CN111088216A - 一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法 - Google Patents

一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其包括以下步骤：对同一病种多个相关病例的包埋蜡块组织进行HE染色及组织学观察，在每个所述HE切片上确认并标记目的细胞区；对比所述HE切片上标记的细胞区，准确标记定位所述包埋蜡块上相对应的目的细胞区位置，核对所有被标记的所述包埋蜡块。本发明实施例的方法用组织芯片法分离福尔马林固定石蜡包埋(Formalin fixed paraffin embedding，FFPE)的组织，操作相对简便，且后续DNA或RNA的提取易于操作，提取的RNA不易污染、降解，质量和浓度都较高，而且成本低。从细胞成分不同的组织切片中分离高度纯化的细胞群，解决了细胞异质性问题，从而提高了从FFPE的组织中提取DNA或RNA的质量。

Description

一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法
技术领域
本发明实施例涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法。
背景技术
分子检测技术是分子诊断的前提和基础，分子检测技术主要包括DNA测序、荧光原位杂交、实时定量PCR、片段分析等，这些检测技术主要围绕DNA、 RNA水平开展。新鲜冰冻组织的DNA、RNA保存较为完整，降解少，故从新鲜冰冻组织提取的DNA、RNA检测数据较为可信，因此目前常用新鲜冰冻组织开展研究，但新鲜冰冻组织保存成本高，组织收集困难，在一定程度上限制了其应用，但福尔马林固定石蜡包埋(Formalin fixed paraffin embedding，FFPE)的组织容易获得，且制作成本低廉、容易保存，但组织经福尔马林固定石蜡包埋后极易引起DNA、RNA降解，而且一张切片上除了肿瘤细胞还存在其他的坏死组织、结缔组织、免疫细胞、血管等，直接提取DNA或RNA 进行相关分子的检测十分不严谨。
激光捕获显微切割(Laser capture microdissection，LCM)是一种能够准确识别并从复杂的异构细胞群中分离同质细胞群的技术手法，ArcturusXTTM系统LCM是现今世界上唯一将LCM和紫外、红外双激光融为一体的显微切割仪器。LCM已经被用于有效的分离各种类型细胞并获取DNA、RNA、蛋白质等。LCM适用组织类型与获取样本种类的多样性使其在科研中起到的作用越发关键。LCM最大优势为能准确分离纯化目的细胞，甚至可通过免疫组化或免疫荧光将特异性细胞标记，收集到的细胞成分能够达到绝对单一。但 LCM分离-RNA提取前进行的HE染色过程极易引起RNA降解，且应用的过程中，其成本较高。因此，如何精确的获取目的细胞变得尤为重要。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，以解决现有技术中检测通量低，检测成本高以及无法获得过度纯化细胞以及提取的DNA或RNA的质量低的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其包括以下步骤：
对同一病种多个相关病例的包埋蜡块组织进行HE染色及组织学观察，在每个所述HE切片上确认并标记目的细胞区；
对比所述HE切片上标记的细胞区，准确标记定位所述包埋蜡块上相对应的目的细胞区位置，核对所有被标记的所述包埋蜡块；
使用具有孔径的针，将多个所述相关病例的包埋蜡块的目的细胞区穿在同一蜡块的不同位置上，并在所述蜡块上做好标记，形成了组织芯片，并对其进行HE染色，显微镜下确定是否为目的细胞区域的组织芯片。
优选的，所述方法还包括：用所述组织芯片进行原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR或原位RT-PCR。
优选的，所述针的直径为1mm。
优选的，所述HE切片标记的目的细胞区域的数量为1-4个。
优选的，所述方法还包括：
用所述组织芯片的蜡块提取目的细胞的RNA，以及通过mRNA反转录获得cDNA。
优选的，所述RNA溶液浓度和纯度紫外分光光度计波长260nm和 280nm处吸光度的比值确定。
优选的，将所述cDNA进行荧光定量PCR，检测所述目的细胞的基因表达量。
优选的，所述cDNA的添加量不要超过PCR反应体系体积的10％。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例的方法，将多个病例的目标细胞集中到同一蜡块上，可以同时对细胞进行检测，提高检测通量，例如，在做免疫组化的过程中可以节省抗体的使用，同时也减少了蜡块的使用损耗。本发明实施例的方法用组织芯片法分离FFPE的组织，操作相对简便，且后续DNA或RNA的提取易于操作，提取的RNA不易污染、降解，质量和浓度都较高，而且成本低。从细胞成分不同的组织切片中分离高度纯化的细胞群，解决了细胞异质性问题，从而提高了从FFPE的组织中提取DNA或RNA的质量。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、试验材料及方法
收集自1980-2012年期间石河子大学医学院第一附属医院病理科滑膜肉瘤病例12例(临床资料详见表1)，所有切片均经过两位以上资深病理医师阅片，根据2013年WHO软组织最新分类标准和Enzinger&Weiss软组织肿瘤(第五版)进行分类及分级，所有病例均进行免疫组化及一步法RT-PCR 技术检测SYT-SSX融合基因进行最终确诊。
表1 12例滑膜肉瘤临床资料一览表
Figure BDA0002320506120000041
注:-F‖为女性，-M‖为男性；BSS：双相型滑膜肉瘤，MFSS：单相型滑膜肉瘤
2、组织芯片法分离滑膜肉瘤上皮区与梭形区
1)由2位以上资深病理医师选取分化较好的双相型滑膜肉瘤病例，在 HE切片上用记号笔标记出每例的梭形细胞区(相等于目的细胞区1)和上皮样细胞区(相当于目的细胞区2)，其中，每例每种细胞区标记1-4个区域。
2)仔细用相应的蜡块对比HE切片上标记的位置，准确定位组织蜡块上对应的位置并作标记。
3)整理核对所有被标记的供体组织蜡块。
4)使用直径1mm孔径的针，将每一例的梭形细胞区穿在同一个蜡块上，上皮细胞区穿在另一个蜡块上，在蜡块上做好标记。
5)用制好的蜡块切片，形成组织芯片，染HE，显微镜下观察，以确定新制组织芯片是目的细胞区域。
3、组织芯片提取RNA(Trizol法)
1)将组织芯片的蜡块放在切片机上，刀片用酒精擦拭。
2)4μm每张进行连续切割，其中2孔芯片(相当于每例每种细胞区标记2个区域)切35张，3孔芯片(相当于每例每种细胞区标记3个区域)切 25张，4孔芯片(相当于每例每种细胞区标记4个区域)切20张，分别装入2ml的无酶EP管内，掌上离心机离心1min，以使组织入管底；
3)加入1.5ml二甲苯，上下摇匀5min，55℃水浴，10min；
