CN105247040A - 皮脂细胞培养和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供培养皮脂细胞的方法，分离的皮脂细胞群，及为筛选抑制或活化脂肪生成的化合物而使用培养的皮脂细胞的方法。

Description

皮脂细胞培养和使用方法

【技术领域】

本发明涉及培养皮脂细胞的方法，及使用培养的皮脂细胞筛选抑制或活化脂肪生成的化合物的方法。

【背景技术】

在人中，皮脂腺贯穿全部皮肤分布，及以最大丰度见于面部和头皮，及仅在手掌及脚底缺乏。皮脂腺是在毛囊中分泌油性物质(皮脂)而润滑动物的皮肤和毛发的显微腺[1]。它们随表皮发挥功能而阻止皮肤脱水，保护身体抵御感染及环境的物理，化学和热攻击。人皮脂的主要成分是甘油三酯和脂肪酸(57.5％)，蜡酯(26％)和角鲨烯(12％)[2]。皮脂的产生贯穿生命被调控，及随着年龄增长而显著地减少[3]。此相关于皮肤的增加的干燥和脆性。而且，几种人疾病，诸如寻常痤疮，特应性皮炎，皮脂溢性皮炎和原发性瘢痕性脱发被认为与皮脂腺的去调节相关[2，4，5]。

皮脂腺与毛囊和表皮有关键的内部相关性，由于皮脂细胞功能障碍导致毛囊结构的变性[5，6]和缺陷皮肤屏障。此在缺乏去饱和脂肪酸的酶的无皮脂突变小鼠中被证明。此突变体显示发育不全的皮脂腺和皮肤表面脂质特征的改变，其导致慢性炎性反应，脱发和真皮结瘢[6]。

原代人细胞的成功的生长常常在具有重要临床含义的人生物学的特定领域构成突破。组织干细胞诸如血和皮肤表皮的干细胞已成功地用于诊所十年[7，8]。尤其是，表皮细胞(角质形成细胞)可体外培养，和可有效操作而形成3维表皮[9，10]。此模型不仅作为治疗患严重的皮肤损伤的患者的工具，而且提供研究调控人表皮再生和分化的分子机理的基本手段。

尽管这些伴随其他类型的细胞的进展，尚无用于培养人原代皮脂细胞的成功的方法。在过去已自成年人面部皮肤和耳廓周区建立人皮脂腺细胞系[11-14]，但它们的用猿猴病毒-40大T抗原或HPV16/E6E7基因(其绕过p53和成视网膜细胞瘤蛋白介导的限制点)的永生化导致细胞转化，其限制了它们为分析它们的细胞周期和分化调节的使用。因而，对于培养人原代皮脂细胞的方法仍有需求。

【发明概述】

本公开提供培养原代皮脂细胞的方法，其包括在适合于培养皮脂细胞的细胞培养基中培养玻璃片之间所夹的皮脂腺经对于在所述皮脂腺上形成皮脂细胞足够的时间长度。方法可还包括自皮脂腺移出皮脂细胞，及在适合于培养皮脂细胞的培养基中，在经细胞外基质蛋白包被的玻璃上培养皮脂细胞。

用于培养原代皮脂细胞的本公开的方法还包括在包含基础培养基，表皮生长因子，霍乱毒素，腺嘌呤，胰岛素，氢化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有丝分裂剂的培养基中，在纤连蛋白包被的玻璃上培养原代皮脂细胞。

本公开的另一方面提供由本公开的方法获得的分离的培养的皮脂细胞群。

本公开的另外的方面提供鉴定调控脂肪生成的化合物，或测定测试化合物对脂肪生成的效应的方法，包括：(a)将测试化合物添加到由本公开的方法获得的培养的皮脂细胞群，及(b)测量测试化合物对皮脂细胞中脂质产生的效应。

本公开的这些和其他方面写入随附的权利要求中，及更详细描述于本公开的详述中。

【附图说明】

图1a～1c显示皮脂腺的照片和1d显示分离方法。

图2a～h显示脂质分析中涉及的基因表达的图。

图3a～3c显示皮脂腺的照片。

图4a～4f显示TGFβ信号传导对皮脂细胞分化的效应的图。

图5a～5d显示稳定地表达针对TGFβRII的shRNA的皮脂细胞中TGFβ信号传导的抑制的效应的照片。

图6显示人皮脂腺和毛囊的图。

图7a～7g显示人头皮，乳房，胸和面部组织中皮脂腺分化的标志物的表达的照片。

图8a～8c显示在用亚油酸处理之前及之后原代皮脂细胞和脂质含量的照片。

图9a和9b显示源于乳房或面部皮肤的皮脂细胞中脂肪酸去饱和酶2(FADS2)和PPARγ表达的图。

图10a和10b显示原代SSG3细胞中TGFβ信号传导的抑制。

【发明详述】

本公开提供不用转化，及使用无滋养层的培养系统而培养人原代皮脂细胞的方法。培养及成功地传代人原代皮脂细胞的新方法克服了上皮细胞培养领域中的主要障碍。

在本公开的方法的实践中，从自供体的皮肤样品切下皮脂腺，及培养足够的时间直到在腺上皮脂细胞形成。

皮脂腺可自皮肤样品由任何适合的过程切下。例如，皮肤样品可切为小块及用分散酶处理而使真皮与表皮分离。在分散酶处理之后，完整皮脂腺用显微手术仪器在解剖显微镜下分离。优选地，保留皮脂腺带的毛干和少量的组织，以保存腺周围的微环境。

本公开的方法中使用的皮肤样品可从皮肤含有皮脂腺的人身体的任何位置得到。已建立原代皮脂细胞培养物来源的头皮，乳房，胸及面部皮肤。优选地，皮脂细胞来自人小儿供体(自新生儿到小于约15岁的年龄的供体)。

然后将含有皮脂腺的外植体夹入玻璃片，诸如玻璃盖玻片之间，如显示于图1d。优选地，玻璃经细胞外基质蛋白包被。优选的细胞外基质蛋白是纤连蛋白，优选人纤连蛋白。

通过使用常规方法制备覆盖纤连蛋白的玻璃盖玻片(在本文也称为纤连蛋白包被的玻璃和类似术语)。包被中人纤连蛋白的量可改变，但是优选约10μg/ml。盖玻片可通过在盖玻片上添加纤连蛋白来包被纤连蛋白，并将盖玻片于室温放置1小时或于4℃过夜。盖玻片然后用1×PBS缓冲剂洗涤3次，于4℃存储不超过1周。

然后将夹入玻璃盖玻片之间的皮脂腺外植体在皮脂细胞培养基中培养，直到皮脂细胞生长出皮脂腺。在培养外植体约1～2周后，皮脂细胞自皮脂腺小叶周边变得明显。在含5％二氧化碳的37℃温育器中培养细胞。

