CN111093652A - 使用丹曲林治疗神经毒剂暴露的方法 - Google Patents

使用丹曲林治疗神经毒剂暴露的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用丹曲林或其药学上可接受的盐治疗暴露于神经毒剂的受试者的方法。

Description

使用丹曲林治疗神经毒剂暴露的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月5日提交的美国临时申请第62/554,049号和2018年5月21日提交的美国临时申请第62/674,406号的权益，全部内容通过引用合并于此。
技术领域
本公开涉及用丹曲林(或丹曲林代谢物，如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐治疗暴露于神经毒性神经毒剂的受试者的方法。
背景技术
神经毒性神经毒剂，也称为神经毒剂，是可通过阻断乙酰胆碱酯酶来破坏神经系统中神经冲动的传递的有机磷化合物。这些毒剂，无论是气体、气溶胶还是液体形式，都具有极高的毒性，并具有非常迅速的作用。神经毒剂中毒会产生多种症状，包括单侧或双侧瞳孔缩小、头痛、抽搐、意识丧失、昏迷和死亡。特别地，神经毒剂中毒会引起癫痫发作，然后会迅速发展为癫痫持续状态(SE)，从而导致癫痫发作相关的脑损伤。神经毒剂引起的癫痫发作用标准的抗癫痫治疗通常无效。
用于治疗神经毒剂中毒的医疗护理可能会被延迟到可能终止神经毒剂诱发的癫痫发作的治疗窗口之外，并且与癫痫发作有关的脑损伤将随着病理级联而继续。因此，需要能够中断病理级联以便在神经毒剂诱发的癫痫发作的难治期间提供神经保护的药物治疗。
发明内容
本公开涉及用药物组合物治疗暴露于神经毒性神经毒剂的受试者的方法，所述药物组合物包含一定量的丹曲林(或丹曲林代谢物，如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐。
附图说明
图1描绘了测试组随时间的平均体重。
图2A描绘了研究第14天的蔗糖偏好测试结果。
图2B描绘了研究第15天的蔗糖偏好测试结果。
图3描绘了强迫游泳测试的结果。
图4描绘了来自额顶叶皮层的平均坏死评分。
图5A描绘了来自E组动物的额顶叶皮层的显微照片(阳性对照，水，SE发作后50分钟)。箭头标记褪色皱缩的神经元。坏死评分是4。
图5B描绘了来自D组动物的额顶叶皮层的显微照片(30mg/kg
Figure BDA0002399483670000021
SE发作后20分钟)。箭头标记正常的神经元。坏死评分为0。
发明详述
通过参考以下结合附图和实施例的详细描述，可以更容易地理解本公开，附图和实施例构成本公开的一部分。应当理解，本公开不限于本文描述和/或示出的特定组合物或方法，并且本文所用的术语仅出于通过举例来描述特定实施方案的目的，而不想要限制所主张的公开内容。另外，在说明书(包括权利要求书)中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数，并且除非上下文中另有明确的说明，否则提到特定数值至少包括所述特定值。所有范围都包含端值并可组合。
修饰词“约”应视为公开了由两个端点的绝对值界定的范围。例如，表述“约2至约4”也公开了范围“2至4”。当用于修饰单个数字时，术语“约”可以指所示数字±10％，并且包含所示数字。例如，“约10％”可以表示9％至11％的范围，并且“约1”是指0.9至1.1。
应当理解，为清楚起见，本文在单独实施方案的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相比之下，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本公开的各种特征也可以单独地或以任何子组合来提供。此外，提到以范围陈述的值包含所述范围内的每个值和所有值。
如本文所用，术语“药物组合物”是指适于向人施用并且包含药学上可接受的赋形剂的组合物，所述赋形剂例如但不限于稳定剂、填充剂、缓冲剂、载剂、稀释剂、媒剂、增溶剂和粘合剂。如本文所用，药物组合物包括但不限于准备用于皮下注射或输注和肌内注射的液体形式。
“治疗有效量”是指本文所述的活性药剂的量，其足以抑制、停止特定受试者或受试者群体中所治疗的病症或病状或使之改善。在某些实施方案中，在人或其他哺乳动物中，治疗有效量可以在实验室或临床环境中通过实验确定，或者可以是针对所治疗的特定疾病和受试者的政府指南所需的量。
如本文所用，“改善”是指在特定受试者或受试者群体中所治疗的病症或病状的严重程度减轻。
如本文所用，“患者”或“受试者”意指哺乳动物。因此，本文描述的方法适用于人和非人受试者。本文描述的方法特别适用于人。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指药学上可接受的事物，例如药物组合物的组分，包括容器，不会引起药理活性的不可接受的损失或不可接受的不良副作用。药学上可接受的成分的实例提供于1990年在美国马里兰州罗克维尔举行的美国药典大会上通过的《美国药典》(USP)《国家处方集》(NF)和由美国食品和药品管理局发行的《FDA非活性成分指南》(1990、1996)(两者均通过引用并入本文，包括任何附图)。也可以使用满足USP/NF以外的必要限制和/或规格的其他等级的溶液或组分。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的盐，其是药学上可接受的并且具有母体化合物的所需药理活性。特别地，这些盐是无毒的，并且可以是无机或有机酸加成盐和碱加成盐。具体地，这些盐包括：当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替代时形成的盐；或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等)配位时形成的盐。仅举例而言，盐还包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等；当化合物包含碱性官能团时，无毒的有机酸或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
如本文所用，“神经毒性神经毒剂”或“神经毒剂”是指影响神经系统中神经冲动的传递的化合物。神经毒剂是有机磷化合物，即，它们具有式(R)3P(O)，其中每个R基团可以相同或不同。“G”型神经毒剂包括甲氟膦酸O-频那酯(梭曼，GD)、N,N-二甲氰基氰磷酰乙酯(塔崩，GA)、甲氟膦酸丙-2-酯(沙林，GB)、甲氟膦酸环己酯(环沙林，GF)和2-(二甲基氨基)乙基(GV)。“V”型神经毒剂包括甲基硫代膦酸O-环戊酯S-(2-二乙基氨基乙基)酯(EA-3148)、(S)-({[2-(二乙基氨基)乙基]磺酰基}(乙基)膦酸乙酯类)(例如(S)-({[2-(二乙基氨基)乙基]硫烷基}(乙基)次膦酸乙酯)(VE))、S-[2-(二乙基氨基)乙基]硫代磷酸O,O-二乙酯(VG)、甲基硫代膦酸S-[2-(二乙基氨基)乙]酯O-乙酯(VM)、N,N-二乙基-2-(甲基-(2-甲基丙氧基)磷酰基)硫烷基乙胺(VR)和({2-[双(丙-2-基)氨基]乙基}硫烷基](甲基)次膦酸乙酯(VX)。本文所述的方法可用于治疗暴露于一种神经毒剂的受试者。本文描述的方法也可以用于治疗暴露于两种以上神经毒剂的受试者。
如本文所用，短语“因暴露于神经毒剂而导致”和“由于神经毒剂暴露而引起”是指作为神经毒剂暴露的直接后果的效应以及作为神经毒剂暴露的继发后果的效应，以及作为神经毒剂暴露的间接后果的效应。
其中，本公开涉及用包含一定量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物治疗暴露于神经毒剂的受试者的方法。本公开还涉及用包含一定量的丹曲林代谢物(例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物治疗暴露于神经毒剂的受试者的方法。例如，在一些方面，所描述的方法防止继发于神经毒剂暴露的神经系统损伤。在其他方面，所描述的方法在神经毒剂暴露后提供神经保护作用。在其他方面，所描述的方法改善继发于神经毒剂暴露的脑组织损伤。在其他方面，所描述的方法改善继发于神经毒剂暴露所继发的癫痫持续状态的脑组织损伤。在其他方面，所描述的方法防止由于神经毒剂暴露而引起的神经元坏死。在其他方面，所描述的方法改善由于神经毒剂暴露引起的神经元坏死。在其他方面，所描述的方法治疗由于神经毒剂暴露而引起的细胞内钙过载。在其他方面，所描述的方法改善由于神经毒剂暴露而引起的细胞内钙过载。在其他方面，所描述的方法防止由于神经毒剂暴露而引起的细胞内钙过载。
