CN111154887A - 一种山羊毛色相关的分子标记方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种山羊毛色相关的分子标记方法及其应用，涉及分子生物学技术领域，(1)以待测山羊的MC1R基因组作为模板，用引物：F:CATGGTGTCCAGCCTCTG，R:TCACCAGGAGCACTGCAG，对其进行PCR扩增，得到PCR产物；(2)将步骤(1)得到的PCR产物进行电泳回收、测序，利用PCR‑SSCP方法检测MC1R基因多态性，依据带型，为AA、AG、GG，所述AA为野生纯合型，所述AG为杂合型，所述GG为突变纯合型；(3)携带纯合GG基因型的山羊毛色为白色的概率为84.15％，且在内蒙古白绒山羊中仅检测到纯合GG基因型；携带等位基因A的个体全部为黑色或青色，且A对G为显性基因；分子标记的位点是MC1R基因g.436bp。本发明提供的山羊毛色相关的分子标记可以用于山羊育种中，选择毛色，推动山羊育种发展。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体是一种山羊毛色相关的分子标记方法及其应用。
背景技术
随着人民生活水平的不断提高，羊毛产品越来越受到大家的喜爱，羊毛因其优质的毛纤维及其色彩多样的天然毛色越来越受到重视。直接利用天然色，可免去深加工中漂白染色的程序，节约成本，亦可减少对环境的污染。羊毛毛色形成过程复杂，但主要受控于遗传因素。基因主要通过调控黑色素细胞的生成和分布来影响被毛颜色。掌握毛色遗传规律，发掘控制毛色相关基因，科学育种，将有利于提高毛产量。另外，羊毛毛色在畜牧业中是识别动物品种和个体的重要依据和主要标志，是生产性能测定等工作中不可缺少的内容之一。同样，不同毛色山羊的经济价值也不尽相同。所以对山羊毛色相关基因的筛选意义重大。
哺乳动物毛色的颜色是由色素颗粒控制的，色素颗粒沉积的多少决定了动物的毛色,而控制色素沉着的是相应的酶蛋白，这些蛋白质由不同的色素沉着基因编码。这些基因在不同的时期起着不同的作用，从多方面调节动物毛色使动物毛色表现出种属的差异，并代表其不同的生产性能。代群体遗传学对毛色遗传的研究表明，所有动物的毛色遗传取决于色原体基因和着色基因(即控制氧化酶的基因)。色原体基因决定颜色，着色基因决定颜色的深浅度，任何个体毛色的表现都是这两种基因共同作用的结果。同时具有特定的遗传特征与形成的某一表型之间的关系是非常复杂的，会受到许多因素包括参与基因表达的发育性的、环境性的、随机性的和外成性事件的影响。
MC1R基因，即黑素皮质素受体1(melanocortin1 re-ceptor)基因，又称促黑素细胞激素受体(m elanocytestim-ulatinghorm onereceptor，MSHR)基因，在小鼠的研究中发现，MC1R 基因第549个核苷酸位置的一个移码突变，导致隐性黄鼠出现，第206个核苷酸位置的一个点突变，导致烟色鼠的出现。在对马的研究中也发现，MC1R基因的一个错义突变，使第83 位的核苷酸由丝氨酸变为苯丙氨酸，从而使马表现栗色毛性状。2000年，W anger等又发现马存在一个新的MC1R基因多态位点，使第84个核苷酸位置由天冬氨酸突变为天冬酰胺。在其他物种，如狐狸、猪、狗和兔等中，也发现MC1R基因突变会引起相应的毛色变异。但目前尚未深入探讨山羊该基因与毛色形成的关系。
发明内容
本发明提供一种山羊毛色相关的分子标记方法及其应用，解决了现有技术中山羊育种不能有效选择毛色的技术问题。
本发明是这样实现的：包括以下步骤：
(1)以待测山羊的MC1R基因组作为模板，用引物对其进行PCR扩增，得到PCR产物，所述引物序列为序列F:CATGGTGTCCAGCCTCTG，R:TCACCAGGAGCACTGCAG；
(2)将步骤(1)得到的PCR产物进行电泳回收、测序，利用PCR-SSCP方法检测MC1R基因多态性，依据带型，为AA、AG、GG，所述AA为野生纯合型为纯黑色，所述AG为杂合型灰色或青色，所述GG为突变纯合型为白色；
作为一种优选的实施方案，分子标记的位点是MC1R基因g.436bp。
一种利用分子标记辅助选育特定毛色山羊的育种方法，(1)以待测山羊的MC1R基因组作为模板，用引物对其进行PCR扩增，得到PCR产物，所述引物序列为 F:CATGGTGTCCAGCCTCTG，R:TCACCAGGAGCACTGCAG；