皮脂细胞培养基是适合于培养皮脂细胞的细胞培养基，包括本领域已知的皮脂细胞培养基。

优选的皮脂细胞培养基包含基础培养基，DMEM/Ham’F-12(3:1)，其补充有表皮生长因子(EGF3ng/ml,AustralBiologicalsSanRamon,California)，霍乱毒素(1.2×10^-10M,SigmaChemicalCo,St.louis,Missouri)，腺嘌呤(24μg/ml,Sigma)，胰岛素(10ng/mlSigma)，氢化可的松(45.2ng/ml,Sigma)，胚胎牛血清(FBS)(2.5％Hyclone,Logan,Utah)，抗生素/抗有丝分裂剂(青霉素/链霉素)(100×,Invitrogen,Carlsbad,California)，如描述于[12]。

抗生素青霉素和链霉素的组合用于防止细胞培养物的细菌混杂，由于它们分别针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的有效作用。两性霉素B用于防止细胞培养物的真菌混杂，由于其抑制多细胞真菌和酵母。

皮脂细胞在皮脂腺外植体上形成之后，将皮脂细胞从外植体除去，及将分离的细胞在纤连蛋白-包被的玻璃，诸如玻璃盖玻片上培养。为了扩展细胞，使用磷酸盐缓冲液溶液(PBS)中0.05％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO,Carlsbad,California)分散细胞。将皮脂细胞放进用纤连蛋白10μg/ml包被的新的12mm板中的培养物中。细胞可传代达约10次，之后细胞会逐渐老化。在本文公开的方法中优选使用低代P2-P6细胞。当扩展皮脂细胞时，它们不需要放置在2个盖玻片之间。当细胞达到80～90％汇合时，它们可扩展。对于培养细胞而言，20～30％的密度可为优选的。在少传代之后，无需纤连蛋白-包被的盖玻片，皮脂细胞可在塑料上生长，但在纤连蛋白-包被的盖玻片上培养细胞可为优选的。

由此，本公开提供培养原代皮脂细胞的方法，其包括在适合于培养皮脂细胞的细胞培养基中培养玻璃片之间所夹的皮脂腺经对于在所述皮脂腺上形成皮脂细胞足够的时间长度。方法可还包括自皮脂腺移出皮脂细胞，及在适合于培养皮脂细胞的培养基中，在经细胞外基质蛋白包被的玻璃上培养皮脂细胞。

方法也可包括获得皮肤样品，及自皮肤样品移出皮脂腺的步骤，该步骤在培养皮脂腺之前实施。

公开也提供培养原代皮脂细胞的方法，其包括在包含基础培养基，表皮生长因子，霍乱毒素，腺嘌呤，胰岛素，氢化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有丝分裂剂的培养基中，在纤连蛋白包被的玻璃上培养原代皮脂细胞。

本公开的另一方面提供由本公开的方法获得的分离的皮脂细胞群。如本文所用，分离的皮脂细胞群指称在皮脂腺中自它们的天然位置移出的皮脂细胞。培养皮脂细胞群，及优选含有仅未分化的和/或分化的皮脂细胞。

皮脂细胞可通过使用实施例中公开的及下文讨论的标志物，本领域已知的以及其他标志物表征。源于头皮的原代培养物之一(被称为SSG3)已被广泛地表征。细胞表达皮脂腺分化的标志物，诸如PPARγ[26]和[23]，Blimp1[26]，c-Myc，角蛋白7和上皮膜抗原EMA/Muc1。培养的皮脂细胞可在亚油酸处理之后体外分化。在未处理的细胞中检测细胞溶质脂质滴，和由电子显微镜检容易检测在亚油酸处理之后具有更高电子密度的脂质滴的增加。在亚油酸代谢和皮脂产生中涉及的脂肪酸去饱和酶2(FADS2)，独特Δ6去饱和酶[29]，相比在人角质形成细胞NIKS，在转化的皮脂细胞SEB-1及SSG3细胞中以mRNA水平高度表达。FADS2主要在达到了脂质合成能力的分化的皮脂细胞中可检测，提供皮脂细胞中活性和分化的功能标志物[49]。与不显示任何显著变化的人角质形成细胞和SEB-1相反，由亚油酸处理诱导的培养的皮脂细胞的分化之后是PPARγ和FADS2表达的增加。那些结果还通过原代SSG3细胞中中性和极性脂质的分析确认。如所预期，在NIKS和SSG3细胞之间磷脂，细胞膜的主要组分的组成类似。但是，脂肪酸的组成有差异。分析2种特定酸，顺-6-十六碳烯酸和棕榈油酸(其分别由2种不同去饱和酶，Δ6/FADS2和Δ9合成)的组合物[31]。顺-6-十六碳烯酸主要体内见于皮脂，相比NIKS(0.79％)，仅在SSG3细胞(2.15％)中被检测。相反，相比SSG3细胞(1.2％)，NIKS中发现的主要脂肪酸是棕榈油酸(6.95％)。而且，在SSG3细胞中，Δ6/Δ9去饱和酶(％顺-6-十六碳烯酸/％棕榈油酸)比，成熟皮脂细胞的指标[32]大大高于NIKS角质形成细胞(分别178.9和11.42)，反映源于头皮的皮脂细胞的功能性。由本公开的方法产生的皮脂细胞群不仅表达皮脂产生和脂质合成中涉及的基因，它们也可产生皮脂-特征性脂质。

如在本文显示，转化生长因子β(TGFβ)信号传导在维持皮脂细胞处于未分化的状态中起到关键作用。TGFβ信号传导通路的活化下调特征性皮脂脂质的产生中涉及的基因(PPARγ和FADS2)的表达，但不影响人皮脂细胞的增殖。而且，通过敲落TGFβ受体II(TGFβRII)来阻遏TGFβ信号传导导致由尼罗红和油红O染色检测的那些细胞中增加的脂质产生。此在阻断TGFβ信号传导之后脂质产生的增加已由电子显微镜检确认。这些观察凸显此人皮脂腺生物学中之前未鉴定的通路的关联。

与之前永生化的皮脂细胞对比，原代SG细胞不表达角蛋白8。角蛋白8不在正常皮脂腺体内正常表达[25]，和在本文的结果指示，永生化的系的转化过程可能改变了几种根本性的细胞标志物的表达。而且，原代皮脂细胞和永生化的细胞显示对亚油酸的不同应答，及TGFβ1处理提示那些细胞的细胞性质基本上不同。

尽管不想被任何特定理论或作用模式束缚，目前认为，TGFβ信号传导通过降低FADS2和PPARγ的表达，由此通过TGFβRII-Smad2依赖性通路降低脂质蓄积来维持皮脂细胞处于未分化的状态(图5)。真皮和上皮细胞之间的分子串扰对于毛囊的起始和维持关键[37]。似乎最可能是类似的皮脂细胞和周围真皮组织之间的通信机理存在。在小鼠中，可考虑毛囊的内部根鞘释放的TGFβ1和皮脂细胞和毛囊上皮之间的双向的相互作用[17]。在真皮中，人成纤维细胞分泌TGFβ[38，39]，其可然后作用于角质形成细胞和皮脂细胞(图6)。也可为此串扰的部分的微环境中的另一组分是最近在小鼠中显示被凸起干细胞控制的立毛肌细胞[40]。紧邻皮脂腺，立毛肌可辅助皮脂释放到皮肤表面[41]。

