CN111118022A - 一种大豆Gm-SEIPIN1A基因及其应用 - Google Patents

一种大豆Gm-SEIPIN1A基因及其应用 Download PDF

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Abstract

一种大豆Gm‑SEIPIN1A基因及其应用属基因工程技术领域，本发明的大豆Gm‑SEIPIN1A基因，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示；本发明的大豆Gm‑SEIPIN1A基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；一种植物表达载体，包含本发明的大豆Gm‑SEIPIN1A基因所编码的蛋白质。转Gm‑SEIPIN1A的酵母突变体的油分明显提高，与酵母突变体油分相比提高了20.48％。转Gm‑SEIPIN1A基因的拟南芥种子的含油量明显提高，最高提高了18.2％。本发明的Gm‑SEIPIN1A基因能提高转基因植物种子的油分含量，对培育高油大豆品种具有重要意义。

Description

一种大豆Gm-SEIPIN1A基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大豆Gm-SEIPIN1A基因及其应用。
背景技术
大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)在世界范围内广泛种植，是一种重要的豆类作物，为 人类和家畜提供饮食蛋白和油脂。在2017年大豆产量占油料种子产量的59％，占了蔬菜油消 费的29％。(http://www.soystats.com)是世界上最重要的油料作物。大豆油主要含有五种脂 肪酸，依次为棕榈酸(16:0,PA)、硬脂酸(18:0,ST)、油酸(18:0,ST)、亚油酸(18:1,OL)、 亚麻酸(18:3,LN)。其中OL,LI,and LN为不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸可以预防心脑血管 疾病和一些癌症。但是多不饱和脂肪酸很不稳定容易被氧化，在加工的过程中容易氢化产生 反式脂肪酸。反式脂肪酸能引起冠心病和动脉硬化等疾病。增加油酸的比例可以减少因氢化 过程而产生的反式脂肪酸。因此在增加油分的同时提高油酸比例是大豆油分育种的重要目标。
油滴(Lipid droplets，LD)常期以来被认为是沉积在细胞质内含物，近些年来被认为是 广泛分布在细胞中的一种复杂的动态细胞器。但是在不同类型细胞中LD的大小差异很大，范 围是从1-100μm。它在不同类型的细胞中也有不同的名称，近几年来，科学家逐渐认同使用 油滴来描述这一细胞器。LD表面由两亲性的单层磷脂、糖脂和甾醇等等组成，中间含有中性 脂质如三酰甘油、二酰甘油、固醇酯和视黄酯等。油滴是储存脂肪的重要场所，通过对脂肪 的储存，油滴可以防止细胞因积累过多的脂肪而导致脂中毒现象。此外油滴还参与膜运输、 细胞信号转导和细胞蛋白代谢。它不仅与人类病原体的传染周期有关。还为多种反应提供了 场所。关于油滴的形成途径有很多模型，至今没有足够多的证据去支持哪一种模型是足够正 确的，现在科学家公认的是油滴是在内质网和外核膜合成的。LD的大小可以被一些脂质(如 磷脂酰胆碱和磷脂酸)调控，一些关键的蛋白(例如Fsp27，SEIPIN，FITM2和perlipin 1)也 能影响LD的大小。这些蛋白质可能通过直接或间接影响LD表面的磷脂的水平和组成来调节 LD的大小。其中SEIPIN基因为研究热点基因，该基因最初在脂肪代谢障碍的病人中被鉴定 出来，随后酵母、果蝇和小鼠的SEIPIN基因均被研究，研究发现它们均能调控油滴的大小， 并能影响细胞中的脂肪含量。证明SEIPIN家族蛋白调控LD合成的功能在不同物种中是保守 的。
SEIPIN基因定位在内质网上，在油滴合成中具有关键作用，SEIPIN蛋白与油滴结合， 能够使油滴固定在内质网上，以此来影响油滴的萌芽。SEIPIN基因突变后，萌芽过程紊乱， 将会形成超大型的LD。近年来，植物中的SEIPIN基因也能鉴定出来。研究发现，拟南芥中 有三个SEIPIN基因，3个基因均能影响LD的合成，过表达At-SEIPIN1能增加拟南芥种子的 油分总含量，并能改变拟南芥油分的脂肪酸组成，RNAi的拟南芥种子显著变小，种子的千粒 重也降低。在蓖麻中过表达At-SEIPIN1基因也能增加种子的含油量，并能增加Hydroxy Fatty 的含量。最新的研究发现，拟南芥seipin2seipin3和seipin三突变体的种子和花粉中出现 了超大的油滴，它们的萌发速度显著降低。拟南芥SEIPIN家族基因的研究表明，植物SEIPIN 基因同样具有调控LD大小和影响油分积累的功能。但是对重要油料作物(大豆、油菜、大豆) 的SEIPIN家族，尚无任何功能研究。最近的研究表明，在大豆中作者通过Meta-QTL结合转 录组数据分析，发现大豆Gm-SEIPIN1A基因是重要的中心枢纽基因。在油菜中，代谢组测序 和脂肪组以及代谢组分析显示大豆Gm-SEIPIN1A基因可能参与油分代谢，但是基因的功能并 没有被直接验证。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能提高植物种子油含量的大豆Gm-SEIPIN1A基因。
