CN111088144B - 单分子dna荧光信号检测系统及阵列微孔的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供单分子DNA荧光信号检测系统，包括阵列芯片与光学检测结构；阵列芯片上阵列若干阵列微孔与集成若干发光件，所述光学检测结构采集所述荧光信号并将其转换成数字信号以实现单分子DNA检测。本发明还涉及一种阵列微孔的检测方法。本发明通过将发光件集成到微孔阵列当中，避免采用零模波导照明的方式，增加激发光的利用率，提高荧光激发效率，增强荧光信号，同时相比于现有的底部为透明材料的零模波导的盲孔结构，减少光信号通过光学元件的损耗，提高荧光信号检测识别的准确率；同时避免零模波导孔的尺寸限制，可应用更高通量的测序微孔阵列芯片，实现单分子荧光测序。
Description
技术领域
本发明涉及单分子DNA测序领域，尤其涉及单分子DNA荧光信号检测系统。
背景技术
单分子DNA测序技术是近十年发展起来的新一代测序技术,也称为第三代测序技术，以美国太平洋生物公司的SMRT技术为代表，其测序原理是采用一种直径只有几十纳米的零模波导孔(zero-mode waveguides wells，ZMWs)，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内，通过零模波导的方式将光信号导入到孔中，当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止，因此通过四种不同荧光标记的脱氧核苷酸分子，实现对每一条DNA分子的单独测序。
与第一代测序技术Sanger测序法和第二代测序技术NGS(next generationsequencing)测序技术相比,第三代测序具有超长读长、测序周期短、无需模板扩增和直接检测表观修饰位点、可实时检测等特点,为研究人员提供了新选择。
目前,SMRT测序在小型基因组从头测序和完整组装中已有良好应用,并且已经或将在表观遗传学、转录组学、大型基因组组装等领域发挥其优势,促进基因组学的研究。
但是与此同时,基于纳米孔芯片的第三代基因测序技术，相比于NGS技术，急需进一步提高测序技术的检测准确率，同时由于阵列孔尺寸较低芯片加工制备难度要求较高，通量较低，因此测序成本很高；这些因素限制了其在基因测序领域的广泛应用和发展。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供单分子DNA荧光信号检测系统。
本发明通过光学检测结构采集阵列微孔中释放的荧光信号和激发光信号，提高检测的准确率，以解决上述技术问题。
本发明提供单分子DNA荧光信号检测系统，包括阵列芯片与光学检测结构；其中，所述阵列芯片上阵列若干阵列微孔与集成若干发光件，所述发光件设置于所述阵列微孔的侧壁上用于照射，若干所述发光件电性连接一控制部，所述阵列微孔只允许单链DNA分子进入；
所述阵列微孔的底端设有微通孔，所述微通孔的孔径小于所述阵列微孔的孔径；所述微通孔的侧壁上吸附一DNA聚合酶，单链DNA分子在DNA聚合酶的作用下合成为双链DNA分子的同时释放一个荧光分子，荧光分子在所述发光件的照射下产生荧光信号，所述荧光信号通过所述微通孔，所述光学检测结构采集所述荧光信号并将其转换成数字信号以实现单分子DNA检测。
优选地，所述阵列芯片的底部连接有薄板，所述微通孔贯穿于所述薄板。
优选地，所述发光件为发光二极管。
优选地，所述光学检测结构包括物镜、第一透镜、反射光栅、反射聚焦镜以及光学探测器，所述物镜用于收集从若干所述微通孔中发出的荧光信号；所述第一透镜用于将从所述物镜中输出的光准直为平行光；所述反射光栅接收所述平行光并将所述荧光信号中不同波长的光分开；所述光学探测器接收所述不同波长的光并将其转化为数字信号，以实现DNA单分子测序的所述荧光信号的实时采集。
优选地，所述光学检测结构还包括第二透镜与阵列共聚焦小孔，所述第二透镜用于将从所述物镜中输出的平行光汇聚至所述阵列聚焦小孔的若干小孔内，以使得所述小孔与微通孔为共聚焦的两个共轭点。
优选地，所述光学探测器包括CMOS图像传感器或CCD探测器。
