CN111117891A - 一种灵芝孢子的保存和激活方法 - Google Patents

一种灵芝孢子的保存和激活方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111117891A
CN111117891A CN201911409905.3A CN201911409905A CN111117891A CN 111117891 A CN111117891 A CN 111117891A CN 201911409905 A CN201911409905 A CN 201911409905A CN 111117891 A CN111117891 A CN 111117891A
Authority
CN
China
Prior art keywords
parts
spores
liquid
ganoderma lucidum
activating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911409905.3A
Other languages
English (en)
Inventor
刘长斯
龙丹萍
石卢宁
黄宗延
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGXI XIANCAOTANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Original Assignee
GUANGXI XIANCAOTANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGXI XIANCAOTANG PHARMACEUTICAL CO Ltd filed Critical GUANGXI XIANCAOTANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority to CN201911409905.3A priority Critical patent/CN111117891A/zh
Publication of CN111117891A publication Critical patent/CN111117891A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明提供一种灵芝孢子的保存和激活方法，具体涉及食用菌育种技术领域。本发明采用去活液将刚刚采集的灵芝孢子进行液氮冷冻和去活，然后加入改良液体石蜡中冷藏，能够保存3‑5年，并采用微波和活化液进行活化，使孢子复苏，能够实现高萌发率。本发明方法简单易操作、工艺可控，可适用于灵芝孢子育种研究中孢子的保存和促进萌发。

Description

一种灵芝孢子的保存和激活方法
【技术领域】
本发明涉及食用菌育种技术领域，具体涉及一种灵芝孢子的保存和激活方法。
【背景技术】
灵芝在中国向来被视为草木菁英，有“瑞草”、“仙草”等美誉，在日本被称为万年茸，是一种珍贵的药(食)用菌。《神农本草经》指出：赤芝(即灵芝)“苦，平，无毒”，主治“胸中结、益心气，补中、增智慧、不忘”，“久食轻身不老，延年神仙”。《本草纲目》记载灵芝有“滋补强壮、延年益寿、利关节、治耳聋”等神奇功效，将其列为药中上品。
正是由于灵芝的神奇功效，以及国家和地方法规没有关于野生灵芝资源保护、恢复、发展及利用等相关规定，人们缺乏法律意识和野生资源保护意识。且近年来，野生灵芝的价格又节节攀升，受利益驱使人们对野生灵芝不管成熟与否都进行采挖，这种掠夺性的采集，对野生灵芝资源造成了严重的破坏，致使一些具有珍贵药用价值的野生灵芝种源濒临灭绝。因而，近年来受市场驱动，也有大力发展灵芝人工栽培育种的趋势，发展出了杂交、原生质体融合、诱变等技术手段。但目前研究表明，灵芝生产上使用的菌种间遗传多样性并不高，而以此亲本材料通过杂交或诱变或原生质体融合等手段获得的杂交菌株或诱变菌株或融合菌株中出现超亲现象的概率很低，无法获得具有优良性状的变异个体，致使难以获得与野生灵芝品质相当的超越亲代的优良菌株。在自然生长环境中，灵芝是通过孢子进行减数分裂生成单核生殖细胞的有性生殖菌类，不同交配型的单核生殖细胞融合后获得的后代在减数分裂和融合的过程中，能够产生丰富的遗传多样性，有利于优良个体的生成和繁衍，但是自然条件下灵芝孢子的萌发极低。虽然近年来也有利用灵芝孢子进行育种的研究，但其仍然没有摆脱萌发率低的难题，且对于孢子作为育种来源的保存也受到限制，在当前的研究中还无法做到将灵芝孢子长期保存下来用于新品种的培育筛选，哪怕是只经过避光存放一天的灵芝孢子都会无法萌发，因此只能即采即用，这极大阻碍了进一步利用灵芝孢子进行的育种研究。
