CN111132753A - pH敏感性脂质体及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

pH敏感性脂质体的制造方法包含：在加温条件下将二元醇、三元以上的多元醇和脂质体膜构成成分混合，制备在二元醇和多元醇的混合物中溶解脂质体膜构成成分而成的混合物溶液的工序；将该混合物溶液和预先加温的水性介质混合，并将它们均质化的工序；将均质化的水性介质进行骤冷，生成脂质体的工序；回收生成的脂质体的工序。利用本发明的方法，可使目前为止不稳定且难以制备的pH敏感性脂质体稳定化，并通过简便的方法制备pH敏感性脂质体。

Description

pH敏感性脂质体及其制造方法
本申请主张基于2017年9月4日在日本国提出申请的日本特愿2017-169356号和日本特愿2017-169359号的优先权，该申请记载的全部内容通过参照而直接援引于本说明书。另外，本申请中引用的全部专利、专利申请和文献中记载的全部内容通过参照而直接援引于本说明书。
技术领域
本发明涉及pH敏感性脂质体及其制造方法，更详细而言，涉及在二元醇和三元以上的多元醇的混合物中添加脂质体的膜构成成分并溶解而得到的pH敏感性脂质体及其制造方法。
背景技术
脂质体作为用于将生物学活性分子传递至细胞质内的载体受到关注。使用脂质体的药剂传递中的主要课题在于，由于通常的脂质体中膜融合性低，因此，在向细胞质内转移后，内含于脂质双分子膜的药剂的释放慢。为了解决该问题，开发一种pH敏感性脂质体，其在生理的条件下稳定，并且转移至细胞质内后，在酸性条件下变得不稳定。例如，报告了使用磷脂酰乙醇胺型磷脂的脂质体的磷脂酰乙醇胺型磷脂与pH响应而使集合结构转移，在酸性环境(pH5以下)释放内含物(例如参照非专利文献1)。
另一方面，报告了使含有阳离子性亲水亲油性分子和阴离子性亲水亲油性分子和两性亲水亲油性分子的至少1种作为构成脂质的脂质体分散于水性介质中时，在酸性pH环境下，该脂质体具有正的Zeta电位，且在碱性pH环境下，该脂质体具有负的Zeta电位，该Zeta电位伴随该分散液的pH的增加，从正向负变化时，释放保持的目的物质(例如参照专利文献1)。
作为脂质体的制法，有超声波法、挤出法(Extrusion Method)、French压力法(French Press)、均质化法、乙醇注入法等各种方法，但在典型的脂质体的工业制造方法中，包括一边搅拌溶解于水混合性有机溶剂的磷脂等脂质成分一边注入添加于水溶液的方法。该方法可使用甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等醇类作为水混合性有机溶剂，但为了维持脂质的溶解状态，需要一边将脂质溶液加温，一边添加混合于水溶液；需要精密控制温度、添加速度或搅拌速度(参照专利文献2)。
另外，报告了以特定的重量比含有卵磷脂、胆固醇和甘油三酯的脂质体，即使不进行均质高压处理等工序，也可以仅通过在常见的混合中需要的搅拌而形成(参照专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5588619号公报
专利文献2：日本特表2006-517594号公报
专利文献3：日本特开2017-66059号公报
非专利文献1：Duzgunes N,Straubinger RM,Baldwin PA,Friend DS,PapahadjopoulosD.Proton-induced fusion of oleic acid-phosphatidylethanolamineliposomes.Biochemistry.1985 24(13)：3091-3098.
