CN111153946A - N-叠氮基乙酰-d-甘露糖胺衍生物及其制备方法和在检测硝基还原酶中的应用 - Google Patents

N-叠氮基乙酰-d-甘露糖胺衍生物及其制备方法和在检测硝基还原酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种N‑叠氮乙酰‑D‑甘露糖胺衍生物及其制备方法和应用。所述化合物的结构如通式(I)所示，其中，R1选自为O、S、NH、NMe、‑CH＝CH‑；R3选自为O、S、NH、NMe；R2选自为H、F、Cl、Br、I、‑OH、‑NH2、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基、‑CO‑C1‑6烷基、‑CO‑NH‑C1‑6烷基、‑COOC1‑6烷基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基；m选自为1‑4的整数；A选自式(I)所述化合物与硝基还原酶发生催化还原反应之后可自行消除或裂解的基团；
Figure DDA0001859092720000012
表示a键或e键。本发明还提供式(I)所示化合物的制备方法和在检测硝基还原酶中的应用。
Figure DDA0001859092720000011

Description

N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物及其制备方法和在检测硝 基还原酶中的应用
技术领域
本发明涉及N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物及其制备方法和应用，尤其涉及N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物在检测硝基还原酶(NTR)中的应用。
背景技术
真核细胞中，多糖参与着细胞膜的构建，在细胞的信息交流、相互作用等方面具有重要作用。然而细胞中的多糖分子结构各异，人们对其进行标记和功能研究存在一定的困难。化学修饰的一些非天然糖类可以通过细胞的糖代谢过程在细胞膜上表达出多糖，从而为多糖功能的研究提供新的方法。无需亚铜离子等催化剂催化的生物正交点击反应因具有特异性高、反应速度快、生物相容性好等优点正成为一种安全有效的细胞标记和检测的方法，在癌细胞的标记和纳米粒子的体内靶向给药等方面具有潜在的应用，受到人们的日益关注。
然而，无需催化剂催化的生物正交点击反应对细胞功能的影响及其对疾病的治疗效力还有待进一步的研究，且基于糖代谢过程以及生物正交点击反应来检测生物体内化合物的工作还很少被报道，因此对生物正交点击反应和糖代谢过程的研究对多糖的检测和标记、癌细胞的识别与治疗、药物释放、生物分子的检测等具有重要的意义。硝基还原酶可以将多种外源硝基芳香族化合物中的硝基还原为羟胺或氨基，这种还原过程已被广泛地应用于药物的激活和硝基芳香族化合物的生物降解中，也是实现药物生物治疗和体内降解代谢的关键步骤。因此，发展检测硝基还原酶的光学探针，将有助于进一步研究其生物功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物。
本发明的另一目的在于提供上述N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物的制备方法。
本发明的又一目的在于提供上述N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物在检测硝基还原酶中的应用。
本发明通过如下技术方案实现：
下式(I)所示的N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物：
Figure BDA0001859092700000021
其中，R1选自为O、S、NH、NMe、-CH＝CH-；R3选自为O、S、NH、NMe；
R2选自为H、F、Cl、Br、I、-OH、-NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-CO-C1-6烷基、-CO-NH-C1-6烷基、-COOC1-6烷基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基；m选自为1-4的整数；A选自式(I)所述化合物与硝基还原酶发生催化还原反应之后可自行消除或裂解的基团；
Figure BDA0001859092700000022
表示a键(直立键)或e键(平伏键)。
优选的，所述R1选自为O、S、NH、-CH＝CH-。
优选的，所述R2选自为H、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2、C1-3烷基或C1-3烷氧基；
优选的，R3选自为O或NH。
优选的，m选自为1或2。
优选的，A为式(I)所述化合物与硝基还原酶发生催化还原反应之后可自行消除或裂解的基团，例如选自包括但不限于如下基团：
Figure BDA0001859092700000023
Figure BDA0001859092700000031