本发明的大豆Gm-SEIPIN1A基因，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的大豆Gm-SEIPIN1A基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
一种植物表达载体，包含本发明的大豆Gm-SEIPIN1A基因所编码的蛋白质。
本发明的大豆Gm-SEIPIN1A基因能在提高植物种子油含量中应用。
本发明从大豆品种Williams82中克隆得到Gm-SEIPIN1A基因。利用任何一种能够引导外 源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的大豆Gm-SEIPIN1A编码基因导入植物细胞， 可获得油分提高的转基因细胞系及转基因植株。使用本发明的基因构建植物表达载体时，在 其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细 胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、 萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)。携带有本发明大豆 Gm-SEIPIN1A的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注 射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成 植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。
本发明的大豆Gm-SEIPIN1A基因对提高植物种子含油量和提高油酸含量，特别是培育高 油和高油酸大豆品种具有重要意义。
附图说明
图1为大豆Gm-SEIPIN1A基因系统进化树分析图
图2为大豆Gm-SEIPIN1A基因在大豆不同组织中的表达结果图
图3为pYEP352-DEST-Gm-SEIPIN1A的酵母PCR结果电泳图
其中：M：5000bp marker；1-6：大豆Gm-SEIPIN1A基因；
图4为转大豆Gm-SEIPIN1A基因酵母的油分测定图
其中：BY4743：野生型酵母；YLR404W：seipin酵母突变体；
图5为转大豆Gm-SEIPIN1A基因酵母的脂肪酸组成测定图
其中：BY4743：野生型酵母；YLR404W：seipin酵母突变体；
图6为转大豆Gm-SEIPIN1A基因的拟南芥在1/2MS固体培养基的筛选结果图
图7为转基因拟南芥PCR检测的电泳结果图
其中：M：5000bp marker；1-7：大豆Gm-SEIPIN1A基因；8：阴性对照；9：阳性对照；
图8为对转基因的拟南芥的大豆Gm-SEIPIN1A基因实时荧光定量结果图
图9为转大豆Gm-SEIPIN1A基因拟南芥的油分测定结果图
其中：WT：野生型拟南芥；
图10为转大豆Gm-SEIPIN1A基因拟南芥的脂肪酸组成测定结果图
其中：WT：野生型拟南芥。
具体实施方式
实施例1、大豆Gm-SEIPIN1A基因系统进化树分析
用大豆Gm-SEIPIN1A基因的氨基酸序列输入到NCBI进行blast,将与大豆Gm-SEIPIN1A 基因的氨基酸相似度较高的序列下载下来，同时将已经研究过的拟南芥At-SEIPIN基因的氨 基酸序列下载下来，用MEGA7软件进行进化树分析。分析结果(见图1)显示在基因拟南芥中 有一个SEIPIN1基因，在大豆中演变为了两个，可能是在野生豆向大豆进化的过程中的复制 造成的。然而这种现象在其他植物如苜蓿、花生、辣椒中均未发现。
实施例2、大豆Gm-SEIPIN1A基因在大豆不同组织中的表达结果
在种植于长春市吉林大学的同一自然环境中，从两个生长于同一自然环境的大豆“Williams82”中收获了根、茎、叶、花和正在发育的种子。在不同时间收集以上材料，在 液氮中立即冷冻，并在进行RNA提取处理后储存在-80℃。
参照sangon公司的柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒提取处理材料的总RNA，经1％琼脂糖 电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH-)的说明 书进行。利用实时荧光定量PCR对大豆Gm-SEIPIN1A基因在大豆不同组织及不同胚发育时期 的表达情况进行检测。实验操作按照sangong公司SGExcel FastSYBR Mixture(With ROX)说 明书在在实时荧光定量PCR仪StepOnePlus中进行。以大豆actin为内参基因，引物如下： PCR反应体系及程序如表3：
