CN111087736A - 一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶及其制备方法与应用。制备方法为：S1将NIPAm分散于水中；S2合成兼具弱扩散性和一定温敏性、形态介于凝胶状和薄膜状之间的水凝胶材料；S3合成纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶材料。本发明制得的水凝胶材料具有保留复杂生物化学物质空间信息的能力，同时具有一定程度的热敏收缩性，能够实现分析物的集聚。同时，由于其LSCT为32℃的特性，特别适用于微生物分泌物的原位检测。因此，本发明中的纳米复合PNIPAm水凝胶材料制备方法过程简便，合成的材料具有普遍适用性。

Description

一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术和无损检测领域，具体涉及一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶及其制备方法与应用，尤其涉及一种具有介于薄膜和凝胶之间形态的纳米颗粒-水凝胶复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
智能PNIPAm(聚N-异丙基丙烯酰胺)水凝胶具有温敏性、亲水性、生物相容性、扩散性，已经被应用与智能化纳米材料复合形成复合材料。常见的用于合成纳米颗粒-水凝胶复合材料的PNIPAm水凝胶的制备过程是采用自由基聚合法，通常使用过硫酸铵以及四甲基乙二胺催化聚合。首先，这种制备方法残余的引发剂、交联剂等物质的存在会对水凝胶的性质产生一定的影响。其次，这种乳液法聚合法合成的水凝胶材料具有比较强的扩散性，容易在培养和检测时破坏生物膜分泌物的空间信息。此外，以水凝胶材料与金纳米颗粒的复合方法为例，现有方法是将成型的水凝胶材料，分别浸泡吸收氯金酸和四硼酸钠溶液，使金纳米颗粒在水凝胶内部合成，这种方法合成的金纳米颗粒较小。
现有专利提及的水凝胶和纳米粒子形成的复合材料，主要是以水凝胶的生物相容性、扩散性和亲水性为优势，辅助实现纳米颗粒的功能，应用于毒素、金属离子、农药等检测。然而，现有纳米粒子-水凝胶复合材料的特性并不能够严格达到“原位”的检测要求。因为传统水凝胶有较强的扩散性，使得分子在空间上各方向都有扩散蔓延，从而导致了空间化学信息的破坏。为了改善现有水凝胶材料性能，使其拥有一定类似“薄膜”的性质，从而赋予这种复合材料区别于原有的应用范围的新功能-空间信息保留能力和集聚能力。以拉曼光谱的检测为例，这种复合材料可以提高样品的空间信息的保留度，同时确保拉曼检测的灵敏度。
本申请中涉及的合成方法得到的纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶，具有一定薄膜的特性(弱扩散性)，避免空间扩散，适合于分析自然界复杂样品的空间分布信息，优化了现有合成方法得到的水凝胶复合材料的存在的弊端。另一方面，这种复合材料保留了智能水凝胶的温敏收缩性，若结合了金纳米颗粒的特性，复合材料将具有优异的拉曼信号增强特性，因此本文涉及的方法合成的复合材料非常适合作为表面增强拉曼的基底。同时这种复合材料保留水凝胶材料的生物相容性和温敏性(低临界溶解温度约为32℃)，因此，特别适合于生物膜的培养、生长、增殖，甚至是特异性分化(多数常见微生物生理温度>32℃)。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的制备方法。该方法合成的智能水凝胶兼具弱扩散性和一定热敏收缩性，具有一定维持生物化学物质空间信息的能力，避免了现有方法合成水凝胶由于扩散性引起的信息破坏和不完整，可应用于复杂物质的空间化学分析检测。
本申请的另一目的在于提供上述方法制得的一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶。
本申请的再一目的在于提供上述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的应用，尤其在原位无损检测生物被膜中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)均匀分散在水中，配制成质量浓度为55～75％的NIPAM分散液；
S2根据NIPAM分散液的高度H＝(0.16(T-30))/(100S-4)+0.2以及水凝胶应用温度T和水凝胶理想体积收缩率S，计算得到NIPAM分散液的高度H；
S3将高度为H的NIPAM分散液在大气压介质阻挡放电条件下反应25～35s，水洗，得到PNIPAm水凝胶；
S4将PNIPAm水凝胶浸泡在金溶胶中，震荡条件下自组装20min以上，水洗，得到纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶。
优选的，S1所述分散的方式为超声分散，超声的频率≥40kHz。
优选的，S2所述水凝胶理想体积收缩率S＝1-收缩后体积/室温下体积×100％，所述收缩后的体积指温度T下的体积。