综上所述，为了能够高效运用灵芝孢子进行新品种的培育与筛选，也为了能够长期保留优良品性灵芝品种的孢子，有必要开发一种灵芝孢子的保存和激活方法。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对灵芝孢子萌发率低、不易保存的问题，提供一种灵芝孢子的保存和激活方法。本发明采用去活液将刚刚采集的灵芝孢子进行液氮冷冻和去活，然后加入改良液体石蜡中冷藏，能够保存3-5年，并采用微波和活化液进行活化，使孢子复苏，能够实现高萌发率。本发明方法简单易操作、工艺可控，可适用于灵芝孢子育种研究中孢子的保存和促进萌发。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种灵芝孢子的保存和激活方法,包括以下步骤：
a.取刚刚从灵芝子实体收集到的孢子，立即浸泡于液氮中10-30秒，然后取出，再浸泡于-40～-20℃的去活液中120-220秒，得去活孢子；
b.取去活孢子加入与去活液相同温度的改良液体石蜡中进行密封，得封存体，然后将封存体置于保存温度为2-10℃的冰箱中即可保存3-5年；
c.取步骤b中保存于冰箱中的封存体，开封后从改良液体石蜡中取出去活孢子，然后用滤纸吸干表面的改良液体石蜡，置于功率密度为1-9mW/cm2的微波下照射6-12分钟，照射期间的温度与步骤b中冰箱的保存温度相同，得初级活化孢子；
d.取初级活化孢子，喷洒活化液后在10-20℃下静置活化10-30分钟，得终极活化孢子；所述终极活化孢子无需消毒便可直接用于接种培养。
优化的，步骤a中所述去活液包括以下重量份比的原料：鱼腥藻15-25份、三角褐指藻13-27份、羊栖菜1-5份、海带4-8份、纤维素酶0.07-0.13份、蛋白酶0.02-0.06份、褐藻酸钠裂解酶0.01-0.03份、新鲜芦荟16-26份、鸢尾黄素0.15-0.75份。
进一步优化的，所述去活液的制备方法为：取鱼腥藻、三角褐指藻、海带、羊栖菜、海带，加入纤维素酶、褐藻酸钠裂解酶酶解100-200分钟，得酶解物，备用；取新鲜芦荟，去掉叶肉，捣碎后，按料液比1:15-25加入氢氧化钠水溶液，超声处理45-65分钟，然后过滤，收集滤液，接着加入滤液等体积的石油醚萃取2-4次，收集下层水层，加入酶解物，搅拌均匀，随后调节pH值至中性，过滤后加入鸢尾黄素，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得去活液。
更进一步优化的，所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为0.05％-0.13％。
再更进一步优化的，步骤b中所述改良液体石蜡的制备方法为：按重量份比，取1-乙基-3-胍基硫脲盐酸盐20-30份，加入乙醇水溶液45-65份溶解后，再加入乙二酸4-10份和乙酰丙酸3-11份，加热回流8-18小时得反应液，然后取反应液回收乙醇至无醇味，接着加入正己烷20-40份进行萃取，收集萃取后的正己烷得萃取液，然后萃取液经减压蒸发除去正己烷，得离子液体；在得到的离子液体中加入离子液体重量10-20倍的液体石蜡、1-5倍的玉米朊，混合均匀，得改良液体石蜡。
再更进一步优化的，步骤d中所述活化液包括以下重量份比的原料：磷酸盐缓冲液70-130份、桑叶4-16份、橙皮3-9份、竹叶1-5份、西瓜皮1-5份、叶绿素0.1-0.5份、碧萝芷2-7份、甘露低聚糖1-3份、青蒿素0.01-0.05份、春雷霉素0.01-0.05份和甘油20-50份。
再更进一步优化的，所述活化液的制备方法为：取桑叶、橙皮、竹叶和西瓜皮，洗净晾干，粉碎后加磷酸盐缓冲液浸泡40-60分钟，然后在55-65℃下回流提取75-95分钟后，过滤，收集滤液，得植物提取液，备用；取叶绿素、碧萝芷、甘露低聚糖，混合均匀，然后加入20％-30％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，接着加入青蒿素、春雷霉素和剩余的甘油，搅拌均匀，得均质包合物，将均质包合物加入到所述植物提取液中，搅拌均匀，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得活化液；所述均质包合物与植物提取液的重量比为1：6-16。
再更进一步优化的，所述活化液的喷洒量为每克孢子喷洒5-15ml。
再更进一步优化的，所述高压均质机的参数设置如下：温度为5-15℃、压力为30-50Mpa、循环次数为2-4次。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明采用去活液将刚刚采集的灵芝孢子进行液氮冷冻和去活，然后加入改良液体石蜡中冷藏，能够保存3-5年，并采用微波和活化液进行活化，使孢子复苏，能够实现高萌发率。本发明方法简单易操作、工艺可控，可适用于灵芝孢子育种研究中孢子的保存和促进萌发。