由于皮脂产生的去调节而皮肤屏障的损伤，当与细菌定居和发炎关联时，可为人中严重的皮肤病情的成因。例如，与疮疱丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)的存在和发炎组合的过皮脂溢可导致寻常痤疮[2]，和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)可使特应性皮炎恶化[4]。皮脂细胞可在暴露于疮疱丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)或脂多糖之后产生抗微生物肽，诸如防御素-1和-2[42，43]，以防止细菌定居[44]及皮脂产生的上调[45]。研究揭示，TGFβ诱导内皮细胞中人β-防御素-2的表达[46]，和影响炎性应答[47]。用本文所述的培养皮脂细胞的新方法，现在可研究与微环境的不同相互作用。

本公开的再一方面提供鉴定调控脂肪生成的化合物，或测定测试化合物对脂肪生成的效应的方法。方法包括：(a)将测试化合物添加到由本文公开的方法获得的培养的皮脂细胞群，及(b)测量测试化合物对皮脂细胞中脂质产生的效应。原代皮脂细胞可用于测量已知是脂肪生成的抑制物或活化物的测试化合物的效应，及鉴定测试抑制或活化脂肪生成的化合物，或改变脂肪生成的抑制物或活化物的效应。测试化合物可为任何类型的化合物。脂肪生成的已知的抑制物或活化物的例包括5α-DHT(二氢睾酮)，5-DHEA(5-脱氢表雄酮)，乙酸环丙孕酮，雌二醇，地塞米松，异维甲酸和罗格列酮。适合的测试化合物包括雄激素，抗雄激素剂，雌激素，肾上腺皮质激素，类视黄醇，PPAR激动剂，5α-还原酶抑制物和TGFβ1配体。

对脂质产生的效应可，例如，根据实施例3中描述的方法，或本领域已知的任何用于检测脂质产生的其他方法测量。

将测试化合物加入根据本公开的方法获得的皮脂细胞群，及测定化合物对脂肪生成的效应。用于测定脂质产生的适合的标志物包括：在用亚油酸处理细胞之后分析FADS2和PPARγ的表达，定量中性脂质蓄积(代表性的皮脂脂质)和极性脂质(代表性的磷脂)的存在，如在实施例3中描述。如显示于图5D的FACS分析可用于定量中性脂质。

通过使用本公开的方法鉴定的化合物可以与本领域已知影响脂肪生成的化合物相同的方式用于处理皮肤病情。

本公开也提供鉴定调控皮脂细胞的增殖，皮脂细胞的分化，皮脂细胞的细胞周期，或皮脂细胞的存活的化合物的方法。方法包括：(a)将测试化合物添加到由本文公开的方法获得的培养的皮脂细胞群，及(b)测量测试化合物对皮脂细胞的增殖，皮脂细胞的分化，皮脂细胞的细胞周期，或皮脂细胞的存活的效应。原代皮脂细胞可用于测量已知调控皮脂细胞的增殖，分化，细胞周期或存活的测试化合物的效应，及鉴定调控皮脂细胞的增殖，皮脂细胞的分化，皮脂细胞的细胞周期，或皮脂细胞的存活的测试化合物。测试化合物可为任何类型的化合物。增殖之后可为溴脱氧尿苷(BrdU)和Ki67标记，免疫荧光和流式细胞术测定。细胞周期分析可通过使用7AAD和Brdu实施及由流式细胞术分析。存活之后可为细胞计数。

提供以下非限制性例，以进一步辅助本公开的理解。

【实施例】

【实施例1：培养皮脂细胞的方法】

从9个月～12岁龄人的男性和女性供体的头皮(SSG3)，面和乳房产生皮脂腺群。经Cincinnati儿童医院医疗中心的伦理学委员会(IRB)批准，收集作为手术废弃物的皮肤样品，提供关于供体的龄和性别的信息。

在将皮肤样品切割成小块之后，在解剖之前，将样品用1×分散酶(1×PBS中2mg/ml,Gibco/InvitrogenCat#17105-04；Carlsbad,California)于4℃处理过夜。分散酶用于自真皮分离表皮，及避免表皮细胞混杂。

在用1×分散酶处理皮肤(图1)之后，用显微手术仪器，在解剖显微镜下分离完整皮脂腺。保留毛干和少量的具有皮脂腺的组织，以保存腺周围的微环境。

为了模拟皮脂腺的微环境，将外植体夹入经人纤连蛋白(10μg/ml,Millipore,Billerica,Massachusetts)包被的玻璃盖玻片之间。

为了包被盖玻片，将10μg/ml的纤连蛋白添加到盖玻片，于室温1小时或于4℃过夜。然后将盖玻片用1×PBS洗涤3次，及于4℃存储不超过1周。

如[12]中所述将外植体培育于皮脂细胞培养基(DMEM/Ham’F-12(3:1)，表皮生长因子(EGF3ng/ml,AustralBiologicals,SanRamon,California)，霍乱毒素(1.2×10-10M,Sigma)，腺嘌呤(24μg/ml,Sigma)，胰岛素(10ng/mlSigma)，氢化可的松(45.2ng/ml,Sigma)，FBS(2.5％Hyclone,Logan,Utah)，抗生素/抗有丝分裂剂(100x,Invitrogen,Carlsbad,California))中。

在1～2周的培养生长之后，自腺小叶周边的细胞外生变得明显(图3)。移出外植体及在纤连蛋白-包被的盖玻片上培养分离的细胞。分离外生出外植体周边的细胞及在纤连蛋白-包被的盖玻片上培养。为了扩展细胞，使用磷酸盐缓冲液溶液(PBS)中的胰蛋白酶-EDTA(GIBCO,Carlsbad,California)0.05％分散细胞。然后将细胞在12mm板中放在经纤连蛋白10μg/ml包被的新板上培养。

【实施例2：培养的皮脂细胞的表征】

【方法】

【蛋白印迹】

将蛋白由电泳在10～12％丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝酸纤维素膜及使经历免疫印迹。将膜用5％脱脂乳或含有0.1％吐温-20的PBS中的5％BSA阻断1小时。通常以1/1,000的浓度使用第一抗体，和以5％脱脂乳中1/2,000使用HRP-偶联的第二抗体。免疫印迹通过使用标准ECL(Amersham,Pittsburgh,宾夕法尼亚)和LuminataTMcrescendo及classico(Millipore)显影。通过使用LI-COROdysseyCLx(LI-CORBiosciences,Lincoln,Nebraska)实施2-色免疫印迹检测。在Odyssey阻断缓冲剂(LI-COR)中阻断膜，和使用缀合到IRDye680LT和800CW的第二抗体(1/10,000；LI-COR)。通过使用Odyssey红外线成像系统(LI-COR)定量蛋白水平。

【反转录病毒感染】

为了消除SSG3细胞中的TGFβRII，使用来自CCHMC心脏学会慢-shRNA库核心的shRNA载体(shRNATGFβRII#197031和194992和shRNA对照)。人库购自Sigma-Aldrich(MISSIONshRNA；St.Louis,Missouri)。病毒载体在TranslationalCoreLaboratories，Cincinnati儿童医院研究基金会由病毒载体核心产生。在用慢病毒感染48h之前，使细胞在6孔板中生长至80％融合。用1pg/ml嘌罗霉素(Sigma)选择感染的细胞48h。选择后，在用5ng/mlTGFβ1活化24h之前，使TGFβRII敲落细胞在常规培养基中生长48h。

