CN111161802A - 一种利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，步骤包括：采样位点布设步骤，高通量测序及微生物种群多样性分析步骤，生物标记筛选步骤和污染来源解析步骤。该湖泊水体污染来源解析方法基于不同来源样品微生物生物标记的差异，利用统计学分析方法量化污染影响程度，以实现基于微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析，为环境水体监测和治理提供技术参考。

Description

一种利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法
技术领域
本发明涉及一种湖泊水体污染来源解析方法，尤其是一种利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法。
背景技术
目前，我国面临严峻的水环境问题，水资源短缺、水生态受损等现象十分突出，其原因在于人类活动将大量工业、农业和生活废弃物排入自然水体，使水体受到污染及破坏，严重影响到我国人民用水安全。水环境问题的解决，其关键在于依据水体污染类型制定有效的治理方案，同时有针对性的加强控制力度。其中，最有效的方式就是对污染来源进行追溯与确定，从源头控制污染排放。因此，有必要设计出一种利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，能够结合高通量测序技术和多种统计学方法对不同污染源之间的微生物多样性差异进行分析，实现污染来源解析，为环境水体管控和治理提供技术支撑。
发明内容
发明目的：提供一种利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，能够结合高通量测序技术和多种统计学方法对不同污染源之间的微生物多样性差异进行分析，实现污染来源解析，为环境水体管控和治理提供技术支撑。
技术方案：本发明所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，包括如下步骤：
步骤1，在待解析湖泊水体设定各个采样位点，并根据湖泊水体区域周边环境确定各种潜在污染源；
步骤2，对各个采样位点所获湖水水样和各个潜在污染源所获污染水样中的微生物样本进行高通量测序，再对高通测序结果经过质控，再进行微生物种群多样性分析；
步骤3，再对各个湖水水样以及潜在污染源水样的微生物种群多样性进行差异分析，从而筛选出各类型水样的生物标记；
步骤4，根据生物标记利用统计学分析进行污染影响程度量化，并通过污染分布来解析污染来源。
进一步地，步骤1中，在根据湖泊水体周边环境确定各种潜在污染源时：若湖泊水体周边环境中存在工业园区，则将园区内的主要工业类型作为潜在污染源；若湖泊水体周边环境中存在人口密集居住区，则将市政污水和畜禽养殖废水作为潜在污染源。
进一步地，步骤2中，在提取水样中微生物样本时，利用0.22μm微孔滤膜抽滤湖水水样以及污染源水样，微生物样本即附着在微孔滤膜表面。
进一步地，步骤2中，在进行高通量测序时，对微生物样本的16s rDNA的V4区进行高通量测序，测序结果经过质控后进行微生物种群多样性分析。
进一步地，步骤2中，在进行微生物种群多样性分析时，通过将测序结果按照97％相似度进行聚类得到分类单元丰度表，对于分类单元丰度表中相对丰度大于0.1％的分类单元对比RDP和NCBI数据库进行注释得到生物学分类信息表。
进一步地，步骤3中，在进行差异分析时，基于分类单元丰度表中的分类单元相对丰度和生物学分类信息表中的物种分类信息，利用线性判别效应大小分析进行差异分析以筛选潜在生物标记。
进一步地，步骤3中，在利用线性判别效应大小分析进行差异分析时，设置分析参数为：LDAScore大于4.4，Kruskal-Wallis秩和检验的统计学意义小于0.05。
进一步地，步骤3中，在筛选潜在生物标记时，利用PCA分析计算因子载荷，将相同来源且在同一组分因子载荷>0.6的进化分支作为该源的生物标记。
进一步地，步骤4中，利用统计学分析进行污染影响程度量化时，是基于生物标记在分类单元丰度表中的相对丰度利用PCA分析计算因子得分。
进一步地，步骤4中，在通过污染分布来解析污染来源时，通过ArcGIS软件中的反距离权重插值分析法进行各污染源生物标记因子得分的可视化分析得到污染分布。
本发明与现有技术相比，其有益效果是：将高通量测序技术和微生物生物标记筛选方法相结合，从而实现污染来源解析的目的；与传统的实时定量荧光扩增技术相比，高通量测序技术具有更广泛的测序深度，不仅可对痕量丰度的微生物种群进行识别，亦可进一步检测出更多具有指示功能的微生物；提供的微生物生物标记筛选方法，即是针对高通量测序技术的优点，对各类型污染源中具有指示功能的微生物生物标记进行筛选，实现污染来源解析的目的；还可针对工业源、农业源和生活源等多种污染源进行生物标记筛选，且进行分析的污染源种类越多，源解析结果将更加准确。
