CN111089971A - 一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置 - Google Patents

一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置。实验容腔的两侧镂空供微吸管和玻璃电极进入；实验容腔的容腔底面上有处于半贴壁状态的细胞，微吸管吸取红细胞，玻璃电极内充有电极内液；膜片钳探头通过膜片钳探头支架固定于实验平台上，膜片钳探头的记录电极连接到玻璃电极夹持器末端，玻璃电极连接到玻璃电极夹持器的夹持端，参比电极接入到实验容腔内的细胞外液中；倒置显微镜的上方设有明场汞灯光源，明场汞灯光源的明场光路照射实验容腔，后被工业相机接收。本发明能够直接检测膜电位变化对膜蛋白动态功能的影响，能够在同步检测两谱相信息的同时记录两谱相信息的耦合关系。

Description

一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置
技术领域
本发明涉及膜片钳技术和微吸管技术的整合，尤其是涉及了一种膜电位调控下的蛋白质分子相互作用定量检测装置。
背景技术
细胞膜的膜电位是细胞生命活动的关键调控因素。神经元的膜电位对神经元的各项生命活动起到重要的调控作用，是动态调控脑神经网络结构与功能的重要生物物理因素；在非神经元细胞中，细胞的膜电位同样调控其增殖、分化等生命活动。膜片钳技术是研究膜电位相关问题的有效手段，其全细胞记录模式能够实现对整个细胞膜的膜电位实施准确而快速的控制。然而，膜片钳目前主要局限于离子通道特性的研究。
膜蛋白是细胞感知外界环境并作出响应的主要感受器，细胞膜上多数蛋白质分子如何感受膜电位变化来调整其动态功能尚未被解析。其主要瓶颈在于缺乏直接有效的研究手段。
微吸管技术被广泛应用于蛋白质－蛋白质相互作用动力学参数的原位检测。在微吸管实验的检测过程中，蛋白质分子时刻处于细胞膜微环境中(待测蛋白制分子分别被连接、表达在红细胞、细胞表面)。因此微吸管实验在检测膜受体、配体之间的相互作用时具有得天独厚的优势。膜片钳技术与微吸管技术两种技术的融合为研究生理条件下膜电位变化对膜蛋白之间相互作用的动态调控提供了可能。然而，目前尚未有方法能够研究生理条件下膜电位变化对膜蛋白之间相互作用的动态调控规律。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置，将膜片钳技术与微吸管技术成功整合，能够检测细胞膜电位变化对膜蛋白相互作用的影响，为生理条件下膜电位变化对膜蛋白之间相互作用的动态调控规律的研究提供了实验方案。
本发明包含了微吸管和膜片钳技术的整合并记录了相应两个谱相信息的耦合关系，能够解析膜电位变化对膜蛋白之间相互作用的影响。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
本发明包括实验平台、明场汞灯光源、倒置显微镜、玻璃电极、微吸管、压电运动平台、第一三维显微操作器、第二三维显微操作器、记录电极和实验容腔骨架；实验平台上布置有实验容腔、膜片钳、第一三维显微操作器，实验容腔位于实验平台中央，实验容腔骨架中间粘贴有上下两片平行的玻璃片，两片玻璃片形成实验容腔，实验容腔的两侧镂空，供微吸管和玻璃电极进入；实验容腔的容腔底面上有处于全细胞记录模式下的处于半贴壁状态的细胞，微吸管吸取红细胞，细胞和红细胞处于实验容腔里的细胞外液中，玻璃电极内充有电极内液，微吸管连接微吸管夹持器的夹持端，微吸管夹持器安装在压电运动平台上，压电运动平台安装在第一三维显微操作器上，第一三维显微操作器固定于实验平台上；压电运动平台通过控制微吸管带动红细胞的运动，控制红细胞执行反复的前进—后退的运动循环，即红细胞与细胞反复接触—分离的运动循环，并通过显示器的实时图像记录每次接触—分离过程中，细胞与红细胞的粘附状态。