2.本发明中将刚刚收集的灵芝孢子用液氮进行速冻，可以有效保留孢子中的水分，防止细胞缺水干涸，为后续萌发提供充足的水源，提高萌发率。
3.本发明采用的去活液中包含了多种酶抑制剂、可抑制酶的多糖和黄酮，能够渗透孢子细胞中，抑制孢子中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等酶的活性，降低细胞新陈代谢，减缓细胞发育和老化，使细胞中营养成分不被消耗，保持细胞的潜在生长活力。其中的多种藻类，含有多种酶抑制剂，通过酶解法可将藻类中的酶提取出来。芦荟外皮中含有芦荟大黄素为代表的黄酮类，与上述提取出来的酶抑制剂和鸢尾黄素共同作用，起到抑制孢子中酶的作用。
4.本发明的离子液体是由1-乙基-3-胍基硫脲盐酸盐、乙二酸和乙酰丙酸制备得到的能够在室温下呈液态的纯离子溶液，有离子液体的存在，可以防止液体石蜡在存放过程中的挥发，因为石蜡的挥发容易使灵芝孢子暴露接触到空气发生氧化衰老而降低萌发率。通常情况下液体石蜡虽然有密封，但相对于长时间的存放仍然无法避免挥发，为了使液体石蜡不易挥发，特别加入了离子液体。
5.本发明将保存在冰箱中的灵芝孢子取出后，先采用微波照射进行预活化，再喷洒活化液进行彻底活化，能够使保存了3-5年的孢子重新焕发生长活力，获得高的萌发率。
本发明先采用低功率密度的微波进行照射，可以促进灵芝孢子细胞的运动，激活自身酶类，使细胞开始复苏并生长发育，有利于孢子的萌发。
活化液中采用从桑叶、橙皮、竹叶和西瓜中提取出的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和各种营养成分，能够显著增强孢子中各种酶的活性。本发明的活化液先采用磷酸缓冲盐溶液浸泡桑叶、橙皮、竹叶和西瓜皮，使上述物料的细胞充分吸水，再回流提取，可快速将细胞中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、氨基酸、维生素、微量元素完整地提取出来。叶绿素、碧萝芷能够清除外植体呼吸代谢产生的自由基，防止细胞衰老而停止分化，甘露低聚糖具有激活细胞免疫应答的作用，可以增强孢子的抗逆性，并且能吸附代谢过程中的毒素，消除有害影响，均能提高萌发率；同时，为了使叶绿素、碧萝芷、甘露低聚糖中成分更易被吸收，采用低温高压均质的方法将上述三种成分粉碎成微粒的形式。青蒿素、春雷霉素具有杀菌消毒作用，使孢子能够直接用于接种培养，而不用再经过消毒处理。甘油作为良好的渗透剂，能够辅助上述各成分进入孢子细胞发挥活化作用。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种灵芝孢子的保存和激活方法,包括以下步骤：
a.取刚刚从灵芝子实体收集到的孢子，立即浸泡于液氮中30秒，然后取出，再浸泡于-20℃的去活液中220秒，得去活孢子；
其中，去活液包括以下重量份比的原料：鱼腥藻25份、三角褐指藻27份、羊栖菜5份、海带8份、纤维素酶0.13份、蛋白酶0.06份、褐藻酸钠裂解酶0.03份、新鲜芦荟26份、鸢尾黄素0.75份。
去活液的制备方法为：取鱼腥藻、三角褐指藻、海带、羊栖菜、海带，加入纤维素酶、褐藻酸钠裂解酶酶解200分钟，得酶解物，备用；取新鲜芦荟，去掉叶肉，捣碎后，按料液比1:25加入氢氧化钠水溶液，超声处理65分钟，然后过滤，收集滤液，接着加入滤液等体积的石油醚萃取4次，收集下层水层，加入酶解物，搅拌均匀，随后调节pH值至中性，过滤后加入鸢尾黄素，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得去活液；氢氧化钠水溶液的质量浓度为0.13％。
b.取去活孢子加入与去活液相同温度的改良液体石蜡中进行密封，得封存体，然后将封存体置于保存温度为10℃的冰箱中即可保存3.5年；
其中，改良液体石蜡的制备方法为：按重量份比，取1-乙基-3-胍基硫脲盐酸盐30份，加入乙醇水溶液65份溶解后，再加入乙二酸10份和乙酰丙酸11份，加热回流18小时得反应液，然后取反应液回收乙醇至无醇味，接着加入正己烷40份进行萃取，收集萃取后的正己烷得萃取液，然后萃取液经减压蒸发除去正己烷，得离子液体；在得到的离子液体中加入离子液体重量20倍的液体石蜡、5倍的玉米朊，混合均匀，得改良液体石蜡。
c.取步骤b中保存于冰箱中的封存体，开封后从改良液体石蜡中取出去活孢子，然后用滤纸吸干表面的改良液体石蜡，置于功率密度为9mW/cm2的微波下照射12分钟，照射期间的温度与步骤b中冰箱的保存温度相同，得初级活化孢子；
d.取初级活化孢子，喷洒活化液后在20℃下静置活化30分钟，得终极活化孢子；所述终极活化孢子无需消毒便可直接用于接种培养。
其中，活化液包括以下重量份比的原料：磷酸盐缓冲液130份、桑叶16份、橙皮9份、竹叶5份、西瓜皮5份、叶绿素0.5份、碧萝芷7份、甘露低聚糖3份、青蒿素0.05份、春雷霉素0.05份和甘油50份。
