁场中稳定一段时间后采集其信号;
(5)结果反演:为获得样品的T2横向弛豫时间图谱,在一定的反演条件下,运用一维反拉普拉斯算法以获取弛豫时间图谱和特征数据并初步判断是否有地沟油掺假;
(6)主成分分析:运用主成分分析法对提取的样品弛豫时间谱特征数据进行处理,通过PCA图上样品的相对位置,即聚合离散情况分布,判别是否存在地沟油掺假;
(7)回归模型和预测分析:将添加不同地沟油的食用油的特征数据与添加量做多元回归分析,构建预测模型,将待测油样测得的特征数据带入模型中,即可计算出掺假比例。
3.根据权利要求2所述的应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,仪器校正首先打开核磁仪器,并将磁体温度开关打开,预热24h,使磁体温度恒定在32℃进行磁场均匀化校正,将直径为25 mm的核磁线圈安装到仪器的磁体腔中,然后将标准纯花生油样放入磁体线圈,在软件的参数设置界面选择Q-FID序列,开启仪器射频单元电源,将RG1,GRG1,PRG分别设置为15,2和1,单击软件界面中的自动匀场按钮,进行磁场均匀化操作,匀场完成后,继续寻找磁场中心频率,单击软件界面中的自动寻找中心频率按钮,仪器将自动寻找中心频率SF及漂移频率O1,当信号的实部、虚部和模均呈平滑曲线时,表明中心频率已经找到,进而继续寻找90°和180°脉宽,单击软件界面中的设置脉冲脉宽按钮,设置起始脉冲宽度为3 μs,结束脉冲宽度为21 μs,累加步长为0.5 μs;仪器将按照设定的参数自动寻找 90°脉宽P1和 180°脉宽P2,当给出的信号图只出现一个波峰和一个波谷时,表明仪器参数已正确设定,可以开始测试。
4.根据权利要求2所述的应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法,其特征在于,步骤(3)中所述的CPMG序列参数为:SW=250 kHz,质子共振频率 SF=21 MHz,RFD=0.08 ms,Tw为2000~4000 ms,模拟增益 RG1为15~20 db,数字增益DRG1为0~5,前置放大增益PRG为0~3,累加次数 NS为4~32,DR=1,回波时间TE为0.2~0.25 ms ,回波个数NECH为8000~10000;步骤(5)中的反演条件中,基底为空白样品瓶的信号、抽样点数为400~600,抽样范围0.1~1000 ms,迭代次数为106
5.根据权利要求2所述的应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法,其特征在于,所述步骤(6)中用于主成分分析的样品弛豫特征数据包括T21, T22, T23, A21,A22, A23, P21, P22, P23, W21, W22, W23,在具体分析过程中在可通过各变量的相应载荷对用于主成分分析的变量进行调整;主成分分析所使用软件包括SIMCA 14.1和SPSS数据分析软件。
6.根据权利要求2所述的应用低场核磁共振快速筛查食用油中掺假地沟油的方法,其特征在于,所述步骤(7)中,运用多元线性拟合法建立地沟油掺假比例与特征数据之间的关系模型对地沟油掺假量进行进一步预测,并通过验证集对模型有效性进行验证。
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