CN111153846A - 吡咯类化合物、其制备方法和药物组合物与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有式(I)结构特征的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐、其制备方法、以及它们作为吲哚胺2,3‑双加氧酶1(IDO1)抑制剂的用途。实验结果表明，本发明的化合物对IDO1的活性具有显著抑制作用，能够有效地促进T淋巴细胞增殖，抑制初始T淋巴细胞分化为调节性T细胞，逆转IDO1介导的免疫抑制作用，可以用于治疗具有IDO1介导的犬尿氨酸代谢途径的病理学特征的相关疾病，包括癌症、病毒感染、神经变性疾病、白内障、器官移植排斥、抑郁症和自身免疫性疾病等。

Description

吡咯类化合物、其制备方法和药物组合物与用途
技术领域
本发明属于新化合物领域，具体涉及一类作为吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)抑制剂的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐，它们的制备方法、含有这些化合物的药物组合物、以及这些化合物或组合物在治疗与IDO1介导的免疫抑制的相关疾病如癌症、病毒感染、神经变性疾病、白内障、器官移植排斥、抑郁症或自身免疫性疾病方面的用途。
背景技术
色氨酸是一种人体内细胞维持增殖和存活所必需的氨基酸，可用于蛋白质、烟酸和5-羟色胺的生物合成。色氨酸通常从食物中摄取，超过95％的色氨酸通过犬尿氨酸途径代谢，剩余在神经系统和肠道中转化为5-羟色氨酸和5-羟色胺，或在松果体中合成褪黑素。吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO1)是人体肝脏外催化色氨酸的犬尿氨酸代谢途径中的限速酶。IDO1在多种组织(如肺、肾、脑、胎盘、胸腺)以及多种细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)中表达。IDO1通过氧化分解色氨酸以降低机体微环境中色氨酸的浓度，并且产生犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、2-氨基-3-羟基苯甲酸、喹啉酸等一系列代谢产物。细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6可诱导IDO1表达的上调(Bernhardt R.ChemRev,1996,96(1):2841-2888)。
Munn DH等报道了IDO1不仅可以催化色氨酸氧化代谢，而且还对机体的固有免疫和适应性免疫具有重要的调节作用(Munn DH,et al.Trends Immonol,2013,34(3):137-143)。IDO1主要是通过催化色氨酸导致色氨酸耗竭及其代谢产物蓄积来实现其对免疫系统的调控作用：一方面，色氨酸的耗竭可通过激活GCN2通路诱导T细胞分裂周期停滞于G1期，从而抑制T细胞的增殖，同时还抑制初始CD4+T细胞分化为辅助性T细胞17(Th17)，进而产生免疫抑制(Munn DH,et al.Immunity,2005,22(5):633-642)。另一方面，犬尿氨酸等色氨酸代谢产物具有细胞毒性，可以杀灭T细胞和自然杀伤(NK)细胞(Frumento G,et al.J ExpMed,2002,196(4):459-468；Munn DH,et al.J Clin Invest,2004,114(2):280-290)，而且这些代谢产物还可以通过激活芳香烃受体(AHR)来诱导CD4+T细胞分化为调节性T细胞(Treg)，并促进树突状细胞(DC)转化成致耐受性DC(Mezrich JD,et al.J Immunol,2010,185(6):3190-3198；Mezrich JD,et al.J Immunol,2008,181(8):5396-5404)；此外，色氨酸代谢产物可通过下调NK细胞受体的表达来抑制NK细胞的功能，这些都可以进一步抑制机体的免疫反应(Della Chiesa M,et al.Blood,2006,108(13):4118-4125)。
IDO1与很多生理病理过程有关。研究表明，IDO1在宿主免疫防御和母胎免疫耐受等生理过程应激中，细胞因子如IFN-γ分泌显著增加，从而诱导IDO1表达上调，导致色氨酸耗竭和犬尿氨酸等代谢产物聚积，从而抑制母体的T细胞反应，诱导母体免疫耐受，确保胎儿不被母体的免疫系统排斥；宿主微环境中的色氨酸耗竭使其不能为病原微生物复制提供所必需的色氨酸，从而导致病原微生物死亡，与此同时IDO1介导的免疫抑制可以避免机体免疫系统的过度激活(Mellor AL,et al.Nat Rev Immunol,2008,8(1):74-80；Terness P,et al.Am J Reprod Immunol,2007,58(3):238-254；Divanovic S,et al.J Infect Dis,2012,205(1):152-161)。当给妊娠小鼠施用IDO1抑制剂后，会引起T细胞介导的胚胎排斥反应，导致小鼠流产，表明IDO1可以使胎儿免受母体的排斥(Munn DH,et al.Science,1998,281(5380):1191-1193)。IDO1对移植组织在新宿主中的存活也发挥免疫抑制作用(RaduCA,et al.Plast Reconstr Surg,2007,119(7):2023-2028)。这些研究结果说明IDO是一种免疫调节酶，参与机体的免疫耐受。
众多研究表明，IDO1介导的免疫耐受与肿瘤免疫逃逸、病毒感染、神经变性疾病、器官移植排斥、自身免疫性疾病、神经精神疾病和白内障等疾病的密切相关(Munn DH,etal.Trends Immonol,2013,34(3):137-143；Nguyen NT,et al.Front Immunol,2014,5:551；Myint AM,et al.J Affect Discord,2007,98(1-2):143-151；Mailankot M,etal.Lab Invest,2009,89(5):498-512)。在这些疾病中，过度表达的IDO1所介导的色氨酸耗竭及其代谢产物的聚积可以抑制T细胞的激活，导致机体的免疫耐受。
在病毒感染的小鼠模型中，给与IDO1抑制剂可明显促进CD8+T细胞的增殖，恢复T细胞的免疫应答，抑制病毒感染宿主的单核巨噬细胞。在流感病毒感染时，过度表达的IDO1介导的免疫抑制作用易导致肺部发生二次感染(Van Der Sluijs KF,et al.J InfectDis,2006,193(2):214-222)。在HIV感染时，IDO1会被上调表达，促进Treg细胞的增殖，而抑制Th17细胞的增殖，造成Tregs/Th17细胞比例失调，导致患者的免疫抑制(Favre D,etal.Sci Transl Med,2010,2(32):32-36)。此外，IDO1介导的色氨酸耗竭及其代谢产物浓度升高还与寄生虫感染有关(Knubel CP,et al.FASEB J,2010,24(8):2689-2701)。
研究表明，IDO1催化的色氨酸代谢产物如犬尿氨酸和喹啉酸等具有神经毒性，并且这些代谢产物与神经变性疾病如记忆障碍症、阿尔茨海默病(AD)、认知障碍症、老年痴呆症、帕金森病、帕金森综合症和运动障碍性疾病的发生密切相关(Malpass K.Nat RevNeurol,2011,7(8):417；Maddison DC,et al.Semin Cell Dev Biol,2015,40:134-141)。在AD患者大脑中IDO1表达和喹啉酸浓度均高于正常人，其中在老年斑周围的小胶质细胞核星形细胞中含量最高。此外，在AD患者血液中的色氨酸浓度低于正常人，而犬尿氨酸浓度则高于正常人，而且两者的比例高低与患者的认知缺陷程度密切相关(Guillemin GJ,etal.Neuropathol Appl Neurobiol,2005,31(4):395-404；Widner B,et al.Adv Exp MedBiol,1999,467:133-138)。神经精神疾病如抑郁症、精神分裂症、焦虑症也与IDO1过度表达和犬尿氨酸等代谢产物水平升高有关。IDO1的过度表达造成色氨酸耗竭，从而减少用于合成神经递质5-羟色胺的色氨酸的量，导致5-羟色胺缺乏，再加上具有神经毒性的犬尿氨酸和喹啉酸等代谢产物的聚积，共同促进神经精神疾病的发生，而且是多种心境障碍的因素(Myint AM.FEBS J,2012,279(8):1375-1385)。因此，抑制IDO1是神经变性疾病和神经精神疾病患者重要的治疗策略。
IDO1高表达所介导的色氨酸过度表达也存在于各种自身免疫性疾病中(NguyenNT,et al.Front Immunol,2014,5:551)。在类风湿关节炎患者滑膜关节组织的DCs高表达IDO1，患者血清中色氨酸浓度降低，而犬尿氨酸浓度和犬尿氨酸/色氨酸比值均明显升高(Widner B,et al.Immunobiology,2000,201(5):621-630)。因此，抑制IDO1也是自身免疫性患者重要的治疗策略。
大量的研究表明，IDO1诱导的免疫抑制在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。IDO1过度表达于各类肿瘤及其微环境中的细胞如DC细胞和基质细胞，导致肿瘤局部色氨酸耗竭和色氨酸代谢产物聚积，从而诱导肿瘤免疫逃逸，帮助肿瘤细胞逃避机体免疫系统的攻击(MunnDH，et al.Trends Immonol,2016,37(3):193-207)。Uyttenhove小组利用免疫组织化学标记方法在黑色瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、淋巴癌、前列腺癌、肾癌、脑癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮癌、甲状腺瘤、肝癌和食管癌等24种人类肿瘤中检测到了IDO1的表达(Uyttenhove C,et al.Nat Med,2003,9(10):1269-1274)。随后在卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、白血病等肿瘤组织中进一步得到证实，并且发现肿瘤组织内IDO1的表达量与肿瘤的恶性程度关系密切，并且影响肿瘤患者的预后(Théate I,et al.CancerImmunol Res,2015,3(2):161-172；Curti A,et al.Blood,2007,109(7):2871-2877；DeJong RA,et al.Int J Gynecol Cancer,2011,21(7):1320-1327；Okamoto A,et al.ClinCancer Res,2005,11(16):6030-6039；Ino K,et al.Br J Cancer,2006,95(11):1555-1561；Speeckaert R,et al.Eur.J.Cancer,2012,48(13):2004-2011)。IDO1抑制剂可以激活T细胞，克服由IDO1介导的肿瘤免疫逃逸，而且可以提高其他肿瘤治疗剂的疗法(KoblishHK,et al.Mol Cancer Ther,2010,9(2):489-498；Wainwright DA,et al.Clin CancerRes,2014,20(20):5290-5301)。
多项临床前和临床研究表明，IDO1抑制剂可以降低色氨酸代谢和犬尿氨酸等代谢产物的聚积，从而逆转IDO1介导的免疫抑制，恢复T细胞和NK细胞的增殖和功能，抑制Treg细胞的增殖，从而增强机体额免疫应答，因此IDO1抑制剂可用于治疗由IDO1介导的免疫抑制所引起的上述相关疾病，包括癌症、病毒感染、神经变性疾病、白内障、器官移植排斥、抑郁症和自身免疫性疾病。此外，IDO1抑制剂还可以和其他化疗剂、靶向抗肿瘤药物、免疫检查点抑制剂、免疫检查点激动剂、抗肿瘤疫苗、抗病毒剂、抗病毒疫苗、细胞因子疗法、过继性细胞免疫治疗和放射治疗联合作用，起到协同或增强疗法的作用(Vacchelli E,etal.Oncoimmunology,2014,3(10):e957994；Jochems C,et al.Oncotarget,2016,7(25):37762-37772；Liu X,et al.Blood,2010,115(17):3520-3530；Zamarin D,etal.Pharmacol Ther,2015,150:23-32)。
基于IDO1与癌症、病毒感染、神经变性疾病、白内障、器官移植排斥、抑郁症和自身免疫性疾病等多种疾病的发病机制密切相关，因此可以采用IDO1抑制剂来抑制IDO1的活性，从而降低色氨酸代谢以及犬尿氨酸等代谢产物的聚积，恢复机体的免疫功能，进而达到治疗上述疾病的目的。本发明所述的化合物能够显著抑制IDO1的活性，可以用于治疗IDO1介导的免疫抑制所引起的相关疾病，包括癌症、病毒感染、神经变性疾病、白内障、器官移植排斥、抑郁症和自身免疫性疾病。
此外，值得指出的是，自从2018年4月默沙东公司宣布IDO1抑制剂epacadostat联合PD-1单抗pembrolizumab治疗转移性黑色素瘤的Ⅲ期临床试验(ECHO-301)失败之后，临床上侧重开发与不含血红素的IDO1结合的新一代apo-IDO1抑制剂。人们希望通过开发有别于早期发现的第一代IDO1抑制剂(作用于含血红素的IDO1)来获得临床试验的突破。其中以百时美施贵宝公司开发的BMS-986205为代表的apo-IDO1抑制剂，目前已重新启动了多项I-III期临床试验。因此apo-IDO1抑制剂也许是未来IDO1抑制剂研发的主流方向。本发明化合物为apo-IDO1抑制剂，具有良好的开发价值和应用前景。
发明内容
发明目的：
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种具有通式(Ⅰ)结构特征的化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶及其药学上可接受的盐、制备方法、药物组合物及用途。本发明的化合物具有优异的IDO1抑制活性，可以用于治疗和/或预防IDO1介导的免疫抑制所引起的各种相关疾病。
技术方案：
本发明提供了通式(I)结构特征的化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002371712560000051
其中：
R1代表氰基、-CO2R6或-CONR7R8；
R2代表氢、卤素、氰基、羟基或硝基；
R3和R4各自独立地代表氢、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C1-C8烷氨基或R3和R4与跟它们连接的氮原子一起形成5-7元杂环；其中所述的杂环可任选地包含一个或多个选自O、S或N杂原子；其中所述的杂环上可任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基或C3-C6环烷基；
R5代表芳基或芳杂环，其中所述的芳基或芳杂环可任选地被一个或多个R9取代；
R6、R7和R8各自独立地代表氢、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C1-C8烷氨基；
R9代表氢、卤素、氰基、羟基、巯基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷氨基或卤代烷基；
其中所述的烷基代表直链烷基、支链烷基或环状烷基；
其中所述的烷氧基代表直链烷氧基、支链烷氧基或环状烷氧基；
其中所述的烷氨基代表直链烷氨基、支链烷氨基或环状烷氨基；
其中所述的烯基代表直链烯基、支链烯基或环状烯基；
其中所述的炔基代表直链炔基或支链炔基；
其中所述的芳基代表苯基、萘基、苊基或四氢萘基；
其中所述的芳杂环代表吡咯基、吡唑基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基的单环杂环；或喹啉基、喹喔啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、2,3-二氢苯并[1,4]二氧杂环己烯基、或苯并[1,3]二氧杂环戊烯基的双环杂环；
其中所述的卤代烷基为具有1-8个碳原子的直链或支链饱和烃基，或为具有3-8个碳原子的环状饱和烃基，或为连接具有1-8个碳原子的直链或支链饱和烃基的具有3-8个碳原子的环状饱和烃基；其中一个或多个氢原子被一个或多个卤原子取代。
进一步地，具有通式(I)所示的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐，其中：
R1代表氰基、-CO2R6或-CONR7R8；
R2代表氢或卤素；
R3和R4各自独立地代表氢、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C1-C8烷氨基或R3和R4与跟它们连接的氮原子一起形成5-7元杂环；其中所述的杂环可任选地包含一个或多个选自O、S或N杂原子；其中所述的杂环上可任选地被一个或多个以下基团取代：C1-C8烷基或C3-C6环烷基；
R5代表芳基或芳杂环，其中所述的芳基或芳杂环可任选地被一个或多个R9取代；
R6、R7和R8各自独立地代表氢、C1-C8烷基或C3-C8环烷基；
R9代表氢、卤素、氰基、羟基、巯基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷氨基或卤代烷基。
更进一步地，具有通式(I)所示的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐，其中：
R1代表氰基、-CO2R6或-CONR7R8；
R2代表氢或卤素；
R3和R4各自独立地代表氢、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氨基或R3和R4与跟它们连接的氮原子一起形成5-7元杂环；其中所述的杂环可任选地包含一个或多个选自O、S或N杂原子；其中所述的杂环上可任选地被一个或多个甲基取代；
R5代表苯环或异噁唑基，其中所述的苯环可任选地被一个或多个R9取代；
R6、R7和R8各自独立地代表氢、C1-C3烷基或C3-C6环烷基；
R9代表氢、卤素、氰基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基或三氟甲基。
更优选地，具有通式(I)所示的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐，其中：
R1代表COOH；
R2代表氢或卤素；
R3和R4各自独立地代表C1-C4烷基或C3-C6环烷基；
R5代表苯环，所述的苯环可任选地被一个或多个R9取代；
R9代表氢、卤素、氰基、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基。
具体来说，通式(I)所示的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐，所述化合物优选自：
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(1)，
Figure BDA0002371712560000071
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(2)，
Figure BDA0002371712560000072
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酰胺(3)，
Figure BDA0002371712560000081
1-(2-((乙基)环己基氨基)-5-(2-氰基-1H-吡咯基-1)苯基)-3-(4-甲基苯基)脲(4)，
Figure BDA0002371712560000082
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(5)，
Figure BDA0002371712560000083
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(6)，
Figure BDA0002371712560000084
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(7)，