活化液的制备方法为：取桑叶、橙皮、竹叶和西瓜皮，洗净晾干，粉碎后加磷酸盐缓冲液浸泡60分钟，然后在65℃下回流提取95分钟后，过滤，收集滤液，得植物提取液，备用；取叶绿素、碧萝芷、甘露低聚糖，混合均匀，然后加入30％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，接着加入青蒿素、春雷霉素和剩余的甘油，搅拌均匀，得均质包合物，将均质包合物加入到所述植物提取液中，搅拌均匀，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得活化液；所述均质包合物与植物提取液的重量比为1：16。
实施例2
一种灵芝孢子的保存和激活方法,包括以下步骤：
a.取刚刚从灵芝子实体收集到的孢子，立即浸泡于液氮中10秒，然后取出，再浸泡于-40℃的去活液中120秒，得去活孢子；
其中，去活液包括以下重量份比的原料：鱼腥藻15份、三角褐指藻13份、羊栖菜1份、海带4份、纤维素酶0.07份、蛋白酶0.02份、褐藻酸钠裂解酶0.01份、新鲜芦荟16份、鸢尾黄素0.15份。
去活液的制备方法为：取鱼腥藻、三角褐指藻、海带、羊栖菜、海带，加入纤维素酶、褐藻酸钠裂解酶酶解100分钟，得酶解物，备用；取新鲜芦荟，去掉叶肉，捣碎后，按料液比1:15加入氢氧化钠水溶液，超声处理45分钟，然后过滤，收集滤液，接着加入滤液等体积的石油醚萃取2次，收集下层水层，加入酶解物，搅拌均匀，随后调节pH值至中性，过滤后加入鸢尾黄素，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得去活液；氢氧化钠水溶液的质量浓度为0.05％。
b.取去活孢子加入与去活液相同温度的改良液体石蜡中进行密封，得封存体，然后将封存体置于保存温度为2℃的冰箱中即可保存3年；
其中，改良液体石蜡的制备方法为：按重量份比，取1-乙基-3-胍基硫脲盐酸盐20份，加入乙醇水溶液45份溶解后，再加入乙二酸4份和乙酰丙酸3份，加热回流8小时得反应液，然后取反应液回收乙醇至无醇味，接着加入正己烷20份进行萃取，收集萃取后的正己烷得萃取液，然后萃取液经减压蒸发除去正己烷，得离子液体；在得到的离子液体中加入离子液体重量10倍的液体石蜡、1倍的玉米朊，混合均匀，得改良液体石蜡。
c.取步骤b中保存于冰箱中的封存体，开封后从改良液体石蜡中取出去活孢子，然后用滤纸吸干表面的改良液体石蜡，置于功率密度为1mW/cm2的微波下照射6分钟，照射期间的温度与步骤b中冰箱的保存温度相同，得初级活化孢子；
d.取初级活化孢子，喷洒活化液后在10℃下静置活化10分钟，得终极活化孢子；所述终极活化孢子无需消毒便可直接用于接种培养。
其中，活化液包括以下重量份比的原料：磷酸盐缓冲液70份、桑叶4份、橙皮3份、竹叶1份、西瓜皮1份、叶绿素0.1份、碧萝芷2份、甘露低聚糖1份、青蒿素0.01份、春雷霉素0.01份和甘油20份。
活化液的制备方法为：取桑叶、橙皮、竹叶和西瓜皮，洗净晾干，粉碎后加磷酸盐缓冲液浸泡40分钟，然后在55℃下回流提取75分钟后，过滤，收集滤液，得植物提取液，备用；取叶绿素、碧萝芷、甘露低聚糖，混合均匀，然后加入20％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，接着加入青蒿素、春雷霉素和剩余的甘油，搅拌均匀，得均质包合物，将均质包合物加入到所述植物提取液中，搅拌均匀，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得活化液；所述均质包合物与植物提取液的重量比为1：6。
实施例3
一种灵芝孢子的保存和激活方法,包括以下步骤：
a.取刚刚从灵芝子实体收集到的孢子，立即浸泡于液氮中15秒，然后取出，再浸泡于-35℃的去活液中145秒，得去活孢子；
其中，去活液包括以下重量份比的原料：鱼腥藻17份、三角褐指藻16.5份、羊栖菜2份、海带5份、纤维素酶0.09份、蛋白酶0.03份、褐藻酸钠裂解酶0.02份、新鲜芦荟18份、鸢尾黄素0.3份。
去活液的制备方法为：取鱼腥藻、三角褐指藻、海带、羊栖菜、海带，加入纤维素酶、褐藻酸钠裂解酶酶解125分钟，得酶解物，备用；取新鲜芦荟，去掉叶肉，捣碎后，按料液比1:17加入氢氧化钠水溶液，超声处理50分钟，然后过滤，收集滤液，接着加入滤液等体积的石油醚萃取3次，收集下层水层，加入酶解物，搅拌均匀，随后调节pH值至中性，过滤后加入鸢尾黄素，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得去活液；氢氧化钠水溶液的质量浓度为0.07％。
b.取去活孢子加入与去活液相同温度的改良液体石蜡中进行密封，得封存体，然后将封存体置于保存温度为4℃的冰箱中即可保存4年；