膜片钳包括膜片钳放大器、膜片钳探头、膜片钳探头支架，膜片钳探头通过膜片钳探头支架固定于实验平台上，膜片钳探头的记录电极通过BNC转接线连接到玻璃电极夹持器末端，玻璃电极连接到玻璃电极夹持器的夹持端，玻璃电极夹持器安装在第二三维显微操作器上，参比电极接入到实验容腔内的细胞外液中；倒置显微镜的上方设有明场汞灯光源，明场汞灯光源的明场光路照射实验容腔的细胞，透射后依次经倒置显微镜的物镜、倒置显微镜内部的反射镜倒置显微镜侧面开设的窗口后进入工业相机上，工业相机内的影像实时显示在显示器上。
本发明通过上述装置能实现在不同膜电位控制下，细胞与红细胞粘附状态的记录。
还包括电脑主机，所述的膜片钳探头的电输出端经膜片钳放大器通过USB线和电脑主机连接，压电运动平台经压电运动平台控制器和电脑主机连接。
所述的明场汞灯光源发射出明场光，通过滤色片后的明场光路从上方往下照射到实验容腔上。
所述的实验容腔骨架侧面预留开设了侧面通孔，参比电极穿设于侧面通孔布置，并稳定接入实验容腔内的细胞外液中。
如图1所示，本发明对微吸管、膜片钳的实验方案进行整合。整合后的实验系统包含了微吸管、膜片钳的必要功能，能够在同步记录两谱相信息的同时记录两谱相信息的耦合关系(可以用于离线还原微吸管技术所控制的红细胞运动状态与电压控制信号、电流采样信号在同一时间尺度上的对应关系)。整合后的实验系统通过电脑主机对压电运动平台、膜片钳放大器等部件实施协同控制。
本发明具有的有益效果是：
本发明结合了膜片钳技术与微吸管技术，能够直接解析细胞膜电位变化对膜蛋白相互作用的影响。
本发明主要针对生命科学领域中膜电位变化对膜蛋白动态功能的影响，本发明具有以下优势：
1)能够直接检测膜电位变化对膜蛋白动态功能的影响；
2)能够在同步检测记录两谱相信息的同时记录两谱相信息的耦合关系(可以用于离线还原微吸管所控制的碰撞状态与电压控制信号、电流采样信号在同一时间尺度上的对应关系)。
附图说明
图1是本发明的系统图。
图2是本发明的实验原理图。
图3是本发明所涉及的实验容腔骨架结构示意图。
图中：1、明场汞灯光源，2、明场光路，3、倒置显微镜，4、用于观测粘附状态的工业相机，5、用于观测粘附状态的显示器，6、膜片钳放大器，7、电脑主机，8、膜片钳探头，9、膜片钳探头支架，10、玻璃电极夹持器，11、玻璃电极，12、控制玻璃电极运动的第二三维显微操作器，13、实验容腔，14、吸取红细胞的微吸管，15、微吸管夹持器，16、压电运动平台，17、控制微吸管运动的第一三维显微操作器，18、压电运动平台控制器，19、实验平台，20、记录电极BNC转接线，21、参比电极，22、记录电极，23、电极内液，25、处于全细胞记录模式下的细胞，26、红细胞，28、容腔底面玻璃片，29、实验容腔骨架，30、侧面通孔。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
如图1，2，3所示，包括实验平台19、明场汞灯光源1、倒置显微镜3、玻璃电极11、微吸管14、压电运动平台16、第一三维显微操作器17、第二三维显微操作器12、记录电极22和实验容腔骨架29；实验平台19上布置有实验容腔13、膜片钳探头支架9、第一三维显微操作器17，第二三维显微操作器12。