CN111184743A

CN111184743A - 多类型混合细胞在心肌梗死细胞治疗中的应用

Info

Publication number: CN111184743A
Application number: CN202010197295.1A
Authority: CN
Inventors: 葛均波; 石洪涛; 孙爱军; 骆晨涛; 孙晓垒
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2040-03-19
Also published as: CN111184743B

Abstract

本发明公开了一种多类型混合细胞在心肌梗死细胞治疗中的应用，其中所述的多类型混合细胞为静脉移植动脉后静脉桥血管来源的细胞。本发明还提供了多类型混合细胞作为预防或治疗心肌梗死的药物的用途。本发明的多类型混合细胞应用于心肌梗死治疗时，能提升心肌梗死后心脏功能，增加左心室射血分数，减小梗死区面积和室壁厚度，并缩小心室内径，从而改善症状，具有重要的临床意义。

Description

多类型混合细胞在心肌梗死细胞治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体的说涉及多类型混合细胞在心肌梗死细胞治疗中的应用。

背景技术

心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)是以剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息和药物不能彻底缓解，伴有血清心肌酶谱活性增高及进行性心电图变化为特征的一种心脏冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所导致的心肌坏死疾病。近些年研发人员进行了多项临床研究，研究结果表明，单支或多支冠状动脉粥样硬化解剖学狭窄是MI的疾病基础，经某些诱因如过劳、激动、寒冷刺激、吸烟等因素致使冠状动脉粥样硬化斑块破裂，冠状动脉管腔中血小板聚集，凝血酶原活化形成血栓，导致心肌坏死。另外冠状动脉痉挛和突增的耗氧量也可导致心肌梗死。约半数以上的急性心肌梗死患者，在起病前有前驱症状，原有心绞痛病情加重，发作时药物无法缓解，常见的并发症有心脏破裂、室壁瘤、附壁血栓、心律失常、心力衰竭和心梗后综合征等。

目前现有的治疗MI方案，基本是以再灌注治疗，缩小梗死面积为主。这类方法包括直接冠状动脉介入治疗和溶栓治疗；但此策略无法弥补已经梗死的心肌细胞。因此，急需一种既可以挽救梗死心肌，缩小梗死面积，又能再生心肌及血管的治疗策略。细胞治疗应运而生，目前见诸报道的有单一干细胞，成纤维细胞，基因，细胞外基质成份等治疗心肌梗死，或者上述几种细胞的组合治疗，但是疗效甚微。治疗瓶颈在于移植的细胞难以在梗死心肌中缺血缺氧且不断收缩运动的微环境中生存。

因此，需要研究开发一种新的适合心肌梗死治疗的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多类型混合细胞在心肌梗死细胞治疗中的应用，其中所述的多类型混合细胞为静脉移植动脉后静脉桥血管来源的细胞；

具体的说，所述的多类型混合细胞是选取静脉移植动脉两周后的静脉桥血管组织，经过胰酶消化得到所需的细胞；

多类型细胞中包括了血管外膜来源干细胞、骨髓来源干细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等。

上述多类型混合细胞在使用时，可成医学上可接受的形式，优选的，可配置成细胞混悬液；

优选的方式为：多类型混合细胞在使用时，每10cm皿密度达80％的多类型细胞离心后弃上清保存于6ml干细胞培养基中，配制成混悬液；

其中干细胞培养基由下列组分组成：

IMDM培养液原液166.4ml

胎牛血清20ml

牛碱性成纤维细胞生长因子(60000U)1.6ml

双抗(青霉素与链霉素1：1)2ml；

本发明还提供了上述多类型混合细胞作为预防或治疗心肌梗死的药物的用途；

其中多类型混合细胞是选取静脉移植动脉两周后的静脉桥血管组织，经过胰酶消化得到的细胞；其包括了血管外膜来源干细胞、骨髓来源干细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等；优选的方式，多类型混合细胞以上述混悬液的方式用于预防或治疗心肌梗死。

本发明对细胞混悬液的移植方法不作限定，作为一种优选方式，为心肌注射；其中心肌注射的注射区域为心肌梗死区、梗死边缘区、梗死远端或室间隔中的一处或几处。

其中心肌注射的注射量为每次1-9×10³-10⁸个混合细胞，可根据病人的病灶大小决定其用量。

本发明提供的多类型混合细胞在心肌梗死治疗中的应用，包含急性心梗和慢性心梗。

本发明提供的多类型混合细胞在心肌梗死治疗中的应用，可应用免疫组织化学技术、心超及分子生物学技术作为评价其在治疗心肌梗死中的技术效果。

所述的免疫组织化学技术包括HE染色，massion染色，α平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色等。

