CN111088217A - 细胞培养基、细胞培养试剂盒及细胞培养方法 - Google Patents

细胞培养基、细胞培养试剂盒及细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养基，所述细胞培养基包含基础培养基、血清替代物、亚油酸、睾酮、维生素A、L‑抗坏血酸、聚赖氨酸、腐胺和2‑巯基乙醇。本发明细胞培养基可体外高效培养皮脂腺细胞，使得不同代次皮脂腺细胞的细胞增殖率、复苏后成活率及脂质合成相关蛋白表达量均显著增加，为广泛研究皮脂腺生理及内分泌功能、探索皮脂腺相关疾病的发病机制和药物开发提供帮助。

Description

细胞培养基、细胞培养试剂盒及细胞培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及细胞培养基、细胞培养试剂盒及细胞培养方法。
背景技术
皮脂腺是一种分枝型的多腺，除手掌、脚底和足背外，存在于人体皮肤的各个部位，尤其集中在头皮、前额和面部等，可能有400-900个腺体/平方厘米的区域。在皮脂腺中存在皮脂腺细胞，起到放出皮脂的作用。皮脂腺细胞通过分化和分裂成为完全成熟的细胞，产生和分泌一种油性、蜡质物质(皮脂)，其主要成分包括甘油三酯和脂肪酸分解产物、蜡酯、角鲨烯、胆固醇酯和胆固醇，起着对皮肤及毛发的保护及保湿作用。皮脂的分泌异常成为油性皮肤、干燥皮肤、粉刺、皮脂溢出症、脂溢性皮炎、干皮病等皮肤病的原因。为了研究开发控制皮脂分泌的医药品或化妆品，能够再现动物生物体的皮脂腺的行为的培养细胞模型的构建是重要的。
目前，临床前研究及科研院可利用的细胞模型以仓鼠皮脂腺细胞较为常用，虽然其细胞与生物体的皮脂腺细胞同样地具有在细胞内形成脂滴的优点，但在基因组信息并未完全研究清楚且在实验结果推至人体上时存在一定的风险性，故目前急需一种人源离体皮脂腺细胞培养方法和可高效体外长期培养皮脂腺细胞的培养基的诞生，为皮脂腺细胞广泛用于研究皮脂腺生理及内分泌功能、探索皮脂腺相关疾病的发病机制和药物开发提供帮助。
然而，正常人皮脂腺细胞只能原代培养3-6代，培养至7-9代时就已大量死亡，体外扩增传代不超过10代就会出现老化，甚至死亡的现象，尤其是在含血清的培养体系中，其老化死亡速度更快，此种现象不能满足大规模和长期皮脂腺细胞实验的需要。
因此，目前急需一种人源离体皮脂腺细胞培养方法和可高效体外长期培养皮脂腺细胞的培养基，为皮脂腺细胞广泛用于研究皮脂腺生理及内分泌功能、探索皮脂腺相关疾病的发病机制和药物开发提供帮助。同时需要一种培养不同代次皮脂腺细胞的细胞增殖率、复苏后成活率及脂质合成相关蛋白表达量均显著增加的培养基，可高效体外培养皮脂腺细胞。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种培养不同代次皮脂腺细胞的细胞增殖率、复苏后成活率及脂质合成相关蛋白表达量均显著增加的培养基。
为此，本发明提供了以下技术方案。
第一方面，本发明提供一种细胞培养基，其中，所述细胞培养基包含基础培养基、血清替代物、亚油酸、睾酮、维生素A、L-抗坏血酸、聚赖氨酸、腐胺和2-巯基乙醇。
在优选的实施方式中，所述基础培养基包含DMEM和Ham’F-12，所述DMEM和Ham’F-12的体积比为1:1。
在优选的实施方式中，所述亚油酸的浓度可以为1-5μg/mL，例如，所述亚油酸的浓度可以为1、1.3、1.5、1.7、1.9、2、2.2、2.5、2.7、2.9、3、3.1、3.3、3.5、3.7、4、4.1、4.3、4.5、4.7或5μg/mL。
在更优选的实施方式中，所述亚油酸的浓度可以为5μg/mL。
在优选的实施方式中，所述睾酮的浓度可以为400-800nmol/L，例如，所述睾酮的浓度可以为400、430、450、470、500、520、550、570、600、630、650、670、700、720、750或800nmol/L。
在更优选的实施方式中，所述睾酮的浓度可以为400nmol/L。
