CN111123429A - 涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法及波导孔结构 - Google Patents

涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法及波导孔结构 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，该方法通过调节高折射率非反射层的沉积厚度可以缩小零模波导孔的孔内体积，显著减少孔内的游离核苷酸，提高信噪比；通过在孔内部沉积高折射率非反射层材料可以使被激发荧光的位置远离零模波导孔的金属壁，使荧光不会减弱甚至淬灭，荧光效果增强的同时也使得检测更加灵敏；选取设定的高折射率非反射层材料以及沉积厚度(即控制孔内样本与非反射壁的折射率)可以在增强荧光与保证酶活性之间获得最佳平衡；通过使用掩模版和正胶的光刻可以使每个零模波导孔中心底部精确的连接DNA聚合酶，提升孔的利用率。本发明还涉及一种涂覆有锚定物质的零模波导孔结构。

Description

涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法及波导孔结构
技术领域
本发明涉及微纳加工工艺领域，尤其涉及一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法。
背景技术
目前利用零模波导孔(ZMW)实现单分子实时测序，两个主要技术成分是：一是零模波导(ZMW)限制允许在与酶相关的标记核苷酸浓度下进行单分子检测，另一个是荧光标记的磷酸连接核苷酸，允许观察不间断的DNA聚合。
ZMWs纳米结构由密集的孔阵列组成，在透明衬底(例如二氧化硅)上沉积金属膜。每个ZMW变成一个纳米光子可视化室，用于记录单个聚合反应，提供的检测体积仅为10-21升。这个体积比衍射限制共焦显微镜提高1000倍，使得在荧光标记核苷酸扩散的背景下观察单核苷酸掺入事件成为可能。除了减少观察体积内标记核苷酸的数量外，高度受限的体积还导致扩散探视时间大大缩短。这使得通过观察体积(通常持续几微秒)的标记核苷酸扩散事件和酶核苷酸掺入事件(通常持续几毫秒)之间更好的时间区分。第二个重要组成部分是磷酸连接核苷酸，其荧光标签通常通过连接体连接到末端磷酸盐而不是碱基。用磷酸连接的核苷酸100％取代未修饰的核苷酸，这是因为酶在结合过程中分解荧光团，留下一个完全天然的双链核酸。
但是在测序的过程中孔内游离的核苷酸较多，对荧光信号检测产生干扰、信噪比低；荧光在被激发时越靠近金属孔壁产生的效果越弱，当完全靠近时会发生荧光淬灭。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法。
本发明通过使用掩膜版与正胶的光刻使每个零模波导孔的底部精确连接DNA聚合酶，提升孔的利用率。
本发明提供一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，包括如下步骤：
在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，所述高折射率非反射材料用于减小所述零模波导孔的孔内体积；
在所述高折射率非反射材料的表面以及所述零模波导孔的底部涂覆正性光刻胶，且在所述零模波导孔的衬底底部通过叠加掩膜版进行曝光，所述掩膜版与所述零模波导孔的底端相对应的位置镂空，以使得涂覆于所述零模波导孔的底端处的所述正性光刻胶在显影后溶解，记为第一区域；
在所述零模波导孔的内壁涂覆锚定物质，所述锚定物质用于吸附待测样本中的DNA聚合酶；所述锚定物质涂覆于所述正性光刻胶的表面以及填充所述第一区域；通过剥离的方式将所述正性光刻胶与其表面的所述锚定物质去除，以使得所述第一区域的所述锚定物质保留于所述零模波导孔的底部。
优选地，在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，包括的方法如下：
在所述零模波导孔的内部涂覆负性光刻胶，从所述零模波导孔的透明衬底侧进行光照射，位于所述零模波导孔底端的所述负性光刻胶曝光且其他区域未曝光；显影后所述零模波导孔底端的所述负性光刻胶保留；
在所述零模波导孔的内部覆盖所述高折射率非反射材料，所述高折射率非反射材料覆盖于所述负性光刻胶的表面；
通过剥离的方式将所述负性光刻胶以及表面的所述高折射率非反射材料一同去除，获得孔壁上覆盖有所述高折射率非反射材料的所述零模波导孔。