发明内容
发明所要解决的问题
但是，这样的pH敏感性脂质体通常不稳定，因此存在难以将水性介质中的Zeta电位成为零的pH值设定为所期望的范围，即难以在从酸性到碱性的广泛的范围内任意地设定脂质体的膜融合性；不能对应对pH敏感性脂质体具有的潜在用途的期待的问题。另外，由于pH敏感性脂质体与通常的脂质体相比不稳定，因此，其工业制造困难，谋求简便且稳定化的pH敏感性脂质体的制造方法。
本发明是为了解决上述的课题而完成的发明，其目的在于，提供一种pH敏感性脂质体，其通过调整构成脂质体的特定的构成成分的含有比率，可在特定的范围内的任意的pH条件下使脂质体的Zeta电位从正向负转变。另外，其目的在于使目前为止不稳定且难以制备的pH敏感性脂质体稳定化，可通过简便的方法制备pH敏感性脂质体。
用于解决问题的技术方案
本发明的1个实施方式涉及的pH敏感性脂质体的特征在于，含有磷脂、类固醇类、阴离子性物质和两性离子性物质作为脂质体膜构成成分，相对于脂质体膜构成成分整体，含有阴离子性物质2.5～15质量％以及两性离子性物质5～20质量％。而且，分散于以下各pH条件的水性介质中时，脂质体的Zeta电位在pH5以下为正，在pH8以上为负，而且，在pH5～8之间伴随pH值的增加从正向负转变。
本发明的其它实施方式涉及的pH敏感性脂质体的制造方法的特征在于，包含：在加温条件下将二元醇、三元以上的多元醇和脂质体膜构成成分混合，制备在所述二元醇和多元醇的混合物中溶解所述脂质体膜构成成分而成的混合物溶液的工序；将该混合物溶液和预先加温的水性介质混合，并将它们均质化的工序；将均质化的水性介质进行骤冷，生成脂质体的工序；回收生成的脂质体的工序。脂质体膜构成成分至少含有两性离子性物质，使脂质体分散于以下各pH条件下的水性介质中时，其Zeta电位在pH5以下为正，在pH8以上为负，而且，在pH5～8之间伴随pH值的增加从正向负转变。
发明效果
根据本发明，可提供一种pH敏感性脂质体，其通过调整构成脂质体的特定的构成成分的含有比率，可在广泛的范围的任意的pH条件下使脂质体的Zeta电位从正向负转变。另外，通过将二元醇、三元以上的多元醇和脂质体膜构成成分混合并溶解，与水性介质搅拌以及混合的简单操作，可制造稳定的pH敏感性脂质体。
附图说明
图1是本发明的一实施方式涉及的pH敏感性脂质体的制造方法的流程图。
图2是本发明的其它实施方式涉及的pH敏感性脂质体的制造方法的流程图。
图3是将实施例1～6中制造的脂质体分散于水性介质而测定的Zeta电位的pH曲线图。
图4是将比较例1和2中制造的脂质体分散于水性介质而测定的Zeta电位的pH曲线图。
具体实施方式
以下，一边参照附图，一边按照以下顺序对本发明的优选的实施方式进行说明。
1.pH敏感性脂质体的成分及组成
2.pH敏感性脂质体的制造方法
3.pH敏感性和其显现机制
4.形状、用途或使用方法
[pH敏感性脂质体的成分及组成]
(二元醇)
在本实施方式中，作为溶解脂质体膜构成成分的二元醇，优选为1,2-烷二醇或1,3-烷二醇。作为1,2-烷二醇或1,3-烷二醇，可举出1,2-丙二醇、1,2-丁二醇、1,2-戊二醇、1,2-辛二醇、1,2-己二醇、1,2-癸二醇、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、丙二醇等。1,2-烷二醇或1,3-烷二醇可使用一种或并用两种以上。1,2-烷二醇或1,3-烷二醇优选为1,2-丙二醇和1,3-丁二醇。1,2-链烷二醇或1,3-链烷二醇的使用量只要能够溶解脂质体膜构成成分就没有特别限定，通过相对于脂质体膜构成成分的总质量使用10～50倍左右，优选为15～30倍左右，可使生成的pH敏感性脂质体稳定化。
(多元醇)