4)23℃下离心，10000rpm，6min；
5)弃上清，加二甲苯1.5ml，上下摇匀5min，55℃水浴，10min；
6)23℃下离心，10000rpm，6min；
7)弃上清，加无水乙醇1.5ml，上下摇匀10min；
8)4℃离心13000rpm，10min，弃上清；
9)重复7.8两次；
10)室温干燥15min；
11)加lysis buffer(细胞裂解液)200μl，轻轻混匀，加蛋白酶K40μl；
12)混匀后封口膜封口，置于55℃水浴摇床过夜；
13)次日，液体清亮，95℃5min以灭火蛋白酶K，9000rpm，4℃离心 11min，取上清，记录液体体积。
14)加Trizol 1ml，上下颠倒轻轻混匀5分钟后置冰上静置30min；
15)加入等体积的三氯甲烷，盖好盖子，剧烈震荡15秒，室温放置10 分钟。
16)4℃，13000rpm离心15分钟，样品会分为三层，红色的有机相、中间层和上层为无色的水相，RNA主要在水相中，将上层无色液转移到新的EP管中(记录体积)。
17)加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30分钟。
18)4℃，12000rpm离心10分钟，去上清。
19)每管加1ml预冷的无水乙醇，将沉淀轻轻弹起后，上下颠倒混匀；
20)4℃，13000rpm离心5分钟，弃上清。
21)室温倒置晾干(不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，2-3分钟即可)。
22)加入20μl无酶水，溶解RNA，放入-80℃冰箱保存备用。
4、基因组RNA产率和纯度鉴定
在紫外分光光度计波长260nm和280nm处吸光度的比值(A260/280),以确定 RNA溶液浓度和纯度。逆转录后进行qRT-PCR检测管家基因β-actin mRNA 表达，未检测到β-actin表达的为不合格样品，检测到β-actin表达的质检合格样品在-80℃超低温冰箱中保存备用。
表2 qRT-PCR所用引物序列
Figure BDA0002320506120000061
5、mRNA反转录
1)模板RNA冰上溶解，室温(15-25℃)溶解gDNA去除液、 Quantiscript ReverseTranscriptase、Quantiscript RT Buffer、RT Primerm Mix、 and RNase-free weter，轻弹壁管以混匀溶液，短暂离心收集留在壁管上的液体，至于冰上。
2)按照下表准备gDNA去除反应，置于冰上。
表3 gDNA去除反应体系
Figure BDA0002320506120000062
Figure BDA0002320506120000071
3)42℃孵育2分钟，后立即置于冰上。
4)按下表准备反转录master mix.
表4反转录master mix反应体系
Figure BDA0002320506120000072
5)将第三步所得到的RNA模板(14μl)加入到含有含有反转录master mix的管子中。
6)42℃孵育15分钟。
7)95℃孵育3分钟以终止反应
8)适当稀释已经完成的逆转录反应液，用于实时定量PCR反应。冰上操作，长期储存，置于-20℃。
6、荧光实时定量PCR(qRT-PCR)
1)根据下表准备反应混合物。无需在冰上进行。
表5 qRT-PCR反应体系
Figure BDA0002320506120000073
Figure BDA0002320506120000081
注意：因为PCR反应是热启动反应，所以在配制mix时不须放置在冰上。cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的10％。加入模板cDNA到每个小管中。充分混合好反应混合物，然后分装到有cDNA的小管中。轻轻地用盖子紧紧封住管口。室温1000g离心1分钟。注意：这一步是没有必要设立在Rotor-Discs的反应。按一下程序进行PCR反应：
表6 qRT-PCR反应条件
Figure BDA0002320506120000082
7、实时荧光定量PCR结果计算
本发明实施例采用相对荧光定量PCR实验类型检测目的基因和内参基因β-actin，通过2-△Ct法计算目的基因mRNA表达水平，其中△Ct为目的基因的Ct值减去内参基因的Ct值，E-cadherin为例，△Ct＝Ct E-cadherin-Ctβ-actin。Ct值为反应的实时荧光强度达到设定的阈值时所经过的扩增循环数，此时扩增是呈对数期增长，每例样本实验重复3次。
应用SPSS17.0分析软件，滑膜肉瘤上皮间叶成分间的总体差异分析采用独立样本的T检验；配对的上皮间叶表达差异分析采用对照样本的T检验对实验所得目的基因荧光实时定量PCR结果的相对数值进行统计分析，P＜ 0.05有统计学意义。
8、组织芯片法分离后RNA提取结果
8例双相型滑膜肉瘤和2例单相型共制成18个组织芯片，HE染色发现有4个样本中存在超过10％的非目的细胞(肌肉、结缔组织或另一成分的肿瘤细胞)，将这4个组织芯片定义为分离不成功的样本，排除实验组。剩余14个组织芯片运用Trizol法提取RNA。应用NanoDrop2000核酸定量仪检测基因组RNA纯度、浓度，结果见表7所示。其中仅一例浓度不足100ng/ul，qRT-PCR中未检测到β-Actin的表达，其余13个样本分离、RNA 提取均较成功。可用于接下来目的基因的检测。
综上所述，使用4μm厚，面积55-63mm2的滑膜肉瘤石蜡组织芯片法，Trizol法提取RNA成功率为72.2％(13/18)。
表7 10例样本组织芯片分离后提取RNA质量与浓度
Figure BDA0002320506120000091
本发明实施例的组织芯片法操作相对简便，且后续DNA或RNA的提取易于操作，提取的RNA不易污染、降解，质量和浓度都较高。本发明实施例成功将组织芯片法用于FFPE的SS两种成分分离中，成功的qRT-PCR结果不仅为研究SS双向分化潜能的机制提供技术支持，也为研究其他类型的间叶源性肿瘤获取目的细胞提供技术保证，尤其是在FFPE组织类型的肿瘤组织或细胞的特异性表达和分子机制的研究中，组织芯片法能够为获取DNA/RNA 及蛋白质提供纯净、单一的目的细胞，从而得出更精确的结果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0002320506120000111
。
序列表
<110> 齐妍
<120> 一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法
<130> GG19677096A
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gagcgggaaa tcgtccgtga catt 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gatggagttg aaggtagttt cgtg 24

