CN111110698A

CN111110698A - 牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法

Info

Publication number: CN111110698A
Application number: CN202010085944.9A
Authority: CN
Inventors: 李军
Original assignee: Car T Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Car T Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-02-11
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2020-05-08

Abstract

本发明公开了一种牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法，该方法采用的是脱落乳牙干细胞，将脱落乳牙干细胞进行扩增步骤后即进行牙髓间充质干细胞的输注步骤，将扩增后的脱落乳牙干细胞回输入卵巢早衰患者体内，回输方式采用静脉注射，每次注射脱落乳牙干细胞的量为8.5×10⁸个，每隔15～30天注射一次，共注射6～10次，每次输注后详细记录患者的使用效果，并随延缓女性卵巢早衰的程度决定是否继续输注和输注脱落乳牙干细胞的剂量。患者在输注牙髓间充质干细胞一至两次后就可感受到身体发生的明显变化，如精力提升、睡眠改善、食欲增加、皮肤感觉细腻光滑、闭经后能够再次来月经、月经量增加以及月经持续时间正常等。

Description

牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法

技术领域

本发明属于女性卵巢保养方法技术领域，具体的说是涉及一种牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法。

背景技术

卵巢早衰（POF）是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前即闭经的现象。特点是原发或继发闭经伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，并伴有不同程度的一系列低雌激素症状，如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等。妇女的平均自然绝经年龄为50～52岁，绝经年龄存在着种族和地区分布的差异，但其绝对值相差不大。总结1858例妇女的自然闭经情况，小于40岁的POF发生率为1％，小于30岁的POF发生率为1‰。原发闭经中POF占10％～28％，继发闭经中POF占4％～18％。发现北京地区妇女POF发生率为1.8％。由此可见，POF在临床上并不少见，POF是一种有多种病因的综合征，在大部分的病例中病因还不明确。

目前POF病因从临床上主要分为以下几个方面，各个病因都可从以上某个方面减少卵巢内卵泡池的储备或引起卵泡功能失调而导致POF。1、遗传因素：通过对家族史的仔细分析，家族性POF的发病率在不同的人群中报道分别为4％～31％，可见遗传因素在POF中占主要地位。X染色体的异常一直被公认为是引起POF的主要病因，随着分子生物学的进展，研究者们在常染色体上也发现了越来越多的与POF相关的候选基因。2、免疫因素：自20世纪50年代开始，研究者发现9％～40％的POF患者合并其他内分泌腺体或系统的自身免疫性疾病，如自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、甲状旁腺功能减退、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、糖尿病等。POF患者常合并2种或以上的自身免疫性疾病，所有伴随POF的自身免疫疾病中，甲状腺疾病是最常见原因，12％～33％的POF患者能被检测出患有甲状腺疾病。18％的POF患者中，家族中存在遗传的甲状腺疾病，第二常见的是多腺体自身免疫疾病（PAGD，Addison病合并内分泌系统功能障碍），在PGADⅠ型中，POF发病率为17％～50％，PGADⅡ型中，POF的发生率为3.6％～7％，PGADⅡ型中包括自身免疫性Addison病、甲状腺自身免疫和胰岛素依赖型糖尿病，还有其他如白斑、秃顶、慢性萎缩性胃炎、恶性贫血等，这些综合征自然病程变化多端，在发病前后都有可能出现POF的症状，如Addison病，POF通常比肾上腺症状要提早发生。