【组织学和免疫荧光】

将人组织在OCT化合物(Tissue-Tek,Sakura,Torrance,California)中冷冻未固定，用于冰冻切片。如之前描述实施免疫染色[48]。

【抗体】

以指示的稀释使用针对以下蛋白的第一抗体：PPARy(Santa-CruzBiotechnologyInc.,SantaCruz,CA,H-100，1/250用于免疫荧光,1/500用于蛋白印迹)，Blimp1(CellSignaling,Danvers,Massachusetts,1/500用于免疫荧光,1/1,000用于蛋白印迹)，纤连蛋白(Santa-CruzBiotechnologyInc.,SantaCruz,CA,EP51/150)，Muc1(Millipore,1/500)，cMyc(CellSignaling,1/800用于免疫荧光,1/1,000用于蛋白印迹)，TGFβRII(Santa-CruzBiotechnologyInc.,SantaCruz,CA,sc-2201/1,000)，p-Smad2(CellSignaling,1/100用于免疫荧光,1/1,000用于蛋白印迹)，Smad2/3(BDBiosciences,SanJose,CA,1/500)，a6整联蛋白(CD49f,BDBiosciences,SanJose,CA,1/100)，溴脱氧尿苷BrdU(Abcam,Cambridge,Massachusetts,1/500)，角蛋白8(此抗体由Dr.BruletandDr.Kemler开发,获自由Iowa大学维持的NICHDDevelopmentalStudiesHybridomaBank,1/1,000)，8-肌动蛋白(Sigma,1/2,000)，角蛋白7(CellSignaling,1/1,000)，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)用作细胞核的标志物(SigmaChemicalCo.,St.louis,MO,1/5,000)。第二抗体AlexaFluor488或555(分子Probe,Carlsbad,California)以1/1,000的稀释使用。荧光像用荧光显微镜AxiolmagerM1(Zeiss)获取，和图像用axioCamMRm照相机(Zeiss,Thornwood,纽约)获取。

【实时PCR】

通过使用RneasyMini试剂盒(Qiagen,Germantown,Maryland)分离总RNA，及用来产生cDNA(最大第1链cDNA合成试剂盒,Fermentas,Waltham,Massachusetts)。将反转录(RT)反应稀释至10ng/pl，并将1pl的各RT用于实时PCR。通过使用CFX96实时PCR系统，CFX管理员软件和SsoFastEvaGreen超混剂(Biorad,Hercules,California)实施实时PCR。全部反应以一式三份运行，及通过使用AACT方法分析，对GAPDH标准化相对表达。

使用的引物：

GAPDH-F：ACATCGCTCAGACACCATG(SEQIDNO:1)，

GAPDH-R：TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG(SEQIDNO:2)

PPARγ-F：GAGCCCAAGTTTGAGTTTGC(SEQIDNO:3)，

PPARγ-R：GCAGGTTGTCTTGAATGTCTTC(SEQIDNO:4)，

FADS2-F：TGTCTACAGAAAACCCAAGTGG(SEQIDNO:5)，

FADS2-R：TGTGGAAGATGTTAGGCTTGG(SEQIDNO:6)，

TGFβRII-F：CTGTGGATGACCTGGCTAAC(SEQIDNO:7)，以及

TGFβRII-R：CATTTCCCAGAGCACCAGAG(SEQIDNO:8)。

【脂肪生成测定】

为尼罗红染色，将细胞或OCT切片在4％甲醛中于室温固定10分钟。在在1×PBS中洗涤3次之后，在0.15MNaCI中于室温实施15分钟用0.1pg/ml的尼罗红(Sigma)的染色。为油红0染色，将细胞在10％福尔马林中固定15分钟，用水洗涤10分钟和用60％异丙醇洗涤，之后用油红0(在60％异丙醇中0.7％)染色45分钟。将细胞用60％异丙醇漂洗，和将核用苏木素染色。为了引发皮脂细胞体外分化，将亚油酸(Sigma,0.1mM)直接添加到皮脂细胞培养基。为了制备细胞用于脂质提取，使2～3千万的细胞沉淀，用1×PBS洗涤，和将脂质于-80℃在氩下避光保存，直到分析。通过使用带有SPE盒的Agilent5973N气相色谱仪/质谱仪测定源于头皮的人皮脂细胞中脂质的定性和定量组成(固相提取)，及由SynelviaS.A.S(Labege,法国)实施。

【由FACS的尼罗红分析】

在6-孔板中培养细胞至80％汇合，及如之前所述，用表达shRNA的慢病毒感染。在嘌罗霉素选择48h之后，将细胞在1×PBS中洗涤，及用含或不含亚油酸(0.1mM)的工作培养基处理24h。对细胞进行胰蛋白酶处理，用1×PBS洗涤一次，和将中性脂质用荧光染料尼罗红(PBS中1pg/ml)标记。将每样品10,000细胞通过使用装备蓝激光(488nm激发)的FACSCantoI(BDBiosciences)来分析。

【电子显微镜检】

使细胞在皮脂细胞培养基中生长至80％融合，及用0.175M二甲胂酸钠缓冲液漂洗一次。将细胞在3％戊二醛/0.175M二甲胂酸缓冲液中于4℃固定1小时。将皿用0.175M二甲胂酸钠缓冲液洗涤两次。使细胞在1％四氧化锇/二甲胂酸缓冲液中后于4℃固定1小时，之后用0.175M二甲胂酸钠缓冲液洗涤3次。在用1.5ml最终洗涤之后，刮细胞，及以10K离心5min。然后使细胞沉淀重悬浮于1ml1％琼脂糖(IX型超低胶凝温度,Sigma)于4℃过夜。然后将样品通过分级的系列的醇处理，浸润及嵌入LX-112树脂(LaddResearch，Williston，Vermont。于60℃聚合3天之后，使用Reichert-JungUltracutE切片机切割超薄切片(100nm)，及在2％水性乙酸双氧铀和Reynolds柠檬酸铅中复染。用装备数字照相机(AMT2kx2KtemCCD)的透射电子显微镜(HitachiH-6750)获取图像。

【统计学】

数据表达为平均值+/-SD。2种细胞类型之间的比较通过使用未配对的2-尾的Student氏t检验实施。当比较处理对相同的细胞类型的效应时，使用配对的2-尾的Student氏t检验。P<0.05被认为显著。

【结果】

【A.1.自小儿供体建立的原代皮脂细胞表达皮脂腺分化的标志物】

为了测定调控原代人皮脂细胞生长和分化的通路，分离皮脂细胞，及通过体外模拟皮脂腺的微环境而使增长。将自9个月～12岁的供体的皮肤外植体微解剖，及将皮脂腺放置在纤连蛋白-包被的玻璃盖玻片之间，以再现体内环境。使用此技术，原代皮脂细胞培养物源于代表4种皮肤组织类型的8个供体：5个头皮，1个乳房，1个胸及1个面样品。对第2代和随后代(3～5)不使用细胞外基质或支持照射的成纤维细胞而实施全部实验。