本文所述的受试者可以通过吸入暴露于神经毒剂。在其他方面，受试者通过神经毒剂的透皮传递而暴露于神经毒剂。在其他方面，受试者通过食用已经被神经毒剂污染的液体或食物而暴露于神经毒剂。在其他方面，受试者通过向受试者皮下、静脉内或肌内施用神经毒剂而暴露于神经毒剂。
在一些方面，所述方法针对在受试者已经暴露于神经毒剂之后保护受试者免于神经坏死的方法。在这些实施方案中，在受试者已经暴露于神经毒剂之后，向受试者施用包含一定量的丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物。如本文所用，“保护”免于神经坏死包括减轻神经毒剂的作用的严重程度或减轻神经毒剂的作用或减少因神经毒剂暴露而导致的神经损伤。在一些方面，“保护”免于神经坏死涵盖在已经暴露于神经毒剂的受试者中预防神经坏死。也就是说，通过施用所述包含丹曲林的组合物(或包含丹曲林代谢物(例如5-羟基丹曲林)的组合物)来“保护”免于神经坏死的受试者在神经行为测试中的表现优于未施用所述组合物的暴露于神经毒剂的受试者。
在一些实施方案中，保护受试者的整个中枢神经系统免于神经坏死。在一些实施方案中，保护额顶叶皮层、海马和/或丘脑免于神经坏死。在其他方面，将保护额顶叶皮层免于神经坏死。在其他方面，保护海马免于神经坏死。在其他实施方案中，保护丘脑免于神经坏死。
神经坏死的存在和程度可以使用本领域已知的方法来确定，包括神经行为测试、放射学测试和病理学评估。
本公开还针对保护受试者免于因暴露于神经毒剂而导致的中枢神经系统功能降低的方法。这些方法包括在受试者已经暴露于神经毒剂之后，向受试者施用包含一定量的丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物。
本公开还涉及保护受试者免于因暴露于神经毒剂而导致的中枢神经系统功能障碍的方法。这些方法包括在受试者已经暴露于神经毒剂之后，向受试者施用包含一定量的丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物。
本公开还针对治疗受试者因暴露于神经毒剂而导致的行为改变的方法。这些方法包括在受试者已经暴露于神经毒剂之后，向受试者施用包含一定量的丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物。
如本文所用，“保护”免于中枢神经系统功能降低包括减轻神经毒剂的中枢神经系统作用的严重程度或减轻神经毒剂的中枢神经系统作用或降低神经毒剂的中枢神经系统作用。也就是说，通过施用所述组合物被“保护”免于中枢神经系统功能降低的受试者在神经行为测试中的表现优于未施用所述组合物的暴露于神经毒剂的受试者。
本公开还针对在已经暴露于神经毒剂的受试者中治疗神经毒剂诱发的癫痫发作的方法。在某些方面，所治疗的癫痫发作是癫痫持续状态(SE)。这些方法包括向受试者施用包含一定量的丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物。如本文所用，治疗神经毒剂诱发的癫痫发作使得癫痫发作的严重程度或持续时间减少。在其他方面，所述治疗使得癫痫发作的严重程度和持续时间都减少。
根据任何所描述的方法治疗上有效治疗受试者的丹曲林或其药学上可接受的盐的量应由本领域技术人员确定。治疗有效量可以是用单剂量治疗受试者所需的量。或者，治疗有效量可以是在慢性或长期的治疗过程中用多于一个剂量(例如多个剂量)治疗受试者所需的丹曲林的累积量。
在受试者是人的那些实施方案中，丹曲林的治疗有效量是1mg/kg至约30mg/kg，以一剂或两剂施用。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为1mg/kg至约20mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约5mg/kg至约30mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约10mg/kg至约30mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约15mg/kg至约30mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约20mg/kg至约30mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约5mg/kg至约20mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约5mg/kg至约15mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约5mg/kg至约10mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约10mg/kg至约20mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约2mg/kg至约10mg/kg，优选为约2mg/kg至约6mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约15mg/kg至约20mg/kg。在其他方面，丹曲林的治疗有效量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或约30mg/kg。在一些实施方案中，用于治疗人受试者的丹曲林的治疗有效量大于30mg/kg，例如30mg/kg至约100mg/kg，以一剂或两剂施用。在一些方面，用于治疗人受试者的丹曲林的治疗有效量为约35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100mg/kg。
根据任何所描述的方法治疗上有效治疗受试者的丹曲林代谢物(例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的量应由本领域技术人员确定。在受试者是人的那些实施方案中，丹曲林代谢物的治疗有效量为1mg/kg至约30mg/kg，以一剂或两剂施用。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为1mg/kg至约20mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约5mg/kg至约30mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约10mg/kg至约30mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约15mg/kg至约30mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约20mg/kg至约30mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约5mg/kg至约20mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约5mg/kg至约15mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约5mg/kg至约10mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约10mg/kg至约20mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约2mg/kg至约10mg/kg，优选为约2mg/kg至约6mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约15mg/kg至约20mg/kg。在其他方面，丹曲林代谢物的治疗有效量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或约30mg/kg。在一些实施方案中，用于治疗人受试者的丹曲林代谢物的治疗有效量大于30mg/kg，例如30mg/kg至约100mg/kg，以一剂或两剂施用。在一些方面，用于治疗人受试者的丹曲林代谢物的治疗有效量为约35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100mg/kg。