Figure BDA0002371712560000091
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(8)，
Figure BDA0002371712560000092
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(9)，
Figure BDA0002371712560000093
1-(3-(3-(4-氟苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(10)，
Figure BDA0002371712560000094
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(11)，
Figure BDA0002371712560000101
1-(3-(3-(4-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(12)，
Figure BDA0002371712560000102
1-(3-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(13)，
Figure BDA0002371712560000103
1-(3-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(14)，
Figure BDA0002371712560000104
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(15)，
Figure BDA0002371712560000111
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(16)，
Figure BDA0002371712560000112
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(17)，
Figure BDA0002371712560000113
1-(3-(3-(3-甲基异噁唑-5-基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(18)，
Figure BDA0002371712560000114
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-甲基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(19)，
Figure BDA0002371712560000121
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-甲氧基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(20)，
Figure BDA0002371712560000122
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氟苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(21)，
Figure BDA0002371712560000123
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(22)，
Figure BDA0002371712560000124
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-溴苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(23)，
Figure BDA0002371712560000131
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氰基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(24)，
Figure BDA0002371712560000132
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(25)，
Figure BDA0002371712560000133
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(26)，
Figure BDA0002371712560000134
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(27)，
Figure BDA0002371712560000141
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氟-4-氰基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(28)，
Figure BDA0002371712560000142
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(3-氟-4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(29)，
Figure BDA0002371712560000143
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(30)，
Figure BDA0002371712560000144
1-(3-(3-(4-甲氧基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(31)，
Figure BDA0002371712560000151
1-(3-(3-(4-氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(32)，
Figure BDA0002371712560000152
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(33)，
Figure BDA0002371712560000153
1-(3-(3-(4-溴苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(34)，
Figure BDA0002371712560000154
1-(3-(3-(4-氰基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(35)，
Figure BDA0002371712560000161
1-(3-(3-(2-氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(36)，
Figure BDA0002371712560000162
1-(3-(3-(2-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(37)，
Figure BDA0002371712560000163
1-(3-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(38)，
Figure BDA0002371712560000164
1-(3-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(39)，
Figure BDA0002371712560000171
1-(3-(3-(2-氟-4-溴苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(40)，
Figure BDA0002371712560000172
1-(3-(3-(2-氟-4-氰基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(41)，
Figure BDA0002371712560000173
1-(3-(3-(2,4-二氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(42)，
Figure BDA0002371712560000174
1-(3-(3-(3-氟-4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(43)，
Figure BDA0002371712560000181
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(44)，
Figure BDA0002371712560000182
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(45)，
Figure BDA0002371712560000183
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(46)，
Figure BDA0002371712560000184
本发明的另一目的在于提供通式(I)所示化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)以取代硝基苯为原料，在碱作用下与胺类化合物HNR3R4反应制得中间体i；
2)i与吡咯-2-羧酸酯经Ullmann反应制得中间体ii；
3)ii经还原制得中间体iii；
4)iii与取代苯异氰酸酯R5NCO缩合制得化合物iv，或者iii先与氯甲酸-4-硝基苯酯形成活性中间体，然后再与胺类化合物R5NH2反应制得目标化合物iv；
iv经水解制得目标化合物v；
v与草酰氯或氯化亚砜反应制成酰氯后再与胺类化合物HNR7R8反应制得目标化合物vi；
vi经高温脱水制得目标化合物vii；
其合成路线如下：
Figure BDA0002371712560000191
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8的定义如权利要求1所述；
其中，步骤1)所述的碱选自三乙胺、DIPEA、Na2CO3、K2CO3或Cs2CO3；
其中，步骤3)所述的还原剂选自锌粉和氯化铵或铁粉和氯化铵。
其中，步骤4)中，vi在三氯氧磷中经高温脱水制得目标化合物vii。
当R2为氯时，通式(Ⅰ)所示化合物的制备方法为：
1)以2-氟-5-溴硝基苯为原料，在碱作用下与胺类化合物HNR3R4反应制得中间体i；
2)i经NCS氯代反应得到中间体viii；
3)viii与吡咯-2-羧酸酯经Ullmann反应制得中间体ix；
4)ix经还原剂还原制得中间体x；
5)x与取代苯异氰酸酯R5NCO缩合制得中间体xi；
6)xi经水解制得目标化合物xii；
其合成路线如下：
Figure BDA0002371712560000201
其中，R3、R4、R5和R6的定义如权利要求1所述。
其中，步骤1)所述的碱选自三乙胺、DIPEA、Na2CO3、K2CO3或Cs2CO3。
其中，步骤4)所述的还原剂选自锌粉和氯化铵或铁粉和氯化铵。
所述通式(I)化合物的药学上可接受的盐可通过一般的化学方法合成。
一般情况下，盐的制备可以通过游离碱或酸与等化学当量或过量酸(无机酸或有机酸)或碱(无机碱或有机碱)在合适的溶剂或溶剂组合物中反应制得。
本发明还提供了一种药物组合物，其主要由在治疗上有效量的活性组分和药学上可接受的辅料组成；所述的活性组分包括通式(Ⅰ)化合物或其药学上可接受的盐的一种或多种。所述药物组合物中，所述的辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
根据治疗目的可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液和悬浮液)等，优选片剂、胶囊、液体、悬浮液和针剂(溶液和悬浮液)。
为了使片剂、丸剂或栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋形剂。
为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液或悬浮液消毒后(最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油)，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可以使用本领域内任何常用的载体。例如：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、聚乙氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可以加入通常溶解剂和缓冲剂等。
本发明所述的组合物在药物组合物中的含量物特殊限制，可在很宽的范围内进行选择，通常可为质量百分比的5～95％，优先为质量百分比的30～85％。
本发明所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据患者年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。
本发明还提供了所述通式(Ⅰ)化合物、其药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)抑制剂中的用途。所述的IDO1抑制剂用于治疗IDO1介导的免疫抑制的相关疾病患者，所述的相关疾病包括癌症、病毒感染、神经变性疾病、白内障、器官移植排斥、抑郁症或自身免疫性疾病。
本发明还提供了所述通式(Ⅰ)化合物、其药学上可接受的盐或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗患者的癌症、病毒感染、神经变性疾病、白内障、器官移植排斥、抑郁症或自身免疫性疾病。
所述的癌症包括但不限于：恶性黑色瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、脑癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮癌、甲状腺瘤、肝癌和食管癌中的一种或多种。
所述的病毒感染包括但不限于：由人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、脊髓灰质病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、人类乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒和水痘-带状疱疹病毒中的一种或多种引起的感染。
所述的神经变性疾病包括但不限于：记忆障碍症、阿尔茨海默病、认知障碍症、老年痴呆症、帕金森症和运动障碍性疾病中的一种或多种。
所述的自身免疫性疾病包括但不限于：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、结节性脉管炎、多发性硬化症、肾病、重症肌无力、混合性结缔组织病、银屑病、肝病、内分泌相关疾病和由于感染引起的自身免疫反应中的一种或多种。
进一步，本发明还提供了所述通式(Ⅰ)化合物、其药学上可接受的盐或所述药物组合物可以与一种或多种其他种类的治疗剂和/或治疗方法联合用于治疗由IDO1介导的相关疾病。
所述其他种类的治疗剂和/或治疗方法包括但不限于：化疗剂、靶向抗肿瘤药物、免疫检查点抑制剂、免疫检查点激动剂、抗肿瘤疫苗、抗病毒剂、抗病毒疫苗、细胞因子疗法、过继性细胞免疫治疗或放射治疗。
所述的化疗剂包括但不限于：烷化剂、微管蛋白抑制剂、拓扑酶抑制剂、铂类药物、抗代谢类药物或激素类抗肿瘤药物。
所述的靶向抗肿瘤药物包括但不限于：蛋白激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、异柠檬酸脱氢酶抑制剂、基于表观遗传学的抗肿瘤药物或细胞周期信号通路抑制剂。
所述的免疫检查点抑制剂包括但不限于：CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、TIM-3抑制剂、VISTA抑制剂、LAG3抑制剂、TIGIT抑制剂、A2AR抑制剂或VTCN1抑制剂。
所述的免疫检查点激动剂包括但不限于：STING激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、RORγ激动剂或ICOS激动剂。
有益效果：
本发明的化合物对IDO1具有很高的抑制活性。药理实验结果表明，这些吡咯类化合物能够有效逆转IDO1介导的免疫抑制作用，促进CD8+T淋巴细胞的增殖，提高颗粒酶B和干扰素-γ的分泌，减少CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的生成，降低PCNA蛋白的表达。体内药效学评价结果表明，本发明的化合物能够显著抑制各种肿瘤类型的小鼠移植瘤的生长，而对免疫系统缺陷的裸鼠移植瘤的生长则无影响，说明这些化合物是通过激活宿主免疫应答而起抗肿瘤作用。
附图说明
图1为本发明化合物对IDO1蛋白表达的影响，其中：A为化合物2、14、26、27和39对IDO1蛋白表达的影响，B为A图的灰度扫描统计结果。Hela细胞以2×105/孔种于6孔板，于37℃，5％CO2条件下培养12h。空白对照(培养基)，受试组(100ng/mL IFN-γ、受试物)，于37℃，5％CO2条件下培养24h，收集细胞，Western blot检测IDO1表达。
图2为本发明化合物对B16F1黑色素瘤小鼠移植瘤生长的影响，其中：A为化合物2对B16F1黑色素移植瘤体积的影响，B为化合物2对B16F1黑色素移植瘤重量的影响。将1×106B16F1细胞皮下移植到C57BL/6小鼠腋窝皮下。移植后3天，将小鼠随机分为模型组、对照组和治疗组(n＝6)。第1-11天给药。*P<0.05，**P<0.01vs.模型组。
图3为本发明化合物对CT26结直肠癌BALB/c小鼠移植瘤生长的影响。将1×106CT26细胞移植于BALB/c小鼠腋窝皮下。移植后3天将小鼠随机分为模型组、对照组和治疗组(n＝8)。
图4为本发明化合物对免疫系统缺陷的裸鼠移植瘤不产生抑制。将1×107 CT26细胞移植于BALB/c裸鼠腋窝皮下。移植后5天后将小鼠随机分为模型组、对照组和治疗组(n＝8)。第1-9天给药。***P<0.001vs.模型组。
图5为本发明化合物对PAN02胰腺癌小鼠移植瘤生长的影响。将1×106 PAN02细胞移植于C57BL/6小鼠腋窝皮下。移植后3天，将小鼠随机分为模型组、对照组和治疗组(n＝6)。
图6为本发明化合物在不同温度下对IDO1活性的影响，其中：A为Epacadostat在不同温度下对IDO1活性的影响，B为化合物26在不同温度下对IDO1活性的影响，C为化合物39在不同温度下对IDO1活性的影响。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(1)的合成
Figure BDA0002371712560000231
2-硝基-4-溴-N,N-(乙基)环己基苯胺(1A)的合成
将2-氟-5-溴硝基苯(3g,13.6mmol)和N-乙基环己胺(2.61g,20.5mmol)溶于N,N-二甲基二酰胺(50mL)中，加入N,N-二异丙基乙胺(3.53g,27.3mmol)，80℃下搅拌4小时。冷却，加入200mL乙酸乙酯和200mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得红色固体4.03g，收率90.4％。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ(ppm)7.75(t,J＝2.1Hz,1H),7.49(dt,J＝8.8,2.1Hz,1H),7.08(dd,J＝8.8,1.7Hz,1H),3.13(m,2H),3.00-2.85(m,1H),1.75(d,J＝15.0Hz,3H),1.63-1.55(m,1H),1.47-1.01(m,6H),0.95(td,J＝7.1,1.7Hz,3H)；MS(EI)m/z325.1[M-H]-.