优选的，S2所述NIPAM分散液的高度H≤1mm，更优选为0.22～0.52mm；水凝胶应用温度T指纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶实际应用温度，所述温度T为32～40℃；所述水凝胶理想体积收缩率S为5～50％。
优选的，S3所述大气压介质阻挡放电条件为：气流为氩气、氧气、二氧化碳和氮气中的至少一种，输出电压为70～90kV，电流为1.5～2A。
优选的，S3所述水洗时间至少3天。
优选的，S4所述金溶胶的浓度为0.05～0.1mg/mL，溶剂为水；所述金溶胶为纳米金溶胶，其中的金纳米粒子为PEG功能化的金纳米粒子；更优选为直径≤200nm的PEG功能化的金纳米粒子。
优选的，S4所述自组装的时间为20～30min。
优选的，S4所述水洗时间至少3天。
优选的，S4所述震荡自组装在摇床上进行。
上述方法制得的一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶。
所述纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的形态介于凝胶状和薄膜状之间。
上述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的应用。
上述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶在原位无损检测生物被膜中的应用，包括以下步骤：
S1将纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶灭菌后，接种菌悬液，静置培养，得到在纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶中原位生长的生物膜；
S2使用拉曼光谱仪检测S1中生物膜成分，得到生物膜的拉曼光谱信息。
优选的，S1所述灭菌方法为：于紫外灯下灭菌16～24h。
优选的，S1所述纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的尺寸为10×10×H mm3，所述H≤1mm；更优选为0.22～0.52mm；所述菌悬液由处于生长对数期的菌悬液稀释100倍得到，接种量为2.5～10μl。
优选的，S1所述菌悬液中的菌为适合培养生物膜的菌类，更优选为食源性病原菌和铜绿假单胞菌中的至少一种。
优选的，S2所述检测的条件为：20倍物镜，激发光源的波长为785nm，最大功率为4.24kW/cm2，采集时间为10s。
优选的，S2所述检测在适宜菌悬液中种菌生物膜生长的温度下进行。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明采用的非热大气压等离子体合成的水凝胶材料，大大减少了由传统水凝胶固有的扩散性导致的生物化学成分在各方向上的位移，同时还保留了一定热敏收缩性，很大程度上保留了复杂生物化学成分的空间化学信息。
(2)本发明中，根据经验关系，可按照实际需求控制复合水凝材料的厚度，从而达到一个在合理范围内得到理想的收缩效果。因此，本发明制备方法得到的纳米复合水凝胶材料具有普适性，应用范围更广。
(3)本发明中纳米颗粒结合度相对更高，距离更近。由于合成方法中没有使用使水凝胶带有正电荷的聚合引发剂，同时聚乙烯吡咯烷酮将水凝胶表面转变为负电，因此水凝胶材料与带有正电的纳米颗粒产生静电吸附作用，结合效果更好。此外，于微生物生理温度时水凝胶材料疏水收缩，促使水凝胶表面金纳米颗粒的相互靠近，通过缩小间隙达到了增强热点的效果。
附图说明
图1为本发明的纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶制备流程图。
图2为实施例1以及对比例1和对比例2中的水凝胶复合材料的场发射扫描电镜图，从左至右分别为对比例1、实施例1和对比例2水凝胶复合材料的场发射扫描电镜图。
图3为实施例1以及对比例1和对比例2中的水凝胶复合材料运用于生物膜检测时的表面增强拉曼信号。
图4为实施例3中的水凝胶复合材料运用于生物膜检测时的表面增强拉曼信号。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请实施例和对比例中所用的大气压介质阻挡放电反应装置购于南京苏曼等离子科技有限公司。
实施例1
(1)配制质量浓度为65％的NIPAM水分散液(使用≥40kHz超声处理使其分散均匀)。根据NIPAM分散液的高度H＝(0.16(T-30))/(100S-4)+0.2以及水凝胶应用温度T＝35℃和水凝胶理想体积收缩率S＝20％，计算得到NIPAM分散液的高度H＝0.25mm；将NIPAM分散液的高度控制在0.25mm。使用大气压介质阻挡放电反应装置，用气体流量计和控制器向反应室中通入氩气，进行非热等离子体处理，处理的时长为30s，大气压介质阻挡放电条件为：输出电压为80kV，电流为1.5A。去离子水洗涤3天，获得兼具弱扩散性和一定热敏收缩性的PNIPAm水凝胶材料。