与二元醇一同溶解脂质体膜构成成分的多元醇为3元以上的多元醇，例如可举出海藻糖、蔗糖、山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨糖醇、棉子糖等。优选为山梨糖醇和甘油。它们的使用量只要能够溶解脂质体膜构成成分就没有特别限定，通过相对于脂质体膜构成成分的总质量使用10～50倍左右，优选为15～30倍左右，可使生成的pH敏感性脂质体稳定化。
(水性介质)
本发明中，“水性介质”是不包含有机溶剂的水性介质，是指能够分散脂质体膜构成成分的介质，没有特别限定，例如为水，优选为注射用蒸馏水、生理食盐水、离子交换水，可以在这些溶液中添加等张剂、缓冲液等。或者，也可以含有作为脂质体内含物质的生理活性物质。
(脂质体膜构成成分)
作为脂质体膜构成成分，除磷脂、胆固醇等外，可举出用于对脂质体赋予pH敏感性的阴离子性物质和两性离子性物质等。以下，依次进行说明。
(1)磷脂
磷脂通常为分子内具有由长链烷基构成的疏水基和由磷酸基等构成的亲水基的亲水亲油性物质。作为磷脂，例如可使用磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸及磷脂酰肌醇这样的甘油脂质、鞘磷脂这样的鞘氨醇磷脂(sphingophospholipid)、心磷脂这样的天然或合成的二磷脂酰系磷脂及它们的衍生物、以及按照常规方法对这些物质进行氢化得到的物质(例如氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC))等。这些物质中，优选为HSPC等进行氢化得到的磷脂、鞘磷脂等。磷脂的量在脂质体膜构成成分整体中通常为20质量％以上，优选为40质量％以上。另外，其它脂质体膜构成成分的量通常为80质量％以下，优选为60质量％以下。
(2)类固醇类
作为脂质体膜的构成成分，除上述磷脂外，可进一步含有类固醇类。作为类固醇类，可举出甾醇、胆汁酸、原维生素D、类固醇激素等具有环戊烷多氢菲的全部的类固醇。其中，优选使用甾醇类。作为甾醇类，例如可举出作为脂质膜稳定化剂而发挥作用的甾醇类，例如胆固醇、二氢胆固醇、胆固醇酯、植物甾醇、谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、胆甾烷醇或羊毛甾醇等。另外，1-O-甾醇葡糖苷、1-O-甾醇麦芽糖苷或1-O-甾醇半乳糖苷的甾醇衍生物也显示对脂质体的稳定化具有效果(日本特开平5-245357号公报)。这些物质中，特别优选胆固醇。
类固醇类的含量没有特别限制，相对于脂质体的构成成分整体，优选为0.01质量％以上，更优选为0.05质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上。另外，优选为30质量％以下，更优选为10质量％以下，进一步优选为5质量％以下。类固醇类可作为分子集合物的稳定化剂而发挥作用。类固醇类可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
(3)阴离子性物质
用于对脂质体赋予pH敏感性的阴离子性物质可举出二酰基甘油半琥珀酸酯、二酰基甘油半丙二酸酯、二酰基甘油半戊二酸酯、二酰基甘油半己二酸酯、二酰基甘油半环己烷-1,4-二酸、脂肪酸、例如、油酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、神经酸、山萮酸等，但并不限定于这些。特别优选常温下为固体的饱和脂肪酸，特别优选为棕榈酸、硬脂酸。在本说明书中，常温是指10℃～30℃。上述阴离子性物质相对于脂质体构成成分的整体量的含有比例为0～20质量％，优选为2.5质量％以上，进一步优选为5质量％以上。另一方面，含有比例的上限可以为20质量％，优选为15质量％。如果阴离子性物质的含有比例超过20％，则在含有脂质体膜构成成分的水性介质中难以维持乳化状态，会产生白浊、凝聚、沉淀而成为不均质的脂质体制剂。
(4)两性离子性物质