POF的临床表现有：1、闭经：分为原发闭经和继发闭经，继发闭经发生在40岁之前。通过对大样本的POF患者的调查发现闭经之前并没有特征性的月经异常的先兆。有的人是在规律的月经后突然闭经，有的是停避孕药或分娩以后闭经，有的则在闭经之前表现为月经周期及经期的紊乱。2、不孕：部分患者因不孕就诊而发现卵巢早衰，不孕是卵巢早衰患者就诊和苦恼的主要原因。有原发不孕和继发不孕，所以建议有卵巢早衰家族史者应尽早计划怀孕。3、低雌激素症状：原发闭经者低雌激素症状潮热和/或性交困难等少见，约22.2％，如果有也大多与既往用过雌激素替代治疗有关，继发闭经者低雌激素症状常见，约85.6％。这与低雌激素症状是由雌激素撤退引起的理论相一致。这些低雌激素症状还包括萎缩性阴道炎和尿频、尿痛等萎缩性尿道炎。4、伴发的自身免疫性疾病：如Addison病、甲状腺疾病、糖尿病、红斑狼疮、类风湿性关节炎、白癜风和克隆病等。另外还有肾上腺功能不全的隐匿症状，如近期体重的减轻、食欲减退、不明确的腹部疼痛、衰弱、皮肤色素沉着加重和嗜盐。

POF的检查：1、病史：卵巢手术史、肿瘤的放化疗史是引起卵巢衰竭的医源性因素。病毒感染史也是引起卵巢衰竭的少见的原因之一，特别是流行性腮腺炎和AIDS病史。由于POF与自身免疫的相关性，所以需询问家族或本人有无自身免疫性疾病史，如Addison病、甲状腺疾病、糖尿病、红斑狼疮、类风湿性关节炎、白癜风和克隆病等。2、体检：Turner综合征有身矮、躯体畸形及性幼稚的三大典型表现。其他与POF伴发的少见的综合征或自身免疫性疾病有各自的特征性的体检结果。特发性POF的体征不多。第二性征发育不全在原发闭经者多见，约占88.9％，在继发闭经者少见，约占8.2％。盆腔检查可发现外阴萎缩、阴道萎缩、黏膜苍白、变薄、点状充血出血等萎缩性性阴道炎和偏小的子宫，但多数POF患者能间断地产生足够的雌激素来维持正常的阴道黏膜。3、阴道B超检查：可见偏小的子宫和双侧明显萎缩的卵巢。有报道通过阴道B超可发现41％～60％的患者的卵巢中有卵泡样结构，通过活检证实这些是过早黄素化的卵泡，没有正常的功能，是卵巢功能减退卵泡衰竭的结果。另外，由于始基卵泡太小B超检测不到，所以B超也不能帮助诊断卵泡型POF卵巢抵抗综合征或非卵泡型POF。4、血激素水平：血FSH持续在40IU/L以上，E2常低于100pmol/L，P低于2nmol/L。Elias等测定首次就诊的卵巢早衰患者的血雄激素水平后发现，POF患者的血睾丸酮和硫酸脱氢表雄酮水平与同年龄妇女近似，雄烯二酮水平低于正常同龄妇女。若伴有甲状腺或肾上腺的自身免疫性疾病并引起其功能低下，则皮质醇、T3、FT3、T4、FT4水平低下，ACTH及TSH水平升高。5、腹腔镜检查：卵巢体积缩小，很难看见发育中卵泡和排卵孔，无黄体形成，子宫体积缩小。卵巢活检对诊断卵巢炎或确定卵泡型或无卵泡型POF并没有太大意义，因为有报道卵巢活检显示无卵泡时仍有妊娠发生的可能，可见卵巢活检的片面性。因此，多数学者不主张应用卵巢活检来进行卵巢早衰的病因诊断及病情评估。POF的诊断：1967年，Moraes-Reuhsen提出凡40岁前出现闭经、围绝经期症候群或绝经期症状，低雌激素血症和高促性腺激素血症，可诊断为卵巢早衰。1973年Goldenberg提出血FSH³40IU/L即为高促性腺激素血症。但此后多个研究证实以单次FSH>40IU/L作为卵泡衰竭的证据是错误的。所以目前全世界公认的卵巢早衰的诊断标准为：1、年龄<40岁；2、闭经时间≥6个月；3、两次间隔1个月以上血FSH>40mIU/ml。因此，卵巢早衰的诊断不难，更主要的是尽可能的明确引起卵巢早衰的病因，以指导临床治疗。