为了确证细胞培养物的确是皮脂细胞，检查已知的皮脂细胞标志物的表达。免疫荧光染色及蛋白印迹展示，那些细胞均匀表达过氧化物酶体增殖子-活化的受体γ(PPARγ)，在分化皮脂细胞中体外和体内表达[23]，但不在人角质形成细胞(NIKS)中表达[24]的脂肪形成性转录因子。SSG3细胞表达此皮脂细胞标志物。实时PCR确认，原代SSG3与永生化的皮脂细胞系SEB-1表达类似水平的PPARγ[12]。但是，与SEB-1相反，SSG3细胞不表达角蛋白8，一般不在皮脂腺中体内表达[25]。此外，SSG3细胞表达皮脂细胞的其他标志物，诸如Blimp1和上皮膜抗原EMA/Muc1。与新近报道一致[13，26]，在SSG3细胞所来源的人头皮切片中，Blimp1在皮脂腺的末端分化的细胞及毛囊的内部根鞘中表达。源于头皮的皮脂细胞中显示的全部结果已被确认与乳房和面部来源的-皮脂细胞类似。唯一的例外是在相比头皮和乳房，源于面部的皮脂细胞的蛋白裂解物中检测到角蛋白7(未分化的皮脂细胞的标志物)以更高表达的表达。角蛋白7表达的差异可依赖于细胞所来源的位置。自实施例1的建立的原代人皮脂细胞功能表达典型皮脂细胞标志物及表示用于研究皮脂细胞的良好模型。

【A.2.原代皮脂细胞可体外分化】

为了确认原代人皮脂细胞在体外有功能，分析它们分化及产生人-特异性脂质的能力。亲脂性染料尼罗红可用于染色末端分化皮脂细胞[27](图8a)。亚油酸是用于生物合成一些前列腺素和其他多不饱和的脂肪酸及引发皮脂细胞体外分化的必要的多不饱和的脂肪酸[28]。我们因此在2天的生理学水平的亚油酸处理之后由尼罗红染色剂分析了细胞脂质分布，及显示SSG3的确产生脂质(图8b)。而且，在未处理的细胞中由电子显微镜检检测细胞溶质脂滴(图8c)，以及在亚油酸处理之后具有更高电子密度的脂滴增加(图8c")。人具有涉及亚油酸代谢和皮脂产生的独特的Δ6去饱和酶/FADS2基因[29]。FADS2主要在达到了脂质合成能力的分化的皮脂细胞中可检测，在皮脂细胞中提供活性和分化的功能性标志物。已根据本公开发现，相比SEB-1，FADS2在SSG3细胞中高度表达(图2c)。这些结果展示，SSG3细胞呈现皮脂细胞分化中涉及的细胞的基因表达模式特征。而且，已显示，在SSG3细胞中由亚油酸处理诱导的分化之后是SSG3中PPARγ的增加(与不显示任何显著变化的SEB-1相反)(图2d)和FADS2的增加(图2e)。

那些数据还由原代SSG3细胞中脂质的分析确认。已发现脂肪酸，尤其是主要见于体内皮脂中的顺-6-十六碳烯酸[29]，及棕榈油酸的组成差异。它们分别由2种去饱和酶，A6/FADS2和A9合成[31](图2f)。代替A9而A6位置的去饱和特异于人皮脂[31]。相比NIKS(0.795％)，顺-6-十六碳烯酸仅在SSG3细胞中被检测(2.150％)。相反，相比SSG3细胞(1.202％)，棕榈油酸主要见于NIKS(6.959％)(图2g和h)。接下来，为了测定SSG3细胞的功能性，定量作为皮脂细胞成熟及关联的代谢过程的指标的16/19去饱和酶的比[32]。发现SSG3细胞中的此比大大优于NIKS(分别为178.868和11.424)，反映源于头皮的皮脂细胞的功能性(图2g)。脂质分析也揭示，仅具有偶数碳链的脂肪酸存在于SSG3中，如在体内皮脂中(图2h)。可得出，已根据本公开建立的原代人皮脂细胞培养物不仅表达皮脂产生和脂质合成中涉及的基因，而且也可产生皮脂-特异性脂质。接下来研究在原代人皮脂细胞中调控分化和脂质产生的机理。

【B.1.TGFβ信号传导在皮脂腺中体内和体外有活性】

研究提示TGFβ作为人皮脂细胞调节的潜在候选体[16]。TGFβ配体结合于由TGFβR1和TGFβRII组成的双二聚受体复合物而磷酸化及活化致使它们转位进核及调控TGFβ-响应基因的结合受体的Smad(Smad2/3)转录因子[33]。TGFβRII对于Smad2通路的活化必要[20，34]。因此，分析由作为TGFβ活化的指标的磷酸化的Smad2/3的存在而TGFβRII的存在和体内和体外通路的功能性。免疫荧光显示，TGFβRII表达贯穿皮脂腺，除了存在于腺中央的分化的，脂质填充的皮脂细胞之外(图3a和3a')。而且，通过检测核磷酸化的Smad2在腺的周边及中央表达，但不在末端分化的皮脂细胞中表达来确定，TGFβ通路在腺中体内有活性(图3b和3b')。在体外，与SEB-1和NIKS类似，当用外源地重组的TGFβ1刺激时，SSG3皮脂细胞活化Smad2(图3c)。

【B.2.TGFβ信号传导对皮脂细胞分化基因的影响】

接下来通过检查用TGFβ1处理后脂肪生成中涉及的基因的表达来探查TGFβ信号传导对皮脂细胞分化的效应。如显示于图3a和b，当细胞用TGFβ1刺激24h时，相比SEB-1，FADS2和PPARγ的mRNA表达在SSG3细胞中显著地降低，提示TGFβ1可防止细胞分化，以及在源于乳房和面部的原代皮脂细胞中显著地降低(图9)。为了测试是否那些效应是TGFβRII-Smad2依赖性的，使用shRNA敲落TGFβ受体II，由此有效抑制Smad2磷酸化[20]。

通过使用2种独立TGFβRIIshRNA获得类似结果：TGFβRII表达在SSG3细胞中减少(图4c)。在TGFβ活化之后，相比对照，磷酸化的-Smad2也在shRNA表达细胞中降低(图4d)，如预期。也用TGFβ处理24h的对照细胞中检测到TGFβRII的减小(图4c)，反映受体的可能的降解[35]。显示当将细胞用TGFβ处理时，减少的TGFβRII表达抑制SSG3细胞显著地减小FADS2和PPARγ基因表达的能力(图4e和f)。

接下来测定的是如何通过分析具有减少的TGFβRII的SSG3shRNA表达细胞中细胞质脂质的存在来抑制TGFβ信号传导在细胞水平影响SSG3细胞的功能性。相比表达shRNA对照的SSG3细胞，TGFβRII耗尽与用尼罗红，油红O正染色的脂质包含体的增加相关，及由电子显微镜检鉴定(图5b和c和图10)。用尼罗红标记的脂滴已也由流式细胞术分析(图5d)。类似于用亚油酸处理的细胞，相比shRNA对照，已在具有减少的TGFβRII的SSG3shRNA表达细胞中检测到细胞的荧光和粒度(代表脂质滴)的增加。