1-(3-硝基-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(1B)的合成
将化合物1A(3g,9.2mmol)溶于DMF(50mL)中，加入吡咯-2-甲酸甲酯(1.15g,9.2mmol)、碘化亚铜(3.49g,18.4mmol)、碳酸铯(5.97g,18.4mmol)和L-脯氨酸(2.12g,18.4mmol)，氮气保护80℃下搅拌12小时。冷却，加入200mL乙酸乙酯和200mL水，硅藻土抽滤，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得黄色固体1.52g，收率44.6％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)7.76(d,J＝2.5Hz,1H),7.57-7.37(m,2H),7.30(t,J＝2.2Hz,1H),7.05(dd,J＝3.9,1.88Hz,1H),6.33(dd,J＝3.9,2.7Hz,1H),3.65(s,3H),3.15(q,J＝7.0Hz,2H),2.95(tt,J＝11.7,2.7Hz,1H),1.84-1.63(m,4H),1.55(d,J＝11.3Hz,1H),1.37(td,J＝14.6,13.7,6.8Hz,2H),1.28-1.01(m,3H),0.91(t,J＝7.0Hz,3H)；MS(EI)m/z 370.5[M-H]-.
1-(3-氨基-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(1C)的合成
将化合物1B(1.52g,4.09mmol)溶于乙醇:水＝5:1的混合溶液(20mL)中，加入锌粉(1.33g,20.46mmol)、氯化铵(1.31g,20.46mmol)，氮气保护下常温反应4小时。抽滤，滤液减压浓缩后加入100mL乙酸乙酯和100mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(50mL)萃取两次，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，得淡黄色固体1.34g。
将化合物1C(1.54g,3.92mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入对甲苯异氰酸酯(0.53g,3.92mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体1.32g，收率63.7％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.50(s,1H),8.6(s,1H),8.17(d,J＝2.4Hz,1H),7.36(d,J＝8.1Hz,2H),7.30-7.17(m,2H),7.14-7.00(m,3H),6.88(dd,J＝8.6,2.6Hz,1H),6.30(t,J＝3.2Hz,1H),3.61(s,3H),3.05(q,J＝7.0Hz,2H),2.77(s,1H),2.24(s,3H),1.96(d,J＝14.6Hz,2H),1.71(s,2H),1.55(d,J＝11.9Hz,1H),1.18(s,5H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)；MS(EI)m/z 473.2[M-H]-.
实施例2
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-(环己基(乙基)氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(2)的合成
Figure BDA0002371712560000251
将化合物1(1.32g,2.78mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.56g,13.92mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.68g，收率53.1％。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ(ppm)8.51(s,1H),8.26(d,J＝2.4Hz,1H),7.28(s,1H),7.21(d,J＝2.0Hz,3H),7.16(dt,J＝3.9,2.0Hz,1H),7.12-6.99(m,3H),6.91(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),6.27(dd,J＝3.9,2.6Hz,1H),2.91-2.8(m,2H),2.55(s,1H),2.37(s,3H),1.59(d,J＝9.7Hz,5H),1.07(t,J＝12.9Hz,5H),0.77(t,J＝6.9Hz,3H)；MS(EI)m/z 459.3[M-H]-.
实施例3
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酰胺(3)的合成
Figure BDA0002371712560000252
将化合物2(1g,1.96mmol)溶于15mL无水二氯甲烷中，冰浴冷却，加入草酰氯2mL，室温反应过夜，减压除去过量的草酰氯，加入15mL无水二氯甲烷溶解，冰浴冷却，滴入3mL氨水，室温反应5小时，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析纯化，得白色固体0.5g，收率50.1％。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ(ppm)8.58(d,J＝2.1Hz,1H),7.80(dd,J＝7.4,1.5Hz),7.80(s,1H),7.28(s,1H),7.22(dd,J＝7.6,2.3Hz,3H),7.09(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.96(dd,J＝7.5,1.3Hz,2H),6.81(d,J＝7.5Hz,1H),6.76(s,2H),6.64(t,J＝7.5Hz,1H),3.29(q,J＝8.0Hz,2H),2.33(d,J＝1.2Hz,3H),1.79-1.67(m,4H),1.60(t,J＝5.6Hz,2H),1.45-1.29(m,4H),1.18(t,J＝8.0Hz,3H)；MS(EI)m/z 458.3[M-H]-.
实施例4
1-(2-((乙基)环己基氨基)-5-(2-氰基-1H-吡咯基-1)苯基)-3-(4-甲基苯基)脲(4)的合成
Figure BDA0002371712560000261
将化合物3(0.4g,0.87mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氯氧磷3mL，65℃反应8小时。冷却，将反应液倒入冰水中，加入氢氧化钠水溶液(4M)调pH值至9，加入100mL二氯甲烷，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.2g，收率52.0％。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ(ppm)8.53(s,1H),8.45(d,J＝2.6Hz,1H),7.28(s,3H),7.23-7.12(m,3H),7.10(dd,J＝8.4,2.6Hz,1H),6.99(dd,J＝4.0,1.6Hz,1H),6.33(t,J＝3.3Hz,2H),2.88(q,J＝7.1Hz,2H),2.56(t,J＝10.8Hz,1H),2.39(s,3H),1.27(d,J＝2.9Hz,4H),1.16-0.99(m,3H),0.90(t,J＝8.8Hz,3H),0.80(t,J＝7.0Hz,3H)；MS(EI)m/z 440.3[M-H]-.
实施例5
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(5)的合成
Figure BDA0002371712560000262
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(5D)的合成
将化合物1C(0.34g,0.99mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入对氯苯异氰酸酯(0.15g,0.99mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.41g。
将化合物5D(0.41g,0.83mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.17g,4.15mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.21g，收率42.1％。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ(ppm)7.73(dd,J＝5.7,3.3Hz,1H),7.54(dd,J＝5.7,3.3Hz,1H),7.40-6.89(m,7H),6.28(dd,J＝3.9,2.6Hz,1H),2.66(s,1H),1.56-1.39(m,3H),0.93(m,10H)；MS(EI)m/z 479.2[M-H]-.
实施例6
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(6)的合成
Figure BDA0002371712560000271
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(6D)的合成
将化合物1C(0.34g,0.99mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入3-三氟甲基苯异氰酸酯(0.19g,0.99mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.43g。
将化合物6D(0.43g,0.81mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.16g,4.07mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.22g，收率52.6％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.14(s,1H),8.00(s,1H),7.62(d,J＝8.5Hz,1H),7.52(t,J＝8.0Hz,1H),7.30(t,J＝8.3Hz,2H),7.17(s,1H),6.95(dd,J＝14.3,6.0Hz,2H),6.27(t,J＝3.1Hz,1H),3.06(q,J＝7.1Hz,2H),2.77(s,1H),1.97(d,J＝12.0Hz,2H),1.70(s,2H),1.55(d,J＝12.2Hz,1H),1.18(t,J＝10.0Hz,5H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)；MS(EI)m/z 513.2[M-H]-.
实施例7
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(7)的合成
Figure BDA0002371712560000281
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(7D)的合成
将化合物1C(0.34g,0.99mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯(0.22g,0.99mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.46g。
将化合物7D(0.46g,0.82mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.16g,4.09mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.23g，收率51.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)10.17(s,1H),8.77(s,1H),8.14(d,J＝2.5Hz,1H),8.08(d,J＝2.5Hz,1H),7.69(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),7.62(d,J＝8.8Hz,1H),7.33-7.22(m,1H),7.16(d,J＝2.4Hz,1H),7.00-6.88(m,2H),3.07(q,J＝7.1Hz,2H),2.77(s,1H),1.95(s,2H),1.70(s,2H),1.28-1.11(m,6H),0.86(t,J＝6.9Hz,3H)；MS(EI)m/z547.2[M-H]-.
实施例8
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(8)的合成
Figure BDA0002371712560000291
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(8D)的合成
将化合物1C(0.34g,0.99mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入3,4-二氯苯异氰酸酯(0.19g,0.99mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.43g。
将化合物8D(0.43g,0.81mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.16g,4.07mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.21g，收率50.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.98(d,J＝10.3Hz,1H),8.71(s,1H),8.14(d,J＝10.3Hz,1H),7.91(d,J＝11.8Hz,1H),7.52(d,J＝8.9Hz,1H),7.30(m,2H),7.15(s,1H),7.05-6.88(m,2H),6.27(s,1H),3.05(q,J＝7.5Hz,2H),2.77(s,1H),1.98-1.89(m,2H),1.70(s,2H),1.23-1.00(m,6H),0.86(t,J＝7.6Hz,3H)；MS(EI)m/z 513.1[M-H]-.
实施例9
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(9)的合成
Figure BDA0002371712560000301
2-硝基-4-溴-N,N-二异丁基苯胺(9A)的合成
将2-氟-5-溴硝基苯(4g,18.2mmol)和二异丁胺(4.7g,36.4mmol)溶于DMF(50mL)中，加入碳酸铯(11.85g,36.4mmol)，30℃下搅拌36小时。冷却，加入200mL乙酸乙酯和200mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥；抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得红色固体5.83g，收率97.3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.05(td,J＝2.4,1.3Hz,1H),8.01(m,1H),3.00-2.65(m,4H),1.70(dt,J＝13.4,6.7Hz,2H),0.81(s,12H)；MS(EI)m/z 327.1[M-H]-.1-(3-硝基-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(9B)的合成
将化合物9A(4.06g,12.33mmol)溶于DMF(50mL)中，加入吡咯-2-甲酸甲酯(1.54g,12.33mmol)、碘化亚铜(4.7g,24.66mmol)、碳酸铯(8.04g,24.66mmol)和肌氨酸(2.84g,24.66mmol)，氮气保护下于80℃搅拌24小时。冷却，加入200mL乙酸乙酯和200mL水，硅藻土抽滤，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得黄色固体1.84g，收率39.9％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)7.90-7.82(m,2H),7.38(t,J＝2.3Hz,1H),7.07(dd,J＝3.9,1.7Hz,1H),6.39-6.32(m,1H),3.66(s,3H),2.99(s,2H),2.78(d,J＝8.5Hz,2H),1.75(m,2H),0.87(d,J＝7.4Hz,12H)；MS(EI)m/z 372.2[M-H]-.
1-(3-氨基-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(9C)的合成
将化合物9B(1.84g,4.92mmol)溶于乙醇:水＝5:1的混合溶液(20mL)中，加入锌粉(1.6g,24.6mmol)、氯化铵(1.58g,24.6mmol)，氮气保护下常温反应4小时。抽滤，滤液减压浓缩后加入100mL乙酸乙酯和100mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(50mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，得淡黄色粗产物1.59g。
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(9D)的合成
将化合物9C(1.59g,4.63mmol)溶于无水四氢呋喃(40mL)中，加入对甲苯异氰酸酯(0.62g,4.63mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体1.77g。
将化合物9D(1.77g,3.69mmol)溶于无水乙醇(40mL)中，加入氢氧化钠(0.75g,18.57mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.69g，收率40.1％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.33(s,1H),7.85(s,2H),7.30-6.59(m,8H),6.11(s,1H),2.10(s,3H),1.55(s,2H),0.74(d,J＝6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 461.2[M-H]-.
实施例10
1-(3-(3-(4-氟苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(10)的合成
Figure BDA0002371712560000311
1-(3-(3-(4-氟苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(10D)的合成
将化合物9C(0.31g,0.91mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氟苯异氰酸酯(0.12g,0.91mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.35g。
将化合物10D(0.35g,0.73mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.15g,3.64mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.17g，收率50.0％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.59(s,1H),8.07-7.93(m,2H),7.53-7.41(m,2H),7.27(d,J＝8.5Hz,1H),7.19-7.06(m,3H),7.00-6.86(m,2H),6.25(dd,J＝3.8,2.6Hz,1H),2.72(d,J＝6.9Hz,4H),1.69(m,2H),0.88(d,J＝6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z465.2[M-H]-.
实施例11
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(11)的合成
Figure BDA0002371712560000321
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(11D)的合成
将化合物9C(0.31g,0.91mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氯苯异氰酸酯(0.14g,0.91mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.37g。
将化合物11D(0.37g,0.75mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.15g,3.73mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.17g，收率50.0％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)10.08(s,1H),8.14(s,1H),7.95(d,J＝2.5Hz,1H),7.59-7.49(m,2H),7.36-7.20(m,3H),6.99-6.86(m,2H),6.25(dd,J＝3.9,2.7Hz,1H),2.75(d,J＝6.8Hz,4H),1.72(m,2H),0.87(d,J＝6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 481.2[M-H]-.
