CN111093384A - 促进蜜蜂对扁桃树作物靶向授粉的制剂 - Google Patents

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Abstract

一种用于通过偏置蜜蜂(西方蜜蜂)的觅食偏好来促进扁桃树作物(扁桃(Prunus dulcis))的授粉的制剂和包含其的组合物。所述制剂包含化合物柠檬烯、芳樟醇和苯甲醛。此外,一种通过使用包含化合物柠檬烯、芳樟醇和苯甲醛的制剂将蜜蜂的授粉活动靶向扁桃树作物的方法。

Description

促进蜜蜂对扁桃树作物靶向授粉的制剂
本公开内容涉及一种制剂和化合物,其通过偏置蜜蜂(西方蜜蜂(Apismellifera))的觅食偏好来促进扁桃树作物(扁桃(Prunus dulcis))的授粉。其还涉及一种使蜜蜂的授粉活动靶向扁桃树作物的方法。
背景技术
在蜜蜂中,气味在其营养源的搜寻和选择中起着重要的作用。众所周知,蜜蜂不仅根据先天的搜寻图像,而且还根据以前在野外以及蜂箱的社会环境中获得的经验来控制资源采集(Ribbands CR(1955)The scent language of honey bees;Ann Rev SmithsonInst 368-377;von Frisch K(1967)The dance language and orientation of bees;Harvard University Press,Cambridge,MA)。从这个意义上说,基于花的气味及其花蜜在野外建立的嗅觉记忆可以通过在蜂箱内提供这种花香来恢复(唤起)(Ribbands CR(1954)Communication between honeybees:the response of crop-attached bees to thescent of their crop:Proc R Entomol Soc Lond A29:141-144;Johnson DL&Wenner AM(1966)A relationship between conditioning and communication in honeybees;AnimBehav 14:261-265;Jakobsen HB&col.,(1995)Can social bees be influenced tochoose a specific feeding station by adding the scent of the station to thehive air?J Chem Ecol 21(11):1635-1648;Reinhard J&col.,(2004)Floral scentsinduce recall of navigational and visual memories in honeybees.J Exp Biol207:4371-4381)。此外,食用由觅食者找回并带进蜂箱的有香味的食物会引起其同巢伙伴的采集偏好产生偏置(von Frisch K(1923)
Figure BDA0002379547430000011
die Sprache der Bienen;Zool Jb Physiol40:1-186;Wenner AM&col.(1969)Honey bee recruitment to food sources:olfactionor language?Science164:84-86;Dornhaus A,Chittka L(1999)Evolutionary originsof bee dances;Nature 401:38)。
在有香味的饲喂站中觅食期间,如果这些气味仍包含在觅食者体内(von FrischK(1967)The dance language and orientation of bees;Harvard University)和/或如果有香味的食物的小样品在蜂箱成员之间口对口传递(交哺)(Farina,WM&col.(2007)Honeybees learn floral odors while receiving nectar from foragers within thehive;Naturwissenschaften,94:55-60),那么蜂箱成员可能会记住这些气味。