Figure BDA0002330570850000031
表3 PCR反应体系和反应程序
Figure BDA0002330570850000032
Figure BDA0002330570850000041
采用2-ΔΔCT法分析数据，确定基因的相对表达量。试验共设3次技术重复，3次生物学重 复。结果(图2)表明大豆Gm-SEIPIN1A基因在大豆的根、茎尖、叶片中基本不表达，主要在 发育中的大豆种子中表达，其中开花后35天(DAF35)时表达量最高，总而言之，大豆 Gm-SEIPIN1A基因是在种子中高度表达的基因。
实施例3大豆Gm-SEIPIN1A基因的克隆
选取籽粒饱满的大豆种子3粒，将种子后播种于花土中盆栽。培养条件为：16h光照， 温度26℃，湿度65％，光强30000勒克斯。对大豆开花后25天的种子取样，提取totalRNA， 反转录成cDNA,根据soybase上公布的基因序列设计引物，引物为：
Figure BDA0002330570850000042
按照表1添加反应成分，按表2程序进行PCR：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002330570850000043
表2 PCR程序
Figure BDA0002330570850000044
实施例4大豆Gm-SEIPIN1A在酵母和拟南芥的表达及其油分的测定
构建酵母表达载体pYEP352-DEST-Gm-SEIPIN1A和植物表达载体pCHF3300-Gm-SEIPIN1A。 制备酵母感受态，利用化学转化法将酵母表达载体pYEP352-DEST-Gm-SEIPIN1A转入到酵母 中。并对转基因酵母进行PCR检测(图3)，对转基因酵母的油分含量(图4)和脂肪酸比例(图 5)进行分析。采用拟南芥侵花法将转入EHA105的植物表达载体pCHF3300-Gm-SEIPIN1A转到 拟南芥中，将筛选出的转基因拟南芥阳性苗(图6)移栽至土壤中，并对转基因拟南芥进行PCR 检测(图7)，同时检测阳性植株中目的基因表达量(图8)，并对转基因的油分含量(图9)及脂 肪酸比例(图10)进行分析。具体方法及结果如下：
1.酵母感受态的制备及转化
1.从YPDA平板上挑取生长1-3周、直径2-3mm的酵母单克隆，接入1ml YPDA 液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入50ml YPDA液体培养基中，30℃恒温， 250rpm振荡培养过夜(16-18hr)，至OD600>1.5；
2.取适量过夜菌液接种于300ml新鲜的YPDA液体培养基，至OD600＝0.2-0.3，30℃ 恒温，250rpm振荡培养至OD600＝0.4-0.6(约3hr)；
3.室温离心2500rpm×5min，弃上清；加入25-50ml ddH2O或TE重悬洗涤酵母沉 淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5ml 1×TE/LiAc重悬后，即为酵母 感受态细胞(若仅用于转染质粒，则可置于4℃可几天内使用)；
4.准备下列试剂：
Figure BDA0002330570850000051
5.分装待转化的质粒DNA，振荡混匀：
pGBKT7-bait 0.1ug
Sperm DNA*(10mg/ml)0.1mg
*Sperm DNA新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20℃
6.每管加入100ul用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀；
7.各加入600ul PEG/LiAc，剧烈振荡(提高转化效率)，30℃恒温，200rpm振荡培养30min；
8.各加入70ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42℃水浴热休克15min，迅速插入冰浴冷却1-2min；
9.室温离心14,000rpm×5sec，尽量弃尽上清，以0.5ml 1×TE重悬沉淀细胞，取100ul涂布SD/-Trp固体培养板，30℃倒置培养3天待菌落长出。
3.2酵母阳性菌落PCR检测
按照下表PCR反应体系和PCR程序进行菌落PCR，结果见图3。对阳性菌落扩繁后保菌。
表4 PCR反应体系
Figure BDA0002330570850000052
Figure BDA0002330570850000061
表5 PCR程序
Figure BDA0002330570850000062
2.浸花法转化拟南芥
1.拟南芥受体材料选择：
将拟南芥种植在16h/8h光照/黑暗条件，20℃到22℃，拟南芥移栽后大约4周进入花期， 转化前将角果及已完全开放的花蕾剪去，仅留下刚刚露白及幼嫩花蕾。