(2)将步骤(1)中所述的PNIPAm水凝胶采用浸泡摇动的方式组装已经被聚乙二醇功能化的金纳米棒。将PNIPAm水凝胶材料浸泡于PEG功能化的金纳米棒溶胶(购于南京先丰纳米材料科技有限公司，PEG功能化的金纳米棒长径比：3.2，长：80nm，宽：25nm，紫外吸收峰：725±10nm，质量浓度：0.1mg/mL)中，置于摇床中进行自组装20min。去离子水洗涤3天，得到纳米复合材料Au@PNIPAm，并在紫外灯照射下灭菌16h。
对比例1
(1)配制质量浓度为95％的NIPAM水分散液(使用≥40kHz超声处理使其分散均匀)，使用大气压介质阻挡放电反应装置，用气体流量计和控制器向反应室中通入氩气，进行非热等离子体处理，处理的时长为60s，大气压介质阻挡放电条件为：输出电压为80kV，电流为1.5A，去离子水洗涤3天，合成厚度为0.01mm的pNIPAM薄膜。
(2)具体过程与实施例1中的步骤(2)完全相同，制得纳米复合材料Au@PNIPAm。
对比例2
(1)使用现有的自由基聚合法，利用引发剂引发NIPAM单体、交联剂或其它共聚单体中的双键发生聚合反应制备PNIPAm水凝胶，具体如下：
在搅拌下将0.5g N-异丙基丙烯酰胺和0.175g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺溶于5mL去离子水中。将该溶液保持在冰上氮气下吹扫15min以除去氧气；然后在搅拌下依次加入25μL 10％的过硫酸铵和10μL的N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，然后在4℃、黑暗条件下反应12h，结束反应，去离子水洗涤3天，即得到PNIPAM水凝胶。
(2)具体过程与实施例1中的步骤(2)完全相同，制得纳米复合材料Au@PNIPAm。
实施例2用于原位无损检测生物被膜
为直观观察生物膜分泌物的扩散性，采用铜绿假单胞菌(购于广东省微生物菌种保藏中心，GIM 1.535)为培养生物膜的试验样品，培养适宜温度为35℃。在培养生物膜之前，采用LB固体培养基(广东环凯微生物科技有限公司，货号：HCM330)进行分离纯化，再用LB肉汤培养基(广东环凯微生物科技有限公司，货号：HCM320)进行活化和扩大培养(取5μl加入到100ml新鲜LB肉汤培养基中)，并且培养到对数生长期。分别取5μl对数生长期的菌悬液(含培养基)接种于尺寸为10×10×1mm3的实施例1和对比例1～2制备的三种纳米复合材料Au@PNIPAm，放入35℃培养箱静置进行生物膜培养。
待生物膜培养至24h后，保持纳米复合凝胶和原位生长的生物膜在35℃，使用拉曼光谱仪，20倍物镜，采用785nm的激发光源，最大功率为4.24kW/cm2，采集时间为10s进行原位无损生物膜检测并获得拉曼光谱信息。
三种方法合成的纳米复合材料Au@PNIPAm检测效果如下表所示：
表1
Figure BDA0002337494420000071
由上表及图2和图3可知，对比例1合成的纳米复合材料组装金纳米棒的效果差，从而导致了拉曼光谱信号增强因子较低。而对比例2合成的纳米复合材料具有很强的扩散性，在各个方向发生了分泌物的扩散现象，从而导致无法获得准确原始的空间化学信息。实施例1合成的纳米复合材料具有一定组装金纳米棒的能力，在35℃时也可以发生一定程度的收缩，使得金纳米棒在空间上相对靠近，从而达到增强拉曼光谱信号的效果。因此，经过比较3种纳米复合材料对生物膜检测效果，可以看出本发明实施例1能够在保留生物膜空间信息的同时达到较高的拉曼增强因子，所以本发明在检测效果上具有一定优异性。
实施例3
(1)配制质量浓度为65％的NIPAM水分散液(使用≥40kHz超声处理使其分散均匀)。根据NIPAM分散液的高度H＝(0.16(T-30))/(100S-4)+0.2以及水凝胶应用温度T＝37℃和水凝胶理想体积收缩率S＝20％，计算得到NIPAM分散液的高度H＝0.27mm；将NIPAM分散液的高度控制在0.27mm。使用大气压介质阻挡放电反应装置，用气体流量计和控制器向反应室中通入氩气，进行非热等离子体处理，处理的时长为30s，大气压介质阻挡放电条件为：输出电压为80kV，电流为1.5A。去离子水洗涤3天，获得兼具弱扩散性和一定热敏收缩性的PNIPAm水凝胶材料。
(2)将步骤(1)合成的PNIPAm水凝胶材料采用浸泡摇动的方式与已经用聚乙二醇功能化的金纳米球进行组装。将PNIPAm水凝胶材料浸泡于PEG功能化的金纳米球溶胶(购于南京先丰纳米材料科技有限公司，PEG功能化的金纳米球的直径：60nm，质量浓度：0.05mg/ml，紫外吸收峰：534-536nm)中，置于摇床中进行组装20min。去离子水洗涤3天，得到纳米复合材料Au@PNIPAm，并在紫外灯照射下灭菌16h。
(3)采用食源性病原菌单增李斯特菌(Listeria monocytogenes(ATCC19115)(G+))，为培养生物膜的试验样品，培养温度为37℃。在培养生物膜之前，对菌株进行分离纯化，再进行活化和扩大培养，并且培养到对数生长期。取5μl对数生长期的菌悬液(含LB肉汤培养基，购于广东环凯微生物科技有限公，货号：HCM330)接种于尺寸为10×10×1mm3的纳米复合材料Au@PNIPAm。放入37℃培养箱静置进行生物膜培养。