作为用于对脂质体赋予pH敏感性的两性离子性物质，可举出月桂基甜菜碱(月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱)等N-烷基-N,N-二甲基氨基酸甜菜碱；椰油酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱等脂肪酸酰胺烷基-N,N-二甲基氨基酸甜菜碱；椰油酰两性基乙酸钠、月桂酰两性基乙酸钠等咪唑啉型甜菜碱；烷基二甲基牛磺酸等烷基磺基甜菜碱；烷基二甲基氨基乙醇硫酸酯等硫酸型甜菜碱；烷基二甲基氨基乙醇磷酸酯等磷酸型甜菜碱。上述两性离子性物质相对于脂质体构成成分的整体量的含有比例为5～20质量％，优选为7质量％以上。另一方面，含有比例的上限可以为20质量％，优选为15质量％。如果两性离子性物质的含有比例超过20质量％，则难以保持脂质体(脂质双重膜)结构。
(5)其它添加剂
本发明的pH敏感性脂质体根据需要可含有其它添加剂。例如，作为抗氧化剂，可举出生育酚同系物即维生素E等。另外，修饰脂质体表面的亲水性高分子的脂质衍生物只要不损害脂质体的结构稳定，就没有特别限定，例如可举出聚乙二醇、葡聚糖、普鲁兰、聚蔗糖、聚乙烯醇、合成聚氨基酸、直链淀粉、支链淀粉、甘露聚糖、环糊精、果胶、卡拉胶以及它们的衍生物。其中，优选为聚乙二醇以及聚乙二醇衍生物。亲水性高分子的脂质衍生物的分子量优选为200～5万左右，更优选为1000～1万左右。
(内含物质)
本发明的pH感受性脂质体可内含水溶性或脂溶性的各种目的物质。使目的物质保持于脂质体的方法只要根据目的物质的种类等适当选择即可。例如在目的物质为水溶性药物的情况下，可在脂质体制造时使药物溶解于水性介质而制备。未被保持的水溶性药物可通过凝胶过滤、超离心分离或超过滤膜处理等而与保持有目的物质的脂质体分离。另一方面，在脂溶性药物的情况下，通过在脂质体膜构成成分溶于二元醇和多元醇的混合物的状态下混合药物而形成脂质体，从而可使目的物质保持于例如双分子膜囊泡(小胞体)的疏水部。
[pH敏感性脂质体的制造方法]
接着，一边参照附图一边对本实施方式涉及的pH敏感性脂质体的制造方法进行说明。应予说明，以下各工序为优选的实例，可以适当在各工序中加以变形或进一步追加公知的制造方法。例如，为了调整脂质体的粒径，可以组合超声波照射法、挤出法(ExtrusionMethod)、French压力法(French Press)、均质化法等。
(二元醇和多元醇的溶解工序)
图1中，在步骤S01中，在加温条件下将至少1种二元醇和至少1种多元醇混合，将它们均质化而制备二元醇和多元醇的混合物。只要能够均匀溶解脂质体膜构成成分，二元醇和多元醇的混合比例就没有特别限定，优选为1：5～5：进一步优选为1，1：2～2：1，最优选为大致1：1。这些的混合方法除利用手动的摇动、使用搅拌子、搅拌叶片的搅拌外，可使用超声波振动器等而进行。另外，混合时的加温条件，只要是这些混合物熔化的温度，就没有特别限制，优选为60℃～90℃，更优选为80℃～85℃。
加温方法没有特别限定，例如除将容器放入装有温水的浴槽内的温浴外，可采用以在容器内装有混合物的状态利用直火将该容器加热的方法、将容器放入电热器内的方法等。
(脂质体膜构成成分的溶解工序)
接着，在步骤S02中，在处于均质化状态的上述混合物中添加脂质体膜构成成分。而且，制备在二元醇和多元醇的混合物中溶解有添加的脂质体膜构成成分的混合物溶液。可以分别添加磷脂等各成分并进行混合，但为了提高可溶化的效率，优选预先混合全部的脂质体膜构成成分并将这些物质添加于上述混合物中。此时，各成分的含量只要是上述范围内，就没有特别限定，阴离子性物质和两性离子性物质的含有比率优选为1：1～1：3的范围内。
作为脂质的一种的胆固醇通常不易溶于水，难以制备脂质体膜中的浓度。但是，如本实施方式这样通过预先使磷脂共存于二元醇和多元醇的混合物中而使胆固醇溶解，从而可容易地调整胆固醇在脂质体膜中的导入量。
(均质化工序)