在优选的实施方式中，所述维生素A的浓度可以为0.12-0.28mmol/L，例如，所述维生素A的浓度可以为0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27或0.28nmol/L。
在更优选的实施方式中，所述维生素A的浓度可以为0.15mmol/L。
在优选的实施方式中，所述L-抗坏血酸的浓度可以为0.04-0.28mmol/L，例如，所述L-抗坏血酸的浓度可以为0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27或0.28nmol/L。
在更优选的实施方式中，所述L-抗坏血酸的浓度可以为0.05mmol/L。
在优选的实施方式中，所述聚赖氨酸的浓度可以为0.13-0.26mmol/L，例如，所述聚赖氨酸的浓度可以为0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25或0.26mmol/L。
在更优选的实施方式中，所述聚赖氨酸的浓度可以为0.26mmol/L。
在优选的实施方式中，所述腐胺的浓度可以为0.4-2.5nmol/L，例如，所述腐胺的浓度可以为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5nmol/L。
在更优选的实施方式中，所述腐胺的浓度可以为1nmol/L。
在优选的实施方式中，所述2-巯基乙醇的浓度可以为25-120μmol/L，例如，所述2-巯基乙醇的浓度可以为25、27、30、33、35、37、40、45、48、50、52、55、57、60、62、66、70、72、75、80、82、85、90、92、95、100、105、110、115或120μmol/L。
在更优选的实施方式中，所述2-巯基乙醇的浓度可以为25μmol/L。
在优选的实施方式中，所述血清替代物为白蛋白或酪蛋白、转铁蛋白和牛胰岛素的组合。
在更优选的实施方式中，所述血清替代物为酪蛋白、转铁蛋白和牛胰岛素的组合。
在更优选的实施方式中，所述酪蛋白的浓度可以为0.2-5mg/mL，例如，所述酪蛋白的浓度可以为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.3、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3、3.3、3.6、4、4.3、4.6或5mg/mL。
在最优选的实施方式中，所述酪蛋白的浓度可以为0.5mg/mL。
在更优选的实施方式中，所述转铁蛋白的浓度可以为1.2-5μg/mL，例如，所述转铁蛋白的浓度可以为1.2、1.3、1.4、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3、3.3、3.6、4、4.3、4.6或5μg/mL。
在最优选的实施方式中，所述转铁蛋白的浓度可以为1.5μg/mL。
在更优选的实施方式中，所述牛胰岛素的浓度可以为12-30μg/mL，例如，所述牛胰岛素的浓度可以为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30μg/mL。
在最优选的实施方式中，所述牛胰岛素的浓度可以为15μg/mL。
第二方面，本发明提供一种皮脂腺细胞培养基，其中，所述皮脂腺细胞培养基包含基础培养基、血清替代物、亚油酸、睾酮、维生素A、L-抗坏血酸、聚赖氨酸、腐胺和2-巯基乙醇。
在优选的实施方式中，所述基础培养基包含DMEM和Ham’F-12，所述DMEM和Ham’F-12的体积比为1:1。
在优选的实施方式中，所述亚油酸的浓度可以为1-5μg/mL，例如，所述亚油酸的浓度可以为1、1.3、1.5、1.7、1.9、2、2.2、2.5、2.7、2.9、3、3.1、3.3、3.5、3.7、4、4.1、4.3、4.5、4.7或5μg/mL。
在更优选的实施方式中，所述亚油酸的浓度可以为5μg/mL。
在优选的实施方式中，所述睾酮的浓度可以为400-800nmol/L，例如，所述睾酮的浓度可以为400、430、450、470、500、520、550、570、600、630、650、670、700、720、750或800nmol/L。