Figure BDA0001859092700000032
等；
其中，X0独立选自于O，S，NH，NMe，-CO-，-CONH-，
Figure BDA0001859092700000033
Figure BDA0001859092700000034
X1，X2，X3，X4分别选自CH，N；Y和Z分别选自CH2，O，NH，NMe，S；
在式(I)化合物中，上述基团A中的X0与亚甲基相连，另一端与氧相连。
n独立地选自为0-4的整数。
R4-R8彼此独立地选自于H、F、Cl、Br、I、-OH、-NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-CO-C1-6烷基、-CO-NH-C1-6烷基、-COOC1-6烷基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基；所述C1-6烷基、C1-6烷氧基、-CO-C1-6烷基、-CO-NH-C1-6烷基、-COOC1-6烷基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基任选被一个或多个卤素取代。
作为实例，所述式(I)所示的N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物选自包括但不限于如下化合物：
Figure BDA0001859092700000041
本发明还提供上述式(I)所示的N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物的制备方法，包括如下步骤：
Figure BDA0001859092700000042
其中，L选自离去基团，例如为卤素、羟基或巯基；R1、R2、R3、m、A、
Figure BDA0001859092700000043
如上面所定义；
将化合物(II)与化合物(III)进行反应，得到式(I)所示的N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物。
根据本发明，
化合物(II)与化合物(III)的摩尔比为1:(1～6)，例如为1:(2～5)。
所述反应优选在缚酸剂的存在下进行；所述缚酸剂选自有机碱，例如三乙胺、N，N-二异丙基乙胺或其混合物。
所述反应在溶剂环境下进行，所述溶剂优选为二氯甲烷和四氢呋喃构成的混合溶剂。
根据本发明，所述制备方法还包括使用硅胶柱层析法对得到的式(I)所示的N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物进行分离提纯。
根据本发明，所述化合物(II)可参考文献中记载的方法进行制备，化合物(III)为市售试剂。
根据本发明，所述化合物(II)可通过如下方法制备，包括：
Figure BDA0001859092700000051
其中，R3、n2如上面所定义；
将化合物(IV)与四丁基氟化铵反应，得到化合物(II)。
根据本发明，
所述反应在溶剂环境下进行，所述溶剂优选为四氢呋喃。
化合物(IV)与四丁基氟化铵的摩尔比为1:(0.5～6)，例如为1:(1～3)。
根据本发明，式(I)化合物可以与带炔基的近红外荧光染料特别是既具有二苯基环辛炔结构又具有近红外荧光发光性质的染料结构，例如花菁素Cy5.5二苯基环辛炔(DBCO-Cy5.5)，发生不需要催化剂催化的点击反应。反应之后，来自式(I)化合物部分的硝基可以通过光致诱导电子转移过程使来自DBCO-Cy5.5部分的荧光发生淬灭。
本发明还提供式(I)所示的N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物用于检测硝基还原酶的用途。
作为实例，所述硝基还原酶选自A549细胞在缺氧状态下表达的硝基还原酶。
根据本发明，所述检测可以在体外进行，也可以用于检测细胞中的硝基还原酶。
根据本发明，所述检测在带炔基的近红外荧光染料特别是既具有二苯基环辛炔结构又具有近红外发光性质的染料结构，例如花菁素Cy5.5二苯基环辛炔(DBCO-Cy5.5)的存在下进行。
优选地，在检测硝基还原酶时，需要在酯酶抑制剂的存在下进行。
本发明式(I)化合物检测细胞中硝基还原酶的原理为：用式(I)化合物培养细胞，当式(I)化合物进入到细胞中后，它会被细胞中过量表达的硝基还原酶还原，生成式(II)化合物。式(II)化合物可以直接参与细胞的糖代谢过程，在细胞膜上生成带有叠氮基团的多糖。再向培养基中加入既具有二苯基环辛炔结构又具有近红外发光性质的荧光染料，例如花菁素Cy5.5二苯基环辛炔(DBCO-Cy5.5)，多糖与带炔基的近红外荧光染料例如DBCO-Cy5.5发生不需要催化剂催化的点击反应，于是将细胞膜上表达的多糖进行了近红外荧光标记，同时完成了对细胞内硝基还原酶的检测。
本发明式(I)化合物用于体外检测的原理为：式(I)化合物与既具有二苯基环辛炔结构又具有近红外发光性质的荧光染料例如花菁素Cy5.5二苯基环辛炔(DBCO-Cy5.5)发生点击反应，该反应得到的产物中，硝基的存在形成光致诱导电子转移过程，使得染料部分的荧光发生淬灭。上述产物能与硝基还原酶发生反应，硝基被还原为氨基，然后经过一系列的断裂过程发生离去，光致诱导电子转移过程消失，染料部分的荧光得以恢复。利用上述产物与酯酶反应前后体系荧光强度的变化，可以在体外进行硝基还原酶的检测。