此外,已证明,觅食者找回并在蜂箱周围移动的有香味的食物可能会影响尚未参与觅食任务的幼蜂的行为(Grüter C y col.(2006)Propagation of olfactoryinformation within the honeybee hive.Behav Ecol Sociobiol 60:707-71;Grüter C&col.(2009).Retention of long-term memories in different age-groups ofhoneybee(Apis mellifera)workers.Insectes Sociaux,DOI 10.1007/S00040-009-0034-0)。
本公开内容的发明人先前已经发表了结果,表明蜜蜂可能在蜂箱内在分配有香味的食物的过程中产生嗅觉记忆。这种记忆可以在事后几天和蜂箱外恢复(唤起),这一点由觅食偏好的偏置证明。这些记忆的建立既不依赖于蜂箱中常见的招募机制,也不依赖于能够恢复先前获得的记忆的有香味的食物储备物的存在(Arenas A&col..(2007).Floralodor learning within the hive affects honeybees'foragingdecisions.Naturwissenschaften,94:218-222)。
在发表在Naturwissenschaften中的“Floral odor learning within the hiveaffects honeybees'foraging decisions”,94:218-222,Arenas A&col.中,还公开了“在蜂箱内”可获得的食物的气味产生长期的嗅觉记忆,其影响在蜂箱外选择食物来源的行为。其还公开了,为了形成对特定花的(纯的)气味的长期记忆,应将这种气味溶解在糖溶液(例如蔗糖溶液50%w/w)中,所述糖溶液可在位于蜂箱内的喂食器中获得(养蜂业中常用的方法)。纯的气味应以最小量稀释在糖溶液中(浓度:每1L可用的糖溶液50μl气味)。
在“Floral scents affect the distribution of hive bees arounddancers”,Behavioral Ecology and Sociobiology(2007)61:1589-1597,July 04,2007,Diaz,Paula C.&col.中,公开了从花返回的蜜蜂体内包含的花的气味在参与“蜜蜂之舞”时吸引同巢伙伴,“蜜蜂之舞”是该物种用来招募其他蜜蜂至蜂箱内的食物来源的机制,此外还增加了通过口对口接触或交哺进行的食物样品转移的发生率。
最后,在“Floral scents experienced within the colony affect long-termforaging preferences in honeybees”,Apidologie 39:714-722,2008,Arenas A&col.中,公开了增加在具有特定气味的食物来源上的着落次数的因素是在蜂箱周围移动的食物的气味,而不是暴露于作为挥发物的相同气味中。此外,在“Passive volatile exposurewithin the honeybee hive and its effect on odor discrimination”,Journal ofComparative Physiology A,195:759-768.2009,Fernandez V&col.中,公开了暴露于“在蜂箱内”作为挥发物的花的气味妨碍在随后的训练中记住那些花的气味。这表明,如果那些在蜂箱内作为挥发性化合物暴露的气味存在于天然花香中,则其不是优选的,即使这些特定的花提供丰富的花蜜作为资源。