实验容腔13位于实验平台19中央，实验容腔骨架29中间粘贴有上下两片平行的玻璃片，两片玻璃片形成实验容腔，实验容腔13的两侧镂空，供微吸管14和玻璃电极11进入；实验容腔13的底面28上有处于全细胞记录模式下的细胞25，微吸管14吸取红细胞26，细胞25和红细胞26处于实验容腔13里的细胞外液中，玻璃电极11内充有电极内液23，微吸管14连接微吸管夹持器15的夹持端，微吸管夹持器15安装在压电运动平台16上，压电运动平台16安装在第一三维显微操作器17上，第一三维显微操作器17固定于实验平台19上；压电运动平台16可以通过控制微吸管14带动红细胞26的运动，控制红细胞26执行反复的前进—后退的运动循环，即红细胞26与细胞25反复接触—分离的运动循环，并通过显示器5的实时图像记录每次接触—分离过程中，细胞25与红细胞26的粘附状态。
倒置显微镜3的上方设有明场汞灯光源1，明场汞灯光源1的明场光路2照射实验容腔13，透射后依次经倒置显微镜3的物镜、倒置显微镜3内部的反射镜进入工业相机4上，工业相机4内的影像实时显示在显示器5上。
本发明通过上述装置能实现在不同膜电位控制下，细胞与红细胞粘附状态的记录。
本发明对实验容腔骨架29的结构进行了重新设计。具体地，为了更容易形成对细胞的高阻封接，本发明通过增大了实验容腔骨架29上下两玻璃片间的厚度来增加玻璃电极11可倾斜的角度。实验容腔骨架29侧面预留开设了侧面通孔30，参比电极21通过实验容腔骨架29侧面通孔30接入到实验容腔内的细胞外液中。
本发明所涉及整合膜片钳的微吸管技术采用了探头8与玻璃电极夹持器10分离的设计。膜片钳相关部件包括膜片钳放大器6、膜片钳探头8、膜片钳探头支架9，膜片钳探头8通过膜片钳探头支架9固定于实验平台19上，膜片钳探头8的记录电极通过记录电极BNC转接线20连接到玻璃电极夹持器10末端，玻璃电极11连接到玻璃电极夹持器10的夹持端，玻璃电极夹持器10安装在第二三维显微操作器12上；参比电极21通过实验容腔骨架29侧面通孔30接入到实验容腔内的细胞外液中。
倒置显微镜3的上方设有明场汞灯光源1，明场汞灯光源1发出的明场光路照射实验容腔13，透射后依次经倒置显微镜3的物镜、倒置显微镜3内部的反射镜进入工业相机4上，工业相机4内的影像实时显示在显示器5上。
所述的明场汞灯光源1发射出全谱的明场光，通过滤色片(例如绿色光滤色片)后的明场光路2从上方照射到实验容腔13上。
所述的实验容腔骨架29侧面预留开设了侧面通孔30，参比电极21通过侧面通孔30稳定接入实验容腔13内的细胞外液中。
具体实施还包括电脑主机7，所述的膜片钳放大器6通过USB线和电脑主机7连接，压电运动平台16经压电运动平台控制器18和电脑主机7连接。
本发明的实验过程如下：
实验容腔13的准备过程中，表达目标蛋白质分子的悬浮细胞25通过多聚赖氨酸粘附在实验容腔底面的玻璃片28上，处于半贴壁状态；
表面连接另一蛋白质分子的红细胞26加入到实验容腔13内的细胞外液中；
实验操作人员选取目标细胞25，移动倒置显微镜3的载物台将其移动到视野中间，并通过操控第二三维显微操作器12控制玻璃电极11对目标细胞25执行封接、破膜、补偿等常规全细胞记录膜片钳的操作；
实验操作人员通过操控第一三维显微操作器17控制微吸管14吸取一个红细胞26；
实验操作人员设置电压刺激模式、参数，以及微吸管实验参数(红细胞26与细胞25的接触时间等)；
开始数据采集阶段：程序自动对全细胞记路模式下的细胞25施加设定的电压刺激，程序自动显示、记录当前电压、电流信息，同时，程序控制红细胞26执行与细胞25反复接触—分离的运动循环，实验操作人员通过显示器5的实时图像记录每次接触—分离过程中，细胞25与红细胞26的粘附状态。
记录完成后保存当次记录过程中电压、电流数据，以及手动记录的粘附状态(一般每次记录时长为50次接触—分离的运动循环的时间，其粘附状态出现的频率记为当前膜电位刺激条件下的粘附频率)；