(2)将步骤(1)得到的PCR产物进行电泳回收、测序，利用PCR-SSCP方法检测MC1R基因多态性；
(3)选用对山羊MC1R基因g.436bp的突变作为分子标记进行毛色选择，对山羊白色进行选择，选留携带纯合GG基因型的个体。
一种用于检测山羊毛色的试剂盒，试剂盒包含试剂盒包含引物序列 F:CATGGTGTCCAGCCTCTG，R:TCACCAGGAGCACTGCAG。
本发明的有益效果：发现山羊MC1R基因的多态位点，利用多态位点在山羊毛色选育中选择山羊毛色，对山羊白色进行选择，选留携带纯合GG基因型的个体，对山羊黑色或青色进行选择，选留携带A基因型的个体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中山羊MC1R基因引物的PCR扩增结果；
图2是实施例1中三只羊的MC1R基因的测序峰图比对图；
图3是MC1R基因的PCR-SSCP分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种山羊毛色相关的分子标记方法，包括以下步骤：
(1)以待测山羊的MC1R基因组作为模板，用由序列表中的序列1和序列2所示的引物对其进行PCR扩增，得到PCR产物；
(2)将步骤(1)得到的PCR产物进行电泳回收、测序，利用PCR-SSCP方法检测MC1R基因多态性，依据带型，为AA、AG、GG，所述AA为野生纯合型为黑色，所述AG为杂合型为灰色或青色，所述GG为突变纯合型为白色。
PCR扩增程序：94℃预变性4min，32个循环(94℃变性30sec，退火30sec，72℃延伸30sec)，最后72℃延伸7min，然后4℃保存。制备2％的琼脂糖凝胶，取PCR产物5μl上样。150V、100mA电泳35min。电泳结束，取出凝胶利用凝胶成像系统拍照，保存图片。PCR产物送公司测序。
实验例
采集黑色、白色、青涩3种不同被毛颜色的山羊耳组织样，其中黑色被毛羊选牙山黑绒山羊(Capra hircus)58只，白色被毛羊选内蒙古白绒山羊(Capra hircus)69只，青色被毛羊选济宁青山羊(Capra hircus)75只，利用酚-氯仿法提取组织DNA,经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测的合格样品放于-20℃保存备用。
材料：蛋白酶K、无水乙醇、Tris-饱和酚、氯仿、常规PCR试剂(Ta KaRa),琼脂糖、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺(Sigma公司),DL 100bp Marker(天根Code:DM109),变性加样缓冲液，变性加样缓冲液为甲酰胺98％、10mmol/L EDTA(p H值8.0)、0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青、琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根Code:DP209)。
引物设计：根据Gen Bank数据库中山羊MC1R基因(Genbank登录号:KT247426.1)设计引物，参见表1，引物由青岛擎科生物有限公司合成。PCR引物扩增的产物大小及退火温度，参见表1。
表1 PCR引物及扩增退火温度
根据引物合成单上下游引物给出的退火温度，通过梯度PCR找出合适的退火温度，由表 1可见，选择最佳退火温度为56℃，PCR扩增的产物为574bp。各对引物的筛选与设计部分所示。PCR反应体系见表2。
表2 PCR反应体系
PCR扩增程序：94℃预变性4min，32个循环(94℃变性30sec，退火30sec，72℃延伸30sec)，最后72℃延伸7min，然后4℃保存。制备2％的琼脂糖凝胶，取PCR产物5μl上样。150V、100mA电泳35min。电泳结束，取出凝胶利用凝胶成像系统拍照，保存图片。PCR产物送公司测序。
牙山黑绒山羊的MC1R基因扩增产物为序列表中的序列1；
内蒙古白绒山羊的MC1R基因扩增产物为序列表中的序列2；
济宁青山羊的MC1R基因扩增产物为序列表中的序列3。
利用PCR-SSCP方法检测MC1R基因多态性。将PCR扩增产物变性，上样于12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳槽置于4℃，先300V电泳20min，再200V电泳12h后，显色后观察分析基因型条带。