实施例12
1-(3-(3-(4-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(12)的合成
Figure BDA0002371712560000322
1-(3-(3-(4-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(12D)的合成
将化合物9C(0.34g,0.99mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-三氟甲基苯异氰酸酯(0.19g,0.99mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.42g。
将化合物12D(0.42g,0.79mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.16g,3.96mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.22g，收率51.3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.86(s,1H),8.00(s,1H),7.83(s,1H),7.53(d,J＝9.1Hz,3H),7.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.02(s,1H),6.82(s,2H),6.12(s,1H),2.60(d,J＝6.7Hz,4H),1.56(s,2H),1.19-0.39(m,12H)；MS(EI)m/z 515.2[M-H]-.
实施例13
1-(3-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(13)的合成
Figure BDA0002371712560000331
1-(3-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(13D)的合成
将化合物9C(0.31g,0.91mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2,4-二氟苯异氰酸酯(0.14g,0.91mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.37g。
将化合物13D(0.37g,0.74mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.15g,3.71mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.18g，收率50.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.39(s,1H),8.20(s,1H),7.91(d,J＝9.1Hz,2H),7.34-7.21(m,2H),7.13(s,1H),7.04(d,J＝9.0Hz,1H),6.99-6.88(m,2H),6.25(s,1H),2.73(d,J＝7.6Hz,4H),1.72(m,2H),0.87(d,J＝7.1Hz,12H)；MS(EI)m/z483.2[M-H]-.
实施例14
1-(3-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(14)的合成
Figure BDA0002371712560000341
1-(3-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(14D)的合成
将化合物9C(0.31g,0.91mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2-氟-4-氯苯异氰酸酯(0.16g,0.91mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.39g。
将化合物14D(0.39g,0.76mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.15g,3.79mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.19g，收率50.1％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.06(s,1H),9.55(s,1H),8.27(s,1H),8.02(t,J＝9.0Hz,1H),7.88(d,J＝2.4Hz,1H),7.45(dd,J＝11.1,2.1Hz,1H),7.21(t,J＝8.6Hz,2H),7.15-7.07(m,1H),6.94-6.90(m,2H),6.23(t,J＝3.0Hz,1H),2.73(d,J＝6.6Hz,4H),1.75-1.66(m,2H),0.85(d,J＝6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 499.2[M-H]-.
实施例15
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(15)的合成
Figure BDA0002371712560000342
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(15D)的合成将化合物9C(0.31g,0.91mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入3-三氟甲基苯异氰酸酯(0.17g,0.91mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.38g。
将化合物15D(0.38g,0.72mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.14g,3.6mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.2g，收率51.3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)10.03(s,1H),8.13(s,1H),8.06(s,1H),7.99(d,J＝12.2Hz,2H),7.71(d,J＝9.0Hz,1H),7.62(d,J＝8.9Hz,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,1H),7.15(s,1H),6.96(s,2H),6.25(s,1H),2.73(d,J＝6.7Hz,4H),1.70(d,J＝13.9Hz,2H),1.09(t,J＝7.0Hz,4H),0.88(d,J＝6.5Hz,8H)；MS(EI)m/z 515.2[M-H]-.
实施例16
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(16)的合成
Figure BDA0002371712560000351
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(16D)的合成
将化合物9C(0.31g,0.91mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯(0.17g,0.91mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.38g。
将化合物16D(0.38g,0.72mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.14g,3.6mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.2g，收率51.3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.08(s,1H),9.88(s,1H),8.09(s,1H),7.96(d,J＝2.5Hz,1H),7.90(d,J＝2.5Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,1H),7.34(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),7.29(d,J＝8.5Hz,1H),7.15(t,J＝2.4Hz,1H),6.99-6.92(m,2H),6.28-6.23(m,1H),2.73(d,J＝6.8Hz,4H),1.69(dt,J＝13.2,6.8Hz,2H),0.88(d,J＝6.5Hz,12H)；MS(EI)m/z 549.2[M-H]-.
实施例17
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(17)的合成
Figure BDA0002371712560000361
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(17D)的合成
将化合物9C(0.31g,0.91mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入3,4-二氯苯异氰酸酯(0.17g,0.91mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.39g。
将化合物17D(0.39g,0.74mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.15g,3.68mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.19g，收率50.0％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.64(s,1H),8.13(s,1H),8.06(s,1H),7.88(d,J＝8.1Hz,2H),7.72(d,J＝9.1Hz,1H),7.63(d,J＝8.9Hz,1H),7.47(s,1H),7.30(d,J＝8.7Hz,1H),2.74(d,J＝6.8Hz,4H),1.77-1.64(m,2H),0.89(d,J＝6.5Hz,12H)；MS(EI)m/z 515.2[M-H]-.
实施例18
1-(3-(3-(3-甲基异噁唑-5-基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(18)的合成
Figure BDA0002371712560000362
1-(3-(3-(3-甲基异噁唑-5-基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(18D)的合成
将化合物9C(0.3g,0.87mmol)溶于无水二氯甲烷(10mL)中，加入氯甲酸对硝基苯酯(0.18g,0.87mmol)，60℃反应1小时，TLC监测反应完全，减压浓缩得到淡黄色粘稠状固体0.27g。将粘稠状固体溶于无水二氯甲烷(10mL)中，加入三乙胺(0.05g,0.53mmol)、3-甲基异噁唑-5-胺(0.05g,0.53mmol)，室温搅拌8小时。柱层析纯化，得白色固体0.08g。
将化合物18D(0.08g,0.17mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.03g,0.86mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.04g，收率51.5％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.21(s,1H),7.96(d,J＝2.5Hz,1H),7.34(d,J＝8.5Hz,1H),7.14(s,1H),7.00-6.93(m,2H),6.25(dd,J＝3.8,2.7Hz,1H),2.69(d,J＝7.0Hz,4H),1.70(dt,J＝13.4,6.7Hz,2H),0.97-0.77(m,15H)；MS(EI)m/z 452.2[M-H]-.
实施例19
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-甲基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(19)的合成
Figure BDA0002371712560000371
2-氯-4-溴-6-硝基-N-二异丁基苯胺(19B)的合成
将化合物9A(15g,45.56mmol)溶于DMF(100mL)中，冰浴下缓慢加入N-氯代丁二酰亚胺(11.1g,83.12mmol)，常温反应8小时。加入200mL乙酸乙酯和200mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得橙色固体7.0g，收率42.8％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)7.91-7.81(m,2H),7.38(t,J＝2.3Hz,1H),7.07(dd,J＝3.9,1.7Hz,1H),6.40-6.32(m,1H),3.06-2.71(m,4H),1.75(m,2H),0.87(d,J＝7.4Hz,12H)；MS(EI)m/z 361.0[M-H]-.
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-硝基苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(19C)的合成
将化合物19B(2.6g,7.15mmol)溶于DMF(50mL)中，加入吡咯-2-甲酸甲酯(1.1g,7.15mmol)、碘化亚铜(2.73g,14.3mmol)、碳酸铯(4.68g,14.3mmol)和肌氨酸(1.69g,14.3mmol)，氮气保护下100℃搅拌12小时。冷却，加入200mL乙酸乙酯和200mL水，硅藻土抽滤，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得黄色固体1.42g，收率48.8％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)7.91-7.77(m,2H),7.37(dd,J＝2.9,1.7Hz,1H),7.07(dd,J＝3.9,1.7Hz,1H),6.35(dd,J＝3.9,2.7Hz,1H),3.66(s,3H),2.89(d,J＝65.1Hz,4H),1.76(m,2H),0.87(d,J＝6.4Hz,12H)；MS(EI)m/z 406.2[M-H]-.
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-氨基苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(19D)的合成
将化合物19C(1.42g,3.49mmol)溶于乙醇:水＝5:1的混合溶液(20mL)中，加入锌粉(1.13g,17.44mmol)、氯化铵(1.12g,17.44mmol)，氮气保护下常温反应4小时。抽滤，滤液减压浓缩后加入100mL乙酸乙酯和100mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(50mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，得淡黄色固体1.28g。
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-甲基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(19E)的合成
将化合物19D(1.28g,3.39mmol)溶于无水四氢呋喃(50mL)中，加入对甲苯异氰酸酯(0.45g,3.39mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体1.14g。
将化合物19E(1.14g,2.24mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.44g,11.18mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.57g，收率51.4％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.51(s,1H),8.36(s,1H),8.07(d,J＝2.6Hz,1H),7.34(d,J＝8.4Hz,2H),7.20(s,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,2H),7.01-6.94(m,2H),6.30-6.24(m,1H),3.01(dd,J＝12.7,6.6Hz,2H),2.88(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),2.24(s,3H),1.70(dt,J＝13.2,6.5Hz,2H),0.87(dd,J＝11.6,6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 495.2[M-H]-.
实施例20
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-甲氧基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(20)的合成
Figure BDA0002371712560000391
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-甲氧基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(20E)的合成
将化合物19D(0.30g,0.79mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-甲氧基苯异氰酸酯(0.15g,1.03mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.26g。
将化合物20E(0.26g,0.49mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.099g,2.47mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.14g，收率55.3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.43(s,1H),8.34(s,1H),8.08(d,J＝2.4Hz,1H),7.36(d,J＝9.0Hz,2H),7.20(t,J＝2.1Hz,1H),6.99-6.96(m,2H),6.89(d,J＝9.0Hz,2H),6.29-6.26(m,1H),3.72(s,3H),3.00(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),2.91-2.85(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),1.73-1.65(m,2H),0.87(dd,J＝12.0,6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z511.2[M-H]-.
实施例21
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氟苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(21)的合成
Figure BDA0002371712560000401
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氟苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(21E)的合成
将化合物19D(0.35g,0.93mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氟苯异氰酸酯(0.13g,0.93mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.33g。
将化合物21E(0.33g,0.64mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.13g,3.21mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.19g，收率52.8％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.20(s,1H),9.64(s,1H),8.39(s,1H),8.07(d,J＝2.5Hz,1H),7.47(dd,J＝8.8,5.0Hz,2H),7.20(t,J＝2.3Hz,1H),7.13(t,J＝8.9Hz,2H),7.06-6.95(m,2H),6.32-6.25(m,1H),3.02(dd,J＝12.7,6.5Hz,2H),2.90(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),1.71(dt,J＝13.2,6.7Hz,2H),0.88(dd,J＝11.7,6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 499.2[M-H]-.
实施例22
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(22)的合成
Figure BDA0002371712560000402
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(22E)的合成
将化合物19D(0.35g,0.93mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氯苯异氰酸酯(0.14g,0.93mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.34g。
将化合物22E(0.34g,0.64mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.13g,3.21mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.17g，收率51.4％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.78(s,1H),8.45(s,1H),8.07(d,J＝2.5Hz,1H),7.50(d,J＝8.9Hz,2H),7.34(d,J＝8.9Hz,2H),7.22(t,J＝2.3Hz,1H),7.03(d,J＝2.5Hz,1H),6.98(dd,J＝3.8,1.8Hz,1H),6.28(dd,J＝3.8,2.7Hz,1H),3.03(dd,J＝12.6,6.5Hz,2H),2.90(d,J＝2.8Hz,2H),1.70(m,2H),0.87(dd,J＝11.3,6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 515.2[M-H]-.
实施例23
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-溴苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(23)的合成
Figure BDA0002371712560000411
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-溴苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(23E)的合成
将化合物19D(0.30g,0.79mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-溴苯异氰酸酯(0.20g,1.03mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.28g，收率61.3％。1H NMR(300MHz,DMSO)δ9.78(s,1H),8.45(s,1H),8.06(d,J＝2.4Hz,1H),7.46(s,4H),7.29-7.28(m,1H),7.06-7.03(m,2H),6.32(dd,J＝3.9,2.7Hz,1H),3.62(s,3H),3.04(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),2.89(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),1.77-1.64(m,2H),0.88(dd,J＝10.5,6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 550.1,574.1[M-H]-.
将化合物23E(0.28g,0.49mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.097g,2.43mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.15g，收率54.9％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.17(s,1H),9.78(s,1H),8.45(s,1H),8.07(d,J＝2.7Hz,1H),7.46(s,4H),7.21(t,J＝2.4Hz,1H),7.03(d,J＝2.4Hz,1H),6.98-6.96(m,1H),6.29-6.27(m,1H),3.02(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),2.89(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),1.77-1.64(m,2H),0.87(dd,J＝11.4,6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 558.1,560.1[M-H]-.
实施例24
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氰基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(24)的合成
Figure BDA0002371712560000421
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氰基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(24E)的合成
将化合物19D(0.30g,0.79mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氰基苯异氰酸酯(0.15g,1.03mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.25g。
将化合物24E(0.25g,0.48mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.096g,2.39mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.13g，收率53.5％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.19(s,1H),10.15(s,1H),8.57(s,1H),8.05(d,J＝2.4Hz,1H),7.70(q,J＝9.0Hz,4H),7.22(t,J＝2.1Hz,1H),7.07(d,J＝2.7Hz,1H),6.99-6.97(m,1H),6.29-6.27(m,1H),3.04(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),2.89(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),1.75-1.66(m,2H),0.87(dd,J＝10.6,6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 558.1,506.2[M-H]-.
实施例25
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(25)的合成
Figure BDA0002371712560000422
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(25E)的合成
将化合物19D(0.30g,0.79mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2-氯苯异氰酸酯(0.16g,1.03mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.27g。
将化合物25E(0.27g,0.51mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.102g,2.54mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.14g，收率53.2％。1H NMR(300MHz,DMSO)δ12.19(s,1H),9.25(s,1H),8.60(s,1H),7.97(d,J＝2.7Hz,1H),7.72(dd,J＝1.5,8.1Hz,1H),7.49(dd,J＝1.5,8.1Hz,1H),7.33-7.28(m,1H),7.20(t,J＝2.1Hz,1H),7.17-7.11(m,1H),7.04(d,J＝2.4Hz,1H),6.97-6.95(m,1H),6.33-6.21(m,1H),3.00(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),2.88(dd,J＝12.6,6.9Hz,2H),1.75-1.66(m,2H),0.88(dd,J＝9.9,6.6Hz,13H)；MS(EI)m/z 514.2[M-H]-.
实施例26
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(26)的合成
Figure BDA0002371712560000431
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(26E)的合成
将化合物19D(0.35g,0.93mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2,4-二氟苯异氰酸酯(0.14g,0.93mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.34g。
将化合物26E(0.34g,0.64mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.13g,3.19mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.17g，收率51.4％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)7.83(d,J＝8.5Hz,1H),7.30(t,J＝9.0Hz,2H),7.14(s,1H),7.02(s,2H),6.90(s,1H),6.23(s,1H),3.01(dd,J＝12.4,6.1Hz,2H),2.86(dd,J＝12.4,6.5Hz,2H),1.74-1.64(m,2H),0.86(dd,J＝10.7,6.8Hz,12H)；MS(EI)m/z 517.2[M-H]-.
实施例27
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(27)的合成
Figure BDA0002371712560000441
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(27E)的合成
将化合物19D(0.35g,0.93mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2-氟-4-氯苯异氰酸酯(0.16g,0.93mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.36g。
将化合物27E(0.36g,0.66mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.13g,3.28mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.18g，收率51.3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.18(s,1H),9.66(s,1H),8.67(s,1H),8.07-7.87(m,2H),7.48(dd,J＝11.1,2.5Hz,1H),7.22(d,J＝9.5Hz,2H),7.05(d,J＝2.5Hz,1H),6.96(t,J＝2.7Hz,1H),6.27(t,J＝3.3Hz,1H),3.05(dd,J＝12.6,6.4Hz,2H),2.87(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),1.70(dt,J＝13.0,6.6Hz,2H),0.86(dd,J＝10.6,6.6Hz,11H)；MS(EI)m/z 533.2[M-H]-.
实施例28
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氟-4-氰基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(28)的合成
Figure BDA0002371712560000451
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氟-4-氰基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(28E)的合成
将化合物19D(0.30g,0.79mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2-氟-4-氰基苯异氰酸酯(0.17g,1.03mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.28g，收率65.3％。1H NMR(300MHz,DMSO)δ10.08(s,1H),8.87(s,1H),8.31(t,J＝8.4Hz,1H),8.00(d,J＝2.7Hz,1H),7.90(dd,J＝10.4,1.8Hz,1H),7.63(dd,J＝8.7,1.2Hz,1H),7.29(t,J＝2.1Hz,1H),7.12(d,J＝2.4Hz,1H),7.05(dd,J＝3.9,1.8Hz,1H),6.33(dd,J＝3.9,2.7Hz,1H),3.62(s,3H),3.10(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),2.87(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),1.78-1.65(m,2H),0.86(dd,J＝8.4,6.7Hz,12H)；MS(EI)m/z 547.2[M-H]-.
将化合物28E(0.28g,0.52mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.104g,2.59mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.13g，收率47.6％。1H NMR(300MHz,DMSO)δ12.20(s,1H),10.06(s,1H),8.86(s,1H),8.31(t,J＝8.4Hz,1H),8.00(d,J＝2.4Hz,1H),7.89(dd,J＝11.7,2.1Hz,1H),7.64-7.61(m,1H),7.29-7.17(m,1H),7.09(d,J＝2.7Hz,1H),6.97(dd,J＝3.9,1.8Hz,1H),6.28(dd,J＝2.7,3.6Hz,1H),3.08(dd,J＝12.3,6.6Hz,2H),2.86(dd,J＝12.3,6.6Hz,2H),1.75-1.66(m,2H),0.85(dd,J＝9.9,6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 533.2[M-H]-.
实施例29
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(3-氟-4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(29)的合成
Figure BDA0002371712560000461
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(3-氟-4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(29E)的合成
将化合物19D(0.30g,0.79mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入3-氟-4-氯苯异氰酸酯(0.18g,1.03mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.29g。
将化合物29E(0.29g,0.53mmol)溶于无水乙醇(10mL)中，加入氢氧化钠(0.106g,2.564mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.15g，收率53.0％。1H NMR(300MHz,DMSO)δ12.12(s,1H),9.99(s,1H),8.51(s,1H),8.06(d,J＝2.4Hz,1H),7.69(dd,J＝12.3,2.4Hz,1H),7.49(t,J＝8.7Hz,1H),7.22-7.18(m,2H),7.06(d,J＝2.4Hz,1H),6.98-6.96(m,1H),6.36-6.12(m,1H),3.04(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),2.90(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),1.75-1.66(m,2H),0.87(dd,J＝11.4,6.6Hz,12H)；MS(EI)m/z 532.1[M-H]-.
实施例30
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(30)的合成
Figure BDA0002371712560000471
2-硝基-4-溴-N-(异丁基)环己基苯胺(30A)的合成
将2-氟-5-溴硝基苯(4.88g,22.2mmol)和N-异丁基环己胺(4.15g,26.6mmol)溶于N-甲基吡咯烷酮(50mL)中，加入N,N-二异丙基乙胺(5.76g,44.4mmol)，氮气保护120℃下搅拌12小时。冷却，加入200mL乙酸乙酯和200mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥；抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得红色固体6.99g，收率88.9％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)7.95(d,J＝2.4Hz,1H),7.65(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),7.35(d,J＝8.9Hz,1H),2.86(d,J＝7.2Hz,2H),2.76(d,J＝11.8Hz,1H),1.68(t,J＝13.0Hz,4H),1.56-1.32(m,4H),1.08(s,3H),0.81(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z353.1[M-H]-.
1-(3-硝基-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(30B)的合成
将化合物30A(3g,8.5mmol)溶于DMF(50mL)中，加入吡咯-2-甲酸甲酯(0.94g,8.5mmol)、碘化亚铜(3.22g,17.1mmol)、碳酸铯(5.51g,17.1mmol)和肌氨酸(1.95g,17.1mmol)，氮气保护下于80℃搅拌12小时。冷却，加入200mL乙酸乙酯和200mL水，硅藻土抽滤，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得黄色固体1.43g，收率42.4％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)7.75(d,J＝2.5Hz,1H),7.47(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),7.41(d,J＝8.9Hz,1H),7.32(dt,J＝2.5,1.2Hz,1H),7.07-7.01(m,1H),6.37-6.27(m,1H),3.65(d,J＝0.7Hz,3H),2.92(d,J＝7.1Hz,2H),2.83(d,J＝11.8Hz,1H),1.72(s,4H),1.59-1.36(m,4H),1.19-1.00(m,4H),0.85(d,J＝6.5Hz,6H)；MS(EI)m/z 398.2[M-H]-.
1-(3-氨基-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(30C)的合成
将化合物30B(1.43g,3.58mmol)溶于乙醇:水＝5:1的混合溶液(20mL)中，加入锌粉(1.16g,17.91mmol)、氯化铵(1.47g,17.91mmol)，氮气保护下常温反应4小时。抽滤，滤液减压浓缩后加入100mL乙酸乙酯和100mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(50mL)萃取两次，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，得淡黄色固体1.27g。
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(30D)的合成
将化合物30C(1.27g,3.44mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入对甲苯异氰酸酯(0.47g,3.44mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得产品1.06g。
将化合物30D(1.06g,2.12mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.42g,10.56mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.48g，收率46.6％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.49(s,1H),8.18-8.02(m,2H),7.39-7.31(m,2H),7.23(d,J＝8.5Hz,1H),7.15(dd,J＝2.7,1.8Hz,1H),7.11-7.04(m,2H),6.97-6.85(m,2H),6.25(dd,J＝3.9,2.7Hz,1H),2.82(s,2H),2.67-2.53(m,1H),2.24(s,3H),1.94(s,2H),1.71(d,J＝11.1Hz,2H),1.54(d,J＝11.1Hz,1H),1.38(dt,J＝13.1,6.6Hz,1H),1.29-0.96(m,5H),0.85(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z487.3[M-H]-.
实施例31
1-(3-(3-(4-甲氧基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(31)的合成
Figure BDA0002371712560000481
1-(3-(3-(4-甲氧基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(31D)的合成
将化合物30C(0.25g,0.67mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-甲氧基苯异氰酸酯(0.13g,0.88mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.23g。
将化合物31D(0.23g,0.44mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.088g,2.22mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.13g，收率58％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.03(s,1H),9.37(s,1H),8.07(d,J＝2.1Hz,2H),7.36(m,2H),7.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.15(t,J＝2.1Hz,1H),6.96-6.94(m,1H),6.89-6.86(m,3H),6.25(q,J＝2.7Hz,1H),3.72(s,3H),2.82(s,2H),2.56(t,J＝10.5Hz,1H),1.89(d,J＝11.1Hz,2H),1.71(d,J＝10.8Hz,2H),1.54(d,J＝10.5Hz,1H),1.41-1.32(m,1H),1.26-1.03(m,5H),0.84(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 503.2[M-H]-.
实施例32
1-(3-(3-(4-氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(32)的合成
Figure BDA0002371712560000491
1-(3-(3-(4-氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(32D)的合成
将化合物30C(0.42g,1.14mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氟苯异氰酸酯(0.16g,1.14mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.39g。
将化合物32D(0.39g,0.77mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.15g,3.85mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.18g，收率47.5％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.64(s,1H),8.15(s,1H),8.06(d,J＝2.6Hz,1H),7.55-7.39(m,2H),7.25(d,J＝8.5Hz,1H),7.19-7.06(m,3H),7.00-6.85(m,2H),6.25(dd,J＝3.8,2.6Hz,1H),2.84(s,2H),2.62(d,J＝11.5Hz,1H),1.95(d,J＝11.4Hz,2H),1.72(d,J＝11.3Hz,2H),1.54(d,J＝11.2Hz,1H),1.38(m,1H),1.29-0.94(m,6H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 491.3[M-H]-.
实施例33
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(33)的合成
Figure BDA0002371712560000501
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(33D)的合成
将化合物30C(0.42g,1.14mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氯苯异氰酸酯(0.18g,1.14mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.4g，收率66.7％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.76(s,1H),8.21(s,1H),8.04(d,J＝2.4Hz,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,2H),7.33(d,J＝8.7Hz,2H),7.30-7.21(m,2H),7.07-6.98(m,1H),6.91(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H),6.35-6.23(m,1H),3.61(s,3H),2.85(s,2H),2.60(d,J＝13.6Hz,2H),1.97(d,J＝11.5Hz,2H),1.73(d,J＝11.3Hz,2H),1.55(d,J＝10.9Hz,1H),1.14(m,6H),0.86(d,J＝6.5Hz,6H)；MS(EI)m/z 521.2[M-H]-.
将化合物33D(0.39g,0.77mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.15g,3.83mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.18g，收率46.2％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.20(s,1H),8.05(d,J＝2.6Hz,1H),7.58-7.45(m,2H),7.37-7.29(m,2H),7.25(d,J＝8.5Hz,1H),7.16(dd,J＝2.7,1.9Hz,1H),6.99-6.85(m,2H),6.25(dd,J＝3.8,2.7Hz,1H),2.84(s,2H),2.61(t,J＝10.7Hz,1H),1.97(d,J＝14.0Hz,2H),1.72(d,J＝11.4Hz,2H),1.54(d,J＝11.2Hz,1H),1.38(m,1H),1.29-0.95(m,6H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 507.2[M-H]-.
实施例34
1-(3-(3-(4-溴苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(34)的合成
Figure BDA0002371712560000511
1-(3-(3-(4-溴苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(34D)的合成
将化合物30C(0.25g,0.67mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-溴苯异氰酸酯(0.17g,0.88mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.26g。
将化合物34D(0.26g,0.46mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.092g,2.29mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.12g，收率47.2％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.05(s,1H),9.77(s,1H),8.20(s,1H),8.05(d,J＝2.4Hz,1H),7.46(s,4H),7.25(d,J＝4.2Hz,1H),7.16(t,J＝2.4Hz,1H),6.97-6.90(m,2H),6.25(q,J＝2.7Hz,1H),2.84(d,J＝4.5Hz,2H),2.61(t,J＝10.8Hz,1H),1.96(d,J＝11.7Hz,2H),1.72(d,J＝9.9Hz,2H),1.54(d,J＝10.8Hz,1H),1.43-1.32(m,1H),1.28-0.99(m,5H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z550.1,552.1[M-H]-.
实施例35
1-(3-(3-(4-氰基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(35)的合成
Figure BDA0002371712560000521
1-(3-(3-(4-氰基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(35D)的合成
将化合物30C(0.25g,0.67mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氰基苯异氰酸酯(0.13g,0.88mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.21g。
将化合物35D(0.21g,0.41mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.082g,2.04mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.11g，收率53.9％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.05(s,1H),10.15(s,1H),8.22(s,1H),8.04(d,J＝2.4Hz,1H),7.70(q,J＝9.0Hz,4H),7.28(d,J＝4.2Hz,1H),7.17(m,1H),6.96-6.93(m,2H),6.26(t,J＝3.3Hz,1H),2.85(d,J＝4.8Hz,2H),2.63(t,J＝10.8Hz,1H),1.97(d,J＝11.7Hz,2H),1.72(d,J＝10.5Hz,2H),1.54(d,J＝11.4Hz,1H),1.43-1.34(m,1H),1.28-1.03(m,5H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 498.2[M-H]-.
实施例36
1-(3-(3-(2-氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(36)的合成
Figure BDA0002371712560000522
1-(3-(3-(2-氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(36D)的合成
将化合物30C(0.25g,0.67mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2-氯苯异氰酸酯(0.12g,0.88mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.22g，收率64.3％。1H NMR(300MHz,DMSO)δ9.51(s,1H),8.38(s,1H),7.97-7.90(m,2H),7.28-7.21(m,3H),7.16-7.05(m,2H),7.02(dd,J＝3.9,1.8Hz,1H),6.92(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),6.29(dd,J＝3.6,2.7Hz,1H),3.61(s,3H),2.83(d,J＝5.7Hz,2H),2.63(t,J＝11.1Hz,1H),1.93(d,J＝10.5Hz,2H),1.72(d,J＝11.4Hz,2H),1.54(d,J＝11.1Hz,1H),1.43-1.39(m,1H),1.27-1.07(m,5H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 505.3[M-H]-..
将化合物36D(0.22g,0.43mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.087g,2.17mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.11g，收率51.4％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.05(s,1H),9.50(s,1H),8.36(s,1H),7.97(d,J＝2.4Hz,1H),7.94-7.91(m,1H),7.28-7.05(m,5H),6.96-6.90(m,2H),6.25(q,J＝3.0Hz,1H),2.82(d,J＝5.7Hz,2H),2.62(t,J＝11.1Hz,1H),1.92(d,J＝10.8Hz,2H),1.71(d,J＝10.5Hz,2H),1.54(d,J＝10.4Hz,1H),1.42-1.38(m,1H),1.27-1.07(m,5H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 491.2[M-H]-.
实施例37
1-(3-(3-(2-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(37)的合成
Figure BDA0002371712560000531
1-(3-(3-(2-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(37D)的合成
将化合物30C(0.25g,0.67mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2-氯苯异氰酸酯(0.14g,0.88mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.24g。
将化合物37D(0.24g,0.46mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.092g,2.29mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.13g，收率55.5％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.04(s,1H),9.21(s,1H),8.26(s,1H),7.91(d,J＝2.4Hz,1H),7.74(d,J＝7.2Hz,1H),7.48(d,J＝6.6Hz,1H),7.31(t,J＝9.0,7.0Hz,1H),7.22-7.11(m,3H),6.95-6.90(m,2H),6.25(t,J＝3.0Hz,1H),2.81(d,J＝4.8Hz,2H),2.60(t,J＝11.4Hz,1H),1.88(d,J＝9.6Hz,2H),1.71(d,J＝10.5Hz,2H),1.54(d,J＝9.6Hz,1H),1.42-1.38(m,1H),1.28-1.07(m,5H),0.85(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z506.2,508.2[M-H]-.
实施例38
1-(3-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(38)的合成
Figure BDA0002371712560000541
1-(3-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(38D)的合成
将化合物30C(0.42g,1.14mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2,4-二氟苯异氰酸酯(0.18g,1.14mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.39g，收率65.0％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.34(s,1H),8.19(s,1H),7.85-7.63(m,2H),7.10(s,3H),6.97-6.83(m,2H),6.78(d,J＝8.5Hz,1H),6.15(s,1H),3.47(d,J＝1.6Hz,3H),2.69(s,2H),2.48(s,1H),1.78(d,J＝11.7Hz,2H),1.57(s,2H),1.40(d,J＝10.5Hz,1H),1.12(d,J＝11.3Hz,2H),0.95(d,J＝11.7Hz,2H),0.72(d,J＝6.5Hz,6H)；MS(EI)m/z 523.3[M-H]-.
将化合物38D(0.39g,0.74mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.15g,3.72mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.17g，收率44.8％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.46(s,1H),8.31(s,1H),7.96(d,J＝2.5Hz,1H),7.87(td,J＝9.2,6.2Hz,1H),7.31(m,1H),7.23(d,J＝8.6Hz,1H),7.15(dd,J＝2.7,1.8Hz,1H),7.09-6.99(m,1H),6.98-6.87(m,2H),6.25(dd,J＝3.9,2.7Hz,1H),2.82(d,J＝6.9Hz,2H),2.59(d,J＝11.0Hz,1H),1.91(d,J＝11.4Hz,2H),1.71(d,J＝11.0Hz,2H),1.54(d,J＝10.5Hz,1H),1.39(dt,J＝13.1,6.5Hz,1H),1.31-0.95(m,5H),0.85(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 509.2[M-H]-.
实施例39
1-(3-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(39)的合成
Figure BDA0002371712560000551
1-(3-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(39D)的合成
将化合物30C(0.42g,1.14mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2-氟-4-氯苯异氰酸酯(0.19g,1.14mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.4g。
将化合物39D(0.4g,0.74mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.15g,3.7mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.19g，收率48.8％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.64(s,1H),8.49(s,1H),7.98(s,2H),7.73(d,J＝7.8Hz,1H),7.45(d,J＝11.2Hz,1H),7.35-7.23(m,3H),7.14(dd,J＝20.4,8.9Hz,3H),6.95(d,J＝8.3Hz,1H),2.82(d,J＝8.0Hz,2H),2.65-2.58(m,1H),1.92(d,J＝9.9Hz,2H),1.70(d,J＝11.1Hz,2H),1.52(d,J＝10.5Hz,1H),1.41-1.35(m,1H),1.25-1.05(m,5H),0.87(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z525.2[M-H]-.
实施例40
1-(3-(3-(2-氟-4-溴苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(40)的合成
Figure BDA0002371712560000561
1-(3-(3-(2-氟-4-溴苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(40D)的合成
将化合物30C(0.25g,0.68mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2-氟-4-溴苯异氰酸酯(0.19g,0.88mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.26g。
将化合物40D(0.26g,0.44mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.089g,2.22mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.14g，收率55.1％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.05(s,1H),9.64(s,1H),8.42(s,1H),8.00-7.95(m,2H),7.58(dd,J＝10.8,2.1Hz,1H),7.35(d,J＝9.0Hz,1H),7.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(m,1H),6.97-6.92(m,2H),6.26(t,J＝3.1Hz,1H),2.83(d,J＝1.2Hz,2H),2.64(t,J＝9.9Hz,1H),1.94(d,J＝9.3Hz,2H),1.72(d,J＝8.0Hz,2H),1.54(d,J＝7.6Hz,1H),1.43-1.39(m,1H),1.28-1.07(m,5H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 568.1,570.1[M-H]-.
实施例41
1-(3-(3-(2-氟-4-氰基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(41)的合成
Figure BDA0002371712560000571
1-(3-(3-(2-氟-4-氰基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(41D)的合成
将化合物30C(0.25g,0.68mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2-氟-4-氰基苯异氰酸酯(0.14g,0.88mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.24g，收率66.7％。1H NMR(300MHz,DMSO)δ10.05(s,1H),8.63(s,1H),8.34(t,J＝8.4Hz,1H),7.92-7.86(m,2H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.27-7.24(m,2H),7.03-6.96(m,2H),6.30(dd,J＝3.9,2.7Hz,1H),3.61(s,3H),2.85(d,J＝5.4Hz,2H),2.67(t,J＝8.1Hz,1H),1.96(d,J＝10.8Hz,2H),1.72(d,J＝11.4Hz,2H),1.53(d,J＝9.9Hz,1H),1.47-1.39(m,1H),1.28-1.03(m,5H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 530.2[M-H]-.
将化合物41D(0.24g,0.45mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.090g,2.24mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.13g，收率55.6％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.07(s,1H),10.04(s,1H),8.62(s,1H),8.35(t,J＝8.4Hz,2H),7.93(d,J＝2.4Hz,1H),7.88(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(d,J＝8.7Hz,1H),7.17(t,J＝2.4Hz,1H),6.99-6.96(m,2H),6.26(q,J＝2.7Hz,1H),2.85(d,J＝6.3Hz,2H),2.67(t,J＝11.1Hz,1H),1.96(d,J＝11.1Hz,2H),1.72(d,J＝9.9Hz,2H),1.53(d,J＝10.5Hz,1H),1.48-1.38(m,1H),1.28-1.03(m,5H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 516.2[M-H]-.
实施例42
1-(3-(3-(2,4-二氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(42)的合成
Figure BDA0002371712560000581
1-(3-(3-(2,4-二氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(42D)的合成
将化合物30C(0.25g,0.68mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入2,4-二氯苯异氰酸酯(0.17g,0.88mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.25g。
将化合物42D(0.25g,0.45mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.090g,2.24mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.12g，收率49.2％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)12.05(s,1H),9.32(s,1H),8.33(s,1H),7.87(d,J＝1.8Hz,1H),7.82(d,J＝8.7Hz,1H),7.65(d,J＝2.4Hz,1H),7.39(dd,J＝9.0,2.4Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H),7.15(t,J＝2.1Hz,1H),6.96-6.92(m,2H),6.26-6.24(m,1H),2.83(d,J＝8.0Hz,2H),2.62(t,J＝10.8Hz,1H),1.92(d,J＝8.1Hz,2H),1.72(d,J＝10.5Hz,2H),1.54(d,J＝9.6Hz,1H),1.46-1.37(m,1H),1.29-1.07(m,5H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)；MS(EI)m/z 540.1,542.1[M-H]-.
实施例43
1-(3-(3-(3-氟-4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(43)的合成
Figure BDA0002371712560000582
1-(3-(3-(3-氟-4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(43D)的合成
将化合物30C(0.25g,0.68mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入3-氟-4-氯苯异氰酸酯(0.15g,0.88mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.23g。
将化合物43D(0.23g,0.43mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.085g,2.13mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.10g，收率44.6％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)10.17(s,1H),8.31(s,1H),8.03(d,J＝2.4Hz,1H),7.72(dd,J＝12.4,2.4Hz,1H),7.46(t,J＝8.8Hz,1H),7.25-7.20(m,2H),7.09(s,1H),6.93(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),6.87(s,1H),6.22(t,J＝3.0Hz,1H),2.84(d,J＝3.6Hz,2H),2.62(t,J＝11.2Hz,1H),1.97(d,J＝10.8Hz,2H),1.72(d,J＝12.0Hz,2H),1.54(d,J＝11.2Hz,1H),1.46-1.37(m,1H),1.30-1.00(m,5H),0.86(d,J＝6.4Hz,6H)；MS(EI)m/z 525.3[M-H]-.
实施例44
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(44)的合成
Figure BDA0002371712560000591
2-硝基-4-溴-N,N-(甲基)环己基苯胺(44A)的合成
将2-氟-5-溴硝基苯(3g,13.6mmol)和N-甲基环己胺(2.34g,20.5mmol)溶于DMF(50mL)中，加入N,N-二异丙基乙胺(8.88g,27.4mmol)，80℃下搅拌4小时。冷却，加入200mL乙酸乙酯和200mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得红色固体3.99g，收率93.1％。
1-(3-硝基-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(44B)的合成
将化合物44A(3g,9.5mmol)溶于DMF(50mL)中，加入吡咯-2-甲酸甲酯(1.19g,9.5mmol)、碘化亚铜(3.60g,19.1mmol)、碳酸铯(6.16g,19.1mmol)和L-脯氨酸(2.19g,19.1mmol)，氮气保护80℃下搅拌12小时。冷却，加入200mL乙酸乙酯和200mL水，硅藻土抽滤，分出有机层，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得黄色产品1.38g。1-(3-氨基-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(44C)的合成
将化合物44B(1.38g,3.87mmol)溶于乙醇:水＝5:1的混合溶液(20mL)中，加入锌粉(1.26g,19.31mmol)、氯化铵(1.24g,19.31mmol)，氮气保护下常温反应4小时。抽滤，滤液减压浓缩后加入100mL乙酸乙酯和100mL水，分出有机层，水层用乙酸乙酯(50mL)萃取两次，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，得淡黄色固体1.24g。
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(44D)的合成
将化合物44C(1.24g,3.79mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入3-三氟甲基苯异氰酸酯(0.71g,3.79mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体1.38g。
将化合物44D(1.38g,2.68mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.54g,13.42mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.68g，收率50.7％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.99(s,1H),8.57(s,1H),8.06(d,J＝42.8Hz,2H),7.70-7.43(m,2H),7.30(t,J＝9.0Hz,2H),7.14(s,1H),7.05-6.83(m,2H),6.27(s,1H),2.64(s,4H),1.90(d,J＝11.3Hz,2H),1.72(d,J＝11.8Hz,2H),1.56(d,J＝11.3Hz,1H),1.20(m,5H)；MS(EI)m/z 499.2[M-H]-.
实施例45
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(45)的合成
Figure BDA0002371712560000611
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(45D)的合成
将化合物44C(0.21g,0.64mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯(0.14g,0.64mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.26g。
将化合物45D(0.26g,0.47mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.09g,2.37mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.13g，收率51.3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)10.15(s,1H),8.56(s,1H),7.99-7.90(m,2H),7.58-7.45(m,2H),7.19(s,1H),7.03(t,J＝2.3Hz,1H),6.88-6.79(m,2H),6.13(t,J＝3.4Hz,1H),2.54(s,4H),1.76(s,2H),1.58(d,J＝11.2Hz,2H),1.42(d,J＝10.9Hz,1H),1.07(m,5H)；MS(EI)m/z 533.1[M-H]-.
实施例46
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸(46)的合成
Figure BDA0002371712560000612
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(46D)的合成
将化合物44C(0.21g,0.64mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，加入3,4-二氯苯异氰酸酯(0.12g,0.64mmol)，常温反应4小时，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.24g。
将化合物46D(0.24g,0.47mmol)溶于无水乙醇(20mL)中，加入氢氧化钠(0.09g,2.33mmol)，65℃下搅拌8小时。冷却，减压浓缩，稀盐酸(1M)调pH至3～4，加入100mL乙酸乙酯，分出有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，柱层析纯化，得白色固体0.12g，收率51.4％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)11.95(s,1H),9.84(s,1H),8.43(s,1H),7.96(d,J＝2.6Hz,1H),7.77(d,J＝2.5Hz,1H),7.39(d,J＝8.8Hz,1H),7.21-7.11(m,2H),7.01(t,J＝2.4Hz,1H),6.85-6.76(m,2H),6.13(t,J＝3.3Hz,1H),2.50(s,4H),1.76(d,J＝11.0Hz,2H),1.58(d,J＝10.5Hz,2H),1.42(d,J＝11.1Hz,1H),1.06(m,5H)；MS(EI)m/z 499.1[M-H]-.
药理活性评价
1.基于HeLa细胞的IDO1抑制活性测试
1.1实验材料和主要仪器
Figure BDA0002371712560000621
1.2实验方法
从ATCC购买的HeLa细胞保存在最低基础培养基(2mM L-谷氨酰胺和调成含有1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙铜酸钠和10％胎牛血清的Earle氏BSS)中。在37℃下将HeLa细胞保存在提供5％CO2的控湿培养箱中。
按5×103/孔的密度将HeLa细胞接种在96孔培养板中，并培养过夜。第二天，将IFN-γ(终浓度100ng/mL)和化合物的系列稀释液(总体积200μL培养基)加给细胞。温育24小时后将140μL上清液/孔移至新的96孔板中，加入10μL 6.1mol/L的三氯乙酸，在恒温烘箱中50℃温育30min以使产生的N-甲酰基犬尿氨酸水解为犬尿氨酸。然后以4000rpm将反应混合物离心10min以去除沉淀物。将100μL上清液/孔移至另一96孔板中，与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合。使用酶标仪在480nm处检测吸光值，所得结果利用IC50计算器计算。实验设3个复孔。
此外，采用MTT法检测各组HeLa细胞的存活率，目的是为了考察化合物是否是通过抑制HeLa细胞的增殖来抑制IDO1的活性。
具体操作：于96孔板中每孔加入20μL 4mg/mL MTT溶液，放入细胞培养箱孵育4小时，将96孔板进行离心，小心吸去孔内液体，每孔加入200μL二甲基亚砜，放置在摇床上300r振荡10min，使紫色结晶物质充分溶解。最后，在酶标仪570nm处检测吸光值。
1.3实验结果
实验结果(表1)表明，本发明的化合物对IDO1的活性具有显著的抑制作用。其中，化合物27的活性最强(IC50:0.010nM)。此外，MTT检测结果表明，各组HeLa细胞的存活率均保持在90％以上，表明这些化合物不是通过抑制HeLa细胞的增殖来抑制IDO1的活性。
表1.本发明化合物对IDO1的抑制活性
Figure BDA0002371712560000631
Figure BDA0002371712560000641
*阳性对照：BMS-52是WO2015031295A1中的第52号化合物。
2.本发明化合物对IDO1蛋白表达的影响
本实验的目的是为了考察本发明化合物是否通过下调IDO1蛋白的表达来抑制IDO1的活性。使用免疫印迹方法检测了化合物对IDO1蛋白表达的影响。
2.1实验方法
将HeLa细胞以2×105每孔的密度种于6孔板培养，于37℃，5％CO2条件下培养12h。空白对照(只加培养基)，模型组(加入IFN-γ、对应阳性药)，药物处理组(加入IFN-γ、对应化合物)，于37℃，5％CO2条件下培养24h，收集细胞，Western blot检测IDO1表达。
2.2实验结果
实验结果(图1)表明，本发明的化合物不会影响IDO1蛋白的表达，同时灰度扫描结果也显示加药组的IDO1蛋白/Actin蛋白比值与对照组相比没有变化。说明本发明化合物不是通过下调IDO1蛋白的表达来抑制IDO1的活性。
3.本发明化合物对T淋巴细胞增殖和IFN-γ释放的影响
T淋巴细胞是人体内免疫系统的核心执行者，在肿瘤免疫应答中起核心作用。IDO1过度表达造成的局部色氨酸耗竭和犬尿氨酸聚积会抑制T淋巴细胞的增殖和诱导其凋亡，同时还能促进初始T淋巴细胞向调节性T淋巴细胞分化，抑制细胞因子如IFN-γ、IL-2和TNF-α等分泌。本实验的目的是检测本发明化合物逆转IDO1介导的免疫抑制的能力。
3.1实验方法
B16F1细胞处理：吸去培养基(高糖DMEM，10％FBS)，PBS洗1-2次。加入0.25％胰酶消化。吸去胰酶，加入培养基，将细胞吹打下来，转移至1.5mL离心管中，离心，吸去上清，加入1mL DMEM培养基重新悬浮细胞。加入丝裂霉素C(终浓度25μg/mL)，吹打混勾，37℃，水浴30min，RP1640洗3次，细胞计数，待用。
脾脏细胞的制备：取C57/BL6小鼠，摘眼球放血处死，无菌取出脾脏放入含有2mL无菌的预冷RPMI 1640培养基的35mm的培养皿中，用5mL注射器针芯轻轻将脾细胞挤出。再加入2mL培养基，用5mL移液管反复吹打直至悬液均匀。将细胞悬液用70μm滤器过滤，300g离心5min(4℃)。弃上清后脾细胞加入10mL Tris-NH4Cl，吹均，静置2-3min，300g离心5min(4℃)，去除红细胞。弃上清后，用PRMI 1640洗涤两次，待用。
1)将处理过的B16F1细胞2×104个/孔(剌激细胞)，脾脏淋巴细胞1×106个/孔(反应细胞)，加入96孔板，加入RP1640(10％FBS)，补齐至200μL。
2)分组：给药组(剌激细胞+反应细胞+对应化合物)，空白对照(只加反应细胞)，模型组(剌激细胞+反应细胞)，除空白对照外，其他组均加入ConA(终浓度5μg/mL)，置于37℃、湿度95％、5％CO2的培养箱中培养，培养48h。
3)加入20μL MTT(终浓度4mg/mL)培养箱中继续培养4h，酶标仪测定570nm波长处吸光度值；计算T淋巴细胞增殖率：
Figure BDA0002371712560000651
3.2实验结果
实验结果表明，在混合淋巴细胞体系中，B16F1细胞高表达IDO1，对T淋巴细胞的增殖能够产生抑制作用。当加入化合物2、14、26、27、39(3倍IC50浓度)培养48h后，利用MTT检测T淋巴细胞的增殖，这些化合物均能显著增加T淋巴细胞的增殖，增殖率达到139.8％～173.0％，而且这些化合物还能提高细胞因子IFN-γ的释放(提高率：125.8％～134.5％)。这些实验说明本发明化合物能够有效逆转IDO1介导的免疫抑制，从而增强T淋巴细胞的增殖能力，促进IFN-γ的分泌，提高T细胞的免疫功能。
4.本发明化合物对调节性T淋巴细胞的影响
CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞是一类重要的调节性T淋巴细胞，在人体免疫系统中起重要的负性调节作用。研究表明，IDO1能够介导初始T细胞向调节性T淋巴细胞转化，导致肿瘤微环境中调节性T淋巴细胞比例增高，从而诱导形成免疫抑制的肿瘤微环境。为此，我们选择高表达IDO1的小鼠黑色素瘤B16F1细胞株，对其加化合物处理后，取其上清与小鼠脾脏细胞进行共培养，模拟肿瘤微环境。收集细胞后使用流式细胞仪检测在共培养体系中化合物对初始T细胞向调节性T细胞分化的影响。
4.1实验方法
将处理过的B16F1细胞(8×104个/孔)，脾脏淋巴细胞(106个/孔，使用5μg/mL的ConA刺激)加入24孔板中，加入对应浓度的化合物后置于37℃、湿度95％、5％CO2的培养箱中培养48h；收集上清液测试ELISA，使用抗CD4、抗CD25、抗Foxp3抗体染色，在流式细胞仪中检测T细胞的分化。
4.2实验结果
实验结果表明，当初始T淋巴细胞与黑色素瘤B16F1细胞株共培养时，调节性T淋巴细胞的数量和仅含初始T淋巴细胞的实验组(3.2％)相比上升了4倍(12.7％)。当化合物2、14、26、27、39(3倍IC50浓度)加入体系中后能够显著逆转这种效应，其将调节性T淋巴细胞比例分别下调至7.8％、5.3％、6.2％、4.7％和4.5％，说明本发明化合物能够通过抑制IDO1的活性逆转初始T淋巴细胞向调节性T淋巴细胞的分化。
5.本发明化合物体内药效学评价
颗粒酶B是常见于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和天然杀伤(NK)细胞颗粒中的丝氨酸蛋白酶，是CTL和NK细胞发挥细胞毒的主要效应因子。而增殖细胞核抗原(PCNA)则是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白，检测PCNA可以客观评价肿瘤细胞的增殖状态。为此，在开展体内药效学评价过程中，利用免疫组化和TUNEL分析检测肿瘤组织中的颗粒酶B、IFN-γ和PCNA水平。
5.1实验方法
小鼠的培养：选择7～8周的雌鼠，在SPF级动物饲养室饲养一周，每只小鼠体重大约在18～20g。
肿瘤细胞的处理：分别采集处于对数生长期的CT26、B16F1、PAN02细胞，180g离心5min(4℃)，使用预冷的PBS洗2次，吹打均匀，终细胞浓度为1×107/mL，冰浴备用。
肿瘤细胞的移植：分别将CT26、B16F1、PAN02细胞悬浮液接种至小鼠右侧腋窝皮下，接种的肿瘤细胞数为1×106/只。每两天使用游标卡尺测量小鼠肿瘤大小一次，称小鼠体重一次。肿瘤的体积按照以下公式计算：V(体积)＝A×B2/2，其中A是肿瘤长边的长度，B是肿瘤短边的长度。当肿瘤体积均值达到40mm3左右时，开始给药。
当肿瘤体积达到一定大小后，结束动物实验。称量小鼠体重，对其进行眼球取血，并对小鼠实施安乐死，剥取肿瘤组织，对肿瘤组织进行称重并拍照。同时，将部分组织置于10％中性固定液中，送样进行石蜡包埋组织、制作石蜡组织切片，并开展H&E染色、TUNEL和免疫组化分析。实验操作参考检测试剂盒说明书。
5.1.1B16F1黑色素瘤小鼠移植瘤模型
移植B16F1黑色素瘤的C57BL/6雌鼠分为5组，每组6只。模型组(PBS+2％的吐温20+2％DMSO，i.p.，qd.)，阳性对照组(顺铂，剂量：1mg/kg，i.p.，qod.)，给药组1-3(实施例化合物2，剂量：1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg，i.p.，qd.)。
5.1.2CT26结直肠癌BALB/c小鼠移植瘤模型
移植CT26结直肠肿瘤的BALB/c雌鼠分为5组，每组8只。模型组(PBS+2％的吐温20+2％DMSO，i.p.，qd.)，阳性对照组(5-FU，剂量：25mg/kg，i.p.，qod.)，给药组(实施例化合物2，剂量：5mg/kg，i.p.，qd.)。
5.1.3CT26结直肠癌裸鼠移植瘤模型
为了验证本发明化合物是否是通过免疫系统发挥抗肿瘤作用，在免疫系统缺陷的小鼠上构建了CT26结肠癌移植瘤模型。
移植CT26结直肠肿瘤的BALB/c(nu/nu)裸鼠分为3组，每组8只。模型组(PBS+2％的吐温20+2％DMSO，i.p.，qd.)，阳性对照组(5-FU，剂量：25mg/kg，i.p.，qod.)，给药组(实施例化合物2，剂量：10mg/kg，i.p.，qd.)。
5.1.4PAN02胰腺癌小鼠移植瘤模型
移植PAN02胰腺癌的C57BL/6雌鼠分为4组，每组6只。模型组(PBS+2％的吐温20+2％DMSO，i.g.，qd.)，阳性对照组1(吉西他滨，剂量：30mg/kg，i.p.，qod.)，阳性对照组2(Epacadostat，剂量：50mg/kg，i.g.，bid.)，给药组(实施例化合物9，剂量：15mg/kg，i.g.,qd.)。
5.2实验结果
5.2.1本发明化合物呈剂量依赖性抑制B16F1黑色素瘤小鼠移植瘤的生长
实验结果(图2)表明，随着给药剂量的升高，化合物2对B16F1黑色素瘤小鼠移植瘤的抑制效果也随之增加，显示剂量依赖性。所有给药组小鼠体重保持在20-23g之间，说明化合物2并不影响小鼠的体重。免疫组化和TUNEL实验表明，化合物2(5mg/kg)可以增加CD8+T细胞浸润，减少Foxp3+Treg细胞的数量，促进颗粒酶B和IFN-γ的分泌，并且增加肿瘤细胞的凋亡。
5.2.2本发明化合物能够显著抑制CT26结直肠癌BALB/c小鼠移植瘤的生长
实验结果(图3)表明，实施例化合物2能够显著抑制CT26结直肠癌BALB/c小鼠移植瘤的生长，并且小鼠的肝脏未见明显的纤维化和炎症表现，其余脏器如心脏、肾脏、脾脏和肺的形态结构也没有发生明显改变，说明这些化合物对小鼠各器官没有出现显著的药物性损伤影响。此外，与模型组相比，5-FU组的小鼠体重自第9天后开始下降，而化合物2的给药组小鼠的体重保持稳定，说明化合物2并不影响小鼠的体重。
免疫组化和TUNEL实验结果表明，化合物2可以增加CD8+T细胞浸润，提高肿瘤组织中IFN-γ的表达，同时能够减少Foxp3+Treg细胞群的数量，并且还可以显著促进颗粒酶B的分泌，降低PCNA蛋白的表达，进一步增加肿瘤细胞的凋亡。
5.2.3本发明化合物对免疫系统缺陷的裸鼠移植瘤不产生抑制
实验结果(图4)表明，细胞毒药物5-FU能够明显抑制CT26结直肠癌裸鼠移植瘤的生长，然而，实施例化合物2却对免疫系统缺陷的裸鼠移植瘤不产生抑制作用。说明化合物2是通过免疫系统发挥抗肿瘤作用。
5.2.4本发明化合物能够显著抑制PAN02胰腺癌小鼠移植瘤的生长
实验结果(图5)表明，相比于模型组，化合物9在PAN02胰腺癌小鼠移植瘤模型中能够显著抑制肿瘤的生长。免疫组化和TUNEL实验表明，化合物9能有效逆转IDO1介导的免疫抑制现象。
需要指出的是，本发明中的其他化合物在多种肿瘤类型如CT26、EMT6、B16F1、PAN02和LLC等小鼠移植瘤模型中同样表现出显著的抗肿瘤作用。例如，化合物20、23、24、26、27、28、30、31、33、34、35、36、38、39、40和41等在低剂量下(2.5mg/kg～15mg/kg)便能显著抑制小鼠移植瘤的生长。此外，对肿瘤组织的免疫组化和TUNEL实验结果表明，这些化合物同样能够增加CD8+T细胞浸润，促进颗粒酶B的分泌，提高肿瘤组织中IFN-γ的表达，同时还能够减少Foxp3+Treg细胞群的数量，降低PCNA蛋白的表达。这些实验表明本发明化合物能够有效逆转IDO1介导的免疫抑制作用。
6.本发明化合物与IDO1蛋白的相互作用
6.1实验方法
1)细胞热迁移实验(CETSA)：其原理是随着温度的升高，蛋白质的三级结构会受到影响进而逐渐降解，但当小分子与蛋白结合后，则可以增加蛋白质的热稳定性，减缓降解趋势。
具体操作：B16F1细胞加入IFN-γ(终浓度100ng/mL)刺激24h之后平均分成2组：对照组和化合物处理组。加入化合物2和27，确保终浓度为1μM，对照组加入等体积的DMSO，3h后收集细胞，用PBS洗两遍，500μL PBS重悬细胞，将其平均分为10份置于进口PCR管中。将PCR仪器设置10个温度(43、46、49、52、55、58、61、64、67、70℃)，将对照组与实验组的每个样品按照对应温度进行加热：每组加热3min后室温放置3min，然后置于冰上。最后，将样品放置在-80℃过夜，第二天取出，置室温融化后利用液氮反复冻融3次。将处理好的样本转移到1.5mL EP管中，12000g，20min离心，取上清40μL加入6×loading混匀，然后进行免疫印迹分析。
2)微量热泳动(MST)：该技术是基于分子在温度梯度中的定向运动从而引起分子性质的变化，如分子大小、电荷和水化层及构象等。MST是一种新型的测量分子间相互作用的技术，可以测量不同的结合模式，包括二聚化、协同作用和竞争作用。该技术适应性强，可用于不同的环境、不同的生物分子和不同的溶液，可以在复杂的生物溶液甚至细胞溶解液中完成而无需样品纯化。
具体操作：将IDO蛋白进行荧光标记，进行正式操作前先测量一定稀释倍数下蛋白的荧光值，以观察是否存在吸附等问题。随后，将待测化合物2的27设置16个不同浓度梯度，并在进口PCR管中用蛋白Buffer配好，每管体积为10μL。向PCR管中加入稀释后的蛋白，总体积20μL。用毛细管吸取10μL上机检测并分析数据。
6.2实验结果
CETSA实验结果表明，对照组(仅含DMSO)的IDO1蛋白在58℃就已经完全降解，而与对照组相比，本发明化合物2和27在61℃高温下依然能维持IDO1蛋白的稳定性，使其不易被降解。说明化合物2和27能够进入B16F1细胞，并与IDO1蛋白结合。
MST实验结果显示，本发明化合物2和27与IDO1蛋白的解离常数KD分别为3.9×10- 8M和1.3×10-10M，说明化合物2和27与IDO1蛋白之间的亲和力很强，并且能够对IDO1有极强的选择结合力。
7.本发明化合物与IDO1蛋白的结合方式
早期研发的IDO1抑制剂主要是通过与含血红素的IDO1(holo-IDO1)结合来抑制IDO1的活性。以Epacadostat为代表的holo-IDO1抑制剂主要通过与血红素铁离子络合而占据IDO1催化口袋，从而产生抑制活性。本实验的目的是为了验证本发明化合物与IDO1蛋白的结合方式。
7.1实验方法
1)不同温度下酶学实验：研究表明，IDO1蛋白的稳定性会随着温度的变化而变化。在25℃时，血红素与IDO1蛋白的结合比较牢固，此时当其与apo-IDO1抑制剂共孵育时，抑制剂无法将血红素挤出IDO1蛋白的结合口袋。而当温度升高至37℃时，血红素与IDO1蛋白结合的稳定性会降低，此时血红素就易被apo-IDO1抑制剂挤出IDO1的结合口袋。然而，holo-IDO1抑制剂如Epacadostat无论在什么温度下都能通过与铁离子络合稳定血红素与IDO1蛋白的结合。因此可以利用不同温度下酶学实验检测抑制剂与IDO1的结合方式(OrtizmeozRF,et al.bioRxiv,2018)。
具体操作：将不同浓度的受试物和IDO1蛋白分为两组，混匀加入EP管中，分别在25℃和37℃预孵育2h，加入过氧化氢酶溶液、亚甲基蓝溶液、TritonX-100溶液、VCNa溶液，在37℃下孵育15min。加入D-Trp溶液，反应总体系为250μL，继续孵育60min，按照1.2检测方法进行检测。
2)X射线衍射实验：为了培养本发明化合物与IDO1蛋白结合的复合物晶体，在50mMTris buffer,pH 7.4的条件下，用42℃的水浴孵育化合物39和hIDO1，持续2h。15000rpm离心5min后，将上清用96孔的sitting-drop trays进行坐滴，再加上结晶溶液后进行晶体生长，获得39/hIDO1复合物晶体后在上海光源BL19U线站采集X射线衍射的数据。
7.2实验结果
酶学实验结果表明，无论是在25℃还是37℃下，Epacadostat都能与含有血红素的IDO1结合，因此在两种不同温度下对IDO1都具有较强的抑制活性(图6A)。然而，在25℃下，实施例化合物26和39对IDO1的抑制作用很弱，只有在37℃时才显示出极强的抑制活性(图6B和图6C)。表明本发明化合物主要是通过与血红素竞争性结合IDO1蛋白而抑制其活性。
进一步地，通过晶体培养获得了实施例化合物39与IDO1蛋白复合物晶体，经X射线衍射结果显示，实施例化合物39能够与apo-IDO1蛋白结合，这进一步证实了本发明化合物是一类apo-IDO1抑制剂。

Claims (10)

1.一种通式(I)所示的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002371712550000011
其中：
R1代表氰基、-CO2R6或-CONR7R8；
R2代表氢、卤素、氰基、羟基或硝基；
R3和R4各自独立地代表氢、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C1-C8烷氨基或R3和R4与跟它们连接的氮原子一起形成5-7元杂环；其中所述的杂环可任选地包含一个或多个选自O、S或N杂原子；其中所述的杂环上可任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基或C3-C6环烷基；
R5代表芳基或芳杂环，其中所述的芳基或芳杂环可任选地被一个或多个R9取代；
R6、R7和R8各自独立地代表氢、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C1-C8烷氨基；
R9代表氢、卤素、氰基、羟基、巯基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷氨基或卤代烷基。
2.根据权利要求1所述的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐，其特征在于：
R1代表氰基、-CO2R6或-CONR7R8；
R2代表氢或卤素；
R3和R4各自独立地代表氢、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C1-C8烷氨基或R3和R4与跟它们连接的氮原子一起形成5-7元杂环；其中所述的杂环可任选地包含一个或多个选自O、S或N杂原子；其中所述的杂环上可任选地被一个或多个以下基团取代：C1-C8烷基或C3-C6环烷基；
R5代表芳基或芳杂环，其中所述的芳基或芳杂环可任选地被一个或多个R9取代；
R6、R7和R8各自独立地代表氢、C1-C8烷基或C3-C8环烷基；
R9代表氢、卤素、氰基、羟基、巯基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷氨基或卤代烷基。
3.根据权利要求3所述的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐，其特征在于：
R1代表氰基、-CO2R6或-CONR7R8；
R2代表氢或卤素；
R3和R4各自独立地代表氢、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氨基或R3和R4与跟它们连接的氮原子一起形成5-7元杂环；其中所述的杂环可任选地包含一个或多个选自O、S或N杂原子；其中所述的杂环上可任选地被一个或多个甲基取代；
R5代表苯环或异噁唑基，其中所述的苯环可任选地被一个或多个R9取代；
R6、R7和R8各自独立地代表氢、C1-C3烷基或C3-C6环烷基；
R9代表氢、卤素、氰基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基或三氟甲基。
4.根据权利要求1所述的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐，其特征在于：
R1代表COOH；
R2代表氢或卤素；
R3和R4各自独立地代表C1-C4烷基或C3-C6环烷基；
R5代表苯环，所述的苯环可任选地被一个或多个R9取代；
R9代表氢、卤素、氰基、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基。
5.根据权利要求1所述的吡咯类化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐，其特征在于所述化合物优选自：
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯，
Figure FDA0002371712550000021
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000031
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酰胺，
Figure FDA0002371712550000032
1-(2-((乙基)环己基氨基)-5-(2-氰基-1H-吡咯基-1)苯基)-3-(4-甲基苯基)脲，
Figure FDA0002371712550000033
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000034
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000041
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000042
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-((乙基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000043
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000044
1-(3-(3-(4-氟苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000051
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000052
1-(3-(3-(4-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000053
1-(3-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000054
1-(3-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000061
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000062
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000063
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000064
1-(3-(3-(3-甲基异噁唑-5-基)脲基)-4-(二异丁氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000071
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-甲基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000072
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-甲氧基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000073
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氟苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000074
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000081
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-溴苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000082
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(4-氰基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000083
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000084
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000091
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000092
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(2-氟-4-氰基苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000093
1-(3-氯-4-(二异丁氨基)-5-(3-(3-氟-4-氯苯基)脲基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000094
1-(3-(3-(4-甲基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000101
1-(3-(3-(4-甲氧基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000102
1-(3-(3-(4-氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000103
1-(3-(3-(4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000104
1-(3-(3-(4-溴苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000111
1-(3-(3-(4-氰基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000112
1-(3-(3-(2-氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000113
1-(3-(3-(2-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000114
1-(3-(3-(2,4-二氟苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000121
1-(3-(3-(2-氟-4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000122
1-(3-(3-(2-氟-4-溴苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000123
1-(3-(3-(2-氟-4-氰基苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000124
1-(3-(3-(2,4-二氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000131
1-(3-(3-(3-氟-4-氯苯基)脲基)-4-((异丁基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000132
1-(3-(3-(3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000133
1-(3-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000134
1-(3-(3-(3,4-二氯苯基)脲基)-4-((甲基)环己基氨基)苯基)-1H-吡咯-2-甲酸，
Figure FDA0002371712550000141
6.权利要求1所述的吡咯类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以取代硝基苯为原料，在碱作用下与胺类化合物HNR3R4反应制得中间体i；
2)i与吡咯-2-羧酸酯经Ullmann反应制得中间体ii；
3)ii经还原制得中间体iii；
4)iii与取代苯异氰酸酯R5NCO缩合制得化合物iv，或者iii先与氯甲酸-4-硝基苯酯形成活性中间体，然后再与胺类化合物R5NH2反应制得目标化合物iv；
iv经水解制得目标化合物v；
v与草酰氯或氯化亚砜反应制成酰氯后再与胺类化合物HNR7R8反应制得目标化合物vi；
vi经高温脱水制得目标化合物vii；
其合成路线如下：
Figure FDA0002371712550000142
其中，R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8的定义如权利要求1所述；
当R2为氯时，通式(Ⅰ)所示化合物的制备方法为：
1)以2-氟-5-溴硝基苯为原料，在碱作用下与胺类化合物HNR3R4反应制得中间体i；
2)i经NCS氯代反应得到中间体viii；
3)viii与吡咯-2-羧酸酯经Ullmann反应制得中间体ix；
4)ix经还原剂还原制得中间体x；
5)x与取代苯异氰酸酯R5NCO缩合制得中间体xi；
6)xi经水解制得目标化合物xii；
其合成路线如下：
Figure FDA0002371712550000151
其中，R3、R4、R5和R6的定义如权利要求1所述。
7.一种药物组合物，其主要由在治疗上有效量的活性组分和药学上可接受的辅料组成；所述的活性组分包括如权利要求1-5中任一项所述的化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐。
8.权利要求1-5中任一项所述的化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐或权利要求7中所述的药物组合物在制备吲哚胺2,3-双加氧酶1抑制剂中的应用。
9.权利要求1-5中任一项所述的化合物、其代谢产物、代谢前体、前药、溶剂化物、结晶或其药学上可接受的盐或权利要求7中所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗患者的癌症、病毒感染、神经变性疾病、白内障、器官移植排斥、抑郁症或自身免疫性疾病。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其中所述的癌症为恶性黑色瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、脑癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮癌、甲状腺瘤、肝癌和食管癌中的一种或多种；所述的病毒感染为人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、脊髓灰质病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、人类乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒和水痘-带状疱疹病毒中的一种或多种引起的感染；所述的神经变性疾病为记忆障碍症、阿尔茨海默病、认知障碍症、老年痴呆症、帕金森症和运动障碍性疾病中的一种或多种；所述的自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、结节性脉管炎、多发性硬化症、重症肌无力、混合性结缔组织病、银屑病和由于感染引起的自身免疫反应中的一种或多种。
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