其中，改良液体石蜡的制备方法为：按重量份比，取1-乙基-3-胍基硫脲盐酸盐22份，加入乙醇水溶液50份溶解后，再加入乙二酸4.5份和乙酰丙酸5份，加热回流10.5小时得反应液，然后取反应液回收乙醇至无醇味，接着加入正己烷25份进行萃取，收集萃取后的正己烷得萃取液，然后萃取液经减压蒸发除去正己烷，得离子液体；在得到的离子液体中加入离子液体重量12倍的液体石蜡、2倍的玉米朊，混合均匀，得改良液体石蜡。
c.取步骤b中保存于冰箱中的封存体，开封后从改良液体石蜡中取出去活孢子，然后用滤纸吸干表面的改良液体石蜡，置于功率密度为3mW/cm2的微波下照射7分钟，照射期间的温度与步骤b中冰箱的保存温度相同，得初级活化孢子；
d.取初级活化孢子，喷洒活化液，活化液的喷洒量为每克孢子喷洒5ml，然后在13℃下静置活化15分钟，得终极活化孢子；所述终极活化孢子无需消毒便可直接用于接种培养。
其中，活化液包括以下重量份比的原料：磷酸盐缓冲液85份、桑叶7份、橙皮4.5份、竹叶2份、西瓜皮2.5份、叶绿素0.2份、碧萝芷3.5份、甘露低聚糖1.5份、青蒿素0.02份、春雷霉素0.02份和甘油27份。
活化液的制备方法为：取桑叶、橙皮、竹叶和西瓜皮，洗净晾干，粉碎后加磷酸盐缓冲液浸泡45分钟，然后在58℃下回流提取80分钟后，过滤，收集滤液，得植物提取液，备用；取叶绿素、碧萝芷、甘露低聚糖，混合均匀，然后加入22％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，接着加入青蒿素、春雷霉素和剩余的甘油，搅拌均匀，得均质包合物，将均质包合物加入到所述植物提取液中，搅拌均匀，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得活化液；均质包合物与植物提取液的重量比为1：8；高压均质机的参数设置如下：温度为5℃、压力为30Mpa、循环次数为2次。
实施例4
一种灵芝孢子的保存和激活方法,包括以下步骤：
a.取刚刚从灵芝子实体收集到的孢子，立即浸泡于液氮中25秒，然后取出，再浸泡于-25℃的去活液中195秒，得去活孢子；
其中，去活液包括以下重量份比的原料：鱼腥藻23份、三角褐指藻23.5份、羊栖菜4份、海带7份、纤维素酶0.12份、蛋白酶0.05份、褐藻酸钠裂解酶0.03份、新鲜芦荟23.5份、鸢尾黄素0.6份。
去活液的制备方法为：取鱼腥藻、三角褐指藻、海带、羊栖菜、海带，加入纤维素酶、褐藻酸钠裂解酶酶解175分钟，得酶解物，备用；取新鲜芦荟，去掉叶肉，捣碎后，按料液比1:22加入氢氧化钠水溶液，超声处理60分钟，然后过滤，收集滤液，接着加入滤液等体积的石油醚萃取3次，收集下层水层，加入酶解物，搅拌均匀，随后调节pH值至中性，过滤后加入鸢尾黄素，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得去活液；氢氧化钠水溶液的质量浓度为0.11％。
b.取去活孢子加入与去活液相同温度的改良液体石蜡中进行密封，得封存体，然后将封存体置于保存温度为8℃的冰箱中即可保存4.5年；
其中，改良液体石蜡的制备方法为：按重量份比，取1-乙基-3-胍基硫脲盐酸盐27份，加入乙醇水溶液60溶解后，再加入乙二酸8.5份和乙酰丙酸9份，加热回流15.5小时得反应液，然后取反应液回收乙醇至无醇味，接着加入正己烷35份进行萃取，收集萃取后的正己烷得萃取液，然后萃取液经减压蒸发除去正己烷，得离子液体；在得到的离子液体中加入离子液体重量17倍的液体石蜡、4倍的玉米朊，混合均匀，得改良液体石蜡。
c.取步骤b中保存于冰箱中的封存体，开封后从改良液体石蜡中取出去活孢子，然后用滤纸吸干表面的改良液体石蜡，置于功率密度为7mW/cm2的微波下照射11分钟，照射期间的温度与步骤b中冰箱的保存温度相同，得初级活化孢子；
d.取初级活化孢子，喷洒活化液，活化液的喷洒量为每克孢子喷洒15ml，然后在18℃下静置活化25分钟，得终极活化孢子；所述终极活化孢子无需消毒便可直接用于接种培养。
其中，活化液包括以下重量份比的原料：磷酸盐缓冲液115份、桑叶13份、橙皮7.5份、竹叶4份、西瓜皮4.5份、叶绿素0.4份、碧萝芷6份、甘露低聚糖2.5份、青蒿素0.04份、春雷霉素0.04份和甘油42份。
活化液的制备方法为：取桑叶、橙皮、竹叶和西瓜皮，洗净晾干，粉碎后加磷酸盐缓冲液浸泡55分钟，然后在62℃下回流提取90分钟后，过滤，收集滤液，得植物提取液，备用；取叶绿素、碧萝芷、甘露低聚糖，混合均匀，然后加入27％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，接着加入青蒿素、春雷霉素和剩余的甘油，搅拌均匀，得均质包合物，将均质包合物加入到所述植物提取液中，搅拌均匀，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得活化液；均质包合物与植物提取液的重量比为1：13；高压均质机的参数设置如下：温度为15℃、压力为50Mpa、循环次数为4次。