数据分析：根据聚丙烯酰胺凝胶电泳图,统计各位点的基因型个体数量,计算基因型频率及等位基因频率,卡方检验分析不同毛色的牙山黑绒山羊、内蒙古白绒山羊、济宁青山羊基因型频率的分布是否存在显著差异。
结果与分析
(1)MC1R基因的PCR扩增结果
依据本研究设计的1对引物对牙山黑绒山羊、内蒙古白绒山羊、济宁青山羊基因组进行扩增,经2％琼脂糖凝胶电泳检测,扩增效果良好,扩增大小与预期一致，扩增结果参见附图 1。
(2)序列分析
将牙山黑绒山羊、内蒙古白绒山羊、济宁青山羊MC1R不同基因型的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收,采用PCR后TA克隆测序，测序比较见图2,发现这3种不同毛色山羊MC1R基因CDs的g.436bp位置(本实验扩增片段的g.56bp)存在碱基突变A→G,导致原有氨基酸异亮氨酸变为缬氨酸。测序基因序列见基因序列表。
(3)MC1R基因的PCR-SSCP多态性检测结果
利用PCR-SSCP方法检测MC1R基因多态性。从图3可以看出,MC1R产物存在多态性,依据带型确定基因型,将其分别命名为AA、AG、GG。
进行基因型频率与基因频率统计学分析，MC1R基因多态性位点各基因型频率和基因频率的检测结果见表3。
表3 MC1R片段基因型频率和基因频率
由表3可以看出，牙山黑绒山羊、内蒙古白绒山羊、济宁青山羊的MC1R基因片段产生三种基因型:AA野生纯合型、AG杂合型、GG突变纯合型，其中，在内蒙古白绒山羊中只存在GG突变纯合型；AG杂合型在牙山黑绒山羊中是优势基因型。内蒙古白绒山羊G的基因频率是1，为优势等位基因，牙山黑绒山羊和济宁青山羊不存在优势等位基因。统计分析后发现该突变位点与山羊毛色极显著相关(P<0.01)。出现对纯合GG基因型的山羊有82只，其中内蒙古白绒山羊有69只，所占比例为84.15％，可见对纯合GG基因型主要为白色，比例约为84.15％，其中内蒙古白绒山羊仅携带纯合GG基因；出现AA基因型多为黑色，出现 GA基因型多为灰色或青色，携带等位基因A的个体全部为黑色或者青色，可见A对G为显性基因。可将本实施例所述分子标记用于山羊育种中的毛色选择，作为辅助选择毛色的方式，尤其是选育白色山羊时，选留携带纯合GG基因型的个体。
本发明的有益效果：发现山羊MC1R基因的多态位点，利用多态位点在山羊毛色选育中选择山羊毛色，对山羊白色进行选择，选留携带纯合GG基因型的个体，对山羊黑色或青色进行选择，选留携带A基因型的个体。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种山羊毛色相关的分子标记及其应用
<130> 1017
<141> 2018-11-08
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 573
<212> DNA
<213> 牙山黑绒山羊(Capra hircus)
<400> 1
catggtgtcc agcctctgct tcctgggtgc catcgctgtg gaccgctaca tctccatctt 60
ctacgccctg cggtaccaca gtgtcgtgac actgccccgc gcgtggagga tcattgcagc 120
cattgggtgg ccagcatcct caccagcgtg ctctccatca cctactacaa ccacacggtc 180
gtcctgctgt gcctcgttgg cttcttcata gccatgctgg ccctgatggc cgtcctctat 240
gtccacatgc tggcccgggc ctgccagcat gcccggggca tcgcccggct ccagaagagg 300
cagcgcccca ttcatcaggg ctttggcctc aagggcgctg ccaccctcac catcctgctg 360
ggcgtcgtct tcctctgctg gggccccttc tttctgcacc tctcgctcat cgtcctctgc 420
ccccagcacc ccacctgtgg ctgcatcttc aagaacttca acctcttcct ggccctcatc 480
atttgcaacg ccattgtgga ccccctcatc tatgccttcc gcagccagga gctccggaag 540