优选地，所述高折射率非反射材料通过沉积的方式覆盖于所述零模波导孔的内部，所述沉积的方式包括气相沉积或选择性原子沉积；所述高折射率非反射材料包括铝、钛、锌、铬、银、镁、锆、硅的氧化物或氮化物、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、聚酰亚胺、纤维素基聚合物、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、正丁基聚合物、含氟聚合物、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或多种。
优选地，在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，包括的方法如下：
在所述零模波导孔的内部涂覆具备络合纳米颗粒的光敏材料，从所述零模波导孔的透明衬底侧进行光照射，位于所述零模波导孔底部的所述光敏材料失去活性；所述零模波导孔的金属覆盖层表面的所述光敏材料络合所述高折射率非反射材料，以获得所述金属覆盖层上覆盖有所述高折射率非反射材料的所述零模波导孔。
优选地，所述光敏材料包括聚多巴胺PDA薄膜。
优选地，位于所述零模波导孔底部的失去活性的所述光敏材料为透明材料。
优选地，所述第一区域位于所述零模波导孔底部的中心位置。
优选地，所述高折射率非反射材料与待测样本的折射率比的范围为：1.5到3.0。
本发明还提供一种涂覆有锚定物质的零模波导孔结构，包括利用所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法制作的波导孔结构本体，所述波导孔结构本体包括透明衬底、光纤波导、金属覆盖层、高折射率非反射层和锚定物质，所述透明衬底、光纤波导、金属覆盖层、高折射率非反射层依次层叠；其中，
所述高折射率非反射层覆盖于所述金属覆盖层的表面，所述高折射率非反射层与所述光纤波导形成波导孔，所述波导孔的孔壁为所述高折射率非反射层，所述波导孔的底部为所述光纤波导；
所述锚定物质设置于所述波导孔的底部，以使得DNA聚合酶精确连接所述锚定物质。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明公开了一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，该方法通过调节高折射率非反射层的沉积厚度可以缩小零模波导孔的孔内体积，显著减少孔内的游离核苷酸，提高信噪比；通过在孔内部沉积高折射率非反射层材料可以使被激发荧光的位置远离零模波导孔的金属壁，使荧光不会减弱甚至淬灭，荧光效果增强的同时也使得检测更加灵敏；选取设定的高折射率非反射层材料以及沉积厚度(即控制孔内样本与非反射壁的折射率)可以在增强荧光与保证酶活性之间获得最佳平衡；通过使用掩模版和正胶的光刻可以使每个零模波导孔中心底部精确的连接DNA聚合酶，提升孔的利用率。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法的整体流程图；
图2为本发明的零模波导孔的内部旋涂负性光刻胶的结构图；
图3为图2经过曝光显影后的结构图；
图4为在图3的零模波导孔的内部覆盖高折射率非反射材料的结构示意图；
图5为在图4经过剥离工艺后获得的零模波导孔的结构示意图；
图6为在图5的基础上调整高折射率非反射材料的厚度后的结构示意图；
图7为本发明的另一种实施例中在零模波导孔的内部旋涂光敏材料的结构示意图；
图8为图7经过紫外光从零模波导孔的底部照射后的结构示意图；
图9为图8的具有活性的光敏材料络合的高折射率非反射材料的结构示意图；
图10为在图5的基础上在孔内部旋涂正性光刻胶的示意图；
图11为图10利用掩膜版曝光显影后的示意图；
图12为在图11的零模波导孔的内部覆盖锚定物质的示意图；
图13为图12经过剥离工艺后获得的示意图；
附图标记：101、透明衬底，102、光纤波导，103、金属覆盖层，104、负性光刻胶，105、高折射率非反射材料，110、底部区域，201、正性光刻胶，202、掩膜版，203、第一区域，204、锚定物质，205、单个DNA分子聚合酶。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明提供一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，如图1-13所示，包括如下步骤：