然而也已发现，TGFβ1处理对于shRNA细胞中的脂质产生无影响(图5b)；其诱导用非靶向shRNA对照感染的SSG3中脂质包含体的减少(图5a)。这些结果提示，以转录水平抑制FADS2和PPARγ经规范Smad信号转导介导。总之，数据确定TGFβ信号传导为从事特征性皮脂脂质的产生中涉及的基因的皮脂细胞分化的抑制(图6)。

【C.讨论】

几路证据推荐转化生长因子β(TGFβ)为人皮脂细胞调节的潜在候选体[15，16]，但原代人培养物的缺乏损阻碍TGFβ信号传导控制皮脂腺分化的分子机理的深入调查。TGFβ通路是普遍存在的，及涉及多种细胞和组织类型的生长和分化的控制。TGFβ受体I(TGFβRI)和TGFβ受体II(TGFβRII)，TGFβ信号传导通路的2种主要受体，据报道在小鼠皮脂腺中表达[17，18]。在人和小鼠上皮细胞系中，TGFβ发挥至少部分经c-Myc表达的下调介导的增殖的有力的抑制物的作用[19，20]。有趣地，小鼠中c-Myc过表达由于毛发分化过程中皮脂细胞分化的活化而诱导皮脂腺尺寸的增加[13，21]。而且，表皮Smad4(TGFβ信号传导的常见的介质)的破坏通过c-Myc上调而导致滤泡间表皮，毛囊和皮脂腺的增生[22]。

为了测定TGFβ信号传导对皮脂细胞分化的效应，研究了TGFβ配体对本公开的新原代人皮脂细胞的效应。发现显示，TGFβ信号传导通路的活化下调特征性皮脂脂质的产生中涉及的基因的表达。发现，对于Smad2通路的活化必要的TGFβRII基因限制原代人皮脂细胞中的脂质产生。这些发现一起显示未分化的状态的人皮脂细胞的维持中TGFβ的作用，及凸显人皮脂腺生物学中此通路的关联。

【D.图的讨论】

图1.纤连蛋白模拟微环境及允许皮脂细胞体外生长。(a)在显微解剖之前的头皮样品(9月龄)。(b)分离的皮脂腺。(c)对人头皮组织的OCT切片的免疫荧光染色显示皮脂腺周围的细胞外基质中纤连蛋白(红色，在(c)中由白色箭标显示)表达。α6-整联蛋白(绿色,在(c’)中由白色箭标显示)标记腺的基底层。放大框住的区及显示于(c’)。比例尺，20μm(c,c’)。(d)分离及培养皮脂细胞的新方法的示意图。头皮外植体放置在用纤连蛋白包被的盖玻片之间。皮脂腺细胞SSG3生长出外植体(100×放大率)。缩写：SG，皮脂腺，HF，毛囊，FN，纤连蛋白。

图2.分离自头皮皮脂腺的原代皮脂细胞可体外分化及产生皮脂-特征性脂质。(a)与SEB-1成对比，SSG3表达PPARγ，但不表达角蛋白8。(b～c)实时PCR显示，PPARγ在SEB-1和SSG3中同等表达，然而相比SEB-1，FADS2在SSG3细胞中更高度表达。将来自源于头皮外植体的第3代SEB-1和SSG3的RNA对GAPDH表达标准化。显示的数据表示各以一式三份实施的3次独立实验(平均值+/-SD,n＝3)。*p-值<0.05(未配对的2-尾的Student氏t检验)。(d)将细胞用或不用0.1mM的亚油酸(LA)培养48h。通过LA活化的分化之后是SSG3细胞中PPARγ表达的增加。*p-值<0.05(配对的2-尾的Student氏t检验)。(e)24h和48h的LA处理诱导SSG3细胞中FADS2表达的显著增加。*p-值<0.05(配对的2-尾的Student氏t检验)。(f)Δ6去饱和酶/FADS2催化棕榈酸向顺-6-十六碳烯酸的转化。(g)脂质分析显示NIKS和SSG3沉淀中Δ9和Δ6的百分率和Δ6/Δ9比。(h)顺-6-十六碳烯酸(*)可在SSG3中检测为体内皮脂，然而在NIKS中，棕榈油酸(**)是检测的丰富的脂质。

图3.TGFβ信号传导是在皮脂腺中体内和体外有活性的。将皮脂腺以水平面切片(图中的红线)。(a)用TGFβRII染色的人头皮组织的OCT切片(红色,由白色箭标显示)显示皮脂腺全体中受体的表达，除了中央处分化的细胞之外。放大框住的区及显示于(a’)。(b)TGFβ通路是体内有活性的，如通过核磷酸化的Smad2的表达表示(红色,由白色箭标显示)。α6：α6-整联蛋白将皮脂腺的基底层染成绿色，由白色箭标显示。比例尺，50μm(a)，20μm(a’,b,b’)。缩写：Epi，表皮；HF，毛囊；SG，皮脂腺。(c)指示的皮脂细胞培养用5ng/ml的TGFβ1配体处理1小时，和由免疫印迹检查全细胞提取物，以测定TGFβ通路的活化。

图4.TGFβ信号传导通过TGFβRII-Smad2依赖性通路引发脂原性基因降低的表达。(a,b)将SSG3细胞用5ng/ml的TGFβ1处理24小时，及用于qPCR。将数据对GAPDH表达标准化，和通过使用未处理的细胞作为参照测定相对表达。在SSG3细胞中，FADS2和PPARγ表达被发现响应TGFβ1处理而显著地下调。(c)表达TGFβRIIshRNA1及对照shRNA(Ctr)的SSG3细胞中的TGFβRII表达显示敲落效率。(d)。免疫印迹确认用TGFβ15ng/ml刺激1h的shRNA表达细胞中p-Smad2活性的减小。以下显示的免疫印迹值，表示用ImageJ，使用来自各条件的比p-Smad2/Smad2/3定量的相对密度。(e,f)。在转录水平的FADS2和PPARγ减小经规范Smad信号转导介导。将表达对未处理的对照(Ctr)标准化。在TGFβRII-缺陷型SSG3细胞中未检测到在用TGFβ1处理之后对照SSG3细胞中PPARγ和FADS2基因的显著减小。*p-值<0.05，**p-值<0.001(配对的2-尾的Student氏t检验)。

图5.TGFβ信号传导的抑制诱导原代SSG3细胞中的脂肪生成。(a,b)稳定地表达针于TGFβRII的shRNA的SSG3细胞由尼罗红(比例尺,20μm)和油红O染色(比例尺,10μm)显示明视场像上脂质滴的蓄积(比例尺,20μm)。白色箭标显示相比对照(Ctr)，shRNA表达细胞中多个脂质滴的存在。24h的TGFβ1(5ng/ml)处理在对照细胞中减小脂质产生的基础水平，但不影响表达TGFβRIIshRNA的细胞，主要由油红O显示。(c)显示相比对照，表达shRNA的SSG3细胞中脂质滴的增加(由白色箭标表示)的电子显微镜检。比例尺，2μm。LD，脂质滴。N，核。(d)用尼罗红标记的表达shRNA的SSG3细胞的流式细胞术。FL-1测量中性脂质，和SSC反映细胞粒度。已为各条件获取10,000个细胞。作为阳性对照，由0.1mM亚油酸(LA)处理24h的SSG3显示表示脂质滴的荧光和粒度的增加。注意相比表达shRNA对照的细胞，表达TGFβRIIshRNA的细胞中荧光增加和粒度增加。与2种不同的表达TGFβRIIshRNA的细胞类似，获得类似结果(见图10)。