有益效果
1)本发明所述式(I)化合物可与既具有二苯基环辛炔结构又具有近红外发光性质的荧光染料(如DBCO-Cy5.5)发生不需要催化剂催化的点击反应，并通过光致诱导电子转移过程使得染料部分的荧光发生淬灭。本发明所述式(I)化合物与DBCO-Cy5.5的反应产物可以与硝基还原酶反应，光致诱导电子转移过程消失，染料部分的荧光得以恢复。
2)本发明所述式(I)化合物可以与硝基还原酶发生还原反应。
3)本发明所述式(I)化合物可用于检测细胞在缺氧状态下过量表达的硝基还原酶。
4)本发明所述式(I)化合物被细胞内的硝基还原酶还原之后，生成可以直接参与细胞糖代谢过程的产物式(II)化合物，式(II)化合物经过一系列的糖代谢过程，最终在细胞膜表面表达出带有叠氮基团的多糖，该多糖可以与加入到细胞培养基中的既具有二苯基环辛炔结构又具有近红外发光性质的荧光染料(如DBCO-Cy5.5)发生不需要催化剂催化的点击反应，因此在细胞膜上表达的多糖就被标记上了近红外荧光，同时实现了检测细胞内硝基还原酶的目的。
术语定义和说明：
除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本申请主题作任何限制。在本申请中，除非另有说明，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。
术语“烷基”指具有1-6个，优选1-3个碳原子的直链或支链烷基，所述烷基例如为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基。
术语“芳基”应理解为优选表示具有6～20个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，优选“C6-14芳基”。术语“C6-14芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环(“C6-14芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“C6芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“C9芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“C10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环(“C13芳基”)，例如芴基，或者是具有14个碳原子的环(“C14芳基”)，例如蒽基。
术语“杂芳基”应理解为含有5-20个环原子、5-14个环原子，或5-12个环原子，或5-10个环原子，或5-6个环原子的单环、双环和三环体系，其中至少一个环体系是芳香族的，且至少一个环体系包含一个或多个杂原子(例如N、O、S、Se等)，其中每一个环体系包含5-7个原子组成的环，且有一个或多个连接点与分子其余部分相连。所述杂芳基基团任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。在一些实施方案中，5-10个原子组成的杂芳基包含1,2,3或4个独立选自O、S、Se和N的杂原子。在另一些实施方案中，5-6个原子组成的杂芳基包含1,2,3或4个独立选自O、S、Se和N的杂原子。
杂芳基基团的单环实例包括，但并不限于，噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻-4H-吡唑基等以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基等；或吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基等以及它们的苯并衍生物；或噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基等。
术语“杂环基”意指单环，双环或三环体系，其中环上一个或多个原子独立任选地被杂原子所取代，环可以是完全饱和的或包含一个或多个不饱和度，但不是芳香族类，有一个或多个连接点连接到其他分子上去。一个或多个环上的氢原子可以独立地未被取代或被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。其中一些实施例是，“杂环基”是3-7个原子组成的单环、或7-10个原子组成的的双环，其包含1-5个，优选1-3个选自N、O、S和Se的杂原子。特别地，所述杂环基可以包括但不限于：4元环，如氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基；5元环，如四氢呋喃基、二氧杂环戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基；或6元环，如四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哌嗪基或三噻烷基；或7元环，如二氮杂环庚烷基。任选地，所述杂环基可以是苯并稠合的。所述杂环基可以是双环的，例如但不限于5,5元环，如六氢环戊并[c]吡咯-2(1H)-基环，或者5,6元双环，如六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基环。含氮原子的环可以是部分不饱和的，即它可以包含一个或多个双键，例如但不限于2,5-二氢-1H-吡咯基、4H-[1,3,4]噻二嗪基、4,5-二氢噁唑基或4H-[1,4]噻嗪基，或者，它可以是苯并稠合的，例如但不限于二氢异喹啉基、1,3-苯并噁唑基、1,3-苯并二氧杂环戊烯基。