S1、在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，所述高折射率非反射材料用于减小所述零模波导孔的孔内体积。零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料的方法包括下面两个可替换的实施方式。
在一个实施例中，如图2-6所示，在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，包括的方法如下：
如图2所示，在所述零模波导孔的内部涂覆负性光刻胶，从所述零模波导孔的透明衬底101侧进行光照射，根据零模波导孔自身的光学性质即从零模波导孔的透明衬底101侧照射的光只能照射到其底部区域110，位于所述零模波导孔底端的所述负性光刻胶104曝光且其他区域未曝光；如图3所示，显影后所述零模波导孔底端的所述负性光刻胶104保留；
在所述零模波导孔的内部覆盖所述高折射率非反射材料105，所述高折射率非反射材料105覆盖于所述负性光刻胶104的表面；
通过剥离的方式将所述负性光刻胶104以及表面的所述高折射率非反射材料105一同去除，获得孔壁上覆盖有所述高折射率非反射材料105的所述零模波导孔。在零模波导孔的内部即金属覆盖层103的表面与光纤波导102的表面旋涂负性光刻胶104，根据零模波导孔本身的光学性质即从透明衬底101底部照射的光只能照射到零模波导孔的底部，利用零模波导孔的这一光学特性在零模波导孔的底部对负性光刻胶101进行曝光，因为金属覆盖层103为非透明材料，故零模波导孔的底部被曝光。被曝光的零模波导孔放置在显影液中进行显影，清洗后只在被曝光区域仍有光刻胶覆盖其他区域的光刻胶被溶解。
在零模波导孔的内部表面覆盖一层高折射率非反射材料105，高折射率非反射材料105覆盖被曝光保留下来的光刻胶与金属覆盖层103的表面，高折射率非反射材料105与待测样本折射比率越高，荧光的强度就越高，但是较高的荧光强度会影响酶的活性，可以通过控制高折射率非反射材料105在零模波导孔的孔壁上的厚度来调整高折射率非反射材料105与待测样本的折射比率，该折射比率一般控制在1.5-3.0之间可保证在增强荧光的同时保证酶的活性。
所述高折射率非反射材料105通过沉积的方式覆盖于所述零模波导孔的内部，所述沉积的方式包括气相沉积(CVD)或选择性原子沉积(ALD)。所述高折射率非反射材料105包括铝、钛、锌、铬、银、镁、锆、硅的氧化物或氮化物、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、聚酰亚胺、纤维素基聚合物、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、正丁基聚合物、含氟聚合物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中的一种或多种,以及氧化硅与其他氧化物组成的溶胶或凝胶。
在另一个可替换的实施例中，如图7-9所示，在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，包括的方法如下：
在所述零模波导孔的内部涂覆具备络合纳米颗粒的光敏材料301，从所述零模波导孔的透明衬底101侧进行光照射，位于所述零模波导孔底部的所述光敏材料301失去活性；所述零模波导孔的金属覆盖层103表面的所述光敏材料301络合所述高折射率非反射材料105，以获得所述金属覆盖层上覆盖有所述高折射率非反射材料105的所述零模波导孔。该实施例提供一种较为简便的利用零模波导孔光学性质沉积高折射率非反射材料的方法，在零模波导孔的内部旋涂一层表面可以络合纳米颗粒的光敏材料，光敏材料优选为聚多巴胺PDA薄膜，由于零模波导孔本身的光学性质即从透明衬底照射的光只能照射到零模波导孔的底部区域302。
被光照射的零模波导孔的底部的光敏材料303失去活性即不能络合高折射率非反射材料105，该失去活性的光敏材料303为透明材质，透明材质将不会影响在后续的涂覆锚定物质的制备方法；而其余部分即金属覆盖层的表面的光敏材料的活性不变，络合设定厚度的高折射率非反射材料，使得高折射率非反射材料与待测样本的折射比率在1.5-3.0之间，以保证在增强荧光的同时保证酶的活性。