需要说明的是，心肌梗死因发生机制不同，分为急性心肌梗死和慢性心肌梗死两种类型。从病理生理角度来看，心肌坏死，是导致心肌功能由代偿最终发展为失代偿的主要原因。其中恢复心肌血供，挽救坏死心肌是目前治疗心梗最重要的手段。心梗后会发生的心室重构主要为：心梗后心肌和细胞外基质发生适应不良性改变导致心室病理性重构，包括心室大小、形态、组织结构及功能状态的改变，是心梗后发展为心衰的基本病理过程。心室重构分早期重构和晚期重构，前者发生于梗死后数小时至6周，主要表现为梗死区膨胀、室壁变薄、室腔扩大。后者则在梗死后6周至大约1年发生，见于非梗死区心室整体进行性扩张和扭曲。

本发明所提供的静脉移植到动脉后获得的多类型混合细胞，是通过小鼠静脉移植动脉模型的建立，人工制造一种无菌性炎症反应，通过炎症反应富集得到的多类型细胞，包括了血管外膜来源干细胞、骨髓来源干细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等，具有如下特点：1、多类型混合细胞相互优势互补，协同生存；2、能耐受缺血缺氧微环境；3、适应心脏持续跳动物理环境；4.自身自然来源，可减少理化因素干扰，保证细胞活性；5.与心肌细胞发育起源一致。经免疫组织化学染色发现多类型混合细胞混悬液注射后，梗死心肌面积较对照组减少。利用心脏超声发现，多类型混合细胞混悬液注射后较对照组LVEF明显增高，提示多类型混合细胞混悬液注射有利于改善心梗7天后和28天后小鼠心脏功能。

本发明优点在于：

本发明通过建立小鼠动静脉移植动物模型，人为制造一种无菌性炎症反应，募集所需的细胞成份，将移植两周后的静脉桥血管组织消化后，得到多类型混合细胞，将其注射到心肌梗死边缘区，利用免疫组织化学技术、心超及分子生物学技术等，评估心功能、心肌梗死情况。结果发现，静脉桥来源的多类型混合细胞的混悬液能增加左心室射血分数，减小梗死区面积和室壁厚度，并缩小心室内径，提示其能改善心肌梗死，可恢复部分梗死心肌功能，从而改善症状，具有重要的临床意义。

附图说明

图1：小鼠静脉移植模型建立方式与混合细胞提取方式；多类型混合细胞混悬液心肌注射后ECHO、心超、组织化学及qPCR检测疗效周期。

图2：心肌梗死7天后，多类型混合细胞混悬液注射后，小鼠心功能改善情况及心超组间对照统计。结果显示，心功能较对照组改善明显。

图3：心肌梗死28天后，多类型混合细胞混悬液注射后，小鼠心肌梗死改善情况。Masson染色结果显示：细胞注射治疗后较对照组梗死面积明显减少。

图4：心肌梗死7、28天后，细胞团移植小鼠心肌梗死改善情况HE、Masson染色结果对比。

其中：Sham：假模组vehicle：心梗+PBS；MC:心梗+多类型混合细胞混悬液

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实验材料来源：

C57小鼠：复旦大学附属中山医院实验动物中心SPF级饲养繁殖；

野生型小鼠购买于上海南方模式生物科技股份有限公司。

实验设计及操作严格遵守动物的饲养和实验遵守中国实验动物管理条例并遵守复旦大学附属中山医院动物实验中心管理规定。

下列实施例中所涉及的心超检测、病理切片观察、qPCR、染色等方法为本领域技术人员公知的方法。

实施例一小鼠动静脉移植动物模型的建立及多类型混合细胞的获得

C57小鼠和野生型小鼠均饲养于恒温、恒湿的动物室，自由进食、饮水。饲养箱内铺以柔软木屑，以减少动物的不适刺激。实验前禁食12h，不禁水。实验条件均在25℃左右条件下进行。

C57小鼠，体重在30g雌雄不限，用1％戊巴比妥那腹腔注射麻醉，浓度为0.1mL/10g。仰卧位固定，充分暴露颈部消毒术野，正中切口，钝性分离受体小鼠右侧颈总动脉周围组织，近心段保证动脉长度，远端游离至血管分叉处。供体小鼠打开胸腔，在小鼠右心房开窗，用10mL注射器从左心室灌注肝素生理盐水，待肝脏变白后，取下腔静脉放入威斯康辛大学保存液(国药慧鑫清源(北京)科技发展有限公司)待移植。