实验操作人员随后根据实验设计修改电压刺激参数，重复数据采集阶段；
通过对比不同电压刺激下粘附频率的变化，这种整合膜片钳的微吸管技术可以解析膜电位变化对膜蛋白相互作用的影响。
本发明能够在同步记录两谱相信息的同时记录两谱相信息的耦合关系。具体地，压电运动平台16每次运动状态变化(开始运动或停止运动)的时刻，电生理谱的数据索引都会被记入一个独立的索引数组文件中，该索引数组文件可以用于离线还原微吸管技术所控制的红细胞26的运动状态与电压控制信号、电流采样信号在同一时间尺度上的对应关系。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置，其特征在于：
包括实验平台(19)、明场汞灯光源(1)、倒置显微镜(3)、玻璃电极(11)、微吸管(14)、压电运动平台(16)、第一三维显微操作器(17)、第二三维显微操作器(12)、记录电极(22)和实验容腔骨架(29)；实验平台(19)上布置有实验容腔(13)、膜片钳、第一三维显微操作器(17)，实验容腔(13)位于实验平台(19)中央，实验容腔骨架(29)中间粘贴有上下两片平行的玻璃片，两片玻璃片形成实验容腔，实验容腔(13)的两侧镂空，供微吸管(14)和玻璃电极(11)进入；实验容腔(13)的容腔底面(28)上有处于全细胞记录模式下的细胞(25)，微吸管(14)吸取红细胞(26)，细胞(25)和红细胞(26)处于实验容腔(13)里的细胞外液中，玻璃电极(11)内充有电极内液(23)，微吸管(14)连接微吸管夹持器(15)的夹持端，微吸管夹持器(15)安装在压电运动平台(16)上，压电运动平台(16)安装在第一三维显微操作器(17)上，第一三维显微操作器(17)固定于实验平台(19)上；
膜片钳包括膜片钳放大器(6)、膜片钳探头(8)、膜片钳探头支架(9)，膜片钳探头(8)通过膜片钳探头支架(9)固定于实验平台(19)上，膜片钳探头(8)的记录电极通过BNC转接线(20)连接到玻璃电极夹持器(10)末端，玻璃电极(11)连接到玻璃电极夹持器(10)的夹持端，玻璃电极夹持器(10)安装在第二三维显微操作器(12)上，参比电极(21)接入到实验容腔内的细胞外液中；倒置显微镜(3)的上方设有明场汞灯光源(1)，明场汞灯光源(1)的明场光路(2)照射实验容腔(13)，透射后依次经倒置显微镜(3)的物镜、倒置显微镜(3)内部的反射镜后进入工业相机(4)上。
2.根据权利要求1所述的一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置，其特征在于：还包括电脑主机(7)，所述的膜片钳探头(8)的电输出端经膜片钳放大器(6)和电脑主机(7)连接，压电运动平台(16)经压电运动平台控制器(18)和电脑主机(7)连接。
3.根据权利要求1所述的一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置，其特征在于：所述的明场汞灯光源(1)发射出明场光，通过滤色片后的明场光路(2)从上方往下照射到实验容腔(13)上。
4.根据权利要求1所述的一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置，其特征在于：所述的实验容腔骨架(29)侧面预留开设了侧面通孔(30)，参比电极(21)穿设于侧面通孔(30)布置，并稳定接入实验容腔(13)内的细胞外液中。
5.根据权利要求1所述的一种膜电位调控下的蛋白相互作用定量检测装置，其特征在于：还包括显示器(5)，显示器(5)连接工业相机(4)输出端。
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