S2、在所述高折射率非反射材料105的表面以及所述零模波导孔的底部涂覆正性光刻胶201，且在所述零模波导孔的衬底底部通过叠加掩膜版202进行曝光，所述掩膜版202与所述零模波导孔的底端相对应的位置镂空，以使得涂覆于所述零模波导孔的底端处的所述正性光刻胶201在显影后溶解，记为第一区域203。在一个实施例中，如图10、11所示，零模波导孔包括按顺序叠加的透明衬底101、非透明的光纤波导102与金属覆盖层103，透明衬底101、光纤波层102以及金属覆盖层103三者之间固定连接，光纤波导102与金属覆盖层103之间一般通过电子束加工而成。金属覆盖层103与光纤波导102形成零模波导孔，光纤波导102作为零模波导孔的底部，金属覆盖层103作为零模波导孔的侧壁。
在零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料105，高折射率非反射材料105用于减小所述零模波导孔的孔内体积，以减少孔内的游离核苷酸，提高信噪比。在高折射率非反射材料105的表面以及零模波导孔的底部同时涂覆正性光刻胶201，并在零模波导孔的底部附加掩膜版202进行曝光；涂覆的方式优选旋涂的涂抹方式，在零模波导孔的底部即透明衬底的底部叠加掩膜版202进行曝光。掩膜版202与透明衬底101叠加并将与正性光刻胶201上需要溶解的位置相对应的位置进行镂空，即将零模波导孔的底部的中心位置即第一区域203对应的掩膜版202上的位置设置为镂空，以使得光照射到零模波导孔底部的中心位置，通过显影液显影后使该中心位置即第一区域203上的正性光刻胶溶解，其他区域的正性光刻胶未溶解。
S3、在所述零模波导孔的内壁涂覆锚定物质204，所述锚定物质204用于吸附待测样本中的DNA聚合酶；所述锚定物质204涂覆于所述正性光刻胶201的表面以及填充所述第一区域203；通过剥离的方式将所述正性光刻胶201与其表面的所述锚定物质204去除，以使得所述第一区域203的所述锚定物质保留于所述零模波导孔的底部。在一个实施例中，如图12、13所示，在正性光刻胶201的表面以及第一区域203内涂覆锚定物质，涂覆的方式优选旋涂的涂抹方式，锚定物质204优选PEG-硅烷-亲和素即PET硅烷功能化后连接链霉亲和素，DNA聚合酶205锚定在链霉亲和素上。最后，通过剥离的方式将正性光刻胶201与其表面的锚定物质204去除，以使得只保留第一区域203的锚定物质204。在检测过程中，零模波导孔内的DNA聚合酶被锚定在第一区域203，以提升零模波导孔的利用率。优选地，第一区域203的尺寸匹配待测样本制的单个DNA聚合酶205的尺寸，即第一区域203的锚定物质204只能锚定单个DNA聚合酶205，以提高DNA聚合酶的单分子占有率。一般地，剥离的方式通过常规技术领域中的lift-off步骤实现。
本发明还提供一种涂覆有锚定物质的零模波导孔结构，包括利用所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法制作的波导孔结构本体，所述波导孔结构本体包括透明衬底、光纤波导、金属覆盖层、高折射率非反射层和锚定物质，所述透明衬底、光纤波导、金属覆盖层、高折射率非反射层依次层叠；其中，
所述高折射率非反射层覆盖于所述金属覆盖层的表面，所述高折射率非反射层与所述光纤波导形成波导孔，所述波导孔的孔壁为所述高折射率非反射层，所述波导孔的底部为所述光纤波导；
所述锚定物质设置于所述波导孔的底部，以使得DNA聚合酶精确连接所述锚定物质。
本发明通过调节高折射率非反射材料105的沉积厚度可以缩小零模波导孔的孔内体积，显著减少孔内的游离核苷酸，提高信噪比；通过在孔内部沉积高折射率非反射层材料105可以使被激发荧光的位置远离零模波导孔的金属壁，使荧光不会减弱甚至淬灭，荧光效果增强的同时也使得检测更加灵敏；选取设定的高折射率非反射层材料以及沉积厚度(即控制孔内样本与非反射壁的折射率)可以在增强荧光与保证酶活性之间获得最佳平衡；通过使用掩模版和正胶的光刻可以使每个零模波导孔中心底部精确的连接DNA聚合酶，提升孔的利用率。
以上，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，所述高折射率非反射材料用于减小所述零模波导孔的孔内体积；
在所述高折射率非反射材料的表面以及所述零模波导孔的底部涂覆正性光刻胶，且在所述零模波导孔的衬底底部通过叠加掩膜版进行曝光，所述掩膜版与所述零模波导孔的底端相对应的位置镂空，以使得涂覆于所述零模波导孔的底端处的所述正性光刻胶在显影后溶解，记为第一区域；