附图说明
图1为本发明的方法流程图；
图2为本发明实施例的潜在生物标记；
图3为本发明实施例的污染分布情况；
图4为本发明实施例的连续监测污染分布情况。
具体实施方式
下面结合附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1：
如图1-4所示，本发明公开的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，包括如下步骤：
步骤1，在待解析湖泊水体设定各个采样位点，并根据湖泊水体区域周边环境确定各种潜在污染源；
步骤2，对各个采样位点所获湖水水样和各个潜在污染源所获污染水样中的微生物样本进行高通量测序，再对高通测序结果经过质控，再进行微生物种群多样性分析；
步骤3，再对各个湖水水样以及潜在污染源水样的微生物种群多样性进行差异分析，从而筛选出各类型水样的生物标记；
步骤4，根据生物标记利用统计学分析进行污染影响程度量化，并通过污染分布来解析污染来源。
进一步地，步骤1中，在根据湖泊水体周边环境确定各种潜在污染源时：若湖泊水体周边环境中存在工业园区，则将园区内的主要工业类型作为潜在污染源；若湖泊水体周边环境中存在人口密集居住区，则将市政污水和畜禽养殖废水作为潜在污染源。
进一步地，步骤2中，在提取水样中微生物样本时，利用0.22μm微孔滤膜抽滤湖水水样以及污染源水样，微生物样本即附着在微孔滤膜表面。
进一步地，步骤2中，在进行高通量测序时，对微生物样本的16s rDNA的V4区进行高通量测序，测序结果经过质控后进行微生物种群多样性分析。
进一步地，步骤2中，在进行微生物种群多样性分析时，通过将测序结果按照97％相似度进行聚类得到分类单元丰度表，对于分类单元丰度表中相对丰度大于0.1％的分类单元对比RDP和NCBI数据库进行注释得到生物学分类信息表。
进一步地，步骤3中，在进行差异分析时，基于分类单元丰度表中的分类单元相对丰度和生物学分类信息表中的物种分类信息，利用线性判别效应大小分析进行差异分析以筛选潜在生物标记。
进一步地，步骤3中，在利用线性判别效应大小分析进行差异分析时，设置分析参数为：LDA Score大于4.4，Kruskal-Wallis秩和检验的统计学意义小于0.05。
进一步地，步骤3中，在筛选潜在生物标记时，利用PCA分析计算因子载荷，将相同来源且在同一组分因子载荷>0.6的进化分支作为该源的生物标记。
进一步地，步骤4中，利用统计学分析进行污染影响程度量化时，是基于生物标记在分类单元丰度表中的相对丰度利用PCA分析计算因子得分。
进一步地，步骤4中，在通过污染分布来解析污染来源时，通过ArcGIS软件中的反距离权重插值分析法进行各污染源生物标记因子得分的可视化分析得到污染分布。
进一步地，步骤4中，确定主要污染来源后，对污染影响程度较高的区域和污染源，可以采取加密布点、连续监测和细化污染源类型等措施提高监测强度。
本发明在具体实施验证时，在某内陆湖泊进行验证实验。已知该湖泊所处区域及周边基本属于城乡结合区域或农业区域，易受到生活源及农业源影响，同时，该湖泊沿岸无工业企业，排除工厂直排可能，污染应来自河流汇入。利用本发明的方法对该湖泊污染来源进行解析：
(1)在该湖泊主要河湖交界处和重要区域(水源地取水口)布设4个采样位点。
(2)该湖泊北部和西部的入湖河流上游存在2个工业园区，园区内以钢铁制造业和机械加工业为主，同时存在化工企业，故将机械加工企业和化工企业作为潜在污染源之一；由于该湖泊位于人口密集的城乡结合区域，故将生活源和畜禽养殖作为潜在污染源。针对以上4类潜在污染源，在12家企业的排水出口进行样品采集，包括机械加工厂3家、化工厂3家、市政污水处理厂3家和畜禽养殖厂3家。
(3)针对该湖泊和潜在污染源的污水处理厂出口共采集16个样本，包括4个湖泊和12个污染源。样本经0.22μm微孔滤膜抽滤获取微生物样本后，提取DNA并送交测序公司对16s rDNA的V4区进行高通量测序，测序结果经质控、聚类处理得到分类单元丰度表，对于丰度较高(>0.1％)的分类单元对比RDP和NCBI数据库进行注释。
(4)将注释信息和丰度信息合并进行线性判别效应大小分析分析，为缩小生物标记筛选范围，设置LDA Score大于4.4，Kruskal-Wallis秩和检验的统计学意义小于0.05。通过生物标记筛选，共有54个潜在生物标记(图2)呈现统计学差异显著(P<0.05)。基于分类单元丰度表中各潜在生物标记的相对丰度，利用PCA分析计算因子载荷，将相同来源且在同一组分因子载荷>0.6的进化分支作为该源的生物标记。
(5)基于生物标记在分类单元丰度表中的相对丰度，重新利用PCA分析计算因子载荷和因子得分。因子载荷用于判断所选生物标记可否代表各类型污染源，因子得分用于量化对应的污染源的影响程度。