优选地，所述阵列微孔的孔径是所述微通孔孔径的100至200倍。
优选地，DNA聚合酶通过化学修饰的方式吸附于所述微通孔的孔壁上。
本发明还提供一种阵列微孔的检测方法，包括通过单分子DNA荧光信号检测系统中的所述控制部控制若干个所述发光件同时发光进行照射，所述光学检测结构采集从所述发光件对应的所述阵列微孔中发出的光信号，当所述光学检测结构采集到与所述阵列微孔相对应的光信号时，所述阵列微孔为通孔；否则为盲孔。
优选地，所述光学检测结构包括面阵传感器，所述面阵传感器包括与所述阵列微孔发出的光信号一一对应的感测点。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明公开了单分子DNA荧光信号检测系统，该检测系统包括可控照明纳米孔阵列芯片，实现纳米孔单分子测序光学信号的实时检测，采用照明系统与荧光检测系统分光路设计，应用共聚焦检测光路，实现微孔阵列的光学信号的并行检测；应用反射式光栅分光系统，实现对四种荧光波长以及照明背景光学信号的分光，降低背景光干扰，提高检测的准确率。
通过阵列微孔的检测方法可用于检测系统的自检测即判定阵列微孔是否为盲孔，结合照明控制信号，停止对盲孔的荧光激发，可有效降低检测系统的功耗，降低成本提高检测效率及准确率。
本发明通过将发光元件集成到微孔阵列当中，避免采用零模波导照明的方式，增加激发光的利用率，提高荧光激发效率，增强荧光信号，同时相比于现有零模波导的盲孔结构(底部为透明材料)，减少光信号通过光学元件的损耗，提高荧光信号检测识别的准确率；同时避免零模波导孔的尺寸限制，可应用更高通量的测序微孔阵列芯片，实现单分子荧光测序。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明的单分子DNA荧光信号检测系统的整体结构示意图；
图2为本发明的单分子DNA荧光信号检测系统的阵列芯片系统的剖视图；
图3为本发明的单分子DNA荧光信号检测系统的芯片的俯视图；
图4为本发明的单分子DNA荧光信号检测系统的单个阵列微孔的光路示意图；
附图标记：1、阵列芯片，2、物镜，3、第二透镜，4、阵列共聚焦小孔，5、第一透镜，6、第一反射式聚焦镜，7、第二反射式聚焦镜，8、第一反射式衍射光栅，9、第二反射式衍射光栅，10、第一光学探测器，11、第二光学探测器，110、微通孔、120、薄板，130、阵列微孔、140、单链DNA分子，150、DNA聚合酶，160、发光二极管。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明提供单分子DNA荧光信号检测系统，如图1-4所示，包括阵列芯片1与光学检测结构；其中，所述阵列芯片1上阵列若干阵列微孔130与集成若干发光件，所述发光件设置于所述阵列微孔130的侧壁上用于照射，若干所述发光件电性连接一控制部，所述阵列微孔130只允许单链DNA分子140进入；
所述阵列微孔130的底端设有微通孔110，所述微通孔110的孔径小于所述阵列微孔130的孔径；所述微通孔110的侧壁上吸附一DNA聚合酶，单链DNA分子在DNA聚合酶的作用下合成为双链DNA分子的同时释放一个荧光分子，荧光分子在所述发光件的照射下产生荧光信号，所述荧光信号通过所述微通孔110，所述光学检测结构采集所述荧光信号并将其转换成数字信号以实现单分子DNA检测。在一个实施例中，阵列芯片1为不透明材料，阵列芯片1上的阵列微孔130通道可多达十万、百万量级，在阵列芯片1内部集成发光件，发光件优选发光二极管160，并且发光二极管160集成在阵列微孔130的侧壁上，通过控制部统一控制发光二极管130的通断。阵列芯片1配合光学检测结构，对发光件以及荧光进行并行检测，通过控制部可控制不同的阵列微孔130对应的发光件进行照射，提高检测系统的检测效率。