Claims (8)

1.一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：
对同一病种多个相关病例的包埋蜡块组织进行HE染色及组织学观察，在每个所述HE切片上确认并标记目的细胞区；
对比所述HE切片上标记的细胞区，准确标记定位所述包埋蜡块上相对应的目的细胞区位置，核对所有被标记的所述包埋蜡块；
使用具有孔径的针，将多个所述相关病例的包埋蜡块的目的细胞区穿在同一蜡块的不同位置上，并在所述蜡块上做好标记，形成了组织芯片，并对其进行HE染色，显微镜下确定是否为目的细胞区域的组织芯片。
2.如权利要求1所述的用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于，
所述方法还包括：用所述组织芯片进行原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR或原位RT-PCR。
3.如权利要求1所述的用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于，
所述针的直径为1mm。
4.如权利要求1所述的用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于，
所述HE切片标记的目的细胞区域的数量为1-4个。
5.如权利要求1所述的用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于，
所述方法还包括：
用所述组织芯片的蜡块提取目的细胞的RNA，以及通过mRNA反转录获得cDNA。
6.如权利要求5所述的用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于，
所述RNA溶液浓度和纯度紫外分光光度计波长260nm和280nm处吸光度的比值确定。
7.如权利要求5所述的用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于，
将所述cDNA进行荧光定量PCR，检测所述目的细胞的基因表达量。
8.如权利要求7所述的用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于，
所述cDNA的添加量不要超过PCR反应体系体积的10％。
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