在更优选的实施方式中，所述睾酮的浓度可以为400nmol/L。
在优选的实施方式中，所述维生素A的浓度可以为0.12-0.28mmol/L，例如，所述维生素A的浓度可以为0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27或0.28nmol/L。
在更优选的实施方式中，所述维生素A的浓度可以为0.15mmol/L。
在优选的实施方式中，所述L-抗坏血酸的浓度可以为0.04-0.28mmol/L，例如，所述L-抗坏血酸的浓度可以为0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27或0.28nmol/L。
在更优选的实施方式中，所述L-抗坏血酸的浓度可以为0.05mmol/L。
在优选的实施方式中，所述聚赖氨酸的浓度可以为0.13-0.26mmol/L，例如，所述聚赖氨酸的浓度可以为0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25或0.26mmol/L。
在更优选的实施方式中，所述聚赖氨酸的浓度可以为0.26mmol/L。
在优选的实施方式中，所述腐胺的浓度可以为0.4-2.5nmol/L，例如，所述腐胺的浓度可以为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5nmol/L。
在更优选的实施方式中，所述腐胺的浓度可以为1nmol/L。
在优选的实施方式中，所述2-巯基乙醇的浓度可以为25-120μmol/L，例如，所述2-巯基乙醇的浓度可以为25、27、30、33、35、37、40、45、48、50、52、55、57、60、62、66、70、72、75、80、82、85、90、92、95、100、105、110、115或120μmol/L。
在更优选的实施方式中，所述2-巯基乙醇的浓度可以为25μmol/L。
在优选的实施方式中，所述血清替代物为白蛋白或酪蛋白、转铁蛋白和牛胰岛素的组合。
在更优选的实施方式中，所述血清替代物为酪蛋白、转铁蛋白和牛胰岛素的组合。
在更优选的实施方式中，所述酪蛋白的浓度可以为0.2-5mg/mL，例如，所述酪蛋白的浓度可以为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.3、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3、3.3、3.6、4、4.3、4.6或5mg/mL。
在最优选的实施方式中，所述酪蛋白的浓度可以为0.5mg/mL。
在更优选的实施方式中，所述转铁蛋白的浓度可以为1.2-5μg/mL，例如，所述转铁蛋白的浓度可以为1.2、1.3、1.4、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3、3.3、3.6、4、4.3、4.6或5μg/mL。
在最优选的实施方式中，所述转铁蛋白的浓度可以为1.5μg/mL。
在更优选的实施方式中，所述牛胰岛素的浓度可以为12-30μg/mL，例如，所述牛胰岛素的浓度可以为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30μg/mL。
在最优选的实施方式中，所述牛胰岛素的浓度可以为15μg/mL。
第三方面，提供一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含本发明所述的细胞培养基和培养细胞。
在优选的实施方式中，所述培养细胞可以为人源皮肤分离的皮脂腺细胞、或鼠源皮肤分离的皮脂腺细胞。
第四方面，提供一种皮脂腺细胞培养试剂盒，其中，所述试剂盒包含本发明所述的皮脂腺细胞培养基和培养细胞。
在优选的实施方式中，所述培养细胞可以为人源皮肤分离的皮脂腺细胞、或鼠源皮肤分离的皮脂腺细胞。
第五方面，提供了一种培养细胞的方法，其中，所述方法包含使用本发明所述的细胞培养基的步骤。