在步骤S03中，将步骤S02中制备的混合物溶液和预先在80℃～85℃加温的水性介质进行混合。此时，水性介质相对于这些混合物整体的添加量必须以脂质体膜构成成分成为用于形成脂质体的适当的浓度区域的方式进行调整。如果水性介质的量过多，则溶解于二元醇和多元醇的混合物中的脂质成分快速凝集而不能形成脂质体。因此，本工序中添加的水性介质的量优选以成为溶解于二元醇和多元醇的混合物溶液的脂质成分与水性介质混合时可溶解的临界浓度的方式设定。例如，相对于步骤S02中制备的混合物溶液的容量，为2～6倍量，优选为3～5倍量，进一步优选为约4倍量。
(脂质体生成工序)
在步骤S04中，通过将在80℃～85℃脂质体膜构成成分溶解的水性介质骤冷至室温附近而生成脂质体。冷却方法没有特别限定，例如除将容器放入到装有冷水的浴槽内的方法外，可采用以在容器内装有混合物的状态将该容器放入冰箱等的方法等。冷却温度只要是脂质体生成的温度，就没有特别限定。如果举出示例，则在脂质中使用磷脂酰胆碱和胆固醇的情况下，作为冷却温度，优选设为62℃以下。可以进一步冷却至室温附近。另外，作为冷却速度，优选为0.5℃/分钟以上，进一步优选为1℃/分钟以上。
(回收工序)
在步骤S05中，可利用过滤、倾析等任意的方法回收存在于水性介质中的脂质体。应予说明，在图1所示的实施方式中，在步骤S01中预先将二元醇和多元醇混合并均质化的溶液中，在步骤S02中添加脂质体膜构成成分，但不一定限定于这样的顺序。例如，可以为在预先加温的二元醇中添加脂质体膜构成成分并溶解，然后添加多元醇并均质化的方法，或者与之相反，首先多元醇和脂质体膜构成成分混合并溶解，然后添加二元醇并均质化的方法。因此，作为本发明的其它实施方式，如图2所示，在步骤S11中，可以以任意的顺序将二元醇、多元醇和脂质体膜构成成分混合，最终在二元醇和多元醇的混合物中溶解脂质体膜构成成分。步骤S11以后的工序与图1相同。
[pH敏感性和其显现机制]
本实施方式的pH敏感性脂质体具有以下性质：使其分散于pH条件不同的各种水性介质中时，其Zeta电位在pH5以下为正，在pH8以上为负，而且，在pH5～8之间伴随pH值的增加从正向负转变。
在此，作为分散于水性介质中的脂质体粒子的带电状态的指标的Zeta电位被定义为将从粒子充分分离而电中性的区域的电位定义为零，进而以该零点为基准测量时的“滑动面”的电位。在微粒的情况下，如果Zeta电位的绝对值增加，则粒子间的排斥力变强，粒子的稳定性变高。相反，如果Zeta电位接近于零，则粒子容易凝聚。因此，Zeta电位被用作分散的粒子的分散稳定性的指标(北原文雄、古泽邦夫、尾崎正孝、大岛广行，“Zeta PotentialZeta电位：微粒子界面的物理化学”，Scientist出版社，1995)。
因此，本实施方式的pH敏感性脂质体显示表面电荷在pH5～8之间伴随pH值的增加从正向负转变的行为，因此，可认为在脂质体分散液的pH为5以下的酸性条件下保持目的物质而稳定存在，在脂质体分散液的pH为5～8之间Zeta电位变为零的pH条件下变得不稳定，引起膜融合而释放内含物。作为Zeta电位的测定方法，可使用公知的方法。例如，如果从外部对带电的粒子分散的体系施加电场，则粒子向电极泳动(移动)，但其速度与粒子的荷电呈正比，因此，可通过测定该粒子的泳动速度而测定Zeta电位。电泳光散射测定法也被称为激光多普勒法，通过观测来自泳动的粒子的散射光，可求出Zeta电位。
[形状、用途或使用方法]
本实施方式的pH敏感性脂质体分散于水性介质时，可显示在酸性pH环境下具有正的Zeta电位，且在碱性pH环境下具有负的Zeta电位的以往没有的pH响应行为。近年，在进行将基因、核酸衍生物等带负电的物质导入细胞内的研究。由于本实施方式的pH敏感性脂质体在pH5以下的酸性条件下具有正的表面电荷，因此可吸附这些物质，可用于在pH5～8的弱酸性至中性条件下释放这些物质而导入细胞内。另外，对形状也没有特别限制，可以为粒径为100nm～10μm的多层脂质体，也可以为单层脂质体。本实施方式的pH敏感性脂质体也可根据其用途而适当调整粒径。例如，如果以对活体内进行给药为目的，则优选调整为200nm以下的粒径。具体的粒径的调整方法可通过使用挤压机使其通过孔径小的过滤器而进行粒径的调节。据说粒径为100nm左右或其以下的小的尺寸的单层脂质体的大小均匀且热力学稳定，即使在作为化妆品使用的情况下，对皮肤的浸透性也良好。