实施例5
一种灵芝孢子的保存和激活方法,包括以下步骤：
a.取刚刚从灵芝子实体收集到的孢子，立即浸泡于液氮中20秒，然后取出，再浸泡于-30℃的去活液中170秒，得去活孢子；
其中，去活液包括以下重量份比的原料：鱼腥藻20份、三角褐指藻20份、羊栖菜3份、海带6份、纤维素酶0.1份、蛋白酶0.04份、褐藻酸钠裂解酶0.02份、新鲜芦荟21份、鸢尾黄素0.45份。
去活液的制备方法为：取鱼腥藻、三角褐指藻、海带、羊栖菜、海带，加入纤维素酶、褐藻酸钠裂解酶酶解150分钟，得酶解物，备用；取新鲜芦荟，去掉叶肉，捣碎后，按料液比1:20加入氢氧化钠水溶液，超声处理55分钟，然后过滤，收集滤液，接着加入滤液等体积的石油醚萃取3次，收集下层水层，加入酶解物，搅拌均匀，随后调节pH值至中性，过滤后加入鸢尾黄素，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得去活液；氢氧化钠水溶液的质量浓度为0.09％。
b.取去活孢子加入与去活液相同温度的改良液体石蜡中进行密封，得封存体，然后将封存体置于保存温度为6℃的冰箱中即可保存5年；
其中，改良液体石蜡的制备方法为：按重量份比，取1-乙基-3-胍基硫脲盐酸盐25份，加入乙醇水溶液55份溶解后，再加入乙二酸7份和乙酰丙酸7份，加热回流13小时得反应液，然后取反应液回收乙醇至无醇味，接着加入正己烷30份进行萃取，收集萃取后的正己烷得萃取液，然后萃取液经减压蒸发除去正己烷，得离子液体；在得到的离子液体中加入离子液体重量15倍的液体石蜡、3倍的玉米朊，混合均匀，得改良液体石蜡。
c.取步骤b中保存于冰箱中的封存体，开封后从改良液体石蜡中取出去活孢子，然后用滤纸吸干表面的改良液体石蜡，置于功率密度为5mW/cm2的微波下照射9分钟，照射期间的温度与步骤b中冰箱的保存温度相同，得初级活化孢子；
d.取初级活化孢子，喷洒活化液，活化液的喷洒量为每克孢子喷洒10ml，然后在15℃下静置活化20分钟，得终极活化孢子；所述终极活化孢子无需消毒便可直接用于接种培养。
其中，活化液包括以下重量份比的原料：磷酸盐缓冲液100份、桑叶10份、橙皮6份、竹叶3份、西瓜皮4份、叶绿素0.3份、碧萝芷4.5份、甘露低聚糖2份、青蒿素0.03份、春雷霉素0.03份和甘油35份。
活化液的制备方法为：取桑叶、橙皮、竹叶和西瓜皮，洗净晾干，粉碎后加磷酸盐缓冲液浸泡50分钟，然后在60℃下回流提取85分钟后，过滤，收集滤液，得植物提取液，备用；取叶绿素、碧萝芷、甘露低聚糖，混合均匀，然后加入25％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，接着加入青蒿素、春雷霉素和剩余的甘油，搅拌均匀，得均质包合物，将均质包合物加入到所述植物提取液中，搅拌均匀，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得活化液；均质包合物与植物提取液的重量比为1：11；高压均质机的参数设置如下：温度为10℃、压力为40Mpa、循环次数为3次。
实施例6
与实施例5的区别在于，不在液氮中进行浸泡。其余方法与实施例5相同。
实施例7
与实施例5的区别在于，不在去活液中进行浸泡。其余方法与实施例5相同。
实施例8
与实施例5的区别在于，不进行微波照射。其余方法与实施例5相同。
实施例9
与实施例5的区别在于，不喷洒活化液。其余方法与实施例5相同。
实施例10实施效果对比
1.实验方法
选取采集自同一块土地的灵芝孢子，随机分成9份，每份含孢子1000个，采用实施例1-9的方法制备，得到实验样品1-9。计算实验样品1-9的萌发率。萌发率％＝萌发的孢子数量/接种的孢子数量×100％。
2.测定结果
表1萌发率测定结果
样品 萌发率％
实验样品1 25.5
实验样品2 29
实验样品3 33.2
实验样品4 41.7
实验样品5 52.1
实验样品6 11.1
实验样品7 0
实验样品8 10.9
实验样品9 12.1
3.实验结果
从表1中可以看出，实验样品1-5的灵芝孢子萌发率较高。液氮、去活液、改良液体石蜡的处理步骤，均能提高灵芝孢子复苏后的萌发率。复苏时采用微波照射、喷洒活化液，均能快速激活灵芝孢子中的酶，以及增强酶的活性，保证高萌发率。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (7)

1.一种灵芝孢子的保存和激活方法,其特征在于，包括以下步骤：
a.取刚刚从灵芝子实体收集到的孢子，立即浸泡于液氮中10-30秒，然后取出，再浸泡于-40～-20℃的去活液中120-220秒，得去活孢子；
b.取去活孢子加入与去活液相同温度的改良液体石蜡中进行密封，得封存体，然后将封存体置于保存温度为2-10℃的冰箱中即可保存3-5年；