制备集成阵列光源的通孔阵列芯片1，通过在微孔阵列中集成发光二极管160与电极，电极连接控制部，控制部通过控制实现不同阵列微孔130的选择性照射。将DNA聚合酶150固定在阵列微孔130底部，具体通过化学修饰的方式吸附于微通孔110的孔壁上，阵列微孔130只允许单链的DNA分子通过，将含有DNA模板以及带有不同荧光标记的四种寡核苷酸分子(A、T、C、G)的预混液，填充到阵列芯片的阵列微孔上，通过设定阵列微孔130的尺寸，只允许单链DNA分子进入，在DNA聚合酶的作用下，单链DNA分子合成为双链分子，每合成一个寡核苷酸分子，将释放一个荧光分子，荧光分子在发光二极管160发出的激发光的照射下，产生荧光信号，从阵列微孔130的底部微通孔110透射，此外也会有一小部分的激发光透射出去，激发光即发光二极管160发出的光；通过光学检测结构采集阵列芯片1中从微通孔110中发出的光信号并将其转换为数字信号，实现荧光信号的实时检测，降低背景光干扰，提高检测的准确率。
所述阵列芯片1的底部连接有薄板120，所述微通孔110贯穿于所述薄板120。一般地，薄板120可以采用金属镀上去，或者电子束溅射工艺，金属包括铝、金、钛、铬、钼。
所述阵列微孔130的孔径是所述微通孔110孔径的100至200倍。阵列微孔130的孔径优选100nm-10μm,微通孔的孔径优选为1nm-50nm，DNA聚合酶150结合在微通孔110侧壁上，正常测序过程DNA单链在聚合酶的作用下，合成双链，同时释放荧光分子，荧光分子在发光二极管160发光的照射下，释放荧光信号，荧光信号在底部开口即微通孔110处会透过芯片向下发射出去，此时少部分激发光也会跟随荧光透射出去。
所述光学检测结构包括物镜2、第一透镜5、反射光栅、反射聚焦镜以及光学探测器，所述物镜2用于收集从若干所述微通孔110中发出的荧光信号；所述第一透镜5用于将从所述物镜2中输出的光准直为平行光；所述反射光栅接收所述平行光并将所述荧光信号中不同波长的光分开；所述光学探测器接收所述不同波长的光并将其转化为数字信号，以实现DNA单分子测序的所述荧光信号的实时采集。在一个实施例中，物镜2用于收集从各个微通孔110中输出的荧光信号，反射光栅包括两个反射式衍射光栅包括第一反射式衍射光栅8与第二反射式衍射光栅9，两个反射式衍射光栅形成一定的角度，同时接收荧光信号与部分透射过去的激发光。反射式衍射光栅利用反射角度的不同将不同波长的光分开，不同波的光具有不同的反射角度。反射处的光信号分别通过反射式的聚焦镜即第一反射式衍射光栅8与第二反射式衍射光栅9将光信号分别反射至第一反射式聚焦镜6与第二反射式聚焦镜7，分别汇聚到第一光学探测器10与第二光学探测器11上，光学探测器为高灵敏度面阵光学探测器，光学探测器优选为CMOS图像传感器或CCD探测器，不同微通孔110对应不同的光学探测器上的感应单元即微通孔一一对应感应单元，感应单元接收与其对应的微通孔发射的荧光信号；通过光学探测器对荧光信号的实时采集即可实现微孔阵列DNA单分子测序荧光信号的实时采集，应用反射式光栅分光系统，实现对四种荧光波长以及照明背景光学信号的分光，降低背景光干扰，提高检测的准确率。
所述光学检测结构还包括第二透镜3与阵列共聚焦小孔4，所述第二透镜3用于将从所述物镜2中输出的平行光汇聚至所述阵列聚焦小孔4的若干小孔内，以使得所述小孔与微通孔110为共聚焦的两个共轭点。在一个实施例中，阵列共聚焦小孔上的小孔与微通孔110的底部开口处为共聚焦的两个共轭点，可以拦截其他位置的杂散光，减少背景干扰。
一种阵列微孔的检测方法，通过单分子DNA荧光信号检测系统中的所述控制部控制若干个所述发光件同时发光进行照射，所述光学检测结构采集从所述发光件对应的所述阵列微孔130中发出的光信号，当所述光学检测结构采集到与所述阵列微孔130相对应的光信号时，所述阵列微孔130为通孔；否则为盲孔。在一个实施例中，在检测系统进行检测之前可通过该方法对其进行自检，通过控制部控制芯片中所有的发光件即发光二极管160同时发光进行照射，光学检测结构接收到从微通孔透射的激发光，则此微孔为通孔，否则为盲孔，盲孔即为芯片上加工失败的孔，通孔即为芯片上加工成功的孔。
具体地，所述光学检测结构包括面阵传感器，所述面阵传感器包括与所述阵列微孔发出的光信号一一对应的感测点，当所述感测点未采集到光信号，与所述感测点一一对应的所述阵列微孔为盲孔；否则为通孔。面阵传感器即上述的CMOS图像传感器或CCD探测器，从芯片上不同位置的微通孔透射的荧光信号，会在面阵传感器上的不同位置感测获得，即阵列微孔发出的光信号一一对应面阵传感器上的感测点，当感测点没有接收到荧光信号，则与感测点对应的阵列微孔为盲孔，否则为通孔；在后续的检测过程中通过控制部控制将自检测为盲孔的阵列微孔对应的发光二极管断开即发光二极管不工作不发光。