本实施方式的pH响应性脂质体分散于水性介质时，可显示在酸性pH环境下具有正的Zeta电位，且在碱性pH环境下具有负的Zeta电位的以往没有的pH响应行为。近年，在进行将基因、核酸衍生物等带负电的物质导入细胞内的研究。由于本实施方式的pH响应性脂质体在pH5以下的酸性条件下具有正的表面电荷，因此可期待将这些物质导入细胞内的方法等用途进行推广。
实施例
以下实施例证明本发明的1个方式和方面，是为了进一步例示而记载的，不应该解释为限定本发明的范围。
[实施例1]
在丙烷-1,2-二醇10.0g中添加山梨糖醇10.0g，在80℃～85℃利用通用搅拌机以350rpm进行加温搅拌溶解并均质化。在加温搅拌的该液体中添加含有磷脂酰胆碱的氢化卵磷脂0.41g、胆固醇0.09g、棕榈酸0.05g、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱0.1g，同样进行搅拌溶解。
在上述制备的混合物溶液中以成为100g的方式添加预先加温至80℃～85℃的精制水，一边搅拌一边混合，利用通用搅拌机以350rpm搅拌1～2小时。停止加温，一边搅拌一边骤冷，冷却至室温左右，将生成的脂质体进行过滤并回收。
[实施例2]
在丙烷-1,2-二醇10.0g中添加甘油10.0g，在80℃～85℃利用通用搅拌机以350rpm进行加温搅拌并均质化。在加温搅拌的该液体中添加含有磷脂酰胆碱的氢化卵磷脂0.82g、胆固醇0.18g、硬脂酸0.1g、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱0.2g，同样进行搅拌溶解。
在上述制备的混合物溶液中以成为100g的方式添加预先加温至80℃～85℃的精制水，一边搅拌一边混合，利用均质机以8000rpm搅拌1～2小时。停止加温，一边搅拌一边骤冷，冷却至室温左右，将生成的脂质体进行过滤并回收。
[实施例3]
在丙烷-1,2-二醇5.0g中添加甘油10.0g，在80℃～85℃利用通用搅拌机以500rpm进行加温搅拌并均质化。在加温搅拌的该液体中添加含有磷脂酰胆碱的氢化卵磷脂0.41g、胆固醇0.09g、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱0.1g，同样进行搅拌溶解。在上述制备的混合物溶液中以成为100g的方式添加预先加温至80℃～85℃的精制水，一边搅拌一边混合，利用挤压机进行处理。
[实施例4]
在丙烷-1,2-二醇30.0g中添加山梨糖醇10.0g，在80℃～85℃利用通用搅拌机以600rpm进行加温搅拌溶解并均质化。在加温搅拌的该液体中添加含有磷脂酰胆碱的氢化卵磷脂0.41g、胆固醇0.09g、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱0.2g，同样进行搅拌溶解。在上述制备的混合物溶液中以成为100g的方式添加预先加温至80℃～85℃的精制水，一边搅拌一边混合，利用挤压机进行处理。
[实施例5]
在1,3-丁二醇10.0g中添加甘油10.0g，在80℃～85℃利用通用搅拌机以600rpm进行加温搅拌并均质化。在加温搅拌的该液体中添加含有磷脂酰胆碱的氢化卵磷脂0.41g、胆固醇0.09g、棕榈酸0.05g、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱0.1g，同样进行搅拌溶解。在上述制备的混合物溶液中以成为100g的方式添加预先加温至80℃～85℃的精制水，一边搅拌一边混合，利用挤压机进行处理。