c.取步骤b中保存于冰箱中的封存体，开封后从改良液体石蜡中取出去活孢子，然后用滤纸吸干表面的改良液体石蜡，置于功率密度为1-9mW/cm2的微波下照射6-12分钟，照射期间的温度与步骤b中冰箱的保存温度相同，得初级活化孢子；
d.取初级活化孢子，喷洒活化液后在10-20℃下静置活化10-30分钟，得终极活化孢子；所述终极活化孢子无需消毒便可直接用于接种培养。
2.根据权利要求1所述的一种灵芝孢子的保存和激活方法，其特征在于，步骤a中所述去活液包括以下重量份比的原料：鱼腥藻15-25份、三角褐指藻13-27份、羊栖菜1-5份、海带4-8份、纤维素酶0.07-0.13份、蛋白酶0.02-0.06份、褐藻酸钠裂解酶0.01-0.03份、新鲜芦荟16-26份、鸢尾黄素0.15-0.75份。
3.根据权利要求2所述的一种灵芝孢子的保存和激活方法，其特征在于，所述去活液的制备方法为：取鱼腥藻、三角褐指藻、海带、羊栖菜、海带，加入纤维素酶、褐藻酸钠裂解酶酶解100-200分钟，得酶解物，备用；取新鲜芦荟，去掉叶肉，捣碎后，按料液比1:15-25加入氢氧化钠水溶液，超声处理45-65分钟，然后过滤，收集滤液，接着加入滤液等体积的石油醚萃取2-4次，收集下层水层，加入酶解物，搅拌均匀，随后调节pH值至中性，过滤后加入鸢尾黄素，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得去活液。
4.根据权利要求3所述的一种灵芝孢子的保存和激活方法，其特征在于，所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为0.05％-0.13％。
5.根据权利要求1所述的一种灵芝孢子的保存和激活方法，其特征在于，步骤b中所述改良液体石蜡的制备方法为：按重量份比，取1-乙基-3-胍基硫脲盐酸盐20-30份，加入乙醇水溶液45-65份溶解后，再加入乙二酸4-10份和乙酰丙酸3-11份，加热回流8-18小时得反应液，然后取反应液回收乙醇至无醇味，接着加入正己烷20-40份进行萃取，收集萃取后的正己烷得萃取液，然后萃取液经减压蒸发除去正己烷，得离子液体；在得到的离子液体中加入离子液体重量10-20倍的液体石蜡、1-5倍的玉米朊，混合均匀，得改良液体石蜡。
6.根据权利要求1所述的一种灵芝孢子的保存和激活方法，其特征在于，步骤d中所述活化液包括以下重量份比的原料：磷酸盐缓冲液70-130份、桑叶4-16份、橙皮3-9份、竹叶1-5份、西瓜皮1-5份、叶绿素0.1-0.5份、碧萝芷2-7份、甘露低聚糖1-3份、青蒿素0.01-0.05份、春雷霉素0.01-0.05份和甘油20-50份。
7.根据权利要求6所述的一种灵芝孢子的保存和激活方法，其特征在于，所述活化液的制备方法为：取桑叶、橙皮、竹叶和西瓜皮，洗净晾干，粉碎后加磷酸盐缓冲液浸泡40-60分钟，然后在55-65℃下回流提取75-95分钟后，过滤，收集滤液，得植物提取液，备用；取叶绿素、碧萝芷、甘露低聚糖，混合均匀，然后加入20％-30％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，接着加入青蒿素、春雷霉素和剩余的甘油，搅拌均匀，得均质包合物，将均质包合物加入到所述植物提取液中，搅拌均匀，再经过0.22μm的滤膜过滤除菌，得活化液；所述均质包合物与植物提取液的重量比为1：6-16。
CN201911409905.3A 2019-12-31 2019-12-31 一种灵芝孢子的保存和激活方法 Pending CN111117891A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911409905.3A CN111117891A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种灵芝孢子的保存和激活方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911409905.3A CN111117891A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种灵芝孢子的保存和激活方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111117891A true CN111117891A (zh) 2020-05-08

Family