许多作物需要通过昆虫授粉,所述昆虫通过访问同一物种的不同花朵促进异花受精。特别地,西方蜜蜂是世界上单一作物种植中最为丰富的传粉者,被认为对提高种子和果实的产量而言非常重要。
在一些蜂蜜产量居世界前列的国家,如阿根廷,养蜂业基本上被理解为一种获取储存在蜂箱中的产品(蜂蜜、蜂胶(propolis或bee glue)和蜂王浆等)的手段。然而,与其中蜜蜂更为重要的其他国家,即美国和法国相比,蜜蜂作为作物传粉者的用途通常还不太发达。然而,随着单一栽培或单一作物种植的发展,为这些作物寻找增加的靶向和可持续的授粉服务的需求也日益增长。
在靶向授粉中要解决的主要问题是,当将蜂箱从觅食者熟悉的一个环境转移到另一个不熟悉的地方时,花的可用性发生了变化。在不熟悉的环境中,蜜蜂缺乏在觅食过程中可被唤起的任何可靠和更新的信息。
在实践中,观察到在迁移(蜂箱转移)之后,觅食者在头几天里相对空闲,没有立即访问所需的花,即使这些花提供可观的回报。这是因为最近引进的蜜蜂缺乏与目标作物相关的在先经验;因此,不存在以前建立的记忆以指导或实现该花的种类的定位。在一个可变的时期(可持续几天),蜜蜂形成新的花香-花蜜联系(记忆)并更新使其能够定位环境中可用的新的花的种类的信息。
市场上可用的两种产品,
Figure BDA0002379547430000031
和BEE
Figure BDA0002379547430000032
与蜜蜂信息素相似,它们在花的场所(floral site)的存在吸引了新的蜜蜂觅食者。它们的用途包括用产品喷洒作物(无论它是什么类型),这在缩小的空间(如小果园和温室)是有效的,但在广阔的田地表面上无效。这将需要几次产品喷洒,这将使实施过于昂贵,并且对于大面积的作物效率极低。虽然这些产品直接作为蜜蜂引诱剂(尽管它们也可能吸引其他昆虫),但它们对特定的花的种类缺乏特异性,并且由于它们的性质,它们可能直接干扰蜜蜂的其他行为。这些产品均不基于与食欲有关的花的气味,也不涉及蜜蜂的嗅觉记忆。
专利申请CN 102823628(A)公开了一种将蜜蜂吸引到大豆作物上的组合物及其使用方法,其中将吸引性组合物喷洒到大豆作物上以促进其授粉,从而增加产量。
另一种策略是“训练”蜜蜂,使其获得从特定的花的种类中采集花粉的偏好,以促进其授粉。这一策略是在30年代由德国和前苏联国家的养蜂人实施的,其用这种方法利用自然香味、特别是通过研磨花朵来刺激蜂箱[(von Frisch,K.(1943),Versuche über dieLenkung des Bienenfluges durch Duftstoffe.Naturwissenschaften 31,445-460]。这种方法的缺点是,通过这种方法进行香味的工业规模生产效率不高,而且需要破坏属于目标物种的花。此外,通过研磨花产生的香味是不稳定的,并且不耐储存。
专利申请CN101569286(A)公开了促进不育植物亲本系的蜜蜂授粉的组合物和方法。所述组合物包含花的次级代谢物,如常见的生物碱(即尼古丁和咖啡因)和水溶性酚类(即黄酮类、槲皮素、没食子酸和咖啡酸)。所述方法包括将蜂箱放置在目标植物生长的帐棚内。然后,在一定的期限内给蜜蜂喂食所述包含次级代谢物的组合物,并继续喂食直到开花期结束,此时将蜜蜂从帐棚中移出。这种方法和组合物不针对任何特定的植物物种,并且不适用于大规模耕作的作物,如扁桃树。
专利申请JP2008212148“Method for promoting pollination of plantincluding induction of flower bee to floral organ of specific plant by takingadvantage of floral fragrance component of flower organ of this plant”记载了一种促进蜜蜂为植物授粉的花香组合物。然而,这项专利申请没有记载以特定的方式模拟扁桃树的花的气味的组合物,也没有记载用于使蜜蜂的授粉活动靶向扁桃树作物的组合物。这种特性的化合物也不能从申请JP2008212148的公开内容中得出。
专利申请WO2013005200(A1)公开了一种通过引起蜜蜂觅食偏好的偏置来促进苹果作物(森林苹果(Malus silvestris))的授粉的组合物及其使用方法。所述组合物包含化合物柠檬醛、苯甲醛和柠檬烯。由于对苹果作物具有特异性,因此该组合物不能用于促进对扁桃树作物的授粉。
专利申请WO2013005199(A1)公开了一种通过引起蜜蜂觅食偏好的偏置来促进向日葵作物(向日葵(Helianthus annuus))的授粉的组合物。所述组合物包含化合物桧烯、β-蒎烯和柠檬烯。由于对向日葵作物具有特异性,因此该组合物不能用于促进对扁桃树作物的授粉。
因此,需要有效且稳定的组合物,其促进扁桃树作物的授粉,并且还可以以简单且成本有效的方式在工业规模上生产,以及需要促进通过蜜蜂(西方蜜蜂)对扁桃树作物授粉的方法。
发明内容
因此,本公开内容的一个目的是提供这样的组合物,其模拟扁桃树的花的气味,以便在应位于扁桃树作物中的蜂箱中的蜜蜂中产生特定的嗅觉记忆以促进其授粉。在用本发明的制剂刺激后所建立的记忆减少了蜜蜂保持空闲直至觅食开始的时间。本发明的组合物通过促进作物上更快和持续的觅食活动来刺激资源的采集。本发明的使用减少了蜂箱留在作物中所需的时间,以及所需的蜂箱数量。此外,该组合物的使用改善了蜂箱的健康状况,并增加了其种群。另一方面,本发明的组合物具有非常低的成本,并且不需要使用复杂的技术来实现。
根据第一方面,本发明涉及一种促进蜜蜂对扁桃树作物靶向授粉的制剂,其包含化合物柠檬烯、芳樟醇和苯甲醛。
在一个实施方案中,本发明的制剂包含49.5%至60.5%的柠檬烯、25%至35%的芳樟醇和10%至20%的苯甲醛。在一个具体实施方案中,本发明的制剂包含50%至60%的柠檬烯、27%至33%的芳樟醇和13.5%至16.5%的苯甲醛。在甚至更具体的实施方案中,模拟扁桃花气味的本发明的制剂包含55%的柠檬烯、30%的芳樟醇和15%的苯甲醛。
根据另一方面,本发明提供一种用于促进蜜蜂对扁桃树作物的靶向授粉的组合物,其包含稀释在糖溶液中的本发明的制剂。
在本发明组合物的优选实施方案中,糖溶液为蔗糖水溶液,更优选为50%w/w的蔗糖溶液。在更具体的实施方案中,本发明的组合物包含0.1ml至0.2ml本发明的制剂/1L50%w/w的蔗糖水溶液。在甚至更具体的实施方案中,本发明的组合物包含0.1ml至0.2ml制剂/1L 50%w/w的蔗糖水溶液,该制剂包含55%的柠檬烯、30%的芳樟醇和15%的苯甲醛。
根据另一方面,本发明提供一种促进蜜蜂对扁桃树作物靶向授粉的方法,其包括以下步骤:
a)将本发明的组合物施用于蜂箱;
b)将蜂箱保持在扁桃树作物中或附近,所述扁桃树作物的授粉可被促进直至开花结束;和
c)移除蜂箱。
根据本发明方法的一个具体实施方案,步骤a)通过位于蜂箱内的人工喂食器进行。
根据本发明方法的另一个具体实施方案,步骤a)在将蜂箱放置在为了促进其授粉的作物中之前2天内进行。
根据本发明方法的另一个具体实施方案,步骤a)在将蜂箱放置在试图促进其授粉的作物中之后进行。
根据本发明方法的另一个具体实施方案,步骤a)在作物的开花水平达到20%之前进行。
根据本发明方法的另一个具体实施方案,在步骤b)期间将组合物第二次给予蜂箱。
附图说明
图1.利用SPME-GC-MS识别的扁桃花中存在的挥发性化合物的图谱。色谱图中编号的峰与表1中识别的化合物有关(参见实施例1)。
图2.利用质谱法识别的扁桃花的挥发性化合物的图谱。A)与保留时间为6.5分钟的峰相对应的质谱图,被确定为1-己醇(根据库NIST08,相似性为95%)。B)与保留时间为8.24分钟的峰相对应的质谱图,被确定为α-蒎烯(根据所述库,相似性为96%)。C)与保留时间为8.96分钟的峰相对应的质谱图,被确定为苯甲醛(根据所述库,相似性为98%)。D)与保留时间为9.84分钟的峰相对应的质谱图,被确定为2-辛酮(根据所述库,相似性为90%)。E)与保留时间为10.8分钟的峰相对应的质谱图,被确定为邻伞花烃(根据所述库,相似性为91%)。F)与保留时间为10.98分钟的峰相对应的质谱图,被确定为柠檬烯(根据所述库,相似性为94%)。G)与保留时间为12.8分钟的峰相对应的质谱图,被确定为2-壬酮(根据所述库,相似性为97%)。H)与保留时间为13.07分钟的峰相对应的质谱图,被确定为芳樟醇(根据所述库,相似性为95%)。I)与保留时间为13.19分钟的峰相对应的质谱图,被确定为壬醛(根据所述库,相似性为90%)。
图3.蜜蜂在喙伸反应(PER)装置中区分扁桃天然的花的气味和不同香味的能力。A-C:蜜蜂暴露于扁桃天然的花的气味与:A,本发明的制剂(制剂)、B,茉莉花香、C,混合物I)、D,混合物II)后的行为;E:每种不同混合物的嗅觉泛化指数(OlfactoryGeneralization Index)。每个不同的字母均表示Kruskal-Wallis检验的显著性差异。
图4.蜜蜂在使用:A,茉莉花香和B,本发明的制剂的喙伸反应(PER)的绝对嗅觉条件化后的区分能力。在这两种情况下,左图包含在训练期间延伸其喙的蜜蜂的百分比(%PER),而右图包含训练后对两种气味(A,制剂和扁桃花;B,茉莉花和扁桃花)的反应。
图5.扁桃树作物(扁桃)中的蜂箱活动。在用:(A)蔗糖溶液(对照,白圈)和(B)本发明的制剂(处理,灰圈)喂食蜜蜂后,测定每分钟进入蜂箱的蜜蜂的数量。蜂箱的数量示于括号中。星号表示显著性差异,**,p<0.01(GLM,最小满足模型(minimum adequate model))。
图6.访问扁桃花的蜜蜂的数量。在进行了以下两种处理的蜂箱附近对作物花上存在的蜜蜂的密度进行量化:i)对照组,被供给蔗糖溶液的蜂箱(白条);ii)处理组,被供给加入本发明的扁桃制剂的蔗糖溶液的蜂箱(制剂,灰条)。每棵树的蜜蜂数量(平均值±SE)与开花百分率。采样树的数量示于括号中,星号表示显著性差异,*,p<0.05(处理之间的比较,Mann-Whitney U-检验)。
图7.本发明的扁桃制剂对贮藏花粉量的影响。进行了以下两种处理的蜂箱内的总花粉面积增加:i)对照组,被供给蔗糖溶液的蜂箱(白条);ii)处理组,被供给加入本发明的扁桃制剂的蔗糖溶液的蜂箱(制剂,灰条)。示出的变化是应用所述处理前一天测量的面积与8天后测量的面积之间的差异。蜂箱的数量示于括号中。星号表示显著性差异,**,p<0.01(GLM,最小满足模型)。
图8.本发明的扁桃制剂对蜂箱种群的影响。进行了以下两种处理的蜂箱内的育雏面积增加:i)对照组,被供给蔗糖溶液的蜂箱(白条);ii)处理组,被供给加入本发明的扁桃制剂的蔗糖溶液的蜂箱(制剂,灰条)。蜂箱的总育雏面积基于每个框架中两侧的育雏面积之和来估算。育雏面积表示最终育雏面积(8天后测量的)除以初始育雏面积(刺激前一天测量的)的比值。蜂箱的数量示于括号中。星号表示显著性差异,*,p<0.05(GLM,最小满足模型)。
图9.本发明的扁桃制剂对作物产量的影响。在进行了以下两种处理的蜂箱附近测量的作物产量:i)对照组,被供给蔗糖溶液的蜂箱(白条);ii)处理组,被供给加入本发明的扁桃制剂的蔗糖溶液的蜂箱(制剂,灰条)。A)每棵树的果实产量。采样树的数量示于括号中(p<0.1)(GLM,最小满足模型)。B)产量(kg/ha)。
具体实施方式
近年来,使用蜜蜂蜂箱对扁桃树作物授粉已获得显著实用性,这是因为极大地增加了所得果实的产量。
自花期开始以来,扁桃树附近的蜜蜂蜂箱的存在导致更多的受精花,从而导致更多的座果,这又产生更多的采收果实。
由于这些原因,扁桃生产者从专门从事蜂箱迁移的养蜂人那里租用授粉服务,在开花期租用一定数量的蜂箱。在这种情况下,由于养蜂人通常用糖溶液刺激其蜂箱,应用含有扁桃花的合成制剂的组合物并不代表通常的养蜂人实践有重大改变。当养蜂人在此期间重新安置其蜂箱时,来自这些群体的蜜蜂在开始访问新花之前表现出延迟。因此,能够在蜂箱内形成“模拟扁桃花香的合成制剂的记忆”将能够减少这种延迟,除此之外还使授粉更有效率。
因此,本发明的一个目的是提供一种制剂,其模拟扁桃天然的花的气味,以使蜜蜂立即开始在扁桃树作物上觅食。这种制剂包含化合物柠檬烯、芳樟醇和苯甲醛。特别地,这种制剂通过增加蜜蜂的觅食活动,特别地吸引其至扁桃花,促进授粉,并因此增加作物的产量而起作用。
虽然柠檬烯、芳樟醇和苯甲醛化合物在本发明制剂中的相对组成可变化,条件是这3种全部存在,但是优选在制剂中,柠檬烯是最丰富的化合物,其次是芳樟醇,苯甲醛是最不丰富的化合物。本发明人还确定了本发明制剂的组分的最佳比例。尽管如此,本领域的专家应注意,所述值可在一定的范围内变化,而不降低其效率,优选在其相对百分比的大约±10%内变化。优选地,柠檬烯以49.5%至60.5%、例如50%至60%的百分比存在。优选地,芳樟醇以25%至35%、例如27%至33%的百分比存在。优选地,苯甲醛以10%至20%、例如13.5%至16.5%的百分比存在。在本发明的一个优选实施方案中,模拟扁桃花的气味的制剂包含55%的柠檬烯、30%的芳樟醇和15%的苯甲醛。此外,根据本申请,术语“柠檬烯”、“芳樟醇”和“苯甲醛”包含这些化合物本身及其衍生物、多晶型物、水合物、溶剂合物等。
出人意料地,本发明人发现虽然本发明的制剂仅结合了在扁桃花的提取物中所识别出的九种主要挥发性化合物中的三种(参见实施例1),但蜜蜂不能将扁桃天然花的香味与本发明的制剂区分开。考虑到这三种化合物中的两种(芳樟醇和苯甲醛)在扁桃花的提取物中的百分比丰度为第3和第5,这是特别出人意料的。此外,柠檬烯、芳樟醇和苯甲醛在本发明制剂的优选实施方案中的相对百分比与它们在花的提取物中的相对百分比丰度明显不同(分别在制剂中为55%-30%-15%,在花的提取物中为80%-13%-7%)。
甚至更出人意料地,本发明的制剂显示出比扁桃花中存在的其他挥发性化合物结合物更好的性能,所述其他挥发性化合物结合物早先被预期会显示出更好的结果。事实上,如实施例2所示,本发明的制剂比包含额外组分的各个类似制剂具有更好的性能。本领域的专家本来预期后者比本发明的制剂更有效。
此外,野外试验还表明,被供给包含本发明制剂的组合物(其也是本申请的一个目的)的蜂箱比对照组蜂箱更早且以时间更长的方式开始觅食活动。
根据本发明的方法,本发明的制剂可在将蜂箱放置在扁桃树作物中之前或期间,利用养蜂人已知的常用方法添加到蜂箱中。本发明的制剂可作为组合物(其也是本申请的一个目的)的一部分引入蜂箱中,其中该制剂以每1L 50%w/w的糖水溶液(例如蔗糖溶液)0.1至0.2ml的浓度稀释。甚至更优选地,本发明的组合物包含稀释在50%w/w的蔗糖溶液中的0.1至0.2ml的包含55%的柠檬烯、30%的芳樟醇和15%的苯甲醛的制剂。本发明的组合物促进蜜蜂对扁桃树作物的靶向授粉。
对于本发明的目的,缩写“w/w”是指溶质重量与总溶液重量之间的比例关系。
至于将制剂(即作为如本文所述的组合物的一部分)给予蜂箱的方式,其可通过蜂箱内的人工喂食器引入,或者通过将500至1000ml的糖组合物倒在蜂箱框架上而直接引入。最后,可根据作物和蜂箱的状态进行第二次给予。特别地,当花期很长时,可任选进行第二次给予,以获得更好的效果。
在将蜂箱放置在扁桃树作物中之前或期间与糖浆结合的本发明制剂的添加,促进目标作物上的快速和持续的觅食活动,并且促进觅食活动的增加。这种简单的刺激方法可以实现扁桃树作物的授粉,并需要使用较少数量的蜂箱。另一方面,本发明的制剂具有较低的生产和商业化成本。
与商业产品
Figure BDA0002379547430000101
和BEE
Figure BDA0002379547430000102
——其在蜜蜂的行为中产生先天反应——相比,本发明的制剂不会引起这种“刚性”反应(其在将相同的蜂箱从一种作物移动到另一种作物的情况下可能适得其反)。相反,它影响决策过程,所述决策过程是可适应的,并且可根据每个蜂箱的需要或不断变化的环境条件进行调整。这在试图进行综合的养蜂和农业管理时证明是必要的,而不会损害所涉及的任何一方。
因此,本发明的制剂可以以少量使用以刺激蜂箱。此外,它是一种简单的制剂,仅包含构成扁桃花香的许多挥发性化合物中的三种,从而产生了一种具有成本效益的产品,所述产品制造简单且易于使用。此外,该制剂刺激蜜蜂在扁桃树作物上的即时觅食。通过给予本发明的制剂或组合物进行的刺激可在将蜂箱带至作物之前或甚至在扁桃开花开始之前进行。
实施例
实施例1:扁桃花中挥发性化合物的识别与定量
为了识别和定量扁桃花中存在的挥发性化合物,使用了以下方案:
选择扁桃树枝,其在以下阶段有20-30朵鲜花:“花蕾”和“一日龄花”。使用聚乙烯袋,将该树枝与暴露的SPME纤维(固相微萃取)(PDMS型,
Figure BDA0002379547430000112
)一起隔离,以收集花中存在的挥发物,持续时间为2小时。然后,在Shimadzu QP-2010GC-MS装置中,在以下条件下对纤维进行解吸:不分流模式,以氦气作为载气,进样器温度为250℃,相间温度为310℃。使用的温度斜坡为:40(1)-5-200-15-300(1);柱:AT-5(直径=0.25mm,长度(longitude)=30m,膜=0.25mm,流速=1ml/min)。
为了稍后对本化合物进行试验分析和识别,使用了NIST05、NIST08和SHIM2205库。
表1示出了9种所识别出的主要化合物的保留时间和峰面积(参见图1)。
Figure BDA0002379547430000111
实施例2:制剂的制备
制备了3种不同的混合物,每种混合物混合了实施例1中识别出的3到4种挥发性化合物。每种混合物的组成为:
-混合物I:50%的柠檬烯、30%的芳樟醇、10%的苯甲醛、10%的壬醛。
-混合物II:50%的柠檬烯、30%的芳樟醇、10%的苯甲醛和10%的2-辛酮。
-混合物III(本发明的制剂):55%的柠檬烯、30%的芳樟醇和15%的苯甲醛。
在所有情况下,都使用纯度超过95%的纯化合物
Figure BDA0002379547430000121
在室温下,通过在不使用溶剂的情况下混合化合物而制备溶液。一旦制备好,将混合物立即用于实验,并储存在2℃-8℃,直到试验结束(4天)。
实施例3:通过差别嗅觉条件化评估混合物
进行差别嗅觉条件化,以评估蜜蜂区分各种香味和扁桃天然的花的气味的能力。对于每种香味,使用32至46只蜜蜂。试验中使用的每只蜜蜂都被控制(harnessed)并向其提供与奖赏相关的香味(奖赏性条件刺激,EC+),并且还向其提供扁桃天然的花的气味而无奖赏(无奖赏性条件刺激,EC-)。这两种刺激物均经由通过连续气流传递香味的装置提供给蜜蜂。将滤纸(30mm x 3mm)用每种混合物(4μl)浸渍,并引入注射器中。另一方面,将来自扁桃树的鲜花放置在通过套管连接到所述装置的布氏烧瓶(500ml)中。重复这种条件化4次,每对香味提供之间有15分钟的间隔,按伪随机顺序进行。评估的香味(EC+)为:A)来自实施例2的混合物3(制剂),B)合成的茉莉花香(Pfeiffer-Gerhards Keramik-Germany),C)来自实施例2的混合物1,和D)实施例2的混合物2。在所有情况下,无奖赏的对照组(EC-)为扁桃天然的花的气味。基于蜜蜂的喙伸反应(PER)(针对两种新的和无奖赏性的刺激物的测试阶段)来评估区分EC+和EC-的能力。
到条件化结束时,除了制剂(来自实施例2的混合物3),蜜蜂能够区分扁桃天然的花的气味和每种其他被评估的香味。这一点可通过比较每个试验中基于蜜蜂性能计算的泛化指数而明显看出(图3E)。
实施例4:通过绝对嗅觉条件化评估制剂
进行绝对嗅觉条件化,以评估蜜蜂区分制剂(来自实施例2的混合物3)和扁桃天然的花的气味的能力。通过向被控制的蜜蜂提供合成的茉莉花香(Pfeiffer-GerhardsKeramik-Germany)或制剂(来自实施例2的混合物3)(每种以4μl嵌入滤纸中并引入注射器中)来训练被控制的蜜蜂,两者都与奖赏有关。每15分钟提供一次刺激物,总共提供4次。在训练结束时,在测试阶段中,向蜜蜂提供两种新的香味:对于用合成的茉莉花香调节的蜜蜂,为扁桃天然的花的气味(放在布氏烧瓶内的鲜花)和制剂(来自实施例2的混合物3),对于用制剂(来自实施例2的混合物3)调节的蜜蜂,为扁桃天然的花的气味和合成的茉莉花香,并评估蜜蜂的喙伸反应(PER)。正如实施例3中所述的实验所发生的那样,用制剂调节的蜜蜂表现出与上次训练试验期间所表现出的学习性能相似的学习性能,表明其不能区分制剂和扁桃天然的花的气味。
实施例5:蜂箱刺激
通过每1000ml 50%w/w的蔗糖水溶液溶解50μl制剂(来自实施例2的混合物3)制备组合物。20个蜂箱通过单次给予500ml的含有制剂的组合物而加料,而其他40个蜂箱接受500ml 50%w/w的蔗糖溶液(对照)。在这两种情况下,均将处理剂(treatment)倒在蜂箱框架上。蜂箱已经放置在开花水平低于5%的扁桃作物中。蜂箱位于Lavalle(MendozaProvince,Argentina)附近的扁桃(Prunus dulcis)作物中。测定蜜蜂的活动(activity),以及扁桃花上的蜜蜂密度、蜂箱的花粉面积和幼雏的增加,直到给予处理剂后6天,此时开花水平达到60%。作物产量也根据每棵树的果实数量和每公顷的Kg数进行了评估。
被供给含有制剂(来自实施例2的混合物3)的组合物的蜂箱的活动水平显著高于对照组(以每分钟进入的蜜蜂数测量)。经刺激的蜂箱的活动与对照组的活动之间的差异在刺激后第3天和第5天明显大于刺激后第1天,在刺激后第1天,实验组的蜂箱活动仅略高于对照组(图5)。
给予含有制剂的糖组合物还使访问扁桃树作物的花的蜜蜂的数量增加。如图6所示,对于花期的每一个水平,经处理的蜂箱附近的作物的花上的蜜蜂密度显著高于对照组附近的作物的花上的蜜蜂密度。
经处理的蜂箱中蜜蜂的更高活动与花粉面积(图7)以及育雏面积(图8)的更多增加有关,表明含有制剂的糖组合物促进食物采集并刺激蜂箱生长。
此外,还证实了对扁桃树作物的有益效果。用含有制剂的糖组合物处理的蜂箱附近的扁桃树作物的产量更高,无论是以每棵树的果实数量来衡量(图9A),还是以每公顷的果实重量来衡量(图9B)。

Claims (15)

1.一种促进蜜蜂对扁桃树作物的靶向授粉的制剂,其中所述制剂包含化合物柠檬烯、芳樟醇和苯甲醛。
2.根据权利要求1所述的制剂,其中所述制剂包含49.5%至60.5%的柠檬烯、25%至35%的芳樟醇和10%至20%的苯甲醛。
3.根据权利要求1所述的制剂,其中所述制剂包含50%至60%的柠檬烯、27%至33%的芳樟醇和13.5%至16.5%的苯甲醛。
4.根据权利要求2所述的制剂,其中所述制剂包含55%的柠檬烯、30%的芳樟醇和15%的苯甲醛。
5.一种促进蜜蜂对扁桃树作物的靶向授粉的组合物,其中所述组合物包含在糖溶液中稀释的根据前述权利要求中任一项所述的制剂。
6.根据权利要求5所述的组合物,其中所述糖溶液为蔗糖水溶液。
7.根据权利要求6所述的组合物,其中所述蔗糖水溶液为50%w/w的蔗糖水溶液。
8.根据权利要求6所述的组合物,其中所述组合物包含0.1ml至0.2ml的根据权利要求1或2所述的制剂/1L 50%w/w的蔗糖水溶液。
9.根据权利要求6所述的组合物,其中所述组合物包含0.1ml至0.2ml的根据权利要求3所述的制剂/1L 50%w/w的蔗糖水溶液。
10.一种促进蜜蜂对扁桃树作物的靶向授粉的方法,其中所述方法包括以下步骤:
a)将权利要求5至9中任一项的组合物给予蜂箱;
b)将蜂箱保持在试图促进其授粉的扁桃树作物中或附近,直到开花结束;和
c)移除蜂箱。
11.根据权利要求10所述的方法,其中步骤a)通过位于蜂箱内的人工喂食器进行。
12.根据权利要求10所述的方法,其中步骤a)在将蜂箱带至试图促进其授粉的作物前2天内进行。
13.根据权利要求10所述的方法,其中步骤a)在将蜂箱放置在试图促进其授粉的目标作物中后进行。
14.根据权利要求12所述的方法,其中步骤a)还在作物的开花水平达到20%之前进行。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法,其中在步骤b)期间将组合物第二次给予蜂箱。
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