现有技术中卵巢早衰的治疗方法有：1、雌孕激素替代治疗（HRT）：雌孕激素替代治疗对于年轻的POF患者来说是非常重要的，即可以缓解低雌激素症状及泌尿生殖道萎缩，为赠卵胚胎移植作准备，又可以预防远期并发症，骨质疏松、老年性痴呆症等、结肠癌的风险降低37％。但长期HRT也有一定的风险，如子宫内膜癌和乳腺癌的发生，但研究表明孕激素每月应用时间大于10天的雌孕激素替代治疗可使子宫内膜癌的风险几乎降至零，而乳腺癌的风险略有增加，但死亡率不增高。通常采用雌、孕激素序贯联合方案，在应用HRT之前，应进行个体化的利弊权衡，并进行必要的监测和随访。2、预防骨质疏松：除HRT外，每天保证1200mg的钙的摄入，VitD 400～800IU/天，进行必要的体育锻炼，如走路、瑜珈或太极等。3、促排卵治疗：文献有很多关于对POF患者促排卵的成功经验的报道，治疗前筛选病人的条件大多是闭经时间短、血FSH水平不太高、临床判断为卵泡型POF等。一般用HRT或GnRHa抑制内源性促性腺激素主要是FSH至较低水平<20IU/L后，予足量hMG/hCG促排卵同时B超监测，要求hMG用量大、持续时间长。降调节能使促排卵成功的理论依据是降调节后内源性FSH水平降低，颗粒细胞表面FSH受体增多，增加了卵巢的敏感性。4、免疫治疗：因免疫因素是卵巢早衰的一个肯定病因，所以对有免疫因素证据的这部分卵巢早衰患者进行免疫抑制治疗是有效的。有多个免疫抑制治疗发生妊娠的报道。到目前为止，还没有明确的方法鉴定免疫因素在POF中的作用，也没有明确的免疫治疗的指征和规范的用药方案，而免疫抑制治疗可引起严重副作用，所以临床上并不推荐盲目应用免疫抑制剂治疗POF。5、DHEA治疗：DHEA 50％由肾上腺皮质网状带分泌，20％由卵巢分泌，30％由外周DHEAS转化而来，体内每天产生6～8mg，血浓度为3～35nmol/L，其水平随年龄增长而降低，DHEA是合成雄烯二酮、睾酮、雌二醇的重要物质，DHEA的含量高低影响这些激素的水平。6、赠卵胚胎移植术：1984年Lutjen等报道了世界第一例卵巢早衰卵母细胞赠送获得成活新生儿，为POF患者提供了获得生育的途径，到目前为止，赠卵胚胎移植对POF患者来说仍是获得妊娠的最有效的治疗。7、卵巢移植：2004年10月DonnezJ等首次报道一例人卵巢组织冻存后自体移植使卵巢功能恢复并分娩活胎，随后几年有多个卵巢冻存和移植成功并妊娠分娩的报道。