第六方面，提供了一种培养皮脂腺细胞的方法，其中，所述方法包含使用本发明所述的皮脂腺细胞培养基的步骤。
第七方面，提供了一种培养人源皮脂腺细胞的方法，其中，所述方法包含以下步骤：
S1.分离皮脂腺细胞：切取人的面部、腹部或头皮部皮肤，依次用PBS缓冲液及70％酒精清洗，立即转入到包含抗生素类物质的本发明培养基中，将皮肤切成3×5 mm小片，用含2.4U/mL中性蛋白酶的PBS在4℃下孵育20h，用细钳将表皮的部分从真皮上分离下来, 将表皮置于0.02%脱氧核糖核酸酶的PBS中37℃孵育15min，显微镜下剥离表皮层，分离得皮脂腺细胞；
S2.培养皮脂腺细胞: 分离的皮脂腺细胞置于细胞培养皿中，将细胞培养皿放入5％CO2细胞培养箱内在37℃下静置培养48-72h，每48-72h更换一次皮脂腺细胞培养基，待皮脂腺细胞长满后传代。
在优选的实施方式中，所述抗生素类物质可以为100IU/ml的青霉素、100μg/mL的链霉素和0.5μg/mL的两性霉素。
此外，提供了本发明所述的细胞培养基在制备试剂盒中的用途。
以及，提供了本发明所述的皮脂腺细胞培养基在制备试剂盒中的用途。
本说明书中，皮脂腺细胞的接种密度可以根据具体的实验条件进行适当调整。优选皮脂腺细胞的接种密度为1-1.5×104/cm2。每一次传代都要根据具体实验要求对细胞的接种密度进行调整。
本说明书中，培养基是指用于培养生物材料的基质。对于生物材料没有特殊限制，可以是病毒、细胞(例如微生物细胞、动物细胞、植物细胞)、组织(例如动物组织、植物组织)等。本发明的培养基优选是用于细胞培养的培养基，即细胞培养基。本发明的培养基更优选是用于皮脂腺细胞培养的培养基。本发明的培养基可以是固体粉末状培养基，也可以是液体培养基，优选是液体培养基。当本发明的培养基是固体粉末状培养基时，优选在使用时将其调制成液体培养基来进行细胞培养，在调制过程中可以添加血清替代物、亚油酸、睾酮、维生素A、L-抗坏血酸、聚赖氨酸、腐胺和2-巯基乙醇等各种成分，使其满足本发明的要件。
本说明书中，当对象为细胞时，“培养”或“细胞培养”是指在体外进行人工维系，使细胞得以增殖。细胞培养通常在无菌条件下进行，可以是培养单个细胞或组织。
本说明书中，所述皮脂腺细胞培养基的制备过程如下：在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入牛胰岛素、酪蛋白、转铁蛋白、亚油酸、 睾酮、维生素A、L-抗坏血酸、聚赖氨酸(400,000道尔顿)、腐胺、2-巯基乙醇，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
本说明书中，试剂盒还包含培养细胞。所述培养细胞可以是常规贴壁的，常温下可存活3-5天；所述培养细胞也可以是低温冻存的，低温冻存是指在-80℃以下长期储存，一般可以储存几天至几年。所述培养细胞还可以是低温储存的，低温储存是指在4℃下储存，一般可以储存1-7天。
本说明书中，本发明的试剂盒还包含用于在进行细胞培养时单独盛放所述培养细胞的容器，该容器具有可通透性膜结构，对于所述容器的形状、材质、规格等均无特殊限制，本领域技术人员可以根据需要适宜选择。
本说明书中，本发明的试剂盒中还可以包含用于添加到培养基中的其它成分，包括但不限于血清替代物、亚油酸、睾酮、维生素A、L-抗坏血酸、聚赖氨酸、腐胺和2-巯基乙醇等添加成分。
本说明书中，本发明的试剂盒中还可以包含用于细胞培养的其它成分或组件，例如指示剂、胰酶、培养瓶、培养皿、使用说明书等。
本说明书中，本发明的试剂盒中，优选所述各成分分开放置，更优选分别置于独立的容器中。
细胞培养基通常1-2天更换一次，也可根据具体培养的细胞类型进行调整。只要细胞在培养器皿中生长至满丰度，就可以进行传代了。本说明书中，细胞传代是指将细胞分种一部分至新的培养器皿中。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供的培养基，采用该培养基体外培养时，不仅能提高细胞的体外增殖能力，还能保持未分化细胞的脂滴生物合成能力。细胞可快速增长，生长稳定，纯度高，该培养基的制备方法简单，最大程度的保留了培养基中各组分的有效活性。