(4)待生物膜培养24h后，保持纳米复合凝胶和原位生长的生物膜在37℃，使用拉曼光谱仪，20倍物镜，采用785nm的激发光源，最大功率为4.24kW/cm2，采集时间为10s进行原位无损生物膜检测并获得拉曼光谱信息。
本实施例的拉曼光谱信息见图4，其中LB肉汤(不含单增李斯特菌)为参照组。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将N-异丙基丙烯酰胺均匀分散在水中，配制成质量浓度为55～75％的NIPAM分散液；
S2根据NIPAM分散液的高度H＝(0.16(T-30))/(100S-4)+0.2以及水凝胶应用温度T和水凝胶理想体积收缩率S，计算得到NIPAM分散液的高度H；
S3将高度为H的NIPAM分散液在大气压介质阻挡放电条件下反应25～35s，水洗，得到PNIPAm水凝胶；
S4将PNIPAm水凝胶浸泡在金溶胶中，震荡条件下自组装20min以上，水洗，得到纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶。
2.根据权利要求1所述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的制备方法，其特征在于，S3所述大气压介质阻挡放电条件为：气流为氩气、氧气、二氧化碳和氮气中的至少一种，输出电压为70～90kV，电流为1.5～2A。
3.根据权利要求1所述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的制备方法，其特征在于，S2所述NIPAM分散液的高度H≤1mm；水凝胶应用温度T指纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶实际应用温度，所述温度T为32～40℃；所述水凝胶理想体积收缩率S为5～50％。
4.根据权利要求1所述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的制备方法，其特征在于，S4所述金溶胶的浓度为0.05～0.1mg/mL，溶剂为水；所述金溶胶为纳米金溶胶，其中的金纳米粒子为PEG功能化的金纳米粒子。
5.根据权利要求1或2或3或4所述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的制备方法，其特征在于，S1所述分散的方式为超声分散，超声的频率≥40kHz；
S2所述水凝胶理想体积收缩率S＝1-收缩后体积/室温下体积×100％，所述收缩后的体积指温度T下的体积；S2所述NIPAM分散液的高度H为0.22～0.52mm；
S3和S4所述水洗时间均至少3天；
S4所述自组装的时间为20～30min。
6.权利要求1～5任一项所述方法制得的一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶。
7.权利要求6所述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的应用。
8.权利要求6所述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶在原位无损检测生物被膜中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1将纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶灭菌后，接种菌悬液，静置培养，得到在纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶中原位生长的生物膜；
S2使用拉曼光谱仪检测S1中生物膜成分，得到生物膜的拉曼光谱信息。
9.根据权利要求8所述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶在原位无损检测生物被膜中的应用，其特征在于，S1所述纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶的尺寸为10×10×H mm3，所述H≤1mm；所述菌悬液由处于生长对数期的菌悬液稀释100倍得到，接种量为2.5～10μl；
S1所述菌悬液中的菌为适合培养生物膜的菌类。
10.根据权利要求8或9所述一种纳米颗粒复合PNIPAm水凝胶在原位无损检测生物被膜中的应用，其特征在于，S1所述菌悬液中的菌为食源性病原菌和铜绿假单胞菌中的至少一种；S1所述灭菌方法为：于紫外灯下灭菌16～24h；
S2所述检测的条件为：20倍物镜，激发光源的波长为785nm，最大功率为4.24kW/cm2，采集时间为10s；所述检测在适宜菌悬液中种菌生物膜生长的温度下进行。
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