卵巢衰老是自然规律，正常妇女卵巢功能在45岁～50岁，左右时开始逐渐衰退。但是近年来却发现卵巢早衰的患者明显增多，经常能看到一些30岁左右的年轻白领出现卵巢早衰的征兆。卵巢早衰的危害：不少女性对卵巢功能早衰不在意，甚至认为不来月经倒轻松，根本不到医院治疗。大多数卵巢功能早衰都是因为不孕时才发现的。出现卵巢功能早衰若不及时治疗，任其闭经，会使患者出现骨质疏松、心血管病变及脂质代谢紊乱等症状，夫妻生活质量也会受到很大影响。导致卵巢早衰的因素：1、与生活习惯有关：调查结果表明，每周吃二到三次鱼、虾的妇女，绝经年龄较晚；常年坚持喝牛奶的妇女，喝牛奶量较多，坚持时间越长，绝经越晚；从不锻炼身体的妇女，绝经年龄早；受到被动吸烟侵害越多，时间越长，绝经越早。2、与患过腮腺炎并发卵巢炎有关：由于腮腺炎并发卵巢炎，破坏了卵巢的功能，使卵巢对垂体的促性腺激素的刺激不敏感，没有产生应该有的反应。3、与生育状况有关：首先与首次怀孕的年龄有关，即首孕年龄越大，绝经愈早，另外，哺乳时间越长，绝经越晚。还有，口服避孕药时间越长，绝经越晚。4、与体内免疫机制有关：体内免疫机制的问题如风湿性关节炎、甲状腺疾病以及遗传性疾病因素等，也是导致卵巢功能早衰的重要原因。5、与月经初潮年龄有关：月经初潮年龄越早，绝经发生得越早。6、与穿塑身内衣有关：由于塑身内衣的压迫，导致卵巢发育受限，卵巢受伤，尤其是少女长期穿紧身衣，不仅会影响发育，还会诱发乳腺增生或囊肿等疾病。7、与生活节奏心理压力有关：生活节奏加快导致的心理压力过大，也会使女性提早出现隐性更年期的症状。据一项问卷调查资料显示，在30多岁的白领女性中，有27％的人存在着不同程度的隐性更年期现象。她们自诉身心疲惫、体重攀升、烦躁失眠、皮肤干燥、发色枯黄、月经紊乱等，有时还会厌倦工作，莫名其妙地病一场，虽然服用了大量保健品也无济于事，严重影响了自己与家人的生活与工作。

卵巢功能早衰对女性机体的影响确实是明显的，由于性激素过早地撤退，可导致月经紊乱、闭经、绝经期提前来临，出现一些本该发生在更年期的代谢紊乱。但是，卵巢功能早衰并不一定意味着人整个机体的衰老。科学研究认为，即使是进入更年期月经停止后，女性全身调节系统会做出积极的变化，进入一种新的平衡状态，从而确保全身其他系统的正常运转。关键是卵巢功能衰减者要正视现实，摆脱精神上的压力，调整好心态，注意自我保健。另外出现了卵巢早衰，应及时用药物治疗。

细胞是生物体基本的结构和功能单位。人体是由220多种不同组织约40万亿个细胞组成的有机体，所有生命活动都是由细胞完成的。细胞治疗(cell therapy) 是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，再将这些细胞回输病人的一种治疗方式。干细胞（stem cell）是未充分分化、具有再生各种组织器官的潜在功能的一类细胞，干细胞主要用于组织器官修复和体内免疫调节，干细胞是一类具有自我更新复制和多向分化潜能的原始细胞，胚胎干细胞是一种全能干细胞，所有的细胞均起源于一个干细胞，成体干细胞是一种多功能或单功能的干细胞，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种多能成体干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞主要存在于结缔组织和器官间质中，包括：骨、脂肪、肌肉、脐带、肺、肝、胰腺等组织中。在体内或体外特定的条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。间充质干细胞属于多功能干细胞，间充质干细胞可以粘附在塑料器皿表面贴壁生长，属于特定表面标记物，具有多向分化潜能，可以体外成骨、成软骨和成脂肪。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法，该方法具体包括牙髓间充质干细胞的扩增和牙髓间充质干细胞的输注两个步骤：牙髓间充质干细胞是一种来源于牙髓的成体间充质干细胞，它包括恒牙中的牙髓干细胞及乳牙中的脱落乳牙干细胞两类，所述牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法采用的是脱落乳牙干细胞，将脱落乳牙干细胞进行扩增步骤后即进行牙髓间充质干细胞的输注步骤，牙髓间充质干细胞的输注步骤具体为：将扩增后的脱落乳牙干细胞回输入卵巢早衰患者体内，回输方式采用静脉注射，每次注射脱落乳牙干细胞的量为8.5×10⁸个，每隔15～30天注射一次，共注射6～10次，每次输注后详细记录患者的使用效果，并随延缓女性卵巢早衰的程度决定是否继续输注和输注脱落乳牙干细胞的剂量。