图6.人皮脂细胞分化中TGFβ信号传导的作用的模型。皮脂腺由在腺外部的增殖皮脂细胞及分化的皮脂细胞组成，当它们达到了它们的完全成熟阶段时在腺的中央填充脂质。皮脂腺周围的细胞环境是多样的，包括真皮成纤维细胞，脂肪细胞，其可为TGFβ配体的源，以通过降低脂质合成中涉及的基因的表达来维持未分化的状态的皮脂细胞。APM：立毛肌，IRS：内部根鞘，ORS：外部根鞘。

图7.原代人皮脂细胞源于头皮，乳房，胸及面部组织表达典型皮脂细胞标志物。(a)头皮样品的苏木素和伊红染色。比例尺，50μm。(b)免疫荧光染色显示，PPARγ(红色,在(b’)中由白色箭标显示)在腺的用α6-整联蛋白染色的周边(绿色,由白色箭标显示)及中央，在来自头皮外植体的人皮脂腺中表达。比例尺，50μm。放大框住的区及显示于(b’)。(c)Blimp1(红色,由白色箭标显示)表达通常见于皮脂腺的分化的细胞及毛囊的内部根鞘。α6-整联蛋白(绿色,由白色箭标显示)标记腺的基底层。(d)角蛋白7(红色,由白色箭标显示)表达依赖于腺的位置(头皮,乳房和胸)改变，如由免疫荧光显示。(e～g)由2-色免疫印迹，源于头皮，乳房，胸及面部外植体的皮脂细胞表达皮脂细胞标志物(Blimp1,c-Myc,Muc1,PPARγ和K7)。SSG4表示源于4岁-头皮样品的原代皮脂细胞。比例尺，50μm(b)，50μm(c和d)。缩写：SG，皮脂腺；HF，毛囊；α6，α6-整联蛋白；K7，角蛋白7。

图8.原代皮脂细胞可体外分化。(a)显示脂质蓄积的证据的人头皮切片(尼罗红染色)。比例尺，50μm(b)将源于头皮外植体的SSG3细胞用0.1mM亚油酸(LA)处理48h，以分化细胞，及用尼罗红染色，以检测脂质。在未处理的及亚油酸-处理的条件，以相同的曝光时间获取像。明视场图像显示在亚油酸处理之后细胞质脂质滴的蓄积，如由黑色箭标表示。比例尺，50μm(c)显示未处理的源于头皮外植体的皮脂细胞SSG3中的细胞质脂质滴的电子显微镜检。比例尺，20μm。放大框住的区及显示于(c’)比例尺，500nm。(c”)在亚油酸处理之后，在SSG3细胞中检测到增加的高-电子密度脂质滴，及放大于c”’。c”和c”’的比例尺是2μm。缩写：HF，毛囊。SG，皮脂腺。LD，脂质滴。N，核。Mi，线粒体。RER，粗糙内质网。SER，光滑内质网。

图9.TGFβ信号传导引发源于乳房和面部的皮脂细胞中脂原性基因的降低的表达。从源于未处理的或用5ng/ml的TGFβ1处理24h的乳房和面部的皮脂细胞分离RNA，及用于实时PCR。实施2次实验，及全部qPCR反应以一式三份实施。为各细胞群对GAPDH表达标准化数据，和通过使用未处理的细胞作为参考点确定相对表达的变化。(a)FADS2及(b)PPARγ表达被发现响应TGFβ1处理而显著地降低，如显示于源于头皮的皮脂细胞(图4a～b)，提示TGFβ的抑制性效应不依赖于皮肤组织类型。*p-值<0.05(配对的2-尾的Student氏t检验)。

图10.TGFβ信号传导的抑制诱导原代SSG3细胞中的脂肪生成。(a)相比用shRNA对照感染的细胞，稳定地表达针于TGFβRII的shRNA(shRNA1)的SSG3细胞显示明视场像上脂质滴的蓄积(白色箭标)及由尼罗红染色(以绿色显示)。比例尺，20μm。(b～c)，相比对照，显示表达针对TGFβRII的shRNA(shRNA2)的SSG3细胞中脂质滴的增加(由白色箭标表示)的电子显微镜检。在表达shRNA的SSG3细胞中检测指示脂质合成的髓磷脂图。缩写：N，核。LD，脂质滴。b和c的比例尺是2μm和c’的比例尺是500nm。

【实施例3：化合物的筛选】

将原代皮脂细胞用于测试已知为脂肪生成的抑制物或活化物的化合物，及鉴定测试抑制或活化脂肪生成，或变化或改变脂肪生成的抑制物或活化物的效应的化合物。

已知的脂肪生成的抑制物或活化物：

雄激素：皮脂产生在雄激素控制下，及毛囊皮脂腺单元异常应答雄激素呈现与痤疮的发病机制相关

5α-还原酶抑制物(用于处理雄激素性脱发)：减少脂肪生成

5α-DHT(二-氢睾酮)(雄激素体内刺激皮脂腺的活性)：增加增殖，增加脂肪生成。

DHEA(5-脱氢表雄酮)(其为肾上腺的主要分泌甾体产物,作用于雄激素受体,对皮脂腺活性的雄激素性影响)：增加脂肪生成

乙酸环丙孕酮(抗-雄激素)：降低脂肪生成

雌激素：雌二醇：降低脂肪生成

肾上腺皮质激素：地塞米松：降低脂肪生成

类视黄醇：异维甲酸(13-顺式视黄酸)：对皮脂细胞的抗-增殖效应，细胞周期停滞，凋亡效应

PPAR激动剂：罗格列酮：降低脂肪生成

靶	参考名称
		雄激素代谢	5a-还原酶抑制物
雄激素	DHT
			DHEA
抗雄激素	乙酸环丙孕酮
		雌激素	雌二醇
肾上腺皮质激素	地塞米松
		类视黄醇	异维甲酸
PPAR激动剂	罗格列酮
		TGFβ通路	TGFβ1配体

可测试TGFβ1配体(10ng/ml)，及应模拟使用针对TGFβRII的shRNA的结果，在TGFβ抑制之后脂质产生增加。

材料和方法：对原代SSG3细胞进行实验，其在实施例1和2中描述。经及不经用亚油酸0.1mM诱导48h，对原代SSG3细胞进行实验，如在实施例2中描述。待在2种处理时间，24hrs和48hrs亚油酸后处理之后测试3种不同浓度的各活性化合物。当添加活性化合物时停止亚油酸处理。

处理后，由2种方法检定脂质产生的效应。在第1方法中，待提取mRNA及待实施实时PCR，以分析在SSG3中显示在48h的亚油酸处理之后增加的FADS2和PPARγ的表达。在第2方法中，皮脂细胞待用尼罗红染色。变化待通过使用FACS分析定量。对应荧光待以2种不同波长(564nm和604nm)测量，其会允许中性脂质蓄积(代表性的皮脂脂质)和极性脂质(代表性的磷脂)存在的定量。定量在具有用于激发其的黄-绿激光的机器中由使用默认滤光器的荧光活化的细胞分选(FACS)来进行。