本发明提供的皮脂腺细胞培养基，采用该培养基体外培养时，不仅能提高皮脂腺细胞的体外增殖能力，还能保持未分化皮脂腺细胞的脂滴生物合成能力。皮脂腺细胞可快速增长，生长稳定，纯度高，该培养基的制备方法简单，最大程度的保留了培养基中各组分的有效活性。
本发明提供的皮脂腺细胞培养基，在冻存和复苏后，形态较好，存活率高，增殖能力好，脂滴形成及合成能力不受影响。同时本发明提供的皮脂腺细胞培养基在进行体外培养皮脂腺细胞时，可有效避免在培养基基础上额外添加血清所带来的相关风险，可消除血清潜在的免疫原性以及病毒微生物污染。
本发明培养基中使用的亚油酸，在体外可诱导皮脂腺细胞的分化，刺激脂质合成受体PPARγ和FADS2表达的增加，从而引发皮脂腺细胞体外分化进而形成脂滴，解决体外培养的皮脂腺细胞脂质合成能力的问题，其是引发皮脂腺细胞体外分化的必要的多不饱和脂肪酸。将亚油酸的浓度控制在1-5μg/mL范围内，观察到皮脂腺细胞脂滴的蓄积能力显著提升。
皮脂腺是雄性激素的靶器官，受到雄性激素的刺激产生皮脂。5α-DHT是睾酮细胞内的一种代谢物，是最活跃的雄性激素，可使皮脂分泌增加。将睾酮的浓度控制在400-800nmol/L范围内，可显著增加皮脂分泌。
本发明培养基中使用的维生素A，是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体，对皮脂腺细胞体外活性和分化至关重要。将维生素A的浓度控制在0.12-0.28mmol/L范围内，可显著提高皮脂腺细胞的增殖率。
本发明培养基中使用的L -抗坏血酸，其在细胞内参与一些重要的羟化作用，能够促进细胞分离，保护细胞免受损伤，是一种细胞抗氧化保护剂。将L -抗坏血酸的浓度控制在0.04-0.28mmol/L范围内，可以更好的保护皮脂腺细胞免受损伤。
在本发明培养基中加入聚赖氨酸，可有效降低介质的表面张力，减少原代培养和传代培养消化过程中气泡形成，减少对皮脂腺细胞的机械伤害，且对皮脂腺细胞生长有明显的促进作用。将聚赖氨酸的浓度控制在0.13-0.26mmol/L范围内，通过降低细胞表面张力，促进代谢产物进入细胞，从而提高皮脂腺细胞的生长速率。
在本发明培养基中加入2-巯基乙醇，其是一种有机化合物，兼具乙二醇和乙二硫醇的官能团，通常用于二硫键的还原，保护二硫键，从而使蛋白质不被氧化掉而失活。将2-巯基乙醇的浓度控制在25-120μmol/L范围内，可有效降低细胞内自由基的产生，降低细胞培养过程中因自由基产生而导致细胞衰老和损伤的产生，进而提高细胞增殖能力。
本发明的基础培养基，搭配本发明的血清替代物、亚油酸、睾酮、维生素A、L-抗坏血酸、聚赖氨酸、腐胺和2-巯基乙醇的组合，可体外高效培养皮脂腺细胞，使得不同代次皮脂腺细胞的细胞增殖率、复苏后成活率及脂质合成相关蛋白表达量均显著增加，为广泛研究皮脂腺生理及内分泌功能、探索皮脂腺相关疾病的发病机制和药物开发提供帮助。
附图说明
图1为采用实施例3制备的培养基培养P2代人皮脂腺细胞10X镜下状态图；
图2为不同培养基培养不同代次人皮脂腺细胞的增值率结果图；
图3为不同培养基培养条件下人皮脂腺细胞内脂质合成蛋白表达量检测结果图；
图4为不同培养基配制成冻存液后人皮脂腺细胞复苏成活率结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚的呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例提供一种皮脂腺细胞培养基，所述皮脂腺细胞培养基包含DMEM/Ham’F-12（1/1）、0.2mg/mL的酪蛋白、1.2μg/mL的转铁蛋白、12μg/mL的牛胰岛素、1μg/mL的亚油酸、400nmol/L的睾酮、0.12mmol/L的维生素A、0.04mmol/L的L-抗坏血酸、0.13mmol/L的聚赖氨酸、0.4nmol/L的腐胺和25μmol/L的2-巯基乙醇。