牙髓间充质干细胞的扩增步骤为：首先需要由牙科医生对乳牙进行拔出后，通过冷链运输将牙齿在冷藏状态下运送到细胞制备中心，然后在GMP条件下的实验室中切开乳牙提取其中的牙髓组织，进行牙髓中干细胞的提取，提取出的牙髓干细胞培养在培养瓶中进行传代和扩增，最后经过间充质干细胞鉴定检测，同时满足呈梭状贴壁生长、细胞表面表达阳性Marker，不表达阴性Marker以及具有成骨、成脂、成软骨分化能力时的细胞即为牙髓干细胞。

脱落乳牙干细胞是在6-12岁宝宝即将脱落的乳牙中提取，且是在没有发生龋齿或炎症的健康的乳牙的牙齿组织中提取。

间充质干细胞的主要特性有：1、低免疫原性，低表达MHC-I，不表达MHC-II、FAS配体以及CD40L等共刺激因子，细胞输注后各种免疫标记物水平没有明显的变化，异体输注不会引起免疫排斥反应；2、损伤趋化作用，具有归巢功能，归巢作用能够主动迁移并聚集到损伤炎症部位，归巢作用与间充质干细胞表面表达的多种趋化因子受体，趋化因子受体相关；3、具有旁分泌作用和细胞滋养作用，促生长；间充质干细胞可以通过旁分泌或者以外泌体、微囊泡及凋亡小体的形式分泌多种生长因子、细胞因子、多肽、激素等细胞生长所需营养物质，从而促进细胞的生长；通过改善组织部位微环境，激活自身干细胞，促进分化新生细胞；4、具有抗凋亡作用，线粒体功能异常会引起活性氧产生增多以及细胞凋亡途径的激活，导致许多疾病的发生和发展，当人体细胞处于应激、损伤等状况时，会激活间充质干细胞将自身线粒体转移给受体细胞，从而修复受损细胞，防止细胞凋亡；5、免疫调节作用，可以根据体内免疫系统状况和炎症水平进行双向调节，抑制炎症反应，在大量炎症因子刺激下，MSCs会被激活转变为抗炎MSC2型，产生大量的NO、IDO等免疫调节因子以及趋化因子，通过抑制效应性T细胞功能，诱导Treg产生发挥免疫抑制作用；而在低水平的促炎因子或高水平的抗炎因子刺激下， MSCs会转变为促炎MSC1型，仅产生少量免疫调节因子，通过释放趋化因子募集淋巴细胞到达炎症发生部位，促进效应性T细胞增殖、激活和分化，抑制Treg的产生；6、体外增殖，易扩增传代，并保持稳定；贴壁后快速生长是间充质干细胞的一个重要特性，反映了细胞自我更新的能力；MSCs体外传代次数可以达到50代及以上；细胞活性随传代次数增加而降低，输注细胞一般使用6代以内的细胞。

牙髓间充质干细胞的体内代谢：大量的实验数据证明间充质干细胞输入体内后，并没有长期停留在体内，而是随着时间的延长而逐渐凋亡。截止到2019年4月，ClinicalTrials 数据库中可以查询到 948 项间充质干细胞治疗的临床试验，可以查询到 11项牙髓干细胞治疗的临床试验，目前可以查询到200件以上的牙髓间充质干细胞（MSCs）产品，绝大多数处于研发和临床阶段，其中已经上市的有7件产品。