ID=70506258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911409905.3A Pending CN111117891A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种灵芝孢子的保存和激活方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111117891A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1752204A (zh) * 2005-07-25 2006-03-29 钟良瑜 灵芝孢子的萌动方法
CN1754957A (zh) * 2004-09-27 2006-04-05 广东省微生物研究所 一种中长期保藏菌种的方法
CN103461007A (zh) * 2013-10-10 2013-12-25 贵州省生物技术研究所 竹黄孢子的保藏方法
CN109157551A (zh) * 2018-09-14 2019-01-08 广东润源中天生物科技有限公司 一种高压冰冻破壁法在制备破壁灵芝孢子粉生产工艺的应用
CN109588376A (zh) * 2018-12-27 2019-04-09 广西融安县金鼎制丝有限责任公司 一种蚕卵的保存方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1754957A (zh) * 2004-09-27 2006-04-05 广东省微生物研究所 一种中长期保藏菌种的方法
CN1752204A (zh) * 2005-07-25 2006-03-29 钟良瑜 灵芝孢子的萌动方法
CN103461007A (zh) * 2013-10-10 2013-12-25 贵州省生物技术研究所 竹黄孢子的保藏方法
CN109157551A (zh) * 2018-09-14 2019-01-08 广东润源中天生物科技有限公司 一种高压冰冻破壁法在制备破壁灵芝孢子粉生产工艺的应用
CN109588376A (zh) * 2018-12-27 2019-04-09 广西融安县金鼎制丝有限责任公司 一种蚕卵的保存方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEONARDI P.等: "Ultra-low freezing to preserve the lingzhi or reishi medicinal mushroom Ganoderma lucidum(Agaricomycetes)", 《INT J MED MUSHROOMS》 *
刘远超 等: "食用菌菌种保藏方法的研究进展", 《中国食用菌》 *
叶坤 等: "一种新的综合法破壁灵芝孢子技术", 《江苏农业科学》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107371960A (zh) 一种沃柑的种植方法
CN102584411A (zh) 一种琼胶原藻生物肥及其制备方法
CN107396798A (zh) 一种柑橘的种植方法
CN104757682A (zh) 一种利用乳酸菌制备银杏果清汁乳酸饮料的方法
CN108464317A (zh) 一种薄荷与香茅发酵制备蚊虫驱避剂的方法
CN108218587A (zh) 一种高生物活性复合海藻肥及其制备方法
CN113519569B (zh) 一种用于猕猴桃早期落叶病的药剂制备方法
CN108935517B (zh) 促进广西甜茶种子发芽的促进剂及其制备方法及其应用
CN109379921A (zh) 一种加快黄精种子萌发的方法
CN112190602A (zh) 一种蚕蛹虫草片剂的制备方法
CN111117891A (zh) 一种灵芝孢子的保存和激活方法
CN107864988B (zh) 一种合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法
KR101542579B1 (ko) 황칠 유용성분 생산방법
CN111149617B (zh) 一种灵芝的组培方法
CN107771675A (zh) 一种罗汉果种植方法
CN108432544A (zh) 一种桑枝云耳的栽培方法
CN103642741A (zh) 一种复合光合菌剂及其制备方法
CN114271277A (zh) 一种利云型果聚糖的应用
CN114133987A (zh) 一种从香樟叶片中提取精油的方法
CN107488624A (zh) 一种印度块菌菌丝快速分离和培养方法
WO2022088283A1 (zh) 一种蚕蛹虫草浓缩液的制作方法
CN114456947B (zh) 细虫草菌株及其人工培养方法
CN107637522A (zh) 一种珍珠李的育苗方法
CN110476712B (zh) 利用广西莪术茎叶栽培茶树菇的方法
CN106134766A (zh) 一种真姬菇的生态循环培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200508