CN111084792A - 酸鱼乳杆菌在制备预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了酸鱼乳杆菌在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。本发明首先提供了酸鱼乳杆菌显著地促进Treg细胞分化、抑制TH1细胞或TH17细胞分化，并抑制细胞因子IFN‑γ或IL‑17产生、促进细胞因子IL‑10或IL‑13产生，显著地减少了自身免疫性疾病的炎症反应；本发明还提供了一种治疗自身免疫性疾病的药物，包含有效剂量的酸鱼乳杆菌，患者服用该药物后达到了治疗自身免疫性疾病的显著效果，不会产生毒副作用，而且酸鱼乳杆菌方便得到；因此，酸鱼乳杆菌或治疗自身免疫性疾病的药物中具有广泛的应用前景。

Description

酸鱼乳杆菌在制备预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及酸鱼乳杆菌在制备预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
背景技术
自身免疫性疾病(autoimmune disease，AID)是指机体免疫系统对自身成分的免疫耐受被打破，从而攻击自身的器官、组织或细胞，引起损伤而诱发的一类疾病；例如，多发性硬化症、格雷夫斯病、自身免疫性肝病、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征等。T细胞的数量和/或功能的异常在自身免疫性疾病的发病中起至关重要的作用，其中，调节性T细胞(Regulatory cells，Tregs)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，可以抑制自身的炎症反应，与自身免疫性疾病的发生关系密切，其异常表达可导致自身免疫性疾病，Treg的功能和/或数量在各种自身免疫性疾病中显著异常，如在系统性红斑狼疮、炎性肠病、类风湿性关节炎和多发性硬化症中Tregs细胞的数量明显降低。辅助性T细胞17(Thelper cell 17，Th17)是一种新发现的能够分泌白介素17(interleukin 17，IL-17)的T细胞亚群，具有促进自身炎症反应的作用，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义，Th17细胞也与许多自身免疫性疾病的致病性密切相关，如在多发性硬化症、类风湿性关节炎和I型糖尿病中Th17细胞的数量明显升高。
多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)是典型的自身免疫性疾病，Treg细胞及Th17细胞在其发生发展中起着关键作用，MS患者外周血中Treg细胞及Th17细胞的数量和/或功能也都明显改变，其外周血中Treg细胞数量明显降低，而Th17细胞数量明显升高。然而，目前对MS患者Treg细胞和Th17细胞异常的原因及其分子机制仍知之甚少，且现有治疗多发性硬化的药物多为激素类，会对患者造成很大的毒副作用。
近年来研究表明，肠道微生物菌群作为重要的环境因素，在免疫系统发育和功能调控中发挥重要作用，是免疫耐受和炎症的关键调控者，肠道微生物菌群能调控包括Treg细胞和Th17细胞在内的多种免疫炎症细胞。因此，从肠道微生物菌群中寻找一种能够治疗自身免疫性疾病的肠道益生菌具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有自身免疫性疾病治疗药物的缺陷和不足，提供酸鱼乳杆菌在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。。
本发明的目的是提供酸鱼乳杆菌在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
本发明另一目的是提供一种治疗自身免疫性疾病的药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了酸鱼乳杆菌在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
优选地，所述酸鱼乳杆菌为酸鱼乳杆菌10851。
所述酸鱼乳杆菌10851采购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
更优选地，所述酸鱼乳杆菌10851为酸鱼乳杆菌10851活菌体或酸鱼乳杆菌10851培养上清液。
更进一步优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症、格雷夫斯病、自身免疫性肝病、自身免疫性脑炎、甲状腺自身免疫病、自身免疫性肾病、系统性血管炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、溃疡性结肠炎、皮肌炎、硬皮病、强直性脊柱炎或桥本甲状腺炎。
再进一步优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症。
优选地，所述应用为酸鱼乳杆菌在制备促进Treg细胞分化、抑制TH1细胞或TH17细胞分化的药物中的应用。
优选地，所述应用为酸鱼乳杆菌在制备抑制细胞因子IFN-γ或IL-17产生、促进细胞因子IL-10或IL-13产生的药物中的应用。
另外，本发明还提供了一种治疗自身免疫性疾病的药物，包含有效剂量的酸鱼乳杆菌。
优选地，所述酸鱼乳杆菌为酸鱼乳杆菌10851。
更优选地，所述酸鱼乳杆菌10851为酸鱼乳杆菌10851活菌体或酸鱼乳杆菌10851培养上清液。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了酸鱼乳杆菌在制备预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。本发明研究发现肠道中的酸鱼乳杆菌(尤其是酸鱼乳杆菌10851)在自身免疫性疾病中的关键作用，能够促进Treg细胞分化、抑制TH1细胞或TH17细胞分化，并抑制细胞因子IFN-γ或IL-17产生、促进细胞因子IL-10或IL-13产生，显著地减少了自身免疫性疾病的炎症反应；
另外，酸鱼乳杆菌本身就是肠道中正常存在的微生物，不会对患者产生副作用，患者易于接受且便于了解患者对药物的反应，有明确的给药途径，有望在根本上达到治疗自身免疫性疾病的效果，从而解决自身免疫性疾病复发的难题，而且酸鱼乳杆菌方便得到，扩增技术成熟，可快速投入生产并获得高效制剂；因此，酸鱼乳杆菌或治疗自身免疫性疾病的药物中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是EAE小鼠肠道菌群组成图。
图2是EAE小鼠肠道菌群组成的变化结果图；其中，“WT”代表WT组小鼠，“KO”代表CD44KO组小鼠，“*”代表p＜0.001差异极显著，“L.acidipiscis”代表酸鱼乳杆菌10851，“L.plantarum”代表植物乳杆菌，“L.ultunensis”代表厄尔纳拉乳杆菌，“L.antri”代表胃窦乳杆菌，“L.oris”代表口乳杆菌，“L.frumenti”代表谷物乳杆菌，“C.termitidis”代表白蚁梭菌，“L.hayakitensis”代表海藻酸乳杆菌，“S.maxima”代表旋动泡硫菌，“S.azabuensis”代表耐氧夏普菌，“P.cellicola”代表酒窖片球菌，“P.argentinicus”代表阿氏片球菌。
图3是CD4+FoxP3+Treg细胞FACS检测结果及其在CