CN111148530A - 病原体免疫原性的增强 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于体内施用的疫苗组合物，其包含修饰为预靶向载体的(减毒的)病原体或共生体，所述预靶向载体包含一个或多个、能够与免疫原性共轭物组分上的互补部分形成高亲和力相互作用的悬垂的反应部分。
Description
技术领域
本发明涉及可用于增强病原体在动物或人体内的免疫原性的方法、化合物、组合物和试剂盒。所述病原体可能包括细菌、分枝杆菌、真菌或寄生虫。
背景技术
由单细胞生物或多细胞生物组成的癌症疫苗或全生物疫苗的效力可能会因病原体的天然免疫逃避策略而受到损害。全生物的使用提供了一种有效的预防接种手段，因为它们将全部抗原暴露于免疫系统。然而，引发这种免疫应答需要大量相对昂贵的全生物疫苗。通过添加佐剂来增强免疫应答可以在减少疫苗数量的情况下产生更高的应答。
佐剂可以减少所需疫苗的剂量，这在资源匮乏的环境下对大量人群尤其有利。一个例子是用于疟疾的减毒寄生虫疫苗的开发。尽管在人类研究中有很好的效果，但是需要静脉注射大量的孢子体来获得保护性免疫。到目前为止，还没有报道能有效减少所需孢子体数量的策略。此外，佐剂与病原体的立即联合施用可能会影响病原体的完整性或生存能力。
因此，需要创造一种疫苗和佐剂试剂盒来提高免疫原性，例如，在人类或动物中针对免疫原性差的病原体刺激体液和细胞应答。此外，希望创造一种全生物疫苗，借此所述病原体(包括共生体)在宿主体内能够在它们的天然生态位分布或复制，这将优选在所述病原体或共生体的天然局部生态位诱导免疫应答。此外，希望提供这样一种增强的疫苗，作为适合于致病的单细胞生物或多细胞生物的部分的试剂盒。还非常希望提供一种通过体内共轭的佐剂-病原体疫苗预防或治疗病原体感染来改善健康的方法，该疫苗可用于健康的人和动物。
发明内容
因此，本发明涉及单细胞或多细胞病原体或共生细胞的体内共价或非共价共轭的疫苗组合物，所述病原体或共生细胞被修饰为预靶向载体，其中病原体或共生细胞包含一个或多个、能够与互补共轭部分形成高亲和力相互作用的悬垂的反应部分。静脉内或局部施用的互补共轭部分将与病原体或共生细胞上的反应部分相互作用，增加其免疫原性。因此，本发明涉及用于体内施用的双组分疫苗组合物，其包含(优选减毒的)病原体或共生体(均修饰为预靶向载体)，所述预靶向载体包含一个或多个悬垂的反应部分，所述悬垂的反应部分能够与免疫原性次要组分上的互补共轭部分形成高亲和力相互作用。
在另一方面，本发明还涉及一种免疫原性佐剂组分，其用于静脉内或局部施用，并用于与根据本发明的预靶向载体组合物的互补部分形成高亲和力相互作用；其中佐剂组分包含至少一种选自由如下组成的组的剂：病原体相关分子模式、抗原、病原体识别受体靶标、佐剂或诊断剂、显像剂、造影剂、治疗剂或其组合或多种。
在第三方面，本发明还涉及一种增强的疫苗组合物，其包含呈组分形式的部分的试剂盒，所述组分包含用于呈现给病原体或共生生物的全生物抗原，和作为次要组分的、包含有效量免疫原性佐剂的生理学上可接受的组分。
在第四方面，本发明还涉及刺激人或动物对病原体或共生生物的免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：a)给人或动物施用病原体或共生生物(其被修饰为预靶向载体组分)，和b)给人或动物施用包含免疫原性部分的疫苗，在共生体或病原体的预靶向位置诱导或辅助针对共生体或病原体的免疫应答(佐剂组分)。
附图说明
图1至6涉及实施例1，说明了使用超分子相互作用的预靶向:
图1示意性地示出了根据本发明的超分子预靶向概念的概念，即通过用UBI-Ad2官能化来标记金黄色葡萄球菌(S.aureus)。这产生了可以在步骤1中施用的官能化病原体(定义为预靶向载体)。可以在步骤2中添加进一步用诊断标记(即荧光标记和/或99mTc-放射性标记)官能化的含多聚环糊精的聚合物(定义为次要共轭物)。组合方法产生了载体：99mTc-共轭物复合物。
图2显示了接种金黄色葡萄球菌-UBI-Ad(圈定位置；步骤1)18h，随后施用99mTc标记的含多聚环糊精的聚合物(步骤2)的小鼠的microSPECT图像。除了一些背景吸收(胃和膀胱)之外，这些图说明了圈定位置含有相对较高量的聚合物，表明载体：99mTc-共轭物复合物及其随时间的稳定性。
图3显示了与从图2所示小鼠切除的未感染组织相比，感染组织中荧光强度的增加。为了适应这种读出，使用了含多聚环糊精聚合物上的荧光标记。
图4示意性地示出了根据本发明的超分子预靶向概念的概念，即通过用99mTc-UBI-Ad2官能化来标记金黄色葡萄球菌。这产生了可以在步骤1中施用的官能化病原体(定义为预靶向载体)。可以在步骤2中添加进一步用诊断标记(即荧光标记和/或111In-放射性标记)官能化的含多聚环糊精的聚合物(定义为次要共轭物)。组合方法产生了99mTc-载体：111In-共轭物复合物。
图5显示了含有99mTc-载体(金黄色葡萄球菌-99mTc-UBI-Ad；圈定的)和111In-共轭物的小鼠的双同位素microSPECT图像。在圆圈中观察到的111In-共轭物的T/NT比表明99mTc-载体：111In-共轭物复合物的成功形成。
图6显示了含有99mTc-对照(金黄色葡萄球菌-99mTc-UBI；圈定的)和111In-共轭物的小鼠的双同位素microSPECT图像。与图4相比，圆圈中观察到的111In-共轭物的降低的T/NT比表明，没有Ad的存在，金黄色葡萄球菌不会充当复合物形成的载体。
图7至13涉及实施例2，示出了通过点击化学进行的预靶向：
图7示意性地示出了通过用UBI-Cy5-叠氮化物官能化标记金黄色葡萄球菌的概念。这产生了可以在步骤1中施用的官能化荧光病原体(定义为预靶向载体)。
图8呈现了共聚焦显微镜图像，其显示金黄色葡萄球菌(A.aureus)-UBI-Cy5-叠氮化物细菌为明亮的荧光点。
图9示意性示出了根据本发明的基于“点击”化学的预靶向概念的概念，即通过用UBI-Cy5-叠氮化物官能化来标记金黄色葡萄球菌。这产生了可以在步骤1中施用的官能化的病原体(定义为预靶向载体)。可以在步骤2中加入含有111In(定义为第二共轭物)的BCO官能化的DTPA螯合物。组合方法产生Cy5-载体：111In-共轭物复合物。
图10显示了当在体外监测时金黄色葡萄球菌-UBI-Cy5-叠氮化物和111In-DTPA-DBCO之间的点击反应的时间依赖性。在混合3小时后，溶液中所有的111In-DTPA-DBCO与细菌结合。
图11示意性示出了通过用Cy5-叠氮化物官能化标记孢子体的概念。CY5-叠氮化物的羧酸基团与表面上的伯胺反应产生官能化的荧光病原体(定义为预靶向载体)，其可以在步骤1中施用。
图12展示了用Cy5-叠氮化物官能化的孢子体的三个共聚焦显微镜图像，第一行为荧光图像(箭头表示香蕉状孢子体的位置)，第二行为透射图像，第三行为二者的叠加。
图13示意性示出了根据本发明的基于点击化学的预靶向概念的概念，即通过用Cy5-叠氮化物官能化来标记孢子体。这产生了可以在步骤1中施用的官能化的病原体(定义为预靶向载体)。互补的活性Cy7染料(Cy7-DBCO；定义为次要共轭物)可以在步骤2中被添加。组合方法产生了Cy5-载体：Cy7-共轭物复合物。
图14该多组分图像示出了当Cy5-叠氮化物和Cy7-dbco在溶液中相互反应时(A)，如何影响Cy5的荧光性质(B)，导致其荧光强度降低(猝灭)。
图15示出使Cy7-DBCO与用Cy5-叠氮化物官能化的孢子体反应，产生了与使溶液中的单个组分反应时所观察到的(图14)相似的Cy5荧光强度的猝灭效果。
图16和17涉及实施例3，示出了病原体表面官能化作为改变与免疫系统相互作用
的手段：
图16示意性地显示了早期疟原虫(malaria parasite)(即所谓的孢子体)如何可以用蛋白质合成修饰，例如使用抗CSP抗体(A)。此外，它表明这种官能化导致免疫细胞的优先摄取(B)。
图17显示了免疫细胞对上述修饰的SPZ的增强识别，更详细地说：在有或没有抗CSP抗体的条件下，单核细胞衍生的树突状细胞和巨噬细胞与表达GFP的遗传修饰的伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)孢子体一起孵育1小时。流式细胞术测定荧光孢子体的摄取。
具体实施方式
本发明涉及一种新的疫苗方法或试剂盒，及其在治疗和在人体中产生免疫应答的方法中的应用。优选地，疫苗所针对的病原体是细菌、原生动物或多细胞寄生虫，它们可以位于细胞内或细胞外。
本发明基本上允许用免疫增强剂原位改变官能化的病原体或共生体的表面，从而导致增强的或更强的免疫应答。
术语“免疫原”是指在适当条件下能够诱导特异性免疫应答并与该应答产物(例如，特异性抗体、佐剂、病原体识别受体的配体、抗原、特异性致敏的T淋巴细胞或其组合)反应的物质。
如本文所用，术语“病原体”是指作为人类或动物的病原体的致病单细胞或多细胞生物。动物可包括一般哺乳动物、家畜、牛、羊、猪、猴子、狗、猫、大鼠、节肢动物、鸟类、爬行动物、鱼类和昆虫。
本文中的“减毒”是指毒性降低的病原体，其可以是活的或死的，代谢活性的或非活性的。病原体或感染因子已被改变或选择，使其无害或毒性较低或反应原性较低，这是疫苗开发中一项广为人知的技术。
如本文所用，“微生物”表示细菌、立克次氏体、支原体、藻类、原生动物、真菌等微生物，例如疟原虫、螺旋体等，“寄生虫”是指感染性的，通常是微观的或非常小的多细胞无脊椎动物，或它们的卵或幼体形式，它们易于被抗体诱导的清除或裂解或噬菌作用破坏，例如，阿米巴、蠕虫肠虫等，而“感染原”或“病原体”表示微生物和寄生虫。
术语“共生体”在这里是指人类或动物宿主的共生体。共生微生物通常是人类或动物肠道或皮肤微生物菌群的一部分。通常，共生微生物，特别是细菌，已经与其宿主共同进化，以提供营养，抵抗病原体，并在适用的情况下帮助肠道发育。共生微生物包括但不限于选自下列的一种或多种细菌：阿德勒克罗伊茨菌属(Adlercreutzia)、颤螺菌属(Oscillopira)、柔膜菌属(Mollicutes)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、真细菌属(Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、理研菌属(Rikenella)、另枝菌属(Alistipes)、海滑菌属(Marinilabilia)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、埃希氏菌属(Escherichia)和/或乳杆菌属(Lactobacillus)。
术语“共轭物”、“共轭物部分”和“共轭物组分”在本文中是用户可互换的，并且指被修饰以选择性地附着于预靶向载体的次要组分。
在本发明的第一方面，体内施用被主要部分(预靶向载体)包被的靶向细胞；当(任选减毒的)病原体或共生体靶向定位时，静脉内或局部施用共价或非共价免疫诱导的共轭物部分。
这种两步法不仅提供免疫诱导共轭物部分的靶向性，而且可以诱导病原体或共生体上的后续载体：共轭物复合物进入靶细胞的内化，靶细胞可以是抗原呈递细胞。
或者，另一个实施方案提供了三步法方案，其在表面产生预靶向载体：共轭物：次要共轭物复合物，其中次要共轭物在施用主要共轭物的同时或之后的短时间内施用，优选在载体-共轭物复合物从靶细胞表面移除之前施用。本发明设想了额外的内化方法，并在此进行了讨论。
因此，本发明利用至少两种组分，即所谓的预靶向载体和共轭物组分，其中一种首先局部积聚，然后将第二种组分引入患者体内，以选择性地共价或非共价偶联到已经就位的组分上。
这两种组分(载体和共轭物组分)提供互补的官能性。本文中的术语“互补的官能性”是指高度选择性的结合化学，其中两个或更多个互补官能化的伴侣分子可能以预定的反应路径共价或非共价反应或结合。一旦结合，这两种组分就形成了载体：共轭物复合物或载体：共轭物基质。
如上所述，可以有利地使用选择性的物理相互作用来完成载体：共轭物的识别，例如在超分子主-客体包结物(inclusion complex)中提供的那些。
这种包结物的优选例子是例如作为主体部分的金刚烷(Ad)和作为客体部分的环糊精(CD)。替代地或附加地，载体共轭物识别也可以通过选择性共价化学来完成，例如化学键合，例如使用叠氮化物和炔烃部分之间的“点击”化学，其中两种反应物有利地是结合到载体化合物的部分和结合到共轭物的部分，当在适当条件下彼此暴露时，它们将反应形成共价键。
本发明的组合物和方法都具有明显的优点，即首先引入预靶向载体(其本身可能不需要具有任何强免疫原性、治疗性或诊断性效果)，以校验准确位置和载体在该位置的定位稳定性，然后使用用一种或多种所需官能性官能化的次要共轭物组分原位修饰载体。这允许病原体的天然分布或靶向，包括未受影响的生存力，而添加免疫原的共轭步骤可以在稍后阶段或仅在优选器官中局部进行。在一个方面，本发明提供了用作疫苗的药物组合物，其包含减毒病原体或共生体和有效量的辅助的(adjuvanting)共轭物部分，所得组合物能够诱导接种的宿主的细胞介导的免疫力以产生有益的应答。
另一方面，本发明提供了包含减毒病原体的组合物。这种预靶向载体可以与共轭物组分直接同时或接近同时施用。
另一方面，本发明提供了一种制备包含减毒病原微生物的疫苗组合物的方法，该疫苗组合物包含病原体或共生体或对病原体或共生体进行化学改变以形成预靶向载体，优选通过向疫苗组合物中添加有效量的免疫原性共轭物组分来增强引发接种的宿主的免疫应答的能力。
疟原虫属(Plasmodium spp)引起的疟疾是一种具有公共卫生重要性的传染病。最严重的疟疾通常由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起，控制寄生虫和/或蚊子载体对疾病的预防和消除至关重要。恶性疟原虫的孢子体阶段是寄生虫暴露于宿主免疫应答的第一阶段，并且由于其胞外位置而易受攻击。
环孢子体蛋白(CSP)是最丰富的孢子体抗原，其与裂殖子表面抗原相比相对更加保守。一种由CSP抗原组成的疫苗目前已注册供人类使用，但诱导的保护是部分的，并随着时间的推移而减弱。在其它孢子体抗原的情况下增强抗CSP免疫应答是可取的。不希望受限于任何特定的理论，据信两步接种方法将增强免疫应答，其中孢子体被允许进入肝细胞并表达对诱导细胞免疫应答至关重要的抗原，而在第二步中，通过将免疫原共价或非共价共轭到剩余的减毒恶性疟原虫孢子体来增加细胞外孢子体的免疫原性，从而与非共轭的孢子体疫苗相比，以低得多的接种率获得强得多的免疫力。
因此，发现在体外修饰孢子体表面，随后将减毒病原体靶向抗原呈递细胞，可增加孢子体的内化，使孢子体对免疫系统可见，并可能增加疫苗接种的效果。
预靶向载体的浓度
待施用的预靶向载体以及共轭物组分的量取决于所获得的免疫应答。典型地，为了实现抗原呈递同观察人或动物的耐受性和安全性之间的最佳平衡，被修饰为预靶向载体的、待注射到患者血管系统和/或组织中的病原体或共生体的数量应当足够。
而可以注射或以其他方式递送的病原体或共生体的数量将根据患者的新陈代谢、体重、器官重量等而变化。已经发现，大约200至2,000,000,000个、任选地悬浮在生物安全溶液中并递送至患者的减毒病原体可能足够，尽管根据不同的使用环境和条件，更大量的病原体可能是必要且理想的。
通过知道给定体积的分散体中病原体的浓度，只需要抽出并注入所需体积的、含有所需数量病原体的液体即可。这显然也适用于共生体。
本发明使用至少两种组分，一种预靶向载体，在此也称为主要组分，和至少一种第一共轭物，在此也称为次要组分。
主要和次要组分被官能化以提供互补的官能性。术语“互补的官能性”在此指的是高度选择性的结合化学，其中两种或更多种互补官能化的伴侣分子可能以预定的反应路径反应或结合。
如上所述，载体-共轭物识别可以有利地使用选择性物理相互作用来完成，例如超分子主-客体包结物中提供的那些。
这种包结物的优选例子是例如作为主要部分的金刚烷(Ad)和作为次要部分的环糊精(CD)。
替代地或附加地，载体-共轭物识别也可以通过选择性共价化学来完成，例如化学键合，例如使用叠氮化物和炔烃部分之间的“点击”化学，其中两种反应物有利地是结合到载体化合物的主要部分和结合到共轭物的次要部分，其中当载体和共轭物在适当条件下彼此暴露时，它们将反应形成共价键。
本发明，无论是组合物还是方法，都具有明显的优点：首先允许引入本身可能不需要具有任何强免疫原性、治疗性或诊断性效果的预靶向载体，以校验准确位置和载体在该位置定位的稳定性，然后使用用一种或多种所需活性官能化的次要组分原位修饰载体。这可以减少例如适当免疫应答所需的疫苗注射次数，但也可以减少病原体(载体)组分的量。此外，其他诊断或治疗活性也可以与载体组分或共轭物偶联，而这迄今为止是无法获得或不可能的。
本发明的一个方面提供了用作疫苗的2组分药物组合物，其包含任选地减毒的且宿主标记的病原微生物，以及有效量的辅助的共轭物部分，所得组合物能够引发接种的宿主对病原体的体液或细胞介导的保护性免疫应答。
另一方面，本发明提供了包含减毒的且标记的病原微生物的组合物。这种预靶向载体组合物可以直接使用，并与辅助的共轭物组分同时或接近同时施用。
另一方面，本发明提供了一种制备含有减毒病原微生物的疫苗组合物的方法，其包括标记病原微生物以形成预靶向载体，优选地，通过向疫苗组合物中加入有效量的免疫原性共轭物组分、其亚单元或生物活性片段，引发接种的宿主针对病原体的免疫应答的能力增强。
预靶向载体优选包含病原体或共生体，病原体或共生体被允许在它们的天然(局部)生态位分布和/或复制，其中它们可以在间质细胞液中、粘膜表面或微血管床中的胞外，或者在组织的淋巴网络中扩散，或者可以在细胞(例如巨噬细胞)中积聚。因此，这些病原体或共生体保持它们对特定器官的天然趋向性。
根据本发明的预靶向载体病原体还可以优选包括显像标记，例如诊断性和/或可检测标记。这有利地允许确定预靶向载体病原体是否以及何时处于期望的位置，以及由于血流或降解而发生的任何损失，这些损失可能对后续治疗产生负面影响。
载体和共轭物官能性
本文使用的术语“载体”和“共轭物”指两种不同但互补的结合伴侣，它们彼此非共价或共价相互作用。如本文所用，术语“载体部分”或“基团”是指载体分子单体的部分(part)或部分(moiety)，其能够共价或非共价结合到互补共轭物官能团上。
“共轭物分子”又是包含一个或多个官能团的分子，其中单价共轭物分子包含一个共轭物官能团，多价共轭物分子包含至少两个共轭物官能团。如本文所用，术语“共轭物官能团”是指共轭物分子单体的部分(part)或部分(moiety)，其能够共价或非共价结合到互补载体官能团上。“载体分子”又是包含一个或多个载体官能团的分子，其中单价载体分子包含一个载体官能团，多价载体分子包含至少两个载体官能团。
优选地，一个共轭物部分与匹配的载体部分特异性相互作用。根据本发明，在使用非共价载体-共轭物对的情况下，共轭物和载体之间的相互作用可以是可逆的，并且由解离常数表示的亲和力决定。典型地，共轭物分子通常不与另一共轭物分子相互作用。
非共价载体-共轭物相互作用的例子包括β-环糊精-金刚烷、β-环糊精-二茂铁、γ-环糊精-芘、葫芦脲-紫精和/或Ni(NTA)-His标签。
共价相互作用的例子包括作为载体-共轭物相互作用的叠氮化物(N3)-炔烃相互作用，例如在应变促进的炔烃(所谓的环辛炔)与叠氮化物(SPAAC)、四嗪或硝酮(SPANC)之间提供无金属生物正交环加成的那些。
例如，二苯并环辛炔基(DBCO)或双环[6.1.0]壬炔(BCN)允许不含铜的“点击”化学应用于要在活生物体中使用的载体。DBCO或BCN基团将优先地并自发地标记含有叠氮化物基团(–N3)的分子。此外，在生理温度和pH范围内，DBCO或BCN基团不与许多生物分子中天然存在的胺或羟基反应。此外，DBCO或BCN基团与叠氮化物基团的反应明显快于与巯基的反应，这使得这是一种高度选择性的反应。也可以使用其他合适的“点击”材料。
优选地，共轭物组分的反应亲和力和反应速度高，以允许在体内快速结合到预靶向载体。因此，优选在使用前测试预靶向载体和次要共轭物组分的潜在共价结合部分，以选择所需的官能性化合物。
本文中的术语“包结物”是指载体化合物吸收或包埋共轭物化合物以形成复合物的任何材料。例如，共轭物化合物可以包埋在由载体化合物形成的空腔中。
优选地，载体-共轭物组分各自是现成的(readily available)，并能够以相对较大的规模和/或在低成本的装置中执行本发明的方法。
如本文所用，术语“载体-共轭物分子相互作用”包括各共轭物和载体官能团之间的非共价结合。在优选的设置中，使用疏水相互作用，例如亲脂性相互作用，而不是基于电荷的相互作用。
官能性可以被颠倒，即可以将共轭物官能团连接到预靶向载体上，并且将载体官能团连接到共轭物组分上。合适的载体的选择或共轭物修饰在很大程度上取决于这种载体或共轭物(包括其连接或结合的方式)可能对组分执行其任务的能力产生的影响。
此外，可以使用多价载体和多价共轭物结构，其包括多个载体和/或共轭物官能团。在这种情况下，一些载体官能团可以(非)共价结合到共轭物分子上，而另一些保持游离，反之亦然。
优选的，基本上非共价载体部分或化合物是环糊精，同时金刚烷部分充当共轭物分子。
环糊精是含有天然存在的、以α-(l,4)键连接的D(+)-吡喃葡萄糖单元的环状多糖。最常见的环糊精是alpha(α)-环糊精、beta(β)-环糊精和gamma(γ)-环糊精，它们分别含有六、七或八个吡喃葡萄糖单元。在结构上，环糊精的环状性质形成花托(torus)样或多纳圈(donut)样形状，具有内部非极性或疏水性空腔，仲羟基位于环糊精花托的一侧，伯羟基位于另一侧。
优选使用β-环糊精，它是金刚烷的最佳结合伴侣。所述环糊精可以含有额外的基团，例如将它连接到支架上的胺，将环糊精结合到金表面上的一种或多种硫醇，或增加溶解度和生物相容性的羟丙基。环糊精家族的其他成员(最有可能是α和γ)也可以用于载体-共轭物相互作用，尽管必须引入不同的共轭物来实现这一点。
因此，可以应用于本发明的超分子载体-共轭物相互作用的一个好的但不是唯一的例子是金刚烷(作为载体分子)和β-环糊精(作为共轭物分子)之间的非共价相互作用。仲羟基所在一侧的直径比伯羟基所在一侧的直径大。环糊精内腔的疏水性允许包含多种化合物(Comprehensive Supramolecular Chemistry,Volume 3,J.L.Atwood et al.,eds.,Pergamon Press(1996)；T.Cserhati,Analytical Biochemistry,225:328-332(1995)；Husain et al.,Applied Spectroscopy,46:652-658(1992)；FR 2 665 169)。各种含环糊精的聚合物及其制备方法在本领域也是已知的(Comprehensive SupramolecularChemistry,Volume 3,J.L.Atwood et al.,eds.,Pergamon Press(1996))。美国专利5,608,015或5,276,088中描述了制备含有固定化环糊精的聚合物的方法，该两项专利描述了通过使聚乙烯醇或纤维素或其衍生物与环糊精衍生物反应或通过使环糊精衍生物与乙酸乙烯酯或甲基丙烯酸甲酯共聚来合成环糊精聚合物的方法。所得环糊精聚合物含有环糊精部分作为病原体或共生体细胞主链的悬垂部分。基于环糊精的聚合物已经被用于治疗应用(Kandoth et al.Two-photon fluorescence imaging and bimodal phototherapy ofepidermal cancer cells with biocompatible self-assembled polymernanopathogens.Biomacromolecules 2014(15):1768-1776)和显像剂(Yan et al.Polybeta-cyclodextrin inclusion-induced formation of two-photon fluorescentnanomicelles for biomedical imaging.Chemical Communications 2014(50):8398-8401)，并且它们表现出优异的生物相容性。金刚烷是一种亲脂性小分子，可以附着在载体上，所述载体可以物理性地借宿在目标组织中。金刚烷结构将刚性和形成类金刚石结构的能力结合起来，并提供了与环糊精的高结合亲和力。一方面，共轭物分子可以是金刚烷，而载体分子优选是与金刚烷非共价相互作用的环糊精。这两种化合物相对便宜，易于在受控环境下生产且无毒。
支架
载体部分可以通过“支架”(即包含间隔分子或其它合适分子结构的结合单元)与病原体连接。支架可用于确保载体部分呈现给进入的共轭物部分，和/或可允许容易地修饰病原体或共生体细胞。此外，几个载体部分或载体官能团可以通过支架分子相互连接以形成多价载体结构。本文使用的术语“多价”是指许多载体或共轭物分子或其官能团，它们是同一分子或结构的一部分。
多价相互作用包含至少两个相同类型的官能团(例如至少两个载体官能团，或至少两个共轭物官能团)，它们通过骨架(或支架)相互结合，这允许匹配载体或共轭物分子的多聚化。多价性的上限取决于病原体或共生体实现所需官能性的有效性，例如细胞是否仍然存活，并能与其他细胞相互作用或可能复制。不希望受限于任何特定的理论，据信多价增强了亲和力，并因此改善了结合，因为单体载体分子倾向于显示显著较低的非共价相互作用。
根据本发明，“多价载体结构”或“多价共轭物结构”是分别包含至少两个载体官能团或共轭物官能团的结构。原则上它可以是合适载体或共轭物单体的二聚体或聚合物，但是通常载体或共轭物分子已经附着或接枝到允许载体或共轭物分子附着的不同类型的聚合物上。
在本发明的一个实施方案中，“多价载体结构”或“多价共轭物结构”优选包含支架或连接结构，至少两个载体分子或至少共轭物分子已经附着或接枝到所述支架或连接结构上，导致支架结构包含至少两个载体宿主官能团或至少两个共轭物官能团。支架结构可以是允许选择的载体或共轭物分子附着的任何结构。支架结构当然也可以是病原体或共生体细胞的一部分。
在另一个实施方案中，支架分子可以是包含少于约30个氨基酸的抗体或多肽，例如少于约25个、少于约20个、少于约15个、少于约10个、少于约5个或少于约6个氨基酸。它也可以是寡肽，例如二肽、三肽、四肽或五肽。在一个实施方案中，多肽或寡肽的重复单元是β-丙氨酸。
共轭物组分
根据本发明的共轭物组分趋向于具有比预靶向载体更小的尺寸，并且可以针对它们的药代动力学进行调节。这样，共轭物组分在预靶向载体表面的保留可以与低程度的背景积聚相结合。
共轭物可以基于合成的或天然存在的化合物，或其组合。优选地，对于与载体部分的共价相互作用，共轭物组分可以由单体材料形成，例如用于点击化学的那些。共价相互作用的例子包括叠氮化物(N3)-炔烃相互作用，例如，二苯并环辛炔基(DBCO)或双环[6.1.0]壬炔(BCN)允许无铜的“点击”化学。虽然这些已经显示于诊断试剂(含有荧光和放射性同位素的螯合物)，但是应当注意，在直接将DBCO或BCN单元连接到所述试剂上之后，包括免疫原性或治疗性部分等的任何单体或多聚体官能性都将结合到病原体表面。
优选的、基本上非共价的载体部分或化合物是环糊精，并且金刚烷部分充当共轭物分子。或者，对于与载体部分的非共价相互作用，共轭物材料可以由聚合材料形成，例如氨基酸序列、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚苯乙烯、聚烯烃、聚酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯和这些聚合物的组合，以及均聚物或共聚物及其混合物。颗粒材料可以进一步包含合适的粘合剂，例如明胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、16-羟基-16、(多)糖、DTPA、DOTO、NOTA其它亲水性材料，以及它们的组合。合适的明胶可以包括牛胶原、猪胶原、羊胶原、马胶原、合成胶原、琼脂、合成明胶以及它们的组合。通过化学交联形成的有用的合成聚合物的例子包括聚乙二醇(以下称为“PEG”)、聚丙二醇(以下称为“PPG”)、聚乙烯醇(以下称为“PVA”)、聚丙烯酸、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸多羟基乙酯、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、葡聚糖或其他糖基聚合物；可以使用均聚物或(大)共聚物或选自由羟甲基纤维素和羟乙基纤维素组成的组的水溶性聚合物的水溶性聚合物、α-羟基酸、α-羟基酸环状二聚体、选自由羟基二羧酸和环状酯组成的组的单体的大共聚物。
可以使用部分水溶性聚合物，其生物相容性通常高于疏水性聚合物。此外，由于羟基的存在，PEG、PPG、PVA、聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯(以下简称“聚HEMA”)易于官能化。特别有用的水凝胶珠是由多羟基聚合物如聚乙烯醇(PVA)或乙烯醇共聚物制成的那些，它们可以通过使用例如活化剂(如羰基二咪唑)与在聚合物网络中的悬垂羟基部分的反应，而容易地被共轭物形成部分标记。
有用的共轭物组分的重均分子量优选为200或更高。此外，为了便于活体的离体排出，优选为50,000或更少。共轭物组分的重均分子量可以适当选择，以获得所需的药代动力学，例如超过最小的非特异性结合。所用聚合物的重均分子量可以有利地通过凝胶渗透色谱法测定。
共轭物选择性地与包含载体部分的预靶向载体连接或反应。这种连接的选择性优选允许通过静脉而不是组织中引入共轭物，因为当共轭物存在于多个位置时，共轭物会自动与载体结合，但是也可以在载体沉积的位置局部给予。
此外，可以施用几种不同的成分，从而允许组合治疗。共轭物可包含可与载体结构反应或结合的共轭物部分或分子，以及至少第一免疫原性试剂。此外，各种其他试剂可以偶联到共轭物上，例如诊断或显像标记，或者携带进一步功能的试剂。
制备修饰的载体或共轭物的示例性方法可以包括提供药学上可接受的聚合物，并且例如通过包被、共价连接或共定位而偶联到预靶向载体或共轭物的表面，并且分别偶联免疫原性试剂和显像剂、可检测标记或其他官能部分。
该方法还可以包括形成一种或多种共轭物悬浮液、使共轭物悬浮液通过过滤器、从共轭物悬浮液中除去杂质、离心沉淀共轭物、透析共轭物悬浮液、和/或调节共轭物悬浮液的pH。该方法还可以包括淬灭共价连接反应。
合适的共轭物组分可以包括有机或无机组分或它们的混合物。例如，共轭物可以选自聚合物。合适的聚合物例如可以选自聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(PIBMA)、PAMAM、聚丙烯酸、多糖、多肽和寡肽。一些这样的聚合物，例如PIBMA，具有进一步的优点，即它们防止与免疫系统的相互作用，并因此在免疫原性试剂被暴露之前还起到掩蔽基团的作用。
对于许多应用，所选择的结构本身优选是无毒/免疫原性的也很重要。合适的聚合共轭物可以包含药学上可接受的聚合物核和一种或多种免疫原性剂和/或显像剂。
优选地，共轭物可以包含药学上可接受的聚合物核，和一种或多种生物活性剂，例如封装在核中的药物或药剂，或抗生素。
然而，最重要的是，共轭物、共轭物组分在细胞/病原体表面上的多价暴露或不同的效果需要引发、辅助或极化免疫应答，因此可以诱导治疗性或预防性效果。这优选通过在载体:共轭物复合物上或中包含一种或多种免疫原性剂来实现。这种“免疫原”是指在适当条件下能够诱导特异性免疫应答并与该应答的产物(例如特异性抗体、特异性致敏的T淋巴细胞或两者都有)反应的物质，而术语“免疫原性”是指由免疫原的存在触发的反应。免疫原性或免疫应答增强剂可以包括但不限于病原体相关分子模式、抗原和/或病原体识别受体的靶标或佐剂。
因此，根据本发明的免疫原性剂可优选地包括但不限于核酸、DNA(载体或质粒)、RNA(例如，mRNA、RNAi构建体的转录物或siRNA)、小分子、拟肽物、蛋白质、肽、聚糖、脂质、表面活性剂及其组合。
组分的施用
预靶向载体的施用
根据本发明的载体组分可以静脉内、局部和口服施用，即它们被注射或输注到患者体内的特定区域和/或特定器官或组织中。实例包括皮内、皮下、肌内和/或鼻内注射或输注。
共轭物组合物可以在尺寸、尺寸分布、可压缩性、含水量、流动性、变形蠕变和/或稳定性以及最佳药代动力学(例如非复合组分的快速清除和最小背景)等因素方面进行选择和设计，使得它们可以被输注或注射。
为了局部增强，通过注射或植入来递送预靶向载体提供了将载体有效靶向其特定自然生态位或位置的手段，从而确保在最需要效应子免疫应答的部位诱导免疫应答。
此外，通过植入或基于针的注射的载体材料的施用通常可以在门诊基础上进行，从而导致比其他手术形式更低的成本。特别是活的、任选地减毒的病原体可以被简单地注射或以其他方式递送，使得病原体可以分布到其天然生态位或在其天然生态位中复制。
优选地，“递送”包括将递送装置(例如注射器或输注导管)定位在血管的目标区域附近，或者不通过脉管系统直接进入目标组织，并且将病原体从递送装置中排出，使得病原体定位在目标区域中。此外，递送可以通过喷雾、乳膏、膏药或口腔糊剂或溶液经皮或经粘膜完成。
共轭物组分的施用
共轭物优选静脉内施用，或者更通常地在血管内施用，因为该组分在预靶向载体组分位置处积聚，或者如果没有结合到载体上，则可能排出。或者，可以局部注射共轭物，例如通过将套管插入所需区域，并将材料注射到载体组分的附近，这包括皮内、肌内、皮下、透皮或经粘膜施用。
施用介质
根据本发明的组分优选分散在合适的分散介质中。组分的施用介质可以是缓冲液/血清溶液，还可以包括注射分散剂如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯或羧甲基纤维素、如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯防腐剂、氯化钠、用于张力剂或注射剂的防腐剂(如甘露醇或葡萄糖)、稳定剂、增溶剂或赋形剂。
因此，本发明优选涉及用于体内施用且用于与互补的次要共轭物部分形成选择性非共价高亲和力相互作用，和/或与具有本发明的载体组分的互补官能性的次要共轭物化合物形成选择性共价键的主要载体组分；其中所述组分包括互补官能性和至少第一诊断剂和/或治疗剂。优选地，所述剂选自由诊断剂、显像剂、造影剂和治疗剂组成的组，优选放射性同位素或化疗药物。
优选地，所述剂选自由以下一种或多种组成的组：抗癌剂、抗生素、抗组胺剂、激素、类固醇、治疗蛋白、生物相容性材料、显像剂和造影剂。
优选地，诊断剂选自由磁共振造影剂、不透射线造影剂、超声造影剂、荧光染料和核医学显像造影剂组成的组，更优选地，其中放射性同位素选自由99mTc、111In、89Zr和/或68Ga组成的组。
本发明还涉及用于局部治疗疾病的方法和化合物，包括向有需要的患者的目标区域施用适于诊断和治疗疾病的根据本发明的试剂盒。
本发明还优选地涉及增强的疫苗组合物，其包含免疫原性量的、呈递来自病原体或共生体的抗原的组分，以及包含有效量的免疫原性佐剂的生理学上可接受的佐剂载体。
本发明还优选地涉及一种针对感染剂或病原体在人体内刺激免疫应答的方法，该方法包括以下步骤:(a)对人体施用病原体或共生体(预靶向载体组分)，和(b)对人体施用生理学上可接受的疫苗载体，该疫苗载体包含含有免疫原性部分的标记特异性结合伴侣，在感染剂的位置诱导或辅助针对感染剂(佐剂组分)的免疫应答。
优选地，所述方法还包括在诱导或辅助免疫应答之前，允许预靶向载体到达期望的位置。
优选地，所述剂是感染性微生物，其选自由以下组成的组：细菌、立克次氏体、支原体、原生动物、蠕虫肠虫和真菌。
在一个实施方案中，人或动物受到感染性微生物的感染，所述感染性微生物选自由以下组成的组：细菌、立克次氏体、支原体、原生动物和真菌或感染性寄生虫。在一个不同的实施方案中，人或动物没有受到感染，并且其中免疫应答导致针对表现出目标感染剂标记的感染剂所致感染的保护性免疫，或者通过诱导针对特定共生体的免疫而产生针对微生物群紊乱的保护性免疫。
优选地，所述方法还包括次要共轭物，该次要共轭物可以在施用主要共轭物的同时或之后短时间内施用，以形成包含预靶向载体:共轭物:次要共轭物的原位复合物。优选地，这种次要共轭物在预靶向载体:共轭物从靶细胞表面移除之前施用。
以下非限制性实施例说明了本发明。
实施例1说明了使用超分子相互作用的预靶向；实施例2说明了通过点击化学进行的预靶向，实施例3说明了病原体表面官能化作为改变与免疫系统相互作用的手段。
所有化学品均从商业来源获得，无需进一步纯化即可使用。NMR光谱是使用BrukerDPX 300光谱仪(300MHz,1H NMR)或Bruker AVANCE III 500MHz和TXI梯度探针获得的。所有光谱都参考残留溶剂信号或TMS。使用1525EF泵和2489UV检测器在Waters系统上进行HPLC。对于制备型HPLC，使用Dr.Maisch GmbH的Reprosil-Pur 120C18-AQ 10m柱，并在使用40min内从H2O/CH3CN(95:5)(含0.1％TFA)至H2O/CH3CN(5:95)(含0.1％TFA)的梯度。对于分析型HPLC，使用Dr.Maisch GmbH的Reprosil-Pur C18-AQ 5μm(250×4.6mm)柱，并使用40min内从H2O/CH3CN(95:5)(含0.1％TFA)至H2O/CH3CN(5:95)(含0.1％TFA)的梯度。MALDI-ToF测量是在Bruker Microflex上进行的。高分辨率质谱是在Exactive orbitrap高分辨率质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)上测量的，并使用Thermo ScientificXcalibur软件(V2.1.0.1139)进行处理。对于透析，使用了Sigma Pur-A-LyzerTM Mega 3,500单位。
实施例1：官能化金黄色葡萄球菌的体内预靶向(也参见图1和图4，说明了病原体/
细胞两步靶向的体内应用的概念)
合成：UBI-Ad
用标准SPPS合成的树脂上UBI29-41(15μmol)的N端Fmoc-基团通过使树脂在DMF(2ml)中的20％哌啶中鼓泡而除去。洗涤后，在DMF(2ml)中加入Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH(36mg，60μmol)、PyBOP(31mg，60μmol)、1-羟基苯并三唑(8.1mg，60μmol)和DiPEA(20μl，120μmol)，并将悬浮液在室温下混合2小时。在用DMF/DCM洗涤并除去Fmoc基团后，加入Fmoc-Gly-OH(36mg，120μmol)、PyBOP(62mg，120μmol)、1-羟基苯并三唑(16mg，120μmol)和DiPEA(20μl，240μmol)，并再次将悬浮液在室温下混合2小时。在用DMF/DCM洗涤并除去Fmoc基团后，加入1-金刚烷羰基氯(24mg，120μmol)、1-羟基苯并三唑(16mg，120μmol)和DiPEA(40μl，240μmol)，并将混合物搅拌14小时。洗涤后，通过在38∶1∶1TFA/TIPS/H2O溶液中搅拌2小时，将化合物从树脂上切下。剩余的溶液在冷的1∶1MTBE/己烷中沉淀，并洗涤沉淀。将所得白色固体干燥，用反相HPLC纯化，随后冻干。MALDI-TOF计算值:2258.7，实测值：2259.9。
Cy50.5CD10PIBMA3的合成：
Cy50.5CD10PIBMA39的合成如下进行：将聚(异丁烯-alt-马来酸酐)Mw 6,000(30mg，5.0mol,Sigma-Aldrich)和Cy5-(SO3)磺酸盐-(SO3)胺(5.0mg，5.6mol)溶解在3mL干燥的DMSO中，并加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，50μL，250mol,Sigma-Aldrich)。在80℃搅拌7h后，加入6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精(95mg，80μmol，Cyclodextrin Shop)，将反应混合物在80℃再搅拌72小时。冷却至室温后，首先将聚合物在H2O中透析1天，然后在100mM磷酸缓冲液(pH 9.0)中透析24小时，随后在H2O中再透析5天，同时每天更新透析介质。将溶液冻干，得到蓝色粉末(87mg，5μmol)，并在-20℃下储存。使用前，在PBS中以1mg/mL的浓度等分成少量试样，并在7℃下储存(<一个月)。
用UBI-金刚烷对金黄色葡萄球菌进行官能化(金黄色葡萄球菌-Ad2)：将含有约3×109个活菌的金黄色葡萄球菌(ATCC 25922，在脑-心浸液中培养24小时)在-20℃下储存在Eppendorf管中，直至进一步使用。为了官能化，将一部分解冻，在PBS中洗涤3次(4min x3,500rpm)，并将20μL UBI-Ad(1mM在PBS中)加入到1mL细菌悬浮液中。在37℃的振荡水浴中搅动1小时后，通过2个离心步骤(4min x 3,500rpm)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤溶液2次。将获得的金黄色葡萄球菌-UBI-Ad稀释在1mL PBS中(含有2x108个活菌)。对于双同位素研究，将金黄色葡萄球菌用99mTc标记的UBI-Ad按照上述方案进行官能化。对于Cy50.5CD10PIBMA39，用锝-99m进行放射性标记，详情如下。在这些研究中，感染中细菌的定位和细菌的靶向都可以通过放射性显像来分析。
Cy50.5CD10PIBMA39的放射性标记
Cy50.5CD10PIBMA39的放射性标记按如下进行：向10μL Cy50.5CD10PIBMA39(1mg/mLPBS)中加入4μL SnCl2.2H2O(0.44mg/mL盐水,Technescan PYP,Mallinckrodt MedicalB.V.)和100μL新洗脱的99mTc-Na-高锝酸盐溶液(500MBq/mL,Mallinckrodt MedicalB.V.)，并将混合物于37℃在振荡水浴中轻轻搅动1h(如M.M.Welling,A.Paulusma-Annema,H.S.Balter,E.K.J.Pauwels和P.H.Nibbering,Eur.J.Nucl.Med.,2000,27,292-301所述)。随后，按照以下步骤通过ITLC分析估算标记随时间的产率：在室温下，以丙酮为流动相，将2μL的反应混合物施加在1×7cm的ITLC-SG纸带(Agilent Technologies,USA)上10分钟。1小时后，分析用锝-99m标记的Cy50.5CD10PIBMA39的最高标记产率(49.6％±12.8)，并且使用SephadexTM G-25(脱盐柱PD-10，GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,德国)，用无菌PBS作为流动相，通过尺寸排阻色谱法纯化反应混合物。收集含有99mTc-Cy50.5CD10PIBMA39的级分并直接应用于显像实验。根据从PD-10纯化计算的数据，获得49.2％±6.9的标记产率，这与ITLC分析估算的产率一致。对于双同位素显像，Cy50.5CD10PIBMA39用铟-111通过如下方法标记：向10μL Cy50.5CD10PIBMA39(1mg/mL PBS)中加入40μL 0.25M NH4-乙酸盐(pH 5.5)和30-50μL InCl3溶液(111MBq/0.3mL，Mallinckrodt Medical B.V.)，并将混合物在37℃的振荡水浴中轻轻搅动1h。放射化学分析如上所述进行。
放射性标记的Cy50.5CD10PIBMA3的稳定性
为了评估放射性标记的稳定性，在24小时后，用ITLC测定了PD-10纯化的99mTc-Cy50.5CD10PIBMA39或111In-Cy50.5CD10PIBMA39的放射性释放量(根据本文所述的相同方法)，释放量少于总放射性的5％。
金黄色葡萄球菌-Ad2与99mTc-Cy50.5CD10PIBMA39的超分子相互作用
为了测定UBI-Ad和Cy50.5 CD10PIBMA39之间的体外超分子相互作用，将0.1mL UBI-Ad(在PBS中)(0.2mg/mL)和0.1mL 99mTc-Cy50.5 CD10PIBMA39或111In Cy50.5CD10PIBMA39(在PBS中)(1mg/mL,1MBq)混合，并将溶液在37℃的振荡水浴中孵育1小时。此后，在剂量校准器中测量加入总量的放射性和用PBS洗涤两次后的沉淀的放射性，以确定放射性标记的Cy50.5CD10PIBMA39与UBI-Ad的结合量。背景活性校正后，结合量表示为放射性总量的百分比(％结合)。为了评估Ad部分的效果，还对非官能化细菌进行了相同的实验，并比较了放射性标记的Cy50.5CD10PIBMA39与非官能化细菌和金黄色葡萄球菌-Ad的所得％结合。经计算，同与非官能化细菌的结合相比，放射性标记的Cy50.5CD10PIBMA39与金黄色葡萄球菌-Ad的结合显著(p<0.01)更高(使用双尾student t-检验，n＝4)。利用聚合物的Cy5组分，还通过共聚焦显微镜观察金黄色葡萄球菌-Ad和Cy50.5CD10PIBMA39之间的超分子相互作用。为此，重复相同的实验，但是这次将非放射性Cy50.5CD10PIBMA39添加到非官能化细菌和金黄色葡萄球菌-UBI-Ad溶液中。洗涤后，将10μL细菌(含或不含UBI-Ad2)Cy50.5CD10PIBMA39溶液移液至带有玻璃插件的培养皿上(
玻璃底皿No.15，聚-d-赖氨酸包被，经γ射线辐照，MatTek公司)。图像是在Leica SP5 WLL共聚焦显微镜上使用Leica Application Suite软件在63x放大下拍摄的。Cy5荧光在633nm激发下测量，在650-700nm收集发射。
动物
使用2-3个月大的Swiss小鼠(20-25g，Crl:OF1株，Charles River实验室,USA)进行所有体内研究。所有动物研究都获得Leiden大学医学中心动物伦理委员会的批准。所有小鼠都被置于LUMC的动物收容所的特定无病原体环境下。食物和水随意供给。
病原体接种
通过在右大腿肌肉内注射0.1mL金黄色葡萄球菌-UBI-Ad2(2x108个活菌/mL)给动物接种。1小时后，将0.1mL 99mTc-Cy50.5CD10PIBMA39(每只小鼠10-20MBq)注入尾静脉。对于双同位素显像，在相同条件下注射99mTc-金黄色葡萄球菌-Ad和111In-Cy50.5CD10PIBMA39。
常规SPECT显像和生物分布方案
SPECT显像如下进行：在注射99mTc标记的化合物后2h，将小鼠放置并固定在三头U-SPECT-2(MILabs,Utrecht,荷兰)的专用定位床上，并持续进行1-2％异氟醚麻醉。
使用0.6mm小鼠多针孔准直器在列表模式数据中采集全身扫描或选定的目标区域(ROI)的放射性计数60分钟。对于从列表模式数据进行重建，光峰能量窗口以140keV为中心，窗口宽度为20％。应用5％的侧窗来校正散射和向下散射校正。使用基于16个像素的有序子集期望最大化迭代(POSEM)重建图像，该迭代具有6个子集、各向同性体素大小为0.2mm，并且衰减和三重能量散射校正被集成到具有0.25mm后置滤波器设置的重建中(如W.Branderhorst,B.Vastenhouw和F.J.Beekman,Phys.Med.Biol.,2010,55,2023-2034中所述)。
体积渲染图像(volume-rendered image)由2-4mm切片生成，并使用MatlabR2014a软件(version 8.3.0.532,MathWorks Natick,MA)进行分析。图像是根据最大强度方案(MIP)生成的，所述最大强度方案将色标阈值调整到目标组织的最佳描绘(如M.N.vanOosterom,R.Kreuger,T.Buckle,W.A.Mahn,A.Bunschoten,L.Josephson,F.W.B.vanLeeuwen和F.J.Beekman,EJNMMI Res.,2014,4,56-56中所述)。显像后，通过腹膜内注射0.25mL Euthasol(ASTfarma，Oudewater，荷兰)对小鼠实施安乐死，并如下所述进行生物分布。对于双同位素标记，如上所述进行显像。在1-1200KeV帧内收集计数，此后，对于图像重建，光峰能量窗口的中心为140keV(99mTc)或240keV(111In)。在其他峰上应用侧窗来屏蔽其他同位素。图2显示了啮齿动物大腿中金黄色葡萄球菌表面上的载体:共轭物复合物的SPECT显像，而图5和6分别显示了含有99mTc载体(金黄色葡萄球菌-99mTc-UBI-Ad；圈定的)和111In-共轭物的小鼠的双同位素microSPECT显像，以及含有99mTc对照(金黄色葡萄球菌-99mTc-UBI；圈定的)和111In-共轭物的小鼠的双同位素microSPECT显像。
常规荧光显像和生物分布方案
使用IVIS光谱显像系统(Caliper Life Science,Hopkinton,MA)对注射的小鼠进行荧光显像。在640nm激发后采集图像，并且收集>680nm的光(采集时间5s)。IVIS光谱数据的显像分析是使用xenogeny v 3.2的活体图像软件(Caliper LS)进行的。此后，移除各种器官和/或注射部位，并用IVIS光谱显像。由于毛发导致荧光发射的额外衰减，因此将其从肌肉上去除，以便进行更详细的荧光显像。最后，对切除的肌肉和其他组织进行荧光离体显像。图3显示了啮齿动物大腿中标记的金黄色葡萄球菌的荧光显像。
生物分布
SPECT显像(如上所述)后，通过手术移除器官和组织，并使用伽马计数器(2470自动伽马计数器，Perkin–Elmer，245keV，60s)计数放射性。每分钟的计数被转换成MBq并校正衰减。计算每克组织注射剂量的百分比(％ID g-1)。
实施例2：使用UBI-Cy5-叠氮化物官能化细菌的概念(见图7)
所有化学品和溶剂均从商业来源获得，无需进一步纯化即可使用。使用1525EF泵和2489UV/VIS检测器在Waters HPLC系统上进行HPLC。对于制备型HPLC，使用Dr.MaischGmbH Reprosil-Pur 120C18-AQ 10μm(250×20mm)色谱柱(12mL min-1)，对于半制备型HPLC，使用Dr.Maisch GmbH Reprosil-Pur C18-AQ 10μm(250×10mm)色谱柱(5mL min-1)。使用Dr.Maisch GmbH Reprosil-Pur C18-AQ 5μm(250 4.6mm)或Dr.Maisch GmbHReprosil-Pur C18-AQ 5μm(250×10mm)色谱柱进行分析型HPLC，同时使用40分钟内从H2O/CH3CN 95:5(含0.1％TFA)至H2O/CH3CN 5:95(含0.1％TFA)的梯度(1mL min-1)。以α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质，颗粒释放肽R(granuliberin R)为内标，在Bruker microflex MALDI-TOF上进行质谱分析。
使用Acquity UPLC光电二极管阵列检测器，SQ Detector质谱仪，在WatersAcquity UPLC-MS系统上进行UPLC/MS。在此使用0.5mL/min的流速(Waters BEH C18
1.7μm(100×2.1mm)色谱柱)。用Bruker AV-400或500光谱仪(分别为400MHz 1HNMR或500MHz 1H NMR)获得了新染料和邻苯二甲酰亚胺丙基-磺基假吲哚的NMR谱，并且化学位移(ppm(δ))与四甲基硅烷(TMS)相关。所使用的缩写包括单重态(s)、二重态(d)、二重态的二重态(dd)、三重态(t)和未解析的多重态(m)。使用Ultrospec 3000光谱仪(Amershampharmacia biotech)记录吸收光谱，从中减去溶剂空白。荧光测量使用配有红敏PMT的Perkin-Elmer LS 55荧光光谱仪进行。染料的荧光性质根据公开的步骤进行测定[21]。氯甲基聚苯乙烯树脂(1％DVB，200-400目，1.6-1.8mmol/g)从TCI chemicals获得。Cy7-DBCO猝灭剂购自德国Jena Bioscience。
3-邻苯二甲酰亚胺丙基三甲基假吲哚的合成
三甲基磺基假吲哚钾(1.5g，5.4mmol)、3-溴丙基邻苯二甲酰亚胺(4.5g，16.8mmol，3当量)和碘化四丁基铵(0.27mmol，0.05当量)在1,2-二氯苯(15ml)中的混合物加热至100℃持续18小时，然后在150℃下加热3小时。随后将粗制假吲哚浆液在Et2O(250mL)中沉淀。用移液管除去大部分上清液，通过离心(2000rpm)从剩余悬浮液中收集沉淀物，并用Et2O洗涤两次。粗构建单元(building block)的初始纯化通过硅胶柱色谱进行(10％->20％MeOH在CH2Cl2中)。通过硅胶柱色谱(25％MeOH在EtOAc中)进一步纯化该物质，并从Et2O中沉淀，得出标题化合物，为浅黄色固体(0.8g，1.8mmol；34％的产率)。Rf(25％MeOH在EtOAc中)＝0.38。MALDI-TOF-MS:[M+H]+C22H23N2O5S计算的m/z＝427.13，实测426.65。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ＝7.93–7.73(m,4H,Phth-Ar-H),7.65–7.59(m,1H,Ar-H),7.56(d,J＝1.7Hz,1H,Ar-H),6.64(d,J＝8.3Hz,1H,Ar-H),3.74(t,J＝7.4Hz,2H,N-CH2-),3.67(t,J＝7.1Hz,2H,N-CH2-),2.10–2.97(m,2H,CH2-CH 2-CH2),1.34(s,6H,C-(CH3)2)。没有观察到假吲哚2-甲基部分的特征峰，可能是由于与氘化甲醇的质子交换。
Cy5-(SO3)邻苯二甲酰亚胺基-(SO3)COOH染料的合成
Cy5-(SO3)邻苯二甲酰亚胺基-(SO3)COOH是基于相较于Lopalco等人先前描述的方法稍有改进的方法合成的。简而言之，羧戊基假吲哚(940mg，2mmol，2当量)和丙二醛二苯胺盐酸盐(540mg，2.2mmol，2.2当量)溶解在15ml AcOH/Ac2O(1:1v/v)中，随后加热至120℃，持续2小时。冷却至室温后，现在为深色的混合物在300ml Et2O中沉淀，半花菁作为棕色沉淀收集。然后，该沉淀用Et2O洗涤一次，用EtOAc洗涤两次。将粗制半花菁溶解在DMF(50mL)中，并加入到75mL带熔块(frit)的聚丙烯容器中的、先前制备的Merrifield树脂结合的氨基苯酚(750mg树脂，1mmol胺部分，1当量)中，并用N2鼓泡混合1小时。用DMF(50mL)和CH2Cl2(50mL)反复洗涤树脂，直到洗脱出所有棕色组分。接下来，1(210mg,0.5mmol,0.5当量)和吡啶/Ac2O(12mL,3:1v/v)被加入到洗涤过的树脂中，并将悬浮液混合2小时。通过过滤从珠子中分离出所得的深蓝色滤液，并再次用DMF洗涤珠子。合并收集的滤液级分，并从Et2O(300mL)中沉淀，得到深蓝色固体(250mg)的粗染料，直接用于下一步反应。少量通过制备型HPLC纯化用于分析。分析型HPLC tR＝29.9min。MALDI-TOF-MS:[M+H]+C42H46N3O10S2计算的m/z＝816.26，实测816.00。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ＝8.30–8.43(m,2H,菁桥CH-CH-CH-CH-CH-CH),7.92–7.79(m,6H,4×邻苯二甲酰亚胺C-H+芳基),7.59–7.67(m,2H,芳基),7.33–7.41(m,2H,芳基),6.48(t,J＝12.4Hz,1H CH-CH-CH-CH-CH-CH),6.24–6.38(m,2H,菁桥CH-CH-CH-CH-CH-CH),4.22(broad t,2H,N-CH 2-CH2-CH2-NPhth),4.12(broad t,J＝6.8Hz,2H,N-CH 2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH),3.71(t,J＝7.2Hz,2H,N-CH2-CH2-CH 2-NPhth),2.21(t,J＝7.2Hz,2H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH 2-COOH),2.00–2.10(m,2H,N-CH2-CH 2-CH2-NPhth),1.71(2×s+m,14H,4×假吲哚CH3+N-CH2-CH 2-CH2-CH2-CH2-COOH),1.62–1.48(m,2H,N-CH2-CH2-CH2-CH 2-CH2-COOH),1.33–1.43(m,2H,N-CH2-CH2-CH 2-CH2-CH2-COOH)ppm。
Cy5-(SO3)胺-(SO3)COOH染料的合成
将100mg 2溶解在甲胺溶液(33％的EtOH溶液，8mL)中，向其中加入水(1mL)。将溶液搅拌过夜，得到金棕色溶液。使用N2鼓泡除去过量的甲胺，然后旋转蒸发。将现在的蓝色残留物溶于MeOH中，并在Et2O中沉淀。通过沉淀收集蓝色沉淀，并用制备型HPLC纯化。MS分析后，将含有产物的级分合并并冻干，得到蓝色固体形式的标题化合物(25mg，36μmol，从染料构建单元开始的两步中产率为18％)。分析型HPLC tR＝24.6min。MALDI-TOF-MS，[M+H]+C34H44N3O8S2计算值＝686.26，实测值686.43。1H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ＝8.34-8.46(m,2H,菁桥CH-CH-CH-CH-CH-CH),7.85(2×d J＝11.4Hz,2H,芳基),7.67–7.74(broad m,2H,NH2),7.63-7.67(m,2H,芳基),7.33–7.41(m,2H,芳基),6.57(t,J＝12.3Hz,1H,菁桥CH-CH-CH-CH-CH-CH),6.26–6.41(2×d,J＝13.8Hz,2×1H,菁桥CH-CH-CH-CH-CH-CH),4.11-4.21(m,4H,N-CH 2-CH2-CH2-NH3+N-CH 2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH),2.86–2.95(m,2H,N-CH2-CH2-CH 2-NH2),2.21(t,J＝7.2Hz,2H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH 2-COOH),1.90–2.04(m,2H,N-CH2-CH 2-CH2-NH2),1.71(2×s+m,14H,4×假吲哚CH3+N-CH2-CH 2-CH2-CH2-CH2-COOH),1.50–1.60(m,2H,N-CH2-CH2-CH2-CH 2-CH2-COOH)1.32-1.42(m,2H,N-CH2-CH2-CH 2-CH2-CH2-COOH)ppm。
N3-Cy5-COOH的合成
将3(25.0mg,36μmol)溶解在H2O(3mL)和MeCN(1mL)的混合物中，并用NMM将溶液的pH调至约8。加入催化量的CuSO4(1mg)，然后加入咪唑鎓叠氮磺酰氯[23](15mg,72μmol,2当量)。将反应混合物搅拌2小时，之后加入第二部分咪唑鎓叠氮磺酰氯(5.0mg,24μmol,0.7当量)，并继续搅拌30分钟。加入KCl(20mg)后，用制备型HPLC纯化反应混合物，随后冻干以得到蓝色固体形式的标题产物(9.0mg,12μmol,33％产率)。分析型HPLC tR＝29.1min。MALDI-TOF-MS,[M+H]+C34H44N3O8S2计算值＝712.25,实测值712.89。1H NMR(400MHz,d6-DMSO,加入4mM碳酸乙烯酯作为内标[21])δ＝8.30-8.45(m,2H,菁桥CH-CH-CH-CH-CH-CH),7.83(2×dJ＝9.1Hz,2H,芳基),7.62-7.67(m,2H,芳基),7.30-7.38(m,2H,芳基),6.60(t,J＝12.3Hz,1H,菁桥CH-CH-CH-CH-CH-CH),6.26–6.42(2×d,J＝13.7Hz,2×1H,菁桥CH-CH-CH-CH-CH-CH),4.05-4.20(m,4H,N-CH 2-CH2-CH2-N3+N-CH 2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH),3.49(在水峰下,2H,N-CH2-CH2-CH 2-N3),2.21(t,J＝7.2Hz,2H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH 2-COOH),1.90–2.05(m,2H,N-CH2-CH 2-CH2-N3),1.71(2×s+m,14H,4×假吲哚CH3+N-CH2-CH 2-CH2-CH2-CH2-COOH),1.50–1.60(m,2H,N-CH2-CH2-CH2-CH 2-CH2-COOH)1.32-1.43(m,2H,N-CH2-CH2-CH 2-CH2-CH2-COOH)ppm。
N3-Cy5-SPZ的生成
实验室饲养的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)被恶性疟原虫寄生虫(NF54)感染，如Ponnudurai,T.等人Infectivity of cultured Plasmodium falciparumgametocytes to mosquitoes.Parasitology 98Pt 2,165-173(1989)中所述。感染后14-21天，在RPMI培养基中解剖并收集唾液腺。将DMSO(5μl)中的Cy5-(SO3)叠氮C3-(SO3)COOH(57nmol)加入到PBS中的悬浮唾液腺中。悬浮液在37℃下摇动3小时，然后以13000RPM离心30秒钟。可见蓝色沉淀，并且上清液被小心地除去。加入150μl RPMI+10％FCS并涡旋悬浮液。再次除去上清液，并且再重复该过程两次。将唾液腺粉碎，用150μl RPMI+10％FCS重新悬浮蓝色沉淀，并用于进一步的实验。
N3-Cy5-sPf的生成也通过共聚焦显微镜使用Cy5组分进行观察。为此，将N3-Cy5-sPf移液至带有玻璃插件的培养皿上(
玻璃底皿No.15，聚-d-赖氨酸涂层，γ射线辐射的，MatTek公司)。图像是在Leica SP5 WLL共焦显微镜上使用Leica Application Suite软件在63×放大倍率下拍摄的。Cy5荧光在633nm激发下测量，发射在650-700nm处收集。
Cy7-DBCO猝灭剂作用下N3-Cy5-COOH的光物理性质
将Cy7-DBCO(800μM在DMSO中，7.5μL)加入到N3-Cy5-COOH(100μM在PBS中，30μL)溶液中，并将所得混合物轻轻摇动60分钟。所得溶液在DMSO或PBS中稀释100倍，并生成2D荧光热图，将其与新制备的N3-Cy5-COOH(1μM，分别在PBS或DMSO中)和Cy7-DBCO(800μM在DMSO中，7.5μL)的混合物进行比较。
还测量了四个样品的吸收光谱。加入Cy7-DBCO(800μM在DMSO中，7.5μL，2当量)后，用N3-Cy5-COOH溶液(1μM在PBS中，3mL)同样通过荧光测量研究猝灭速率。每隔5分钟进行一次荧光和吸光度测量。图8显示细菌的荧光标记证实了用UBI-Cy5-叠氮化物的官能化。
Cy7-DBCO猝灭剂作用下N3-Cy5-sPf的光物理性质
将80ul含有N3-Cy5-sPf的悬浮液移液到比色杯中，并通过加入420μl水稀释6.25倍。使用荧光光谱仪(Perkin Elmer LS-55)测量荧光(在610nm激发)。在加入PBS(5μl)中的0.4nmol的Cy7-DBCO淬灭剂后，将溶液匀浆并立即再次测量，然后每隔10min测量一次，直到Cy5荧光(几乎)为零。
UBI-Cy5-叠氮化物官能化的金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌(见实施例1)按如下进行官能化：在温和摇动过程中，将0.1mL金黄色葡萄球菌悬浮液(含有1x106-1x109个活菌/mL PBS)在室温下与10μL UBI29-41-Cy5-叠氮化物(1μM)孵育1小时。作为对照，我们在相同条件下用10μL UBI29-41(1μM)孵育另一批细菌。此后，用PBS洗涤细菌两次(4min,3,500rpm)。
利用肽的Cy5组分，还通过共聚焦显微镜观察细菌用UBI-Cy5-叠氮化物的官能化。为此，将UBI-Cy5-叠氮化物官能化的金黄色葡萄球菌溶液移液至带有玻璃插件的培养皿上(
玻璃底皿No.15，聚-d-赖氨酸涂层，γ射线辐射的，MatTek公司)。图像是在LeicaSP5 WLL共焦显微镜上使用Leica Application Suite软件在63×放大倍率下拍摄的。Cy5荧光在633nm激发下测量，发射在650-700nm处收集。
上述实施例表明，本发明可成功地用于多种多细胞或单细胞病原体。
DBCO-DTPA的放射性标记(见图9，使用带有放射性标记的点击化学对病原体/细胞
进行两步官能化
对于同位素标记，DBCO-DTPA用铟-111按如下进行标记：向10μL的DBCO-DTPA(1mg/mL H2O,1.38nM)中加入90μL的0.25M乙酸铵(pH 5.5)和50μL的InCl3溶液(111MBq/0.3mL,Mallinckrodt Medical B.V.)，并将混合物在室温下于振荡水浴中轻轻搅动1小时。
随后，按照以下方案通过ITLC分析估算标记随时间的产率：在室温下，将2μL的反应混合物施加在1×7cm的ITLC-SG纸带(Agilent Technologies,USA)上10min，以0.25M乙酸铵(pH 5.5)作为流动相。1小时后，评估铟-111标记DBCO-DTPA的最高标记产率(>98％)，并直接应用于实验。为了评估放射性标记的稳定性，24小时后，用ITLC(按照上述相同的方法)测定了111In-DBCO-DTPA的放射性释放量，结果发现其不到总放射性的5％。
用111In-DBCO-DTPA标记UBI-Cy5-叠氮化物官能化的金黄色葡萄球菌
将1mL UBI-Cy5-叠氮化物官能化的金黄色葡萄球菌(1x106-1x109个活菌/毫升PBS)与15μL新标记的111In-DBCO-DTPA混合，并孵育1小时或于室温下温和摇动3小时。作为空白对照，进行无细菌孵育。此后，用PBS(4min,3,500rpm)洗涤细菌两次，并计算总培养管、细菌沉淀和洗涤液的放射性。对于细菌数量、UBI肽和时间间隔的每个样品，计算111In-DBCO-DTPA与细菌沉淀的结合，并针对空白进行校正。
图10显示了使用点击化学的共轭物部分与金黄色葡萄球菌预靶向载体的时间依赖性结合。
实施例3:孢子体与免疫细胞的相互作用(参见图16对概念的说明):
通过3-4天前喂食感染寄生虫的小鼠，用表达GFP的伯氏疟原虫感染实验室饲养的斯氏按蚊。21-28天后，手动解剖整个唾液腺，收集在RPMI培养基中，随后压碎并均质化以从它们的腺体中释放孢子体。将游离孢子体重悬于100ul中，并使用相差显微镜在Bürker计数室中计数。
单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)和巨噬细胞(MoMac)是通过根据前述方案培养外周血单核细胞获得的。MoDC和MoMac与表达GFP的基因修饰的伯氏疟原虫孢子体在37度、5％CO2下以1:1的比例孵育1小时。孢子体可以直接加入，或者在刺激前通过在室温下与抗PbCS抗体(3D11，由Antonio Mendes,iMM,Lisbon提供)孵育30分钟进行调理。刺激1小时后，收获细胞并保存在冰上以阻止进一步的吞噬作用。流式细胞术测定荧光孢子体的摄取。
通过对GFP阳性细胞进行圈门(gating)并将所述阳性细胞除以由流式细胞仪计数的细胞总数来计算调理细胞的百分比。图17，A部分显示了圈门策略的代表性例子，图17，B部分显示了所有实验中调理细胞的百分比。单核细胞衍生的树突细胞用黑条表示，单核细胞衍生的巨噬细胞用灰条表示。须状物(Whisker)代表标准差。未刺激的细胞作为阴性对照。
上述实施例说明了本发明可以成功地和广泛地应用于各种不同的病原体。
Claims (24)
1.一种用于体内施用的双组分疫苗组合物，其包含修饰为预靶向载体的(优选减毒的)病原体或共生体，所述预靶向载体包含一个或多个、能够与免疫原性次要组分上的互补共轭物部分形成高亲和力相互作用的悬垂的反应部分。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述高亲和力相互作用包括在包合亲和复合物中的超分子载体-共轭物相互作用。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中载体表面上的主要部分选自由如下组成的组：链霉亲和素、环糊精、抗体、抗体片段、配体和适体，并且其中所述共轭物部分是与各载体部分互补的部分。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述载体部分包括金刚烷基团，并且其中所述共轭物部分包括环糊精基团。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述高亲和力相互作用包括形成一个或多个共价键。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述病原体或共生体被官能化以与共轭物部分形成共价点击连接，优选使用无铜点击化学。
7.根据权利要求5或6的组合物，其中所述载体部分包含一个或多个叠氮化物基团，并且其中连接到病原体的共轭物部分包含一个或多个反应性炔基团，优选其中所有基团都适合无铜点击化学。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含载体组分，其量适于在暴露于共轭物部分时引起治疗有效的免疫应答。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述预靶向载体部分包含诊断标记。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述诊断标记选自由如下组成的组：诊断剂、显像剂、造影剂、治疗剂，优选地，诊断标记选自由如下组成的组：磁共振造影标记、阴性造影标记、不透射线的造影标记、超声造影标记、荧光标记、荧光造影标记和(放射性)同位素造影标记或其组合。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述诊断标记包括荧光放射或可检测γ射线源，优选医用放射性同位素，更优选99mTc。
12.一种用于静脉内或局部施用的免疫原性共轭物组分，其用于与权利要求1-11中任一项所述的互补载体组合物形成高亲和力相互作用；其中次要共轭物组分包含用于选择性偶联至所述预靶向载体以及至少一种选自由如下组成的组的剂的互补官能性：诊断剂、显像剂、造影剂、治疗剂或其组合或多种。
13.根据权利要求12所述的组分，其中所述共轭物组分是免疫增强剂，例如病原体相关分子模式、抗原、抗体、病原体识别受体的靶标或佐剂。
14.根据权利要求13所述的组分，其中所述共轭物组分包括对病原体具有选择性且被称为免疫原性的抗体，优选用于作为病原体的疟疾孢子体的环孢子体抗体。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中诊断剂选自由如下组成的组：磁共振造影剂、阴性造影剂、不透射线的造影剂、超声造影剂、荧光造影剂和(放射性)同位素造影剂，优选放射性同位素、荧光染料和荧光标记。
16.一种增强的疫苗组合物，其包含免疫原性量的、根据权利要求1至11中任一项所述的被修饰为预靶向载体的病原体或共生体组分，以及生理学上可接受的、根据权利要求12至15中任一项所述的共轭佐剂，所述预靶向载体具有免疫原性功能以在共轭时产生针对病原体或共生体的免疫应答，所述共轭佐剂包含有效量的免疫原性部分。
17.一种在人体中刺激针对病原体或共生体的免疫应答的方法，其包括以下步骤
a.向人体施用根据权利要求1至11中任一项所述的官能化的病原体或共生体(预靶向载体组分)，和
b.向人体施用生理学上可接受的、根据权利要求12至16中任一项所述的共轭物组分，所述共轭物组分包含含有免疫原性部分的特异性结合伴侣，在病原体或共生体的位置诱导或辅助针对病原体或共生体的免疫应答。
18.根据权利要求17所述的方法，其包括在用共轭物组分诱导或辅助免疫应答之前，允许所述预靶向载体到达期望的位置或在期望的位置积聚。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述剂是选自由如下组成的组的病原体：细菌、立克次体、支原体、分枝杆菌、原生动物、真菌以及单细胞和多细胞寄生虫。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述人体患有选自由如下组成的组的感染性微生物所致的感染：细菌、立克次体、支原体、分枝杆菌、原生动物、真菌和寄生虫。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述人体患有由选自由细菌和真菌组成的组的共生生物引起的微生物群失衡。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述人体没有遭受感染，并且其中所述免疫应答导致针对表现出目标感染剂标记的感染剂所致感染的保护性免疫，或者通过诱导针对特定共生体的免疫而产生针对微生物群紊乱的保护性免疫。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其包括提供次要共轭物组分，其中所述次要共轭物组分在施用所述主要共轭物的同时或之后短时间内施用，以形成包含预靶向载体:共轭物:次要共轭物的原位复合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述次要共轭物在预靶向载体:共轭物从靶细胞表面移除之前施用。
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