本发明公开了单分子DNA荧光信号检测系统，该检测系统包括可控照明纳米孔阵列芯片，实现纳米孔单分子测序光学信号的实时检测，采用照明系统与荧光检测系统分光路设计，应用共聚焦检测光路，实现微孔阵列的光学信号的并行检测；应用反射式光栅分光系统，实现对四种荧光波长以及照明背景光学信号的分光，降低背景光干扰，提高检测的准确率。
通过阵列微孔的检测方法可用于检测系统的自检测即判定阵列微孔是否为盲孔，结合照明控制信号，停止对盲孔的荧光激发，可有效降低检测系统的功耗，降低成本提高检测效率及准确率。
本发明通过将发光元件集成到微孔阵列当中，避免采用零模波导照明的方式，增加激发光的利用率，提高荧光激发效率，增强荧光信号，同时相比于现有零模波导的盲孔结构(底部为透明材料)，减少光信号通过光学元件的损耗，提高荧光信号检测识别的准确率；同时避免零模波导孔的尺寸限制，可应用更高通量的测序微孔阵列芯片，实现单分子荧光测序。
以上，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。
Claims (10)
1.单分子DNA荧光信号检测系统，其特征在于，包括阵列芯片与光学检测结构；其中，所述阵列芯片上阵列若干阵列微孔与集成若干发光件，所述发光件设置于所述阵列微孔的侧壁上用于照射，若干所述发光件电性连接一控制部，所述阵列微孔只允许单链DNA分子进入；
所述阵列微孔的底端设有微通孔，所述微通孔的孔径小于所述阵列微孔的孔径；所述微通孔的侧壁上吸附一DNA聚合酶，单链DNA分子在DNA聚合酶的作用下合成为双链DNA分子的同时释放一个荧光分子，荧光分子在所述发光件的照射下产生荧光信号，所述荧光信号通过所述微通孔，所述光学检测结构采集所述荧光信号并将其转换成数字信号以实现单分子DNA检测。
2.如权利要求1所述的单分子DNA荧光信号检测系统，其特征在于，所述阵列芯片的底部连接有薄板，所述微通孔贯穿于所述薄板。
3.如权利要求2所述的单分子DNA荧光信号检测系统，其特征在于，所述发光件为发光二极管。
4.如权利要求1所述的单分子DNA荧光信号检测系统，其特征在于，所述光学检测结构包括物镜、第一透镜、反射光栅、反射聚焦镜以及光学探测器，所述物镜用于收集从若干所述微通孔中发出的荧光信号；所述第一透镜用于将从所述物镜中输出的光准直为平行光；所述反射光栅接收所述平行光并将所述荧光信号中不同波长的光分开；所述光学探测器接收所述不同波长的光并将其转化为数字信号，以实现DNA单分子测序的所述荧光信号的实时采集。
5.如权利要求4所述的单分子DNA荧光信号检测系统，其特征在于，所述光学检测结构还包括第二透镜与阵列共聚焦小孔，所述第二透镜用于将从所述物镜中输出的平行光汇聚至所述阵列聚焦小孔的若干小孔内，以使得所述小孔与微通孔为共聚焦的两个共轭点。
6.如权利要求4所述的单分子DNA荧光信号检测系统，其特征在于，所述光学探测器包括CMOS图像传感器或CCD探测器。
7.如权利要求2所述的单分子DNA荧光信号检测系统，其特征在于，所述阵列微孔的孔径是所述微通孔孔径的100至200倍。
8.如权利要求1所述的单分子DNA荧光信号检测系统，其特征在于，DNA聚合酶通过化学修饰的方式吸附于所述微通孔的孔壁上。
9.一种阵列微孔的检测方法，其特征在于，包括:
通过如权利要求1所述的单分子DNA荧光信号检测系统中的所述控制部控制若干个所述发光件同时发光进行照射，所述光学检测结构采集从所述发光件对应的所述阵列微孔中发出的光信号，当所述光学检测结构采集到与所述阵列微孔相对应的光信号时，所述阵列微孔为通孔；否则为盲孔。
10.如权利要求9所述的一种阵列微孔的检测方法，其特征在于，所述光学检测结构包括面阵传感器，所述面阵传感器包括与所述阵列微孔发出的光信号一一对应的感测点。
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