本发明中使用的牙髓间充质干细胞是脱落乳牙干细胞，干细胞来源是6-12岁儿童脱落的乳牙，属于废弃物，采集过程不会对供者产生伤害，因此不存在伦理争议问题。另外牙髓腔是一个相对封闭的结构，乳牙从采集点运送到实验室的过程中可以保持很好的完整结构，牙齿切割和干细胞提取的过程都是在GMP实验室完成，因此其安全性与其他来源干细胞相比更高。GMP实验室是采用符合国际细胞制备质量管理体系标准的一种生物实验室，GMP实验室能够为满足患者治疗疾病的需求提供干细胞的分离纯化、培养扩增、收集冻存、检测质控、细胞复苏、产品运输和细胞回输等技术应用。

本发明的有益效果是：使用本发明方法改善女性卵巢早衰的效果显著，给患者输注牙髓间充质干细胞后，牙髓间充质干细胞作为治疗药物的作用机制是牙髓间充质干细胞进入人体后通过归巢作用聚集在损伤或疾病部位，然后通过分泌生物活性因子进行免疫调节和细胞滋养，最终激活自身干细胞进行组织的修复。患者在输注牙髓间充质干细胞一至两次后就可感受到身体发生的明显变化，如精力提升，睡眠改善，睡眠深，食欲增加，皮肤感觉细腻光滑、润泽、肤色变白，皱纹减少，面部色斑变淡，闭经后能够再次来月经，月经量增加，月经持续时间正常。连续随访数月，月经基本正常，而且有规律，多年不孕患者可顺利怀孕。还可出现头发增多，皮肤开始变得紧致以及肌肉变得紧实，乳房、臀部变得紧致富有弹性，食欲增加，不适症状减轻，阴部变湿润，复查血清超氧化物歧化酶(SOD)活力测定，雌激素水平测定均明显升高。闭经的不适症状已基本消失，复查雌激素水平明显上升。表1为使用牙髓间充质干细胞与其他干细胞的差异化比较。

表1：牙髓间充质干细胞与其他干细胞的差异化比较：

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作详细描述。

本发明公开了一种牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法，该方法具体包括牙髓间充质干细胞的扩增和牙髓间充质干细胞的输注两个步骤：牙髓间充质干细胞是一种来源于牙髓的成体间充质干细胞，它包括恒牙中的牙髓干细胞及乳牙中的脱落乳牙干细胞两类，所述牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法采用的是脱落乳牙干细胞，将脱落乳牙干细胞进行扩增步骤后即进行牙髓间充质干细胞的输注步骤，牙髓间充质干细胞的输注步骤具体为：将扩增后的脱落乳牙干细胞回输入卵巢早衰患者体内，回输方式采用静脉注射，每次注射脱落乳牙干细胞的量为8.5×10⁸个，每隔15～30天注射一次，共注射6～10次，每次输注后详细记录患者的使用效果，并随延缓女性卵巢早衰的程度决定是否继续输注和输注脱落乳牙干细胞的剂量。

牙髓间充质干细胞的扩增步骤为：首先需要由牙科医生对乳牙进行拔出后，通过冷链运输将牙齿在冷藏状态下运送到细胞制备中心，然后在GMP条件下的实验室中切开乳牙提取其中的牙髓组织，进行牙髓中干细胞的提取，提取出的牙髓干细胞培养在培养瓶中进行传代和扩增，最后经过间充质干细胞鉴定检测，同时满足呈梭状贴壁生长、细胞表面表达阳性Marker，不表达阴性Marker以及具有成骨、成脂、成软骨分化能力时的细胞即为牙髓干细胞。脱落乳牙干细胞是在6-12岁宝宝即将脱落的乳牙中提取，且是在没有发生龋齿或炎症的健康的乳牙的牙齿组织中提取。