除非另有说明，杂环基、杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如其位置异构体。因此，对于一些说明性的非限制性实例，吡啶基或亚吡啶基包括吡啶-2-基、亚吡啶-2-基、吡啶-3-基、亚吡啶-3-基、吡啶-4-基和亚吡啶-4-基；噻吩基或亚噻吩基包括噻吩-2-基、亚噻吩-2-基、噻吩-3-基和亚噻吩-3-基。
附图说明
图1为近红外荧光染料DBCO-Cy5.5与实施例1中制备的化合物(1)反应前后的荧光光谱图。
图2为实施例1中制备的化合物(1)用于检测A549细胞在缺氧状态下表达的硝基还原酶。
图3为本申请式(I)化合物检测细胞中硝基还原酶的反应机理图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
制备例1
制备化合物(II-1)
Figure BDA0001859092700000091
在冰水浴下，将化合物(IV-1)(0.75g,1.5mM)溶于无水四氢呋喃中，再加入1M的四丁基氟化铵(1.5eq.,2.25mM)的四氢呋喃溶液，然后在室温下搅拌反应3小时。待反应完成之后，用10mL氯化铵的饱和水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，收集有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂。粗产物用硅胶柱层析法纯化，淋洗剂为石油醚/乙酸乙酯(v/v＝1:2-1:3)，得到白色固体(541mg，93％)。
实施例1
制备化合物(1)
Figure BDA0001859092700000092
在冰水浴和氩气保护下，将式(II-1)化合物(388mg，1mM)溶于15mL干燥的四氢呋喃/二氯甲烷(THF/DCM，1:1v/v)的混合溶液中，再加入三乙胺(0.809g，8mM)和N,N-二异丙基乙胺(1.034g，8mM)，反应10分钟后，逐滴加入溶于10mL干燥的THF/DCM(1:1v/v)溶液的4-硝基氯甲酸苄酯(862mg,4mM)。继续在0℃反应1小时，撤去冰水浴，恢复至室温，反应3小时。待反应完成之后，除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析法纯化，淋洗剂为石油醚/乙酸乙酯(v/v＝1:1)，得到白色固体(204mg，36％)。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.261-8.231(d,2H),7.636-7.609(d,2H),5.999(s,1H),5.332-5.092(m,4H),4.729(s,1H),4.361-4.279(m,1H),4.154-4.072(m,2H),3.939(s,2H),2.174-1.909(m,9H).ESI-MS:计算值C22H25N5O13Na+(M+Na)+590.1,实验值590.1.
实施例2
制备化合物(2)
Figure BDA0001859092700000101
在冰水浴和氩气保护下，将式(II-1)化合物(388mg，1mM)溶于15mL干燥的四氢呋喃/二氯甲烷(THF/DCM，1:1v/v)的混合溶液中，再加入三乙胺(0.809g，8mM)和N,N-二异丙基乙胺(1.034g，8mM)，反应10分钟后，逐滴加入溶于10mL干燥的THF/DCM(1:1v/v)溶液的氯甲酸5-硝基呋喃-2-甲酯(820mg,4mM)。继续在0℃反应1小时，撤去冰水浴，恢复至室温，反应3小时。待反应完成之后，除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析法纯化，淋洗剂为石油醚/乙酸乙酯(v/v＝1:1)，得到白色固体(189mg，34％)。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.63(d,1H),7.03(d,1H),5.990(s,1H),5.330-5.094(m,4H),4.730(s,1H),4.355-4.280(m,1H),4.152-4.080(m,2H),3.931(s,2H),2.173-1.913(m,9H).ESI-MS:计算值C20H23N5O14Na+(M+Na)+580.1,实验值580.1.