在本公开的一些方面，在暴露于神经毒剂之后，向受试者施用包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物的时间选择会影响赋予受试者的神经坏死保护量。
在本公开的一些方面，在暴露于神经毒剂之后，向受试者施用包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物的时间选择会影响赋予受试者中枢神经系统功能下降的量。
在本公开的一些方面，在暴露于神经毒剂之后，向受试者施用包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物的时间选择会影响受试者神经毒剂诱发的癫痫发作的治疗。
包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的组合物可以以两剂以上向受试者长期施用，即在受试者已经暴露于神经毒剂后，历经两周以上，例如2、3、4、5、6、7、8周以上的过程施用。包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的组合物可以以一剂或多剂向受试者短期施用，即在受试者已经暴露于神经毒剂后，历经不到两周的过程，例如，历经数小时或数天的过程，例如历经1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时或历经2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天的过程施用。
关于包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物的时间选择，在一些方面，所述包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐药物组合物在受试者已经暴露于神经毒剂后24小时以内向受试者施用至少一剂。在一些方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物在受试者已经暴露于神经毒剂后20小时以内向受试者施用至少一剂。在一些方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物在受试者已经暴露于神经毒剂后16小时以内向受试者施用至少一剂。在一些方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物在受试者已经暴露于神经毒剂后12小时以内向受试者施用至少一剂。在一些方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物在受试者已经暴露于神经毒剂后8小时以内向受试者施用至少一剂。在一些方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物在受试者已经暴露于神经毒剂后4小时以内向受试者施用至少一剂。在一些方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物在受试者已经暴露于神经毒剂后2小时以内向受试者施用至少一剂。在一些方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物在受试者已经暴露于神经毒剂后1小时以内向受试者施用至少一剂。在一些方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物在受试者已经暴露于神经毒剂后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或约24小时以内向受试者施用至少一剂。
尽管在一些方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物一剂就可以递送治疗有效量的丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)给暴露于神经毒剂的受试者。但在其他方面，可能需要两剂以上药物组合物将治疗有效量的丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)递送给暴露于神经毒剂的受试者。例如，可能需要2、3、4、5、6、7、8、9或10剂药物组合物将治疗有效量的丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林的)递送给暴露于神经毒剂的受试者。这些额外剂量可以与第一剂基本同时施用。在其他方面，额外剂量在时间上与第一剂分开。在施用3剂以上的那些方面中，每剂可以在时间上与任何其他剂量的施用分开。
在本公开的一些方面，向暴露于神经毒剂的受试者施用丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)是针对神经毒剂暴露的辅助疗法。暴露于神经毒剂的受试者也可以被施以一种或多种神经毒剂解毒剂。针对神经毒剂暴露的一类解毒剂是乙酰胆碱酯酶再活化剂，例如氯化阿肟(asoxime)(HI-6)。针对神经毒剂暴露的另一类解毒剂是乙酰胆碱受体的可逆拮抗剂，例如阿托品，例如硝酸甲基阿托品。暴露于神经毒剂的受试者也可以被施以抗癫痫药。例示性抗癫痫药包括醛类(例如三聚乙醛)，芳族烯丙醇类(例如司替戊醇)，苯并二氮卓类(例如氯巴占、氯硝西泮、氯氮卓、地西泮、咪达唑仑、劳拉西泮、硝西泮、替马西泮、尼美西泮)，巴比妥类(例如苯巴比妥、甲基苯巴比妥、巴比沙隆)，溴化物类(例如溴化钾)，氨基甲酸酯类(例如非尔氨酯)，羧酰胺类(例如卡马西平、奥卡西平、醋酸艾司利卡西平)，脂肪酸类(例如丙戊酸、丙戊酸钠、双丙戊酸钠，维加巴因、普罗加比、替加宾)，托吡酯，GABA类似物(例如加巴喷丁、普瑞巴林)，乙内酰脲类(例如乙妥英、苯妥英、美芬妥英、磷苯妥英)，恶唑烷二酮类(例如甲乙双酮、三甲双酮、依沙双酮)，丙二酸酯类(例如贝克拉胺)，嘧啶二酮类(例如扑米酮)，吡咯烷类(例如布瓦西坦、左乙拉西坦、塞曲西坦)，琥珀酰亚胺类(例如乙琥胺、苯琥胺、甲琥胺)，磺酰胺类(例如乙酰唑胺、舒噻嗪、醋甲唑胺、唑尼沙胺)，三嗪类(例如拉莫三嗪)，脲类(例如苯丁酰脲、苯乙酰脲)，丙戊酰胺类(例如丙戊酰胺、甲乙基戊酰胺)，吡仑帕奈及其组合。在一些方面，抗癫痫药是苯并二氮卓，例如咪达唑仑。在其他方面，抗癫痫药是巴比妥酸盐。在其他方面，抗癫痫药是乙内酰脲。在一些方面，抗癫痫药是三聚乙醛。在其他方面，抗癫痫药是溴化钾。在一些方面，抗癫痫药是脂肪酸。在其他方面，抗癫痫药是托吡酯。
在向暴露于神经毒剂的受试者施用解毒剂的那些方面中，在施用解毒剂之后，施用丹曲林(或丹曲林代谢产物，例如5-羟基丹曲林)。例如，可以在施用乙酰胆碱酯酶再活化剂之后和/或施用乙酰胆碱受体反向拮抗剂之后施用丹曲林。
在向暴露于神经毒剂的受试者施用抗癫痫药的那些方面中，可以在施用抗癫痫药的同时施用丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)。可以与施用抗癫痫药实质上同时，以及例如在施用抗癫痫药的约5分钟之内施用丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)。在其他实施方案中，在施用抗癫痫药之前施用丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)。在其他实施方案中，在施用抗癫痫药后施用丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)。
包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物可以静脉内施用。在其他方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物可以透皮施用。在其他方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物可以肌内施用。在其他方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物可以骨内施用。在其他方面，包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的药物组合物可以皮下施用。