浸花法转化拟南芥
①接种单个菌落于5mL YEP培养基(利福平10μg/mL，卡那霉素100μg/mL)中，培养过夜；
②1：100扩培到500mL YEP的锥形瓶中，继续摇培12hr左右至生长密度为OD600值1.0-1.2；
③室温，5000g离心10min收集菌体；
④用转化介质(1/2MS培养基，5％的蔗糖，0.05％Silwet L-77，0.5g/L MES，pH5.7) 悬浮菌体密度至OD600为0.8左右；
⑤将含有农杆菌的转化介质倒入培养皿中，将剪去荚果的拟南芥平放在桌面上，使得整 个花序连同莲座基部的叶片都浸入转化介质中。如果再次侵染，一般两次侵染之间间隔时间 为一周比较好，具体浸染时间和浸染次数依拟南芥生长条件而定。
⑥取出拟南芥，将其侧卧放在干净的塑料托盘上，并用薄膜覆盖避光保湿恢复24hr；
⑦将拟南芥扶起，培养液浇透后，放在光下正常培养，转化后植株正常的开花生长，3-4 周待长角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。收获的种子，37℃烘箱放置24h后，放于 -20度冰箱中常期储存。
3.拟南芥筛选
1.拟南芥种子消毒
(1)根据实验需要分出约10mg拟南芥种子装于1.5mL EP管中；
(2)加入1mL 10％的次氯酸钠溶液上下颠倒混匀；
(3)用涡旋仪震荡2min后低速离心后弃掉10％的次氯酸钠溶液；
(4)加入1ml的灭菌水，用移液器吹打数次；
(5)重复操作步骤(4)；
(6)用移液器将种子和少量灭菌水喷洒到含basta筛选剂的1/2MS培养基上；
(7)将拟南芥种子吹打均匀后吸去多余水分后，在超净工作台中吹10min；
(8)将平板封口，黑暗条件下倒置于4℃春化72h；
(9)春化结束后，将平板置于光照培养箱中竖直培养。培养条件为：16h光照/8h黑暗， 22/16℃，光照强度60μE m-2s-1。
2.用含4mg/l的basta抗性培养基筛选拟南芥
将培养基上生长约2周的转基因拟南芥阳性幼苗移到土壤中，阳性拟南芥植株见图6。 约2周后，取拟南芥叶片，利用CTAB法提取拟南芥叶片DNA，进行PCR检测。检测结果见图 7。结果显示获得的转基因植株为阳性植株。获得约4周后，取拟南芥叶片，提取总RNA，进行荧光实时定量PCR检测。检测结果见图8。结果证明大豆Gm-SEIPIN1A基因在拟南芥中有所表达。
4.酵母和拟南芥种子油分含量测定
提取油分的方法
1.取鲜酵母50mg/拟南芥干种子10mg，放入到2ml EP管中，加入2粒小钢珠。用磨样机 将其磨碎。
2.加入用甲醇溶液作为溶剂配制的2.5％浓硫酸1ml，上下颠倒混匀后将管放在70℃ 水浴中1小时，期间间隔10分钟晃动一次，提取甲酯化脂肪酸。
3.一小时后关掉水浴锅，待自然冷却后，取500μl提取液到新离心管中。
4.向其中加入600μl 0.9％NaCl溶液、300μl正己烷，涡旋震荡数分钟，4000rpm 离心10分钟，取上清到新离心管中。
5.取400μl上清液于气相专用瓶中，加入10μl浓度为10mg/ml的17:0脂肪酸作 为内标，用气相色谱仪测定油分含量。每个样品取3个平行作为实验重复。
酵母的油分测定结果见图4，结果表明在酵母seipin突变体ylr404wΔ中大豆 Gm-SEIPIN1A的表达使酵母油分的含量提高了20.48％。表明在seipin突变体菌株中表达大豆Gm-SEIPIN1A可以促进TAG的形成。脂肪酸组成成分见图5，结果表明，在seipin突变体菌 株中表达大豆Gm-SEIPIN1A基因使酵母的TAG-18:1(油酸)增加3.4％。拟南芥的油分测定结果见图9，结果显示，在转大豆Gm-SEIPIN1A基因的拟南芥种子中检测到TAG最高分别增加了18.2％，脂肪酸组成成分见图10。脂肪酸组成成分分析显示油酸含量最高增加了8.2％。综上 所述，说明大豆Gm-SEIPIN1A能起到增加植物种子油分含量和油酸含量的作用。
Figure BDA0002330570850000081
Figure BDA0002330570850000091
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　序列表
发明名称：大豆Gm-SEIPIN1A基因及其应用
SEQ ID NO.1 Gm-SEIPIN1A的核苷酸序列
（i）序列特征：（A）长度：1224bp；（B）类型：DNA；（C）链性：双链
　　　（ii）分子类型：核苷酸
　　　（iii）序列描述：SEQ ID NO.1
1 ATGGAAGAAC ACAGAAAAGA AGGCTTTTTT TTGCCAACAC CAGTTGCAAA ACTAATATCC
61 TTTCAAACGG ATTTGATCTA CAATGGCCTG GTTTCTCTCT TTTCCTCTAT CCACTCTCTT
121 TTTTCCGTGG CTACAGAGTC CTACCACCGT GCTGAGGAGA CCAAAGACAG TGTTGAATCA