改善案例1：方女士，34岁，卵巢早衰，不孕不育。

临床现象：平时月经不规律，量少，持续时间短，结婚10年一直未怀孕，检查雌激素指标较低，子宫、卵巢偏小。

2019年5月12号第一次输注后随访；使用一周后无明显感觉和变化。2019年5月26号第二次输注后随访；输注后一周随访，精力提升，睡眠深，食欲增加，皮肤感觉细腻光滑，使用干细胞后第一次来月经，量增加，持续时间4天。2019年6月9号第三次输注一周随访；精力充沛，睡眠香，食欲好，皮肤变紧致细腻。2019年7月12号第四次输注一月后随访；第二次来月经，每天量约80ML左右，持续4天，连续随访三个月，月经基本正常，而且有规律。输注干细胞六个月后月经未按时来，并出现恶心、食欲不振，全身乏力，建议到医院检查，检查结果是怀孕了。2018年8月11日顺利产下6斤重男婴。

改善案例2：张女士，43岁，突然停经6个月，雌激素指标降低。

临床现象：出现停经、易出汗、潮热、心慌、失眠、食欲下降、掉头发、性欲的下降、阴部干涩和易怒等症状。用药情况：己烯雌酚片0.5mg/1次/日，21天后停药一周，周期性服。服药一个月后有来月经，但是量少，天数少，时间不规律。

2019年3月9日第一次输注后一周随访：无明显不适感觉，皮肤变光滑、润泽、肤色变白。2019年4月13日第二次输注后随访：皱纹减少，面部色斑变淡，睡眠改善,精力提升，月经量增加。2019年5月18日第三次输注后随访：后头发出现增多，皮肤开始变得紧致以及肌肉变得紧实，乳房、臀部变得紧致富有弹性，食欲增加，不适症状减轻，阴部变湿润，月经量中等，持续4天左右，每次规律。复查血清超氧化物歧化酶(SOD)活力测定，雌激素水平测定均明显升高。建议己烯雌酚片减半0.25mg/1次/日，21天后停药一周，周期性服用。输注6个月后随访，月经基本正常，过去不适症状已基本消失，复查雌激素水平雌二醇（E2）350ng/L孕酮（P）2.0μg/L明显上升。建议停止使用己烯雌酚片。停用己烯雌酚片后连续随访四个月，精力充沛，睡眠好，食欲香，月经正常并规律，无明显不适。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法，其特征在于：牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法具体包括牙髓间充质干细胞的扩增和牙髓间充质干细胞的输注两个步骤：牙髓间充质干细胞是一种来源于牙髓的成体间充质干细胞，它包括恒牙中的牙髓干细胞及乳牙中的脱落乳牙干细胞两类，所述牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法采用的是脱落乳牙干细胞，将脱落乳牙干细胞进行扩增步骤后即进行牙髓间充质干细胞的输注步骤，牙髓间充质干细胞的输注步骤具体为：将扩增后的脱落乳牙干细胞回输入卵巢早衰患者体内，回输方式采用静脉注射，每次注射脱落乳牙干细胞的量为8.5×10⁸个，每隔15～30天注射一次，共注射6～10次，每次输注后详细记录患者的使用效果，并随延缓女性卵巢早衰的程度决定是否继续输注和输注脱落乳牙干细胞的剂量。

2.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法，其特征在于：所述牙髓间充质干细胞的扩增步骤为：首先需要由牙科医生对乳牙进行拔出后，通过冷链运输将牙齿在冷藏状态下运送到细胞制备中心，然后在GMP条件下的实验室中切开乳牙提取其中的牙髓组织，进行牙髓中干细胞的提取，提取出的牙髓干细胞培养在培养瓶中进行传代和扩增，最后经过间充质干细胞鉴定检测，同时满足呈梭状贴壁生长、细胞表面表达阳性Marker，不表达阴性Marker以及具有成骨、成脂、成软骨分化能力时的细胞即为牙髓干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的牙髓间充质干细胞延缓女性卵巢早衰的方法，其特征在于：所述脱落乳牙干细胞是在6-12岁宝宝即将脱落的乳牙中提取，且是在没有发生龋齿或炎症的健康的乳牙的牙齿组织中提取。