在所述方法中使用的优选药物组合物包括丹曲林(或丹曲林代谢产物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。优选的药物组合物包含丹曲林(或丹曲林代谢物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐、甘露醇、聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯80)、聚维酮(例如聚维酮K12)、任选的pH调节剂(例如NaOH或HCl)和水。
包含丹曲林(或丹曲林代谢产物，例如5-羟基丹曲林)或其药学上可接受的盐的特别优选的药物组合物是
Figure BDA0002399483670000131
(丹曲林钠，新泽西州伍德克利夫湖的伊戈尔制药)。
Figure BDA0002399483670000132
是一种无菌冻干粉形式的注射用悬浮液。它以20mL的小瓶形式提供，其中包含250mg丹曲林钠、125mg甘露醇、25mg聚山梨酸酯80、4mg聚维酮K12和足量的氢氧化钠或盐酸用于调节pH。当用5mL无菌注射用水USP复溶时，得到悬浮液。
提供以下实施例来说明本公开内描述的一些概念。尽管每个实施例被认为提供了本公开的具体的各个实施方案，但是这些实施例均不应被认为是对本文所述的更一般的实施方案的限制。在以下实施例中，已努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。
具体实施方式
实施例1
研究概述
本研究目的是确定
Figure BDA0002399483670000133
在既定的大鼠GD(梭曼)存活模型中是否具有神经保护作用。在梭曼诱发癫痫发作后的20或50分钟，通过静脉推注给予10或30mg/kg
Figure BDA0002399483670000134
单剂量。皮下(SQ)注射梭曼之前30分钟用氯化阿肟(HI-6)处理，SQ梭曼注射后1分钟用硝酸甲基阿托品处理，以及在梭曼诱发癫痫发作(拉辛评分至少为3)后20分钟用咪达唑仑处理，提高存活率。对照包括一组未经处理(原始)的大鼠，另一组在梭曼诱发癫痫发作后50分钟将接受无菌水。
单剂量GD暴露后约28天，进行了一系列的神经行为测试。在第29天，通过放血和心内灌注在麻醉下处死所有大鼠。从每只大鼠收集脑以进行显微神经病理学检查，从每只大鼠收集心脏以进行可能的病理学检查。
实验对象是经颈静脉插管的≥8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(查尔斯河实验室)，暴露当天体重为300-500g。使用蔗糖偏好测试和强迫游泳神经行为测试来评估涉及学习和/或感觉运动整合的任务中的潜在缺陷。
材料
梭曼(GD)-用0.9％氯化钠稀释。梭曼是一种有机磷神经毒剂，可通过与乙酰胆碱酯酶(AChE)形成加合物来使其失活。
·化学名称： 甲氟膦酸频那酯
·化学式： C7H16FO2P
·分子量： 182.17
·MRIGlobal批号： GD090415-DOC-1
·一级标准ID： 13972-49-3
·纯度： 100％
·储存条件： <4℃
HI-6：化学名称：[(E)-[1-[(4-氨基甲酰基吡啶-1-鎓-1-基)甲氧基甲基]吡啶-2-亚基]甲基]-肟鎓；甲磺酸盐(氯化阿肟)
结构：
Figure BDA0002399483670000141
化学式：C14H16Cl2N4O3
分子量：359.207
硝酸甲基阿托品：化学名称：3-羟基-2-苯基丙酸(8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛-3-基)酯；硝酸盐
结构：
Figure BDA0002399483670000151
化学式：C18H26N2O6
分子量：366.414
咪达唑仑：化学名称：8-氯-6-(2-氟苯基)-1-甲基-4H-咪唑并[1,5-a][1,4]苯并二氮卓
结构：
Figure BDA0002399483670000152
化学式：C18H13ClFN3
分子量：325.771
Figure BDA0002399483670000153
是FDA批准的药物，用于结合适当的支持措施治疗恶性高热，以及用于预防高危患者的恶性高热。
动物
在本研究中，使用了48只雄性Sprague Dawley大鼠(加8只额外/替代品，共56只；查尔斯河实验室)，≥8周龄，300-500g，带有供应商植入的颈静脉导管。通过尾标或带有独特字母数字标记的耳标识别大鼠。(参见SOP MRI-1504，“识别动物和笼子的程序”)。
纳入研究的所有大鼠均体健，没有任何临床疾病迹象，并且有适合于研究开始时给药的专利导管。递送时，检查动物的疾病-健康迹象，并在Spencer常规动物设施中隔离检疫不少于48小时。兽医检查动物的健康状况并将其释放以进行研究(参见SOP MRI-1501，“动物的驯化和/或隔离检疫程序”)。根据SOP MRI-1500，动物在递送三天内称重。从动物到达次日到整个研究期间，工作人员每天至少对大鼠进行两次处理，以使其在整个研究过程中适应环境并保持一致性。
所有大鼠均提供经Lab Diet认证的啮齿动物食物，根据来源、批号和分析证书识别，不限量饲喂。经分析证书确认(对于每一批，由供应商提供；参见SOP MRI-1510，“动物饲养程序”)，饲料中没有可能影响研究结果的污染物。在整个研究过程中，给水瓶(一个水瓶/笼子)提供自来水，适应期和进行蔗糖偏好测试(见下文)除外，在此期间，为大鼠提供两个装有自来水的水瓶或一个装有自来水的水瓶和一个装有1％蔗糖溶液的水瓶。
在整个适应/隔离检疫和生命期中，将动物圈养在带有线顶的聚碳酸酯Tecniplast笼中(Tecniplast，Phoenixville，PA)。单独饲养动物以防止损坏导管。将大鼠饲养在环境受控的房间中，每小时至少换气10次。将房间保持在68.0℉至79.0℉的温度和50％±20％的相对湿度下，每天进行12小时的明暗循环。在研究期间，通过AmegaView监测系统每天24小时或使用湿度计监测室温、湿度和光照循环(12小时:12小时反转明暗)(参见SOP MRI-1170，“动物房的温度和湿度监测”)。
剂量
HI-6、梭曼、硝酸甲基阿托品和咪达唑仑：根据先前对所述模型的经验，选择以下各者的单次剂量：HI-6(IP，125mg/kg)；梭曼(SC，154μg/kg，1.4×LD50)、硝酸甲基阿托品(IM，2mg/kg)和咪达唑仑(IM，2mg/kg)。这一方案预期会引起惊厥，达到至少为3的拉辛评分，并提供可接受数量的存活者供随访研究。
Figure BDA0002399483670000171
在大鼠的单剂量耐受性评估中，将12、40和60mg/kg的
Figure BDA0002399483670000172
静脉推注剂量给予各别组的颈静脉插管的大鼠。12mg/kg的耐受性良好。40mg/kg剂量在给药后两天使体重略有减轻，60mg/kg在给药后约24小时使得接受这一剂量的所有五只大鼠频临死亡。根据预期的耐受性，本研究选择了10和30mg/kg的
Figure BDA0002399483670000173
单次静脉推注剂量。大鼠的10和30mg/kg
Figure BDA0002399483670000174
剂量分别相当于人约2和6mg/kg的剂量。
给药方案
如表1所示，总共48只加最多8只额外的经供应商植入有颈静脉导管的Sprague-Dawley雄性大鼠分6组使用。
表1.
Figure BDA0002399483670000175
的初步功效研究设计
Figure BDA0002399483670000176
注意：对于C组和D组，在咪达唑仑注射后将立即给予
Figure BDA0002399483670000181
给药从D组开始，然后分别是B组、A组、C组、E组和F组。
给药准备
根据SOP MRI-5821“研究开发和测试评估(RDTE)稀释溶液的标准品和样品的制备”，在冰冷的0.9％氯化钠中制备GD。
通过添加5mL无菌注射用水到一瓶冻干产品中来制备
Figure BDA0002399483670000182
实验设计
动物准备
在研究第1天(GD暴露日)之前或当天，将大鼠转移到稀动物实验室复合物中。