本实施例皮脂腺细胞培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入12μg/mL的牛胰岛素、0.2mg/mL的酪蛋白、1.2μg/mL的转铁蛋白、1μg/mL的亚油酸、400nmol/L的睾酮、0.12mmol/L的维生素A、0.04mmol/L的L-抗坏血酸、0.13mmol/L的聚赖氨酸、0.4nmol/L的腐胺和25μmol/L的2-巯基乙醇，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
实施例2
本实施例提供一种皮脂腺细胞培养基，所述皮脂腺细胞培养基包含DMEM/Ham’F-12（1/1）、5mg/mL的酪蛋白、5μg/mL的转铁蛋白、30μg/mL的牛胰岛素、5μg/mL的亚油酸、800nmol/L的睾酮、0.28mmol/L的维生素A、0.28mmol/L的L-抗坏血酸、0.26mmol/L的聚赖氨酸、2.5nmol/L的腐胺和120μmol/L的2-巯基乙醇。
本实施例皮脂腺细胞培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入30μg/mL的牛胰岛素、5mg/mL的酪蛋白、5μg/mL的转铁蛋白、5μg/mL的亚油酸、800nmol/L的睾酮、0.28mmol/L的维生素A、0.28mmol/L的L-抗坏血酸、0.26mmol/L的聚赖氨酸、2.5nmol/L的腐胺和120μmol/L的2-巯基乙醇，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
实施例3
本实施例提供一种皮脂腺细胞培养基，所述皮脂腺细胞培养基包含DMEM/Ham’F-12（1/1）、0.5mg/mL的酪蛋白、1.5μg/mL的转铁蛋白、15μg/mL的牛胰岛素、5μg/mL的亚油酸、400nmol/L的睾酮、0.15mmol/L的维生素A、0.05mmol/L的L-抗坏血酸、0.26mmol/L的聚赖氨酸、1nmol/L的腐胺和25μmol/L的2-巯基乙醇。
本实施例皮脂腺细胞培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入15μg/mL的牛胰岛素、0.5mg/mL的酪蛋白、1.5μg/mL的转铁蛋白、5μg/mL的亚油酸、400nmol/L的睾酮、0.15mmol/L的维生素A、0.05mmol/L的L-抗坏血酸、0.26mmol/L的聚赖氨酸、1nmol/L的腐胺和25μmol/L的2-巯基乙醇，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例1
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例1，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明皮脂腺细胞培养基中的酪蛋白替换为大豆蛋白水解物。
该对比例皮脂腺细胞培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入15μg/mL的牛胰岛素、0.5mg/mL的大豆蛋白水解物、1.5μg/mL的转铁蛋白、5μg/mL的亚油酸、400nmol/L的睾酮、0.15mmol/L的维生素A、0.05mmol/L的L-抗坏血酸、0.26mmol/L的聚赖氨酸、1nmol/L的腐胺和25μmol/L的2-巯基乙醇，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例2
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例2，和实施例3相比，该对比例2的区别在于：将本发明皮脂腺细胞培养基中的亚油酸替换为油酸、睾酮替换为雌二醇。
该对比例皮脂腺细胞培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入15μg/mL的牛胰岛素、0.5mg/mL的酪蛋白、1.5μg/mL的转铁蛋白、5μg/mL的油酸、400nmol/L的雌二醇、0.15mmol/L的维生素A、0.05mmol/L的L-抗坏血酸、0.26mmol/L的聚赖氨酸、1nmol/L的腐胺和25μmol/L的2-巯基乙醇，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例3