移植后第3天。常规麻醉小鼠后，切开原颈部切口缝线，观察其静脉桥颜色及搏动情况检查其通畅率。若桥血管颜色鲜红，搏动良好，则表明模型建立成功；若桥血管呈黑色或观察不到搏动，则表明模型建立失败。吻合时，保证腔静脉血流方向与术前一致，避免静脉瓣对吻合后血流动力学造成影响。

移植14天后，取移植物血管剪碎，1立方毫米大小，放置于37摄氏度5％二氧化碳培养箱3小时。下一步，培养瓶翻面，将已配好的链霉素(100mg/ml)、-2-巯基乙醇(0.1mM)、青霉素(100u/ml)和白血病抑制因子(艾美捷科技有限公司)(10ng/ml)的培养基加入培养1周。正常换液培养至细胞密度达80％。胰酶(上海慧颖生物科技有限公司，Gibco 0.25％胰蛋白酶溶液)消化2分钟，收集细胞团，即为多类型细胞。

10cm皿密度达80％的多类型细胞离心后弃上清保存于6ml干细胞培养基中，配制成混悬液；备用。

其中干细胞培养基按照如下配制：

IMDM培养液原液166.4ml(北京亚米生物科技有限公司)

胎牛血清20ml(赛默飞世尔科技有限公司)

牛碱性成纤维细胞生长因子(60000U)1.6ml(赛默飞世尔科技有限公司)

双抗(青霉素与链霉素单位比为1：1)2ml(赛默飞世尔科技有限公司)

实施例二多类型混合细胞对心肌梗死小鼠的体内实验

实施例一中得到的多类型混合细胞混悬液注射至心梗7天和28天的实验组小鼠心肌。

小鼠心肌梗死模型的建立：采用C57小鼠，体重在30g雌雄不限，用1％戊巴比妥那腹腔注射麻醉，浓度为0.1mL/10g。仰卧位固定，酒精消毒切口皮毛，在心脏部位第3肋间隙位置做1.5cm切口。用4-0proline丝线打一个荷包结备用。显微镊钝性分离肌肉。穿破肋间肌，左手挤出心脏，剥开心包。以左心耳下缘为标志，在线下2mm处6-0proline丝线结扎左冠脉，浅行进针，结扎。心室前臂变白后将心脏快速推入胸腔。挤出气体，收紧荷包关胸。置于暖垫，小鼠苏醒。

模型建立后后根据不同时间点(2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天)行心肌梗死边缘区细针注射；根据不同时间点(1周、2周和4周)进行心超、qPCR、HE、MASSON染色监测。

总的细胞团注射量为10⁶个(混悬液1ml)。

实验结果如下：

我们构建了小鼠动静脉移植模型，2周后组织块贴壁培养得细胞团块(图1)，并在2,4,6,8,10,12,14天等节点进行相应实验与心肌注射。

实验中，我们发现多类型混合细胞混悬液注射7天后，提高心梗小鼠左室射血分数(LVEF)约20％，减小左室内径(LVIDs与LVIDd)约2mm、心率(bpm)约100bpm、左室舒张末容积(LVEDV)约30微升和左室收缩末容积(LVESV)约40微升(图2)；多类型混合细胞混悬液注射28天后，减小心梗小鼠心肌梗死区面积约10％(图3)。通过观察心肌HE、MASSON染色发现，心梗后7天与28天，多类型混合细胞混悬液注射后，均缩小了小鼠心肌梗死的面积约10％(图4)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种多类型混合细胞在心肌梗死细胞治疗中的应用，其特征在于其中所述的多类型混合细胞为静脉移植动脉后静脉桥血管来源的细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的多类型混合细胞是静脉移植动脉两周后的静脉桥血管组织，经过胰酶消化得到的细胞。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于其中所述的心肌梗死包含急性心肌梗死和慢性心肌梗死。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于其中多类型混合细胞在使用时，混悬于干细胞培养基中，配制成混悬液。

5.根据权利要求1或4任一项所述的应用，其特征在于多类型混合细胞的移植方式是心肌注射。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于其中心肌注射的注射区域为心肌梗死区、梗死边缘区、梗死远端或室间隔中的一处或几处。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于其中心肌注射的用量为每次1-9×10³-10⁸个混合细胞。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的混悬液是：每10cm皿密度达80％的多类型细胞离心后弃上清保存于6ml干细胞培养基中，配制成混悬液；

其中干细胞培养基由下列组分组成：

IMDM培养液原液166.4ml；

胎牛血清20ml

牛碱性成纤维细胞生长因子(60000U)1.6ml

双抗2ml。

9.多类型混合细胞作为预防或治疗心肌梗死的药物的用途，其中多类型混合细胞是选取静脉移植动脉两周后的静脉桥血管组织，经过胰酶消化得到的细胞。