给药
在研究第1天，A-E组的所有动物均在GD攻击前30分钟通过腹膜内(IP)途径接受了胆碱酯酶再活化剂HI-6(125mg/kg)。A-E组的所有大鼠均通过单次皮下注射暴露于GD(154μg/kg或约1.4×LD50)。对于A-E组，在GD注射后约一分钟，通过IM途径施用硝酸甲基阿托品(AMN)(2.0mg/kg)。如上表1所定义，在GD暴露后癫痫发作后约20分钟，A-E组中的所有动物肌内接受2mg/kg剂量的咪达唑仑。F组未接受HI-6、GD、AMN、咪达唑仑和
Figure BDA0002399483670000184
通过Hamilton微型注射器施用
Figure BDA0002399483670000183
然后用0.2mL无菌注射用水冲洗导管以确保完全递送至静脉。
癫痫发作的开始由如下所述的拉辛量表的“3”分界定：
1＝停滞和凝视
2＝点头，“湿狗摇”
3＝前肢阵挛
4＝双侧前肢阵挛
5＝双侧前肢阵挛，后腿直立和失去平衡
如果大鼠在GD暴露后约20分钟后未达到“3”分，那么它在研究中将被替换。
如表1所示，在癫痫发作(拉辛等级为“3”)后50或20分钟，A和C组的大鼠接受10mg/kg剂量的
Figure BDA0002399483670000191
IV，B和D组的大鼠接受30mg/kg剂量的
Figure BDA0002399483670000192
IV。E组大鼠在癫痫发作后50分钟接受量与
Figure BDA0002399483670000193
的最高剂量相当剂量的对照(无菌注射用水)IV。
在A-E组进行GD攻击后约6小时，然后在每个AM和PM，对大鼠施用5mL乳酸林格氏液SQ持续长达攻击后的前7天，以帮助恢复。观察到动物自由进食和饮水，在笼子内自由移动，没有任何脱水迹象(没有背部皮肤隆起)表明动物从攻击中恢复过来，停止SQ液体。这一部分是由兽医根据他/她对动物的评估来决定的。此外，在攻击后的同一时间范围内(长达攻击后7天)，向动物提供水凝胶(ClearH2O)和稀粥(在笼底的缸中潮湿的饲料)以帮助它们从GD攻击的影响中恢复过来。
体重
在从供应商收到的前72小时内，记录研究中每只动物的体重，然后在研究的第1、3、5、10、17、24和28天再次记录体重。如果研究负责人辨别出动物在攻击后持续体重减轻，那么要更频繁地收集体重。如果任何动物的体重减轻了其原始体重的10％以上，那么每天对其称重，直到所述动物持续增加而不是体重减轻为止。所有组的体重如图1所示。到研究第25天，用
Figure BDA0002399483670000194
处理的所有梭曼暴露组(A、B、C、D组)的体重均恢复至阴性对照(F组)值。
临床观察
在隔离检疫和适应期间，每天进行一般健康观察。在隔离检疫和适应期间，以及整个生命期间，每天对动物进行两次处理。在研究第1天，在暴露前观察大鼠。GD暴露后，频繁地监测大鼠以评估癫痫发作的首次出现。咪达唑仑、
Figure BDA0002399483670000201
和/或无菌水给药后，每天至少两次观察动物，并在安乐死当天至少观察一次。评估并记录临床观察，包括弓背姿势、脱水、皮毛粗糙和食欲不振。如果适用，在每个观察点记录改良的拉辛评分。这时还在研究笔记本或根据SOP MRI-1528“动物观察程序”的适当的数据获取表中记录任何其他异常临床观察结果。记录死亡时间；任何被发现死亡的动物都在其被发现死亡时记录。
动物处置
研究的第1天是梭曼暴露和
Figure BDA0002399483670000202
处理的日子。所有死亡的大鼠都被发现死亡(在垂死状态下未实施安乐死)。协议规定的大鼠数为每组8只存活，这由于高梭曼剂量导致的死亡率而未能达到。总存活率为45只暴露于梭曼的大鼠中存活27只(60％)。见表2。
表2
Figure BDA0002399483670000203
(a)一只A组大鼠在接受咪达唑仑和
Figure BDA0002399483670000204
之前被发现死亡。
(b)一只E组老鼠在接受水之前被发现死亡。
模型的特征
Figure BDA0002399483670000211
神经行为测试
因梭曼暴露而受损的脑区域包括海马和内嗅、额叶和顶叶皮层。这些区域包含用于学习、记忆形成、信息处理和其他认知过程的结构和神经回路。为了评估
Figure BDA0002399483670000212
的潜在神经保护作用，使用一系列需要学习、记忆、感觉运动整合和适应性反应的既定行为测试对大鼠进行了评估。
选择的测试为：1)蔗糖偏好测试和2)强迫游泳测试。
蔗糖偏好测试
蔗糖偏好测试(SPT)利用大鼠比普通水更喜欢糖水的自然倾向。这是一项既定的测试，用于衡量寻求愉悦行为(快感)或缺乏愉悦行为(缺乏快感)，并且要求动物适应装有自来水和1％蔗糖水的瓶子的左右摆放变化。SPT在研究第14和15天进行。
在SPT之前，将大鼠单独饲养，并随意获取食物和水(每个笼子中有一个水瓶)。对于SPT的适应部分，将2个水瓶放入每只大鼠的家笼中，持续5-6天。水瓶装有吸管，可最大程度地减少漏出，大约每24小时称重一次。在适应阶段之后，一个水瓶装满约200mL的1％蔗糖溶液，另一个水瓶装满约200mL的自来水。二十四小时后，记录每个瓶中剩余的液体量。然后切换瓶子的左/右放置，并在二十四小时后再次记录每个瓶中剩余的液体量。消耗的蔗糖溶液量(mL)表示为两个24小时周期每个周期消耗的液体总量(蔗糖水加水)的百分比，并在各组和各天之间进行比较。
SPT结果如图2A和2B所示。在测试的第二天(第15天)，阳性对照组(水，50分钟)没有保持对蔗糖的偏好，相比之下，接受
Figure BDA0002399483670000221
的4组中有3组。
强迫游泳测试
强迫游泳测试(FST)是由Porsolt在1970年代后期开发的，它是筛选抗抑郁药在啮齿动物中的功效的快速方法。未经处理(“正常”)的啮齿动物5分钟FST结束时出现的静止增加被解释为反映“行为绝望”，而其被抗抑郁药逆转与这些药物对人的抗抑郁功效相关。然而，由于许多原因，这一测试的结构效度受到质疑，其中包括：1)在FST中测试抗抑郁药的急性作用，而在临床抑郁症患者中，药物需要4-6周实现临床改善；2)FST中的因变量是动物对测试的急性反应，而不是动物的特征；和3)将漂浮行为解释为“行为绝望”是拟人化的。现在认为，在未处理的大鼠中看到的进行性静止反映了对被置于容器中没有逃脱的可能性的急性压力的适应性反应。
在FST中，在充满水(30cm高，25℃)的玻璃圆筒形室内(46cm H×30cm D)中测量游泳活动和静止。使用温度计来确保所有动物的水温恒定在24-26℃。进行了两次游泳训练，第一次是开始15分钟的“预测试”，然后是24小时之后的第二次5分钟的“测试”。录制了测试视频。FST的每一分钟都记录了活跃游泳所花费的时间和静止所花费的时间。
在研究第25和26天进行FST。在研究第25天，将每只大鼠放在充满水的有机玻璃圆筒中15分钟。在研究第26天，将每只大鼠放回充满水的有机玻璃圆筒中进行5分钟测试。在测试的每一分钟中，对每只大鼠移动和静止的时间评分。FST结果如图3所示。
Figure BDA0002399483670000231
处理组显示的趋势与阴性对照(未处理)相似，也就是说，在5分钟的测试过程中，静止所花费的时间逐渐增加。
神经行为测试顺序
神经行为测试的顺序从压力最小到压力最大进行。同一天不进行两次测试。所有测试都在早上进行。测试进行如下(在研究第1天攻击日之后)：
研究第8天，蔗糖偏好测试(持续长达8天)
研究第25天，强迫游泳测试(持续2天)
测试动物的顺序是随机的，并且掩盖了接受两种测试的大鼠的组身份，以使进行这些测试的技术人员对处理组不了解。使用录像带对测试结果进行评分。
安乐死与组织收集和加工
对于研究第29天的每组，通过IP注射≤200mg/kg氯胺酮和≤20mg/kg甲苯噻嗪的目标剂量麻醉所有存活的大鼠。向大鼠心内膜注射肝素化盐水，然后再注入0.4％多聚甲醛(灌注规程遵循Rao等人(2006年))。收集每只大鼠的心脏并储存在固定剂中以进行可能的评估。
组织收集后，根据SOP MRI-1526“Spencer动物保健设施中动物尸体和医疗废物的处置”处置动物尸体。
将脑留在多聚甲醛固定剂中在4℃下过夜放置至少4天，然后将其在装有固定剂的小瓶中放在冰袋上过夜运送至HSRL公司进行评估。如Rao等人(2014)和Bolon等人(2013)所述，将每个脑均匀地修剪成7个切片，以获得整个脑的最大解剖学表现，包括已知受梭曼和其他有机磷神经毒剂影响的区域(例如梨状皮层、内嗅皮层、海马、杏仁核、丘脑、小脑)。将切片常规处理，切成5微米的切片，包埋在石蜡中，并用苏木精和曙红染色。操作人员不知道剂量组和处理。