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例3，和实施例3相比，该对比例3的区别在于：将本发明皮脂腺细胞培养基中的亚油酸替换为油酸、睾酮替换为雌二醇、维生素A替换为β-胡萝卜素。
该对比例皮脂腺细胞培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入15μg/mL的牛胰岛素、0.5mg/mL的酪蛋白、1.5μg/mL的转铁蛋白、5μg/mL的油酸、400nmol/L的雌二醇、0.15mmol/L的β-胡萝卜素、0.05mmol/L的L-抗坏血酸、0.26mmol/L的聚赖氨酸、1nmol/L的腐胺和25μmol/L的2-巯基乙醇，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例4
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例1，和实施例3相比，该对比例4的区别在于：将本发明皮脂腺细胞培养基中的L-抗坏血酸替换为叶酸、聚赖氨酸替换为葡聚糖、腐胺替换为精胺、2-巯基乙醇替换为乙醇胺盐酸。
该对比例皮脂腺细胞培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入15μg/mL的牛胰岛素、0.5mg/mL的酪蛋白、1.5μg/mL的转铁蛋白、5μg/mL的亚油酸、400nmol/L的睾酮、0.15mmol/L的维生素A、0.05mmol/L的叶酸、0.26mmol/L的葡聚糖、1nmol/L的精胺和25μmol/L的乙醇胺盐酸，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例5
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例1，和实施例3相比，该对比例5的区别在于：将本发明皮脂腺细胞培养基中牛胰岛素的浓度调整为10μg/mL、酪蛋白的浓度调整为0.1mg/mL、转铁蛋白的浓度调整为1.1μg/mL、亚油酸的浓度调整为0.5μg/mL、睾酮的浓度调整为300nmol/L、维生素A的浓度调整为0.1mmol/L、L-抗坏血酸的浓度调整为0.01mmol/L、聚赖氨酸的浓度调整为0.1mmol/L、腐胺的浓度调整为0.3nmol/L、2-巯基乙醇的浓度调整为20μmol/L。
该对比例皮脂腺细胞培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入10μg/mL的牛胰岛素、0.1mg/mL的酪蛋白、1.1μg/mL的转铁蛋白、0.5μg/mL的亚油酸、300nmol/L的睾酮、0.1mmol/L的维生素A、0.01mmol/L的L-抗坏血酸、0.1mmol/L的聚赖氨酸、0.3nmol/L的腐胺和20μmol/L的2-巯基乙醇，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例6
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例6，和实施例3相比，该对比例6的区别在于：将本发明皮脂腺细胞培养基中牛胰岛素的浓度调整为35μg/mL、酪蛋白的浓度调整为6mg/mL、转铁蛋白的浓度调整为6μg/mL、亚油酸的浓度调整为7μg/mL、睾酮的浓度调整为850nmol/L、维生素A的浓度调整为0.4mmol/L、L-抗坏血酸的浓度调整为0.4mmol/L、聚赖氨酸的浓度调整为0.3mmol/L、腐胺的浓度调整为3nmol/L、2-巯基乙醇的浓度调整为150μmol/L。