实施例3
制备化合物(3)
Figure BDA0001859092700000102
在冰水浴和氩气保护下，将式(II-1)化合物(388mg，1mM)溶于15mL干燥的四氢呋喃/二氯甲烷(THF/DCM，1:1v/v)的混合溶液中，再加入三乙胺(0.809g，8mM)和N,N-二异丙基乙胺(1.034g，8mM)，反应10分钟后，逐滴加入溶于10mL干燥的THF/DCM(1:1v/v)溶液的甲基(2-(甲基((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)乙基)氨基甲酰氯)(1.16g,4mM)。继续在0℃反应1小时，撤去冰水浴，恢复至室温，反应3小时。待反应完成之后，除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析法纯化，淋洗剂为石油醚/乙酸乙酯(v/v＝1:1)，得到白色固体(193mg，30％)。1HNMR(300MHz,CD3OD):δ8.30(d,1H),6.95(d,1H),5.986(s,1H),5.328-5.097(m,4H),4.736(s,1H),4.350-4.276(m,1H),4.149-4.083(m,2H),3.929(s,2H),3.30(s,3H),3.10(t,2H),2.49(t,2H),2.23(s,3H),2.171-1.906(m,9H).MALDI-TOF-MS:计算值C24H34N7O12S+(M+H)+644.1,实验值644.1.
实施例4
制备化合物(4)
Figure BDA0001859092700000111
在冰水浴和氩气保护下，将式(II-1)化合物(388mg，1mM)溶于15mL干燥的四氢呋喃/二氯甲烷(THF/DCM，1:1v/v)的混合溶液中，再加入三乙胺(0.809g，8mM)和N,N-二异丙基乙胺(1.034g，8mM)，反应10分钟后，逐滴加入溶于10mL干燥的THF/DCM(1:1v/v)溶液的氯甲酸(7-(对硝基苄基醚)-3-甲)酯(1.56g,4mM)。继续在0℃反应1小时，撤去冰水浴，恢复至室温，反应3小时。待反应完成之后，除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析法纯化，淋洗剂为石油醚/乙酸乙酯(v/v＝1:1)，得到白色固体(215mg，29％)。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.270-8.235(d,2H),7.710-7.601(d,4H),7.042(s,1H),7.008(d,1H),5.985(s,1H),5.334-5.100(m,4H),4.840-4.727(m,3H),4.358-4.274(m,1H),4.159-4.080(m,2H),3.951(s,2H),2.170-1.911(m,9H).MALDI-TOF-MS:计算值C32H31N5O16Na+(M+Na)+764.1,实验值764.1.
实施例5
Figure BDA0001859092700000121
在冰水浴和氩气保护下，将式(II-1)化合物(388mg，1mM)溶于15mL干燥的四氢呋喃/二氯甲烷(THF/DCM，1:1v/v)的混合溶液中，再加入三乙胺(0.809g，8mM)和N,N-二异丙基乙胺(1.034g，8mM)，反应10分钟后，逐滴加入溶于10mL干燥的THF/DCM(1:1v/v)溶液的2-(2-((对硝基苄氧基)甲基)苯基)乙酰氯(1.28g,4mM)。继续在0℃反应1小时，撤去冰水浴，恢复至室温，反应3小时。待反应完成之后，除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析法纯化，淋洗剂为石油醚/乙酸乙酯(v/v＝1:1)，得到白色固体(208mg，31％)。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.280-8.234(d,2H),7.715-7.609(d,4H),7.045(s,1H),7.003(d,1H),5.981(s,1H),5.339-5.090(m,4H),4.851-4.725(m,5H),4.360-4.278(m,1H),4.157-4.091(m,2H),3.956(s,2H),2.173-1.906(m,9H)。MALDI-TOF-MS:计算值C30H33N5O13Na+(M+Na)+694.1,实验值694.1.