神经病理学
使用6点半定量评分系统对每只大鼠的7个脑切片进行显微镜评估。微观病变按6点量表评分：
0＝正常
1＝每40倍显微镜视野1-5个细胞受影响
2＝每40倍显微镜视野6-20个细胞受影响
3＝每40倍显微镜视野21-50个细胞受影响
4＝每40倍显微镜视野有50％-80％细胞受影响
5＝每40倍显微镜视野中受>80％细胞受影响
表3列出了来自额顶叶皮层的病理数据，按组显示了每个坏死评分动物的比例。
表3
Figure BDA0002399483670000241
来自额顶叶皮层的平均坏死评分如图4所示。
显微照片如图5A和5B所示。图5A描绘了来自E组(阳性对照，水，SE发作后50分钟)的动物的显微照片。箭头标记褪色皱缩的神经元。这一动物的坏死评分为4。图5B描绘了来自D组(30mg/kg
Figure BDA0002399483670000251
SE发作后20分钟)的动物的显微照片。箭头标记正常的神经元。这一动物的坏死评分为0。
表4描述了显微镜病理发现。F组动物(未处理)无明显发现。E组(阳性对照)有预期的发现。与阳性对照(E组)相比，
Figure BDA0002399483670000252
处理的大鼠额叶顶叶皮层的坏死范围减小，与文献报道一致。
表4
Figure BDA0002399483670000253
结论
总体而言，与未处理的动物相比，经
Figure BDA0002399483670000254
处理的动物在神经行为测试中的表现更好。与未处理的动物相比，经
Figure BDA0002399483670000255
处理的动物大脑皮层的细胞坏死水平较低。
Figure BDA0002399483670000256
处理的动物表现出剂量依赖性和时间依赖性的治疗作用，影响细胞死亡。这些神经行为测试和神经病理学发现是一致的，并且似乎直接相关。
Figure BDA0002399483670000257
在所有组中均具有良好的耐受性，未观察到新的安全性迹象。
实施例2
研究概述
本研究的目的是确定
Figure BDA0002399483670000261
在既定的大鼠GD(梭曼)存活模型中是否具有神经保护作用。在梭曼诱发癫痫发作后的20或60分钟，通过静脉推注给予10或30mg/kg
Figure BDA0002399483670000262
单剂量。皮下(SQ)注射梭曼之前30分钟用三氯阿肟(HI-6)处理，SQ梭曼注射后1分钟用硝酸甲基阿托品处理，以及在梭曼诱发癫痫发作(拉辛评分至少为3)后20分钟用硫酸阿托品、氯化吡咯肟(2-PAM-Cl)和咪达唑仑处理将提高存活率。对照将包括两个单独的组：一组未经处理(原始)的大鼠(阴性对照)，另一组在梭曼诱发癫痫发作后60分钟接受无菌水或无菌水加甘露醇媒剂。
在第2天，将通过放血和心内灌注在麻醉下处死所有大鼠。将从每只大鼠收集脑以进行显微神经病理学检查，将从每只大鼠收集心脏以进行可能的病理学检查。
实验对象将是经颈静脉插管的≥8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(查尔斯河实验室)，暴露当天体重为300-500g。
材料
梭曼(GD)-用0.9％氯化钠稀释。梭曼是一种有机磷神经毒剂，可通过与乙酰胆碱酯酶(AChE)形成加合物来使其失活。
·化学名称： 甲氟膦酸频那酯
·化学式： C7H16FO2P
·分子量： 182.17
·MRIGlobal批号： GD090415-DOC-1
·一级标准ID： 13972-49-3
·纯度： 100％
·储存条件： <4℃
在这一模型中，用于提高存活率的处理将是：1)氯化阿肟(HI-6)；2)硝酸甲基阿托品；3)硫酸阿托品；4)氯化吡咯肟；5)咪达唑仑。HI-6是一种AChE再活化剂，可以从乙酰胆碱酯酶(AChE)取代类似梭曼的有机磷酸盐，从而使所述酶再活化。硫酸阿托品是作用于中枢的毒蕈碱乙酰胆碱受体的竞争性和可逆拮抗剂。硝酸甲基阿托品是作用于外周的毒蕈碱乙酰胆碱受体的竞争性和可逆拮抗剂；两者均在临床上用于对抗由梭曼和其他有机磷酸神经毒剂诱发的急性胆碱能综合症。咪达唑仑是用于治疗癫痫发作的苯并二氮卓。选择这些药物是因为肟、阿托品和苯并二氮卓代表了针对急性神经毒剂/有机磷酸酯毒性的公认临床治疗。由解磷定(一种AChE再活化剂)、阿托品和地西泮(一种苯并二氮卓)组成的三药疗法是目前FDA批准的针对军事人员的对策。
HI-6：化学名称：[(E)-[1-[(4-氨基甲酰基吡啶-1-鎓-1-基)甲氧基甲基]吡啶-2-亚基]甲基]-肟鎓；甲磺酸盐(氯化阿肟)
结构：
Figure BDA0002399483670000271
化学式：C14H16Cl2N4O3
分子量：359.207
硝酸甲基阿托品：化学名称：3-羟基-2-苯基丙酸(8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛-3-基)酯；硝酸盐
结构：
Figure BDA0002399483670000281
化学式：C18H26N2O6
分子量：366.414
咪达唑仑：化学名称：8-氯-6-(2-氟苯基)-1-甲基-4H-咪唑并[1,5-a][1,4]苯并二氮卓
结构：
Figure BDA0002399483670000282
化学式：C18H13ClFN3
分子量：325.771
Figure BDA0002399483670000283
(丹曲林钠)是FDA批准的药物，用于结合适当的支持措施来治疗恶性高热，以及用于预防高危患者的恶性高热。
丹曲林钠：化学名称：1-[[[5-(4-硝基苯基)-2-呋喃基]亚甲基]氨基]-2,4-咪唑烷二酮钠盐的水合物
结构：
Figure BDA0002399483670000291
分子量：399
赋形剂：甘露醇(25mg/mL)聚山梨醇酯80(5mg/mL)；聚维酮K12(0.8mg/mL)
5％甘露醇溶液：5％甘露醇溶液(在无菌水中)
化学式：C6H14O6
动物
在本研究中，将使用120只雄性Sprague Dawley大鼠(加20只额外/替代品，总计140只；查尔斯河实验室)，≥8周龄，300-500g，带有供应商植入的颈静脉导管。将通过尾标或带有独特字母数字标记的耳标识别大鼠。(参见例如，SOP MRI-1504，“识别动物和笼子的程序”)。
纳入研究的所有大鼠均将体健，没有任何临床疾病迹象，并且将有适合在研究开始时给药的专利导管。递送时，将检查动物的疾病-健康迹象，并将在常规动物设施中隔离检疫不少于48小时。兽医将检查动物的健康状况并将其释放进行研究(参见例如，SOP MRI-1501，“动物的驯化和/或隔离检疫程序”)。动物将在递送后三天内称重。从动物到达次日到整个研究期间，工作人员将每天至少对大鼠进行两次处理，以使其在整个研究过程中适应环境并保持一致性。
所有大鼠均将提供经Lab Diet认证的啮齿动物食物，根据来源、批号和分析证书识别，不限量饲喂。经分析证书确认(对于每一批，由供应商提供；参见例如，SOP MRI-1510，“动物饲养程序”)，饲料中将不存在可能影响研究结果的污染物。在整个研究过程中，将给水瓶(一个水瓶/笼子)提供自来水。
在整个适应/隔离检疫和生命期中，将动物圈养在带有线顶的聚碳酸酯Tecniplast笼中(Tecniplast，Phoenixville，PA)。将单独饲养动物以防止损坏导管。将大鼠饲养在环境受控的房间中，每小时至少换气10次。将房间保持在68.0°F至79.0°F的温度和50％±20％的相对湿度下，每天进行12小时的明暗循环。在研究期间，通过AmegaView监测系统每天24小时或使用湿度计监测室温、湿度和光照循环(12小时:12小时反转明暗)(参见例如，SOP MRI-1170，“动物房的温度和湿度监测”)。
剂量
HI-6、梭曼、硫酸阿托品、硝酸甲基阿托品、2-PAM Cl和咪达唑仑：根据先前对所述模型的经验，选择以下各者的单次剂量：HI-6(IP，125mg/kg)；梭曼(SC，154μg/kg，1.4×LD50)、硝酸甲基阿托品(IM，2mg/kg)；硫酸阿托品(0.45mg/kg)、2-PAM Cl(25mg/kg)和咪达唑仑(IM，1.8mg/kg)。HI-6、硝酸甲基阿托品和咪达唑仑的纳入对于确保足够的存活率是必要的。这一方案预期会引起惊厥，其拉辛评分至少为3，并提供可接受数量的存活者供随访研究。