该对比例皮脂腺细胞培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，在以DMEM:Ham’F-12体积比为1:1的培养基中，加入35μg/mL的牛胰岛素、6mg/mL的酪蛋白、6μg/mL的转铁蛋白、7μg/mL的亚油酸、850nmol/L的睾酮、0.4mmol/L的维生素A、0.4mmol/L的L-抗坏血酸、0.3mmol/L的聚赖氨酸、3nmol/L的腐胺和150μmol/L的2-巯基乙醇，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
效果验证：
图1为采用实施例3制备的培养基培养P2代人皮脂腺细胞10X镜下状态图，由图1可以看出：本发明培养基培养的皮脂腺细胞铺板率较高，且生长形态良好，可用于常规培养及实验所需要。
图2为不同培养基培养不同代次人皮脂腺细胞的增值率结果图，由图2可以看出：本发明的三种培养基，可显著提高细胞培养率，且均在85%以上，远大于未使用本发明配方体系的培养基，通过进一步筛选本发明培养基中的组分及调整本发明培养基中各组分的浓度，本发明培养基的细胞增值率可达95%以上，说明本发明培养基优于未使用本发明配方体系的培养基，本发明培养基对皮脂腺细胞增殖有显著提升作用。
图3为不同培养基培养条件下人皮脂腺细胞内脂质合成蛋白表达量检测结果图，由图3可以看出：本发明的三种培养基，其平均相对表达量均在1.65以上，远大于未使用本发明配方体系的培养基，通过进一步筛选本发明培养基中的组分及调整本发明培养基中各组分的浓度，本发明培养基可显著提高细胞表达PLIN2蛋白，说明本发明培养基优于未使用本发明配方体系的培养基，本发明培养基对皮脂腺细胞体外分化有显著作用。
图4为不同培养基配制成冻存液后人皮脂腺细胞复苏成活率结果图，由图4可以看出：本发明的三种培养基，可显著提高细胞冻存后的成活率，其成活率均在90%以上，而且通过进一步筛选本发明培养基中的组分及调整本发明培养基中各组分的浓度，本发明培养基对人皮脂腺细胞复苏成活率的提高更显著。而未使用本发明配方体系的培养基，其成活率在50-70%范围内，说明本发明培养基优于未使用本发明配方体系的培养基，本发明培养基对皮脂腺细胞冻存后成活率有显著提升作用，本发明培养基更适合于后期培养和实验。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (10)

1.细胞培养基，其中，所述细胞培养基包含基础培养基、血清替代物、亚油酸、睾酮、维生素A、L-抗坏血酸、聚赖氨酸、腐胺和2-巯基乙醇。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述基础培养基包含DMEM和Ham’F-12，所述DMEM和Ham’F-12的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述血清替代物为白蛋白或酪蛋白、转铁蛋白和牛胰岛素的组合。
4.皮脂腺细胞培养基，其中，所述皮脂腺细胞培养基包含基础培养基、血清替代物、亚油酸、睾酮、维生素A、L-抗坏血酸、聚赖氨酸、腐胺和2-巯基乙醇。
5.根据权利要求4所述的皮脂腺细胞培养基，其中，所述基础培养基包含DMEM和Ham’F-12，所述DMEM和Ham’F-12的体积比为1:1。
6.根据权利要求4所述的皮脂腺细胞培养基，其中，所述血清替代物为白蛋白或酪蛋白、转铁蛋白和牛胰岛素的组合。
7.细胞培养试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求1-3所述的细胞培养基和培养细胞。
8.皮脂腺细胞培养试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求4-6所述的皮脂腺细胞培养基和培养细胞。
9.细胞培养方法，其中，所述方法包含使用权利要求1-3任一项所述的细胞培养基的步骤。
10.皮脂腺细胞培养方法，其中，所述方法包含使用权利要求4-6任一项所述的皮脂腺细胞培养基的步骤。
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