实施例6
Figure BDA0001859092700000122
在冰水浴和氩气保护下，将式(II-1)化合物(388mg，1mM)溶于15mL干燥的四氢呋喃/二氯甲烷(THF/DCM，1:1v/v)的混合溶液中，再加入三乙胺(0.809g，8mM)和N,N-二异丙基乙胺(1.034g，8mM)，反应10分钟后，逐滴加入溶于10mL干燥的THF/DCM(1:1v/v)溶液的(2-(2-甲基-6-((4-硝基苯)氧基)苯)丙烷-2-基)氨基甲酰氯(1.45g,4mM)。继续在0℃反应1小时，撤去冰水浴，恢复至室温，反应3小时。待反应完成之后，除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析法纯化，淋洗剂为石油醚/乙酸乙酯(v/v＝1:1)，得到白色固体(200mg，28％)。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.270-8.235(d,2H),8.206(s,1H),7.710-7.601(d,2H),7.042(m,1H),7.008(d,1H),6.825(d,1H),5.985(s,1H),5.334-5.100(m,6H),4.840-4.727(m,1H),4.358-4.274(m,2H),4.159-4.080(m,1H),2.295(s,3H),2.170-1.911(m,9H),1.447(s,6H).MALDI-TOF-MS:计算值C32H38N6O13Na+(M+Na)+737.2,实验值737.2.
实施例7
将实施例1中得到的化合物(1)(10μM)加入到近红外荧光染料DBCO-Cy5.5(10μM)中，分别测量反应前近红外荧光染料DBCO-Cy5.5的荧光强度和反应之后溶液体系的荧光强度。由图1可以看出，当DBCO-Cy5.5与实施例1中得到的化合物(1)反应之后，其荧光强度大大减弱，这是因为在反应产物中，硝基的光诱导电子转移过程使得荧光染料部分的荧光发生了淬灭。
实施例2-6中得到的化合物也具有上述相同的荧光淬灭效果。
实施例8
将实施例1中得到的化合物(1)应用于检测细胞中的硝基还原酶。A549细胞在缺氧条件下可以过量表达硝基还原酶，将A549细胞置于1％的氧气浓度的环境中培养以提高细胞内硝基还原酶的浓度，双香豆素被用作硝基还原酶的抑制剂，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)被用作细胞内酯酶的抑制剂。化合物(1)检测硝基还原酶需要在抑制酯酶活性的条件下进行。
A组细胞先用0.2mM的AEBSF培养细胞24h，再加入25μM的化合物(1)培养24h；B组细胞不加抑制剂(既不加AEBSF也不加双香豆素)，只加入25μM的化合物(1)培养细胞24h；C组细胞加入两种酶的抑制剂(0.2mM的AEBSF和0.1mM的双香豆素)同时培养细胞24h，再加入25μM的化合物(1)培养细胞24h；待化合物(1)培养完成之后，洗去化合物(1)，向三组细胞中加入1μM的DBCO-Cy5.5培养2h。再洗去DBCO-Cy5.5，加入10μg/mL的细胞核染料Hoechst 33342染色20min，最后洗去Hoechst 33342，对细胞进行共聚焦显微镜成像。
图2中每一行从左往右的4个图分别是蓝色荧光通道的图像(即细胞核的成像)、近红外荧光通道的图像(即在细胞膜上表达的被标记上近红外荧光的带有叠氮基团的多糖的成像)、明场图像、蓝色通道和近红外通道的重叠图像。从图中可以看出：第2列中A组图和B组图的细胞膜上近红外荧光强度大，而C组图的细胞膜上近红外荧光强度弱。
从图2第二列的近红外荧光通道的3个图像中可以看出，即便加入AEBSF抑制了细胞内酯酶的活性，A组细胞仍然能够像不加酶抑制剂的B组细胞一样，在细胞膜上表达出多糖，说明化合物(1)进入细胞后虽然无法与酯酶发生反应，但可以与细胞中过量表达的硝基还原酶发生反应。而加入了两种酶的抑制剂的C组细胞，膜上荧光强度大大减弱，这是因为C组细胞内的酯酶和硝基还原酶的活性因加入了酶抑制剂而大大降低，化合物(1)进入到细胞中后，既不会与酯酶发生水解反应也不能与硝基还原酶发生还原反应，不能产生酶解产物化合物(II)，细胞无法进行糖代谢过程在细胞膜表面表达出带有叠氮基团的多糖，这进一步说明了A组细胞的细胞膜上被标记上近红外荧光的带有叠氮基团的多糖是化合物(1)与硝基还原酶发生了还原反应再经过细胞的糖代谢过程最后在细胞膜上表达所产生的，因此我们可以在抑制酯酶活性的条件下检测A549细胞在缺氧条件下过量表达的硝基还原酶，即化合物(1)可用于检测活细胞中的硝基还原酶。
实施例2-6中得到的化合物也具有上述相同的效果。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.下式(I)所示的N-叠氮基乙酰-D-甘露糖胺衍生物：