181 GCAGTGCAAC GTGCTCCTTC TCAAAGCACT CATGGCAGCG CACTCTTGCT GAAGAAACTG
241 GGACTTTGCT TCCTGAGTGT TGCGTATGTG TGCATGGTTA TGATTTTGGC TCTCATTCTG
301 GCTGCTGTGG TGGGTGTTGC TTTGGTTCGG TTGTGGGTGG AGGAACCCGT GTCTGTCAAG
361 GAAAATCTGC ATTTTGATTA CACTGAAGCT CACCCTACGG CTGTGTTTTT ATTCAATGGA
421 GTTAGAAGCT TTAAGGGTCA CCTCAAGAAA AAGCAAATAA GTGTCCCAGT TGGCCACTCG
481 TTTTTCGCTT CTTTGGTTCT TGTGATGCCT GAATCTGACT TTAATAGGGA GCTTGGCGTC
541 TTTCAGTTGA CTGCAGAACT CATATCTGTG AATGGAAATG TGATAGCAAA ATCTAGCCAG
601 CCATGCATGT TGCGGTTTAG AAGCTCGCCA ATTCGACTAG CCCGGACCTT TATGATGGGT
661 GTGCCTCTGG TGCTTGGAAT CTCAGGGGAG ACTCAGAATA TTAATGTAGA AATACTGAGG
721 CACAAAGAAG ACTATAGAAG AAGCAATGCT ATTAGAGTAA CTCTGCATCC AAGAGCAGGA
781 ACATCTTCTC TTCCACAGCT ATATGAAGCC GATATTGTGA TAAAATCCCA TTTGCCTTGG
841 ACCAAAGAAT TGGTTCGAAA TTGGAAGTGG ACATTTTATG TTTGGGTGTC CTTGTATGTC
901 TACATTGTAC TACTTGTGTC TCTCCTATGT TGTTATAGGC CACTCGTCTT TCTGGTGACA
961 CCAGAGTATT TCAATGATCA TAGGGTGAGT GAACTTACAA GAGAAGAACC AGGACAATTA
1021 GGAGATGAAA GTGAGGTTTC TGAGTTGTTG AGGAAATGGA GAAGAAGCAG AAGTAAGAGA
1081 AAAACCGTCC TGGCACATGG TGGTGTGCCA GAAACCATTG TTGGATCATC AGCATCCAGC
1141 ATTAGCATGA CTGCTAGAGA AGATGTAACC AGTGTGGTTA TGGAGGATGA GGTTGAGGAC
1201 TCTGAATCAG TGTGCATAGG TTAG
SEQ ID NO.2 Gm-SEIPIN1A的氨基酸序列
（i）序列特征：（A）长度：407个氨基酸；(B)类型：氨基酸；（C）链性：单链。
（ii）分子类型：多肽
（iii）序列描述：SEQ ID NO.2
1 MEEHRKEGFF LPTPVAKLIS FQTDLIYNGL VSLFSSIHSL FSVATESYHR AEETKDSVES
61 AVQRAPSQST HGSALLLKKL GLCFLSVAYV CMVMILALIL AAVVGVALVR LWVEEPVSVK
121 ENLHFDYTEA HPTAVFLFNG VRSFKGHLKK KQISVPVGHS FFASLVLVMP ESDFNRELGV
181 FQLTAELISV NGNVIAKSSQ PCMLRFRSSP IRLARTFMMG VPLVLGISGE TQNINVEILR
241 HKEDYRRSNA IRVTLHPRAG TSSLPQLYEA DIVIKSHLPW TKELVRNWKW TFYVWVSLYV
301 YIVLLVSLLC CYRPLVFLVT PEYFNDHRVS ELTREEPGQL GDESEVSELL RKWRRSRSKR
361 KTVLAHGGVP ETIVGSSASS ISMTAREDVT SVVMEDEVED SESVCIG

Claims (4)

1.一种大豆Gm-SEIPIN1A基因，其特征在于其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种根据权利要求1所述大豆Gm-SEIPIN1A基因所编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
3.一种植物表达载体，其特征在于包含权利要求2所述大豆Gm-SEIPIN1A基因所编码的蛋白质。
4.一种权利要求1所述大豆Gm-SEIPIN1A基因在提高植物种子油含量中的应用。
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