在所述零模波导孔的内壁涂覆锚定物质，所述锚定物质用于吸附待测样本中的DNA聚合酶；所述锚定物质涂覆于所述正性光刻胶的表面以及填充所述第一区域；通过剥离的方式将所述正性光刻胶与其表面的所述锚定物质去除，以使得所述第一区域的所述锚定物质保留于所述零模波导孔的底部。
2.如权利要求1所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，其特征在于，在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，包括的方法如下：
在所述零模波导孔的内部涂覆负性光刻胶，从所述零模波导孔的透明衬底侧进行光照射，位于所述零模波导孔底端的所述负性光刻胶曝光且其他区域未曝光；显影后所述零模波导孔底端的所述负性光刻胶保留；
在所述零模波导孔的内部覆盖所述高折射率非反射材料，所述高折射率非反射材料覆盖于所述负性光刻胶的表面；
通过剥离的方式将所述负性光刻胶以及表面的所述高折射率非反射材料一同去除，获得孔壁上覆盖有所述高折射率非反射材料的所述零模波导孔。
3.如权利要求2所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，其特征在于，所述高折射率非反射材料通过沉积的方式覆盖于所述零模波导孔的内部，所述沉积的方式包括气相沉积或选择性原子沉积；所述高折射率非反射材料包括铝、钛、锌、铬、银、镁、锆、硅的氧化物或氮化物、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、聚酰亚胺、纤维素基聚合物、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、正丁基聚合物、含氟聚合物、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，其特征在于，在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，包括的方法如下：
在所述零模波导孔的内部涂覆具备络合纳米颗粒的光敏材料，从所述零模波导孔的透明衬底侧进行光照射，位于所述零模波导孔底部的所述光敏材料失去活性；所述零模波导孔的金属覆盖层表面的所述光敏材料络合所述高折射率非反射材料，以获得所述金属覆盖层上覆盖有所述高折射率非反射材料的所述零模波导孔。
5.如权利要求4所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，其特征在于，所述光敏材料包括聚多巴胺PDA薄膜。
6.如权利要求4所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，其特征在于，位于所述零模波导孔底部的失去活性的所述光敏材料为透明材料。
7.如权利要求1所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，其特征在于，所述第一区域的尺寸匹配待测样本中的单个DNA聚合酶的尺寸。
8.如权利要求7所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，其特征在于，所述第一区域位于所述零模波导孔底部的中心位置。
9.如权利要求1所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，其特征在于，所述高折射率非反射材料与待测样本的折射率比的范围为：1.5到3.0。
10.一种涂覆有锚定物质的零模波导孔结构，其特征在于，包括利用权利要求1所述的一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法制作的波导孔结构本体，所述波导孔结构本体包括透明衬底、光纤波导、金属覆盖层、高折射率非反射层和锚定物质，所述透明衬底、光纤波导、金属覆盖层、高折射率非反射层依次层叠；其中，
所述高折射率非反射层覆盖于所述金属覆盖层的表面，所述高折射率非反射层与所述光纤波导形成波导孔，所述波导孔的孔壁为所述高折射率非反射层，所述波导孔的底部为所述光纤波导；
所述锚定物质设置于所述波导孔的底部，以使得DNA聚合酶精确连接所述锚定物质。
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