Figure BDA0002399483670000301
在大鼠的单剂量耐受性评估中，将12、40和60mg/kg
Figure BDA0002399483670000302
静脉推注剂量给予各别组的颈静脉插管的大鼠。大鼠的10和30mg/kg
Figure BDA0002399483670000303
剂量分别相当于人约2和6mg/kg的剂量。
给药方案
如下表所示，总共120组加最多20只额外的经供应商植入有颈静脉导管的Sprague-Dawley雄性大鼠将分6组使用。动物将以20只一小队进行。所有组的分配将随机分配，规定每个剂量组应由每个小队中的至少一只动物代表。
表.按组的处理分配
Figure BDA0002399483670000311
注意：对于C组和D组，将在咪达唑仑注射后立即给予
Figure BDA0002399483670000312
给药准备
根据例如SOP MRI-5821“研究开发和测试评估(RDTE)稀释溶液的标准品和样品的制备”，将在冰冷的0.9％氯化钠中制备GD。
将通过添加5mL无菌注射用水(不含抑菌剂)添加到一瓶冻干产品中来制备
将通过在可注射的小瓶中加入无菌的0.9％盐水，将HI-6制备成250mg/mL的浓度。
将通过在可注射的小瓶中添加无菌注射用水(WFI)，将硝酸甲基阿托品制备为4mg/mL的浓度。
将用无菌盐水将硫酸阿托品制备成.8mg/mL的浓度。
将用无菌盐水将2-PAM Cl制备成100mg/mL的浓度。
然后将硫酸阿托品和2-PAM Cl 1:1混合并以0.5mL/kg IM施用。
咪达唑仑将从供应商处以10mg/mL的溶液形式购得，并将按原样施用。
实验设计
动物准备
在研究第1天(GD暴露日)之前或当天，将大鼠转移到测试地点。
给药
在研究第1天，将所有动物称重至最接近的克数，并将根据这些体重计算所有处理剂量。A-E组将在GD攻击前30分钟通过腹膜内(IP)途径接受胆碱酯酶再活化剂HI-6(125mg/kg)。A-E组的所有大鼠都将通过单次皮下注射暴露于GD(154μg/kg(308ug/mL)，约1.4×LD50)。对于A-E组，在GD注射后大约一分钟，将通过IM途径施用硝酸甲基阿托品(AMN)(2.0mg/kg)。上表中定义的GD暴露后癫痫发作后约20分钟，A-E组中的所有动物都将肌内注射硫酸阿托品(0.45mg/kg)与2-PAM-Cl(25mg/kg)的混合物，并将肌内注射1.8mg/kg剂量的咪达唑仑。F组将不接受HI-6、GD、AMN、咪达唑仑和
Figure BDA0002399483670000321
Figure BDA0002399483670000322
将通过100uL汉密尔顿微注射器或鲁尔锁注射器(1cc)施用，取决于将施用的给药剂量，然后用至少0.2mL无菌注射用水冲洗导管以确保完全递送至静脉。
癫痫发作的开始由如下所述的拉辛量表的“3”分界定：
1＝停滞和凝视
2＝点头，“湿狗摇”
3＝前肢阵挛，耳朵有节律性甩动并伴有眨眼和面部阵挛
4＝双侧前肢阵挛
5＝双侧前肢阵挛，后腿直立和失去平衡
如果大鼠在GD暴露后约20分钟后未达到“3”分，那么它在研究中将被替换。
如上表所示，A和C组的大鼠将在癫痫发作(拉辛等级为“3”)后60或20分钟接受10mg/kg剂量的
Figure BDA0002399483670000331
IV，B和D组的大鼠将接受30mg/kg剂量的
Figure BDA0002399483670000332
IV。E组大鼠将在癫痫发作后60分钟接受量与
Figure BDA0002399483670000333
的最高剂量相当剂量的对照(无菌水或在无菌注射用水中的5％甘露醇溶液(由30mg/kg剂量的RYANODEX递送的甘露醇量))IV。
在A-E组GD攻击后约6小时，将向大鼠施用5mL乳酸林格氏液以帮助恢复。
体重
在从供应商收到的前72小时内，然后在研究第1和2天，将在研究中记录每只动物的体重。在接收时第一次称重和研究第1天称重之间没有增加体重的任何动物将被替换。
临床观察
在隔离检疫和适应期间，每天将进行一般健康观察。在隔离检疫和适应期间，以及整个生命期间，每天将对动物进行两次处理。在研究第1天，在暴露前将观察大鼠并称重。GD暴露后，将连续监测大鼠以记录癫痫发作。咪达唑仑、
Figure BDA0002399483670000334
和/或对照溶液给药后，在癫痫发作后的1、2、4和6小时将观察动物，并在安乐死当天至少观察一次。评估并记录临床观察，包括弓背姿势、脱水、皮毛粗糙和食欲不振。如果适用，在每个观察点记录拉辛评分。这时还将在研究笔记本或按照例如SOP MRI-1528“动物观察程序”的相应数据采集表中记录任何其他异常的临床观察结果。记录死亡时间；任何被发现死亡的动物都将在其被发现死亡时记录。
安乐死与组织收集和加工
对于研究第2天的每组，通过IP注射大于75mg/kg戊巴比妥溶液对所有存活的大鼠进行深度麻醉。将向大鼠心内膜注射肝素化盐水，然后再注入0.4％多聚甲醛或10％中性缓冲福尔马林(灌注方案遵循Rao等人的方法(2006))。将收集每只大鼠的心脏并储存在固定剂中以进行可能的评估。
组织收集后，将根据例如SOP MRI-1526“Spencer动物保健设施中动物尸体和医疗废物的处置”处置动物尸体。
将脑留在4℃多聚甲醛中储存过夜，第二天将其排干并更换为冷PBS，并在4℃下储存过夜。第二天，将PBS排干并更换为10％蔗糖溶液，并在4℃下储存过夜，然后转移到10％中性缓冲福尔马林中过夜。或者，脑将在室温下在10％福尔马林固定剂中保留至少4天，然后运送。如Rao等人(2014)和Bolon等人(2013)所述，将每个脑均匀地修剪成7个切片，以获得整个脑的最大解剖学表现，包括已知受梭曼和其他有机磷神经毒剂影响的区域(例如梨状皮层、内嗅皮层、海马、杏仁核、丘脑、小脑)。将切片常规处理，切成5微米的切片，包埋在石蜡中，并用苏木精和曙红染色。操作人员将不知道剂量组和处理。
神经病理学
使用6点半定量评分系统对每只大鼠的7个脑切片进行显微镜评估。微观病变按6点量表评分。
神经行为测试
可选地，在安乐死之前但在第1天GD暴露之后，将对大鼠进行神经行为测试，例如实施例1中所述。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种在受试者已经暴露于神经毒剂之后保护所述受试者免于神经坏死的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，保护额顶叶皮层、海马和/或丘脑免于神经坏死。
3.一种治疗暴露于神经毒剂的受试者的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
4.一种保护受试者免于因暴露于神经毒剂而导致的中枢神经系统功能降低的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
5.一种治疗神经毒剂诱发的癫痫发作，特别是癫痫持续状态的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
6.一种保护受试者免于因暴露于神经毒剂而导致的中枢神经系统功能障碍的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