Figure FDA0001859092690000011
其中，R1选自为O、S、NH、NMe、-CH＝CH-；R3选自为O、S、NH、NMe；
R2选自为H、F、Cl、Br、I、-OH、-NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-CO-C1-6烷基、-CO-NH-C1-6烷基、-COOC1-6烷基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基；m选自为1-4的整数；A选自式(I)所述化合物与硝基还原酶发生催化还原反应之后可自行消除或裂解的基团；
Figure FDA0001859092690000013
表示a键或e键。
2.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，R1选自为O、S、NH、-CH＝CH-；
R2选自为H、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2、C1-3烷基或C1-3烷氧基；
R3选自为O或NH；
m选自为1或2；
A为式(I)所述化合物与硝基还原酶发生催化还原反应之后可自行消除或裂解的基团，所述A选自包括但不限于如下基团：
Figure FDA0001859092690000012
Figure FDA0001859092690000021
其中，X0独立选自于O，S，NH，NMe，-CO-，-CONH-，
Figure FDA0001859092690000022
Figure FDA0001859092690000023
X1，X2，X3，X4分别选自CH，N；Y和Z分别选自CH2，O，NH，NMe，S；
在式(I)化合物中，所述X0与亚甲基相连，另一端与氧相连；
n独立地选自为0-4的整数；
R4-R8彼此独立地选自于H、F、Cl、Br、I、-OH、-NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-CO-C1-6烷基、-CO-NH-C1-6烷基、-COOC1-6烷基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基；所述C1-6烷基、C1-6烷氧基、-CO-C1-6烷基、-CO-NH-C1-6烷基、-COOC1-6烷基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基任选被一个或多个卤素取代。
3.根据权利要求1或2所述的衍生物，其特征在于，所述衍生物选自如下化合物：
Figure FDA0001859092690000031
Figure FDA0001859092690000041
4.根据权利要求1-3任一项所述衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
Figure FDA0001859092690000042
其中，L选自离去基团，例如为卤素，羟基或巯基；R1、R2、R3、m、A具有权利要求1-3任一项所述的定义；将化合物(II)与化合物(III)进行反应，得到式(I)所示的衍生物。
5.根据权利要求4所述衍生物的制备方法，其特征在于，化合物(II)与化合物(III)的摩尔比为1:(1～6)；
优选地，所述反应在缚酸剂的存在下进行，所述缚酸剂选自有机碱。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述化合物(II)通过如下方法制备，包括：
Figure FDA0001859092690000043
其中，R3、n2具有权利要求1-3任一项所述的定义；
将化合物(IV)与四丁基氟化铵反应，得到化合物(II)。
7.权利要求1-3任一项所述衍生物用于检测硝基还原酶的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述检测在带炔基的近红外荧光染料的存在下进行，特别是既具有二苯基环辛炔结构又具有近红外发光性质的染料结构，如花菁素Cy5.5二苯基环辛炔(DBCO-Cy5.5)的存在下进行；
优选地，所述检测在体外进行，或者用于检测细胞中的硝基还原酶。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，在细胞中检测硝基还原酶时，需要在酯酶抑制剂的存在下进行。
10.根据权利要求7-9任一项所述的用途，其特征在于，在细胞中检测硝基还原酶时，所述硝基还原酶选自A549细胞在缺氧状态下表达的硝基还原酶。
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