[实施例6]
在1,3-丁二醇30.0g中添加山梨糖醇10.0g，在80℃～85℃利用通用搅拌机以600rpm进行加温搅拌溶解并均质化。在加温搅拌的该液体中添加含有磷脂酰胆碱的氢化卵磷脂0.41g、胆固醇0.09g、棕榈酸0.15g、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱0.3g，同样进行搅拌溶解。在上述制备的混合物溶液中以成为100g的方式添加预先加温至80℃～85℃的精制水，一边搅拌一边混合，利用挤压机进行处理。
[比较例1]
在1,3-丁二醇5.0g中添加甘油15.0g，在80℃～85℃利用通用搅拌机以350rpm进行加温搅拌并均质化。在加温搅拌的该液体中添加含有磷脂酰胆碱的氢化卵磷脂0.41g、胆固醇0.09g、棕榈酸0.05g，同样进行搅拌溶解。在上述制备的混合物溶液中以成为100g的方式添加预先加温至80℃～85℃的精制水，一边搅拌一边混合，1～2小时后，利用挤压机进行处理。
[比较例2]
添加甘油10.0g，在80℃～85℃利用通用搅拌机以350rpm加温搅拌溶解并均质化。在加温搅拌的该液体中添加含有磷脂酰胆碱的氢化卵磷脂0.82g、胆固醇0.18g、棕榈酸0.05g、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱0.1g，同样进行搅拌溶解。在上述制备的混合物溶液中以成为100g的方式添加预先加温至80℃～85℃的精制水，一边搅拌一边混合，利用通用搅拌机以350rpm搅拌1～2小时。停止加温，一边搅拌一边骤冷，冷却至室温左右，进行过滤。
[比较例3]
添加甘油10.0g，在80℃～85℃利用通用搅拌机以350rpm加温搅拌溶解并均质化。在加温搅拌的该液体中添加含有磷脂酰胆碱的氢化卵磷脂0.82g、胆固醇0.18g、棕榈酸0.05g，同样进行搅拌溶解。在上述制备的混合物溶液中以成为100g的方式添加预先加温至80℃～85℃的精制水，一边搅拌一边混合，使用均质机以8000rpm搅拌1～2小时。停止加温，一边搅拌一边骤冷，冷却至室温左右。该比较例中，油脂的再析出多(认为乳化力不足)，不能制作脂质体。
[3]Zeta电位的测定
使用氢氧化钾水溶液和磷酸水溶液将上述实施例及比较例中制备的脂质体的水性分散液调整为各种pH，在26℃恒温条件下使用Malvern公司制的商品名Zetasizer NanoSeries ZSP测定Zeta电位。将其结果示于图3和4。如图3所示，可知实施例1～6中制备的脂质体在pH5以下的水性介质中全部具有正的Zeta电位，在pH5.4至pH7.6之间伴随pH值的增加Zeta电位接近于零，从正向负转变。如果pH高于该范围，则Zeta电位变成负的值。与此相对，如图4所示，比较例1中制备的脂质体在pH4以下仅显示正的Zeta电位，但由于Zeta电位的绝对值小，因此认为在该区域中非常不稳定。另外，比较例2中制备的脂质体在所有的pH中显示负的Zeta电位。如此可知：实施例1～6中制备的脂质体显示pH敏感性，同时在pH5以下Zeta电位的绝对值大，因此可稳定地存在。

Claims (15)

1.一种pH敏感性脂质体，其特征在于，含有磷脂、类固醇类、阴离子性物质和两性离子性物质作为脂质体膜构成成分，
所述脂质体相对于所述脂质体膜构成成分整体，含有所述阴离子性物质2.5～15质量％以及所述两性离子性物质5～20质量％，
当使所述脂质体分散于以下各pH条件的水性介质中时，所述脂质体的Zeta电位在pH5以下为正，在pH8以上为负，而且在pH5～8之间伴随pH值的增加从正向负转变。
2.根据权利要求1所述的pH敏感性脂质体，其中，
所述阴离子性物质和所述两性离子性物质的含有比率为1：1～1：3。
3.根据权利要求1或2所述的pH敏感性脂质体，其中，