7.一种治疗因暴露于神经毒剂而导致的行为改变的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经毒剂是乙酰胆碱酯酶抑制剂。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经毒剂是有机磷酸酯。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经毒剂是甲氟膦酸O-频那酯(梭曼)、N,N-二甲氰基氰磷酰乙酯(塔崩)、甲氟膦酸丙-2-酯(沙林)、甲氟膦酸环己酯(环沙林)或2-(二甲基氨基)乙基(GV)。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述神经毒剂是甲基硫代膦酸O-环戊酯S-(2-二乙基氨基乙基)酯(EA-3148)、(S)-({[2-(二乙基氨基)乙基]硫烷基}(乙基)次膦酸乙酯)(VE)、S-[2-(二乙基氨基)乙基]硫代磷酸O,O-二乙酯(VG)、甲基硫代膦酸S-[2-(二乙基氨基)乙]酯O-乙酯(VM)、N,N-二乙基-2-(甲基-(2-甲基丙氧基)磷酰基)硫烷基乙胺(VR)或({2-[双(丙-2-基)氨基]乙基}硫烷基](甲基)次膦酸乙酯(VX)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗有效量为1mg/kg至约30mg/kg丹曲林。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述受试者已经暴露于所述神经毒剂之后24小时以内向所述受试者施用所述丹曲林。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以一剂或多剂施用于所述受试者。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用乙酰胆碱酯酶再活化剂、乙酰胆碱受体反向拮抗剂、抗癫痫药，或其组合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述乙酰胆碱酯酶再活化剂是氯化阿肟(HI-6)。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述乙酰胆碱受体反向拮抗剂是硝酸甲基阿托品。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗癫痫药是苯并二氮卓。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述苯并二氮卓为咪达唑仑。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述药物组合物在施用所述乙酰胆碱酯酶再活化剂之后施用。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述药物组合物在施用所述乙酰胆碱酯酶再活化剂之后和施用所述乙酰胆碱受体反向拮抗剂之后施用。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述药物组合物与施用所述抗癫痫药同时或实质上同时施用。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述药物组合物在施用所述抗癫痫药之后施用。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、骨内或透皮施用。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含丹曲林或其药学上可接受的盐、甘露醇、聚山梨酸酯、聚维酮、任选的pH调节剂，以及水。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与暴露于所述神经毒剂下而未施用所述包含丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物的受试者相比，施用所述包含丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物导致神经行为改善。

Claims (28)

1.一种在受试者已经暴露于神经毒剂之后保护所述受试者免于神经坏死的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，保护额顶叶皮层、海马和/或丘脑免于神经坏死。
3.一种治疗暴露于神经毒剂的受试者的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
4.一种保护受试者免于因暴露于神经毒剂而导致的中枢神经系统功能降低的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
5.一种治疗神经毒剂诱发的癫痫发作，特别是癫痫持续状态的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
6.一种保护受试者免于因暴露于神经毒剂而导致的中枢神经系统功能障碍的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
7.一种治疗因暴露于神经毒剂而导致的行为改变的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经毒剂是乙酰胆碱酯酶抑制剂。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经毒剂是有机磷酸酯。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经毒剂是甲氟膦酸O-频那酯(梭曼)、N,N-二甲氰基氰磷酰乙酯(塔崩)、甲氟膦酸丙-2-酯(沙林)、甲氟膦酸环己酯(环沙林)或2-(二甲基氨基)乙基(GV)。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述神经毒剂是甲基硫代膦酸O-环戊酯S-(2-二乙基氨基乙基)酯(EA-3148)、(S)-({[2-(二乙基氨基)乙基]硫烷基}(乙基)次膦酸乙酯)(VE)、S-[2-(二乙基氨基)乙基]硫代磷酸O,O-二乙酯(VG)、甲基硫代膦酸S-[2-(二乙基氨基)乙]酯O-乙酯(VM)、N,N-二乙基-2-(甲基-(2-甲基丙氧基)磷酰基)硫烷基乙胺(VR)或({2-[双(丙-2-基)氨基]乙基}硫烷基](甲基)次膦酸乙酯(VX)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗有效量为1mg/kg至约30mg/kg丹曲林。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述受试者已经暴露于所述神经毒剂之后24小时以内向所述受试者施用所述丹曲林。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以一剂或多剂施用于所述受试者。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用乙酰胆碱酯酶再活化剂、乙酰胆碱受体反向拮抗剂、抗癫痫药，或其组合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述乙酰胆碱酯酶再活化剂是氯化阿肟(HI-6)。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述乙酰胆碱受体反向拮抗剂是硝酸甲基阿托品。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗癫痫药是苯并二氮卓。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述苯并二氮卓为咪达唑仑。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述药物组合物在施用所述乙酰胆碱酯酶再活化剂之后施用。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述药物组合物在施用所述乙酰胆碱酯酶再活化剂之后和施用所述乙酰胆碱受体反向拮抗剂之后施用。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述药物组合物与施用所述抗癫痫药同时或实质上同时施用。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述药物组合物在施用所述抗癫痫药之后施用。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、骨内或透皮施用。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含丹曲林或其药学上可接受的盐、甘露醇、聚山梨酸酯、聚维酮、任选的pH调节剂，以及水。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与暴露于所述神经毒剂下而未施用所述包含丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物的受试者相比，施用所述包含丹曲林或其药学上可接受的盐的药物组合物导致神经行为改善。
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