acgctccaag aggtgctgca gtgctcctgg tga 573
<210> 2
<211> 573
<212> DNA
<213> 内蒙古白绒山羊(Capra hircus)
<400> 2
catggtgtcc agcctctgct tcctgggtgc catcgctgtg gaccgctaca tctccgtctt 60
ctacgccctg cggtaccaca gtgtcgtgac actgccccgc gcgtggagga tcattgcagc 120
cattgggtgg ccagcatcct caccagcgtg ctctccatca cctactacaa ccacacggtc 180
gtcctgctgt gcctcgttgg cttcttcata gccatgctgg ccctgatggc cgtcctctat 240
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cagcgcccca ttcatcaggg ctttggcctc aagggcgctg ccaccctcac catcctgctg 360
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 济宁青山羊(Capra hircus)
<400> 3
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gtcctgctgt gcctcgttgg cttcttcata gccatgctgg ccctgatggc cgtcctctat 240
gtccacatgc tggcccgggc ctgccagcat gcccggggca tcgcccggct ccagaagagg 300
cagcgcccca ttcatcaggg ctttggcctc aagggcgctg ccaccctcac catcctgctg 360
ggcgtcgtct tcctctgctg gggccccttc tttctgcacc tctcgctcat cgtcctctgc 420
ccccagcacc ccacctgtgg ctgcatcttc aagaacttca acctcttcct ggccctcatc 480
atttgcaacg ccattgtgga ccccctcatc tatgccttcc gcagccagga gctccggaag 540
acgctccaag aggtgctgca gtgctcctgg tga 573
Claims (4)
1.一种山羊毛色相关的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测山羊的MC1R基因组作为模板，用引物对其进行PCR扩增，得到PCR产物，所述引物序列为F:CATGGTGTCCAGCCTCTG，R:TCACCAGGAGCACTGCAG；
(2)将步骤(1)得到的PCR产物进行电泳回收、测序，利用PCR-SSCP方法检测MC1R基因多态性，依据带型判别，共显示三种不同类型的条带，为AA、AG、GG，所述AA为野生纯合型为纯黑色，所述AG为杂合型灰色或青色，所述GG为突变纯合型为白色。
2.根据权利要求1所述的一种山羊毛色相关的分子标记方法，其特征在于，分子标记的位点是MC1R基因g.436bp。
3.一种利用分子标记辅助选育特定毛色山羊的育种方法，其特征在于，
(1)以待测山羊的MC1R基因组作为模板，用引物对其进行PCR扩增，得到PCR产物，所述引物序列为F:CATGGTGTCCAGCCTCTG，R:TCACCAGGAGCACTGCAG；
(2)将步骤(1)得到的PCR产物进行电泳回收、测序，利用PCR-SSCP方法检测MC1R基因多态性；
(3)选用对山羊MC1R基因g.436bp的突变作为分子标记进行毛色选择，对山羊白色进行选择，选留携带纯合GG基因型的个体。
4.一种用于检测山羊毛色的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含引物序列F:CATGGTGTCCAGCCTCTG，R:TCACCAGGAGCACTGCAG。
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