作为对照，SSG3待用TGFβ1处理24h，及应检测尼罗红表达的减小。实验会以一式三份进行，以获得显著数据。

通过使用配对的2-尾的Student氏t检验实施2组(未处理的及处理的)之间的比较。p值<0.05会被认为是显著的。

本公开的例示实施方式包括：

实施方式1.培养原代皮脂细胞的方法，其包括在适合于培养皮脂细胞的细胞培养基中培养玻璃片之间所夹的皮脂腺经对于在所述皮脂腺上形成皮脂细胞足够的时间长度。

实施方式2.实施方式1的方法，其中所述玻璃片经细胞外基质蛋白包被。

实施方式3.实施方式1或2的方法，其中所述细胞外基质蛋白是纤连蛋白。

实施方式4.实施方式1～3之任一项的方法，其中所述皮脂腺来自人小儿供体。

实施方式5.实施方式1～4之任一项的方法，其还包括，在培养皮脂腺之前，获得皮肤样品，及自皮肤样品移出皮脂腺。

实施方式6.实施方式1～5之任一项的方法，其中所述皮肤样品来自人小儿供体。

实施方式7.实施方式1～6之任一项的方法，其中所述细胞培养基包含基础培养基，表皮生长因子，霍乱毒素，腺嘌呤，胰岛素，氢化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有丝分裂剂。

实施方式8.实施方式1～7之任一项的方法，其还包括自皮脂腺移出皮脂细胞，及在适合于培养皮脂细胞的培养基中，在经细胞外基质蛋白包被的玻璃上培养皮脂细胞。

实施方式9.实施方式1～8之任一项的方法，其中所述培养基包含基础培养基，表皮生长因子，霍乱毒素，腺嘌呤，胰岛素，氢化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有丝分裂剂。

实施方式10.实施方式1～9之任一项的方法，其中所述细胞外基质蛋白是纤连蛋白。

实施方式11.培养原代皮脂细胞的方法，其包括在包含基础培养基，表皮生长因子，霍乱毒素，腺嘌呤，胰岛素，氢化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有丝分裂剂的培养基中，在纤连蛋白包被的玻璃上培养原代皮脂细胞。

实施方式12.实施方式11的方法，其中所述原代皮脂细胞源于人小儿供体。

实施方式13.分离的培养的皮脂细胞群，其由权利要求1～13之任一项的方法获得。

实施方式14.鉴定调控脂肪生成的化合物的方法，其包括：(a)将测试化合物添加到实施方式13的培养的皮脂细胞群，及(b)测量测试化合物对皮脂细胞中脂质产生的效应。

实施方式15.实施方式14的方法，其中在添加测试化合物之前，将培养的皮脂细胞群的部分用亚油酸诱导。

实施方式16.实施方式14或15的方法，其中测量测试化合物的效应包括测量FADS2或PPARγ，或二者的表达。

本文所用的术语“包含(comprising)”(及其语法变异)用于包括“具有(having)”或“包括(including)”的意思，及不排除“仅由…组成(consistingonlyof)”的意思。本文所用的术语“a”，“an”和“the”理解为包括复数个以及单数，除非另外指示。

上述描述例证及描述公开。此外，公开仅显示及描述优选的实施方式，但如上所述，需知，其能在各种其他组合，修饰和环境中使用，和能进行在本发明概念的范围之内的变化或修饰，如在本文表达，与以上教导和/或关联领域的技能或知识相当。本文以上所述的实施方式还旨在解释由申请人已知的最佳模式，及致使其他本领域技术人员利用该，或其他，实施方式中的公开及具有由特定应用或其使用需要的各种修饰。因此，说明书未旨在限制本发明到本文公开的形式。而且，随附的权利要求旨在被解释为包括替代性的实施方式。

各权利要求定义独立的发明，侵权目的被认识为包括与权利要求中特定的各种元件或限制的相当体。

此说明书中引用的全部出版物和专利申请通过引用在本文合并，及为任何和全部目的，犹如各个体出版物或专利申请被特别和个别指定为通过引用合并。当本公开和通过引用在本文合并的任何出版物或专利申请之间的不一致性发生时，以本公开为准。

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Claims (20)

1.培养原代皮脂细胞的方法，其包括在适合于培养皮脂细胞的细胞培养基中培养玻璃片之间所夹的皮脂腺经对于在所述皮脂腺上形成皮脂细胞足够的时间长度。

2.权利要求1的方法，其中所述玻璃片经细胞外基质蛋白包被。

3.权利要求2的方法，其中所述细胞外基质蛋白是纤连蛋白。

4.权利要求1的方法，其中所述皮脂腺来自人小儿供体。

5.权利要求1的方法，其还包括，在培养皮脂腺之前，获得皮肤样品，及自皮肤样品移出皮脂腺。

6.权利要求5的方法，其中所述皮肤样品来自人小儿供体。

7.权利要求1的方法，其中所述细胞培养基包含基础培养基，表皮生长因子，霍乱毒素，腺嘌呤，胰岛素，氢化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有丝分裂剂。

8.权利要求1的方法，其还包括：

自皮脂腺移出皮脂细胞，及

在适合于培养皮脂细胞的培养基中，在经细胞外基质蛋白包被的玻璃上培养皮脂细胞。

9.权利要求8的方法，其中所述培养基包含基础培养基，表皮生长因子，霍乱毒素，腺嘌呤，胰岛素，氢化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有丝分裂剂。

10.权利要求8的方法，其中所述细胞外基质蛋白是纤连蛋白。

11.培养原代皮脂细胞的方法，其包括在包含基础培养基，表皮生长因子，霍乱毒素，腺嘌呤，胰岛素，氢化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有丝分裂剂的培养基中，在纤连蛋白包被的玻璃上培养原代皮脂细胞。

12.权利要求11的方法，其中所述原代皮脂细胞源于人小儿供体。

13.分离的培养的皮脂细胞群，其由权利要求1的方法获得。

14.分离的培养的皮脂细胞群，其由权利要求11的方法获得。

15.鉴定调控脂肪生成的化合物的方法，其包括：

(a)将测试化合物添加到权利要求13的培养的皮脂细胞群，及

(b)测量测试化合物对皮脂细胞中脂质产生的效应。

16.权利要求15的方法，其中在添加测试化合物之前，将培养的皮脂细胞群的部分用亚油酸诱导。

17.权利要求15的方法，其中测量测试化合物的效应包括测量FADS2或PPARγ，或二者的表达。

18.鉴定调控脂肪生成的化合物的方法，其包括：

(a)将测试化合物添加到权利要求14的培养的皮脂细胞群，及

(b)测量测试化合物对皮脂细胞中脂质产生的效应。

19.权利要求18的方法，其中在添加测试化合物之前，将培养的皮脂细胞群的部分用亚油酸诱导。

20.权利要求18的方法，其中测量测试化合物的效应包括测量FADS2或PPARγ，或二者的表达。