(6)通过ArcGIS软件中的反距离权重插值分析进行各污染源影响分布的可视化分析。由污染分布情况(图3)可知，污染主要来自市政污水和机械加工业。化工业和畜禽养殖影响相对较弱，其中化工污染来源与机械加工相同。基于以上结论，通过位点加密和连续监测对市政污水、机械加工业及其配套产业实施进一步监测。
(7)补测机械加工业中电镀企业污染源微生物样品，加密湖泊监测位点至8个并连续监测。重复生物标记筛选步骤和污染影响程度量化步骤，通过ArcGIS软件反距离权重插值分析进行各污染源影响分布的可视化分析。由污染分布情况(图4)可以看出，生活污水对湖泊的影响主要来自西部和东北部的城镇河流输入。机械加工废水的影响可能来自南部湖区附近的工业园区，该区域存在一家大型钢铁厂及大量小型机械加工厂。机械加工废水的季节影响主要集中在丰水期，可能由于政策影响，高污染高能耗的制造加工业会在冬季停产以减少雾霾的产生。电镀与机械加工行业影响区域存在重叠，即由湖区南北岸河流输入。通过本发明提供的湖泊污染来源解析方法，可知该湖区水质主要受西部、东北部的市政污水影响和南部工业园区的机械加工及电镀企业影响。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (10)

1.一种利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，在待解析湖泊水体设定各个采样位点，并根据湖泊水体区域周边环境确定各种潜在污染源；
步骤2，对各个采样位点所获湖水水样和各个潜在污染源所获污染水样中的微生物样本进行高通量测序，再对高通测序结果经过质控，再进行微生物种群多样性分析；
步骤3，再对各个湖水水样以及潜在污染源水样的微生物种群多样性进行差异分析，从而筛选出各类型水样的生物标记；
步骤4，根据生物标记利用统计学分析进行污染影响程度量化，并通过污染分布来解析污染来源。
2.根据权利要求1所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，步骤1中，在根据湖泊水体周边环境确定各种潜在污染源时：若湖泊水体周边环境中存在工业园区，则将园区内的主要工业类型作为潜在污染源；若湖泊水体周边环境中存在人口密集居住区，则将市政污水和畜禽养殖废水作为潜在污染源。
3.根据权利要求1所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，步骤2中，在提取水样中微生物样本时，利用0.22μm微孔滤膜抽滤湖水水样以及污染源水样，微生物样本即附着在微孔滤膜表面。
4.根据权利要求3所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，步骤2中，在进行高通量测序时，对微生物样本的16s rDNA的V4区进行高通量测序，测序结果经过质控后进行微生物种群多样性分析。
5.根据权利要求4所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，步骤2中，在进行微生物种群多样性分析时，通过将测序结果按照97％相似度进行聚类得到分类单元丰度表，对于分类单元丰度表中相对丰度大于0.1％的分类单元对比RDP和NCBI数据库进行注释得到生物学分类信息表。
6.根据权利要求5所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，步骤3中，在进行差异分析时，基于分类单元丰度表中的分类单元相对丰度和生物学分类信息表中的物种分类信息，利用线性判别效应大小分析进行差异分析以筛选潜在生物标记。
7.根据权利要求6所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，步骤3中，在利用线性判别效应大小分析进行差异分析时，设置分析参数为：LDAScore大于4.4，Kruskal-Wallis秩和检验的统计学意义小于0.05。
8.根据权利要求6所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，步骤3中，在筛选潜在生物标记时，利用PCA分析计算因子载荷，将相同来源且在同一组分因子载荷>0.6的进化分支作为该源的生物标记。
9.根据权利要求1所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，步骤4中，利用统计学分析进行污染影响程度量化时，是基于生物标记在分类单元丰度表中的相对丰度利用PCA分析计算因子得分。
10.根据权利要求1所述的利用微生物生物标记的湖泊水体污染来源解析方法，其特征在于，步骤4中，在通过污染分布来解析污染来源时，通过ArcGIS软件中的反距离权重插值分析法进行各污染源生物标记因子得分的可视化分析得到污染分布。
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