所述阴离子性物质为常温下为固体的饱和脂肪酸。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的pH敏感性脂质体，其中，
所述两性离子性物质为选自以下物质中的至少1种：包含月桂基甜菜碱、即月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱的N-烷基-N,N-二甲基氨基酸甜菜碱；包含椰油酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱的脂肪酸酰胺烷基-N,N-二甲基氨基酸甜菜碱；包含椰油酰两性基乙酸钠、月桂酰两性基乙酸钠的咪唑啉型甜菜碱；包含烷基二甲基牛磺酸的烷基磺基甜菜碱；包含烷基二甲基氨基乙醇硫酸酯的硫酸型甜菜碱以及包含烷基二甲基氨基乙醇磷酸酯的磷酸型甜菜碱。
5.根据权利要求3所述的pH敏感性脂质体，其中，
所述常温下为固体的饱和脂肪酸为棕榈酸或硬脂酸。
6.pH敏感性脂质体的制造方法，其特征在于，包含：
在加温条件下将二元醇、三元以上的多元醇和脂质体膜构成成分混合，制备在所述二元醇和多元醇的混合物中溶解所述脂质体膜构成成分而得到的混合物溶液的工序；
将所述混合物溶液和预先加温的水性介质混合，并将它们均质化的工序；
将所述均质化的水性介质骤冷，生成脂质体的工序；
回收所述脂质体的工序；
所述脂质体膜构成成分至少含有两性离子性物质，
当使所述脂质体分散于以下各pH条件的水性介质中时，所述脂质体的Zeta电位在pH5以下为正，在pH8以上为负，而且，在pH5～8之间伴随pH值的增加从正向负转变。
7.根据权利要求6所述的pH敏感性脂质体的制造方法，其中，
所述混合物溶液是在预先在加温条件下将所述二元醇和所述三元以上的多元醇混合并均质化而得到的溶液中添加所述脂质体膜构成成分并搅拌而得到的。
8.根据权利要求6或7所述的pH敏感性脂质体的制造方法，其中，
相对于所述脂质体膜构成成分整体，含有所述两性离子性物质5～20质量％。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的pH敏感性脂质体的制造方法，其中，
相对于所述脂质体膜构成成分整体，以2.5～15质量％的比率含有阴离子性物质。
10.根据权利要求9所述的pH敏感性脂质体的制造方法，其中，
所述阴离子性物质和所述两性离子性物质的含有比率为1：1～1：3。
11.根据权利要求6～10中任一项所述的pH敏感性脂质体的制造方法，其中，
所述脂质体膜构成成分还含有磷脂和胆固醇。
12.根据权利要求9～11中任一项所述的pH敏感性脂质体的制造方法，其中，
所述阴离子性物质为常温下为固体的饱和脂肪酸。
13.根据权利要求6～12中任一项所述的pH敏感性脂质体的制造方法，其中，
所述两性离子性物质为选自以下物质中的至少1种：包含月桂基甜菜碱、即月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱的N-烷基-N,N-二甲基氨基酸甜菜碱；包含椰油酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱的脂肪酸酰胺烷基-N,N-二甲基氨基酸甜菜碱；包含椰油酰两性基乙酸钠、月桂酰两性基乙酸钠的咪唑啉型甜菜碱；包含烷基二甲基牛磺酸的烷基磺基甜菜碱；包含烷基二甲基氨基乙醇硫酸酯的硫酸型甜菜碱以及包含烷基二甲基氨基乙醇磷酸酯的磷酸型甜菜碱。
14.根据权利要求6～13中任一项所述的pH敏感性脂质体的制造方法，其中，
所述二元醇为丙烷-1,2-二醇、1,3-丁二醇或它们的混合物，所述多元醇为山梨糖醇、甘油或它们的混合物。
15.根据权利要求12所述的pH敏感性脂质体的制造方法，其中，
所述常温下为固体的饱和脂肪酸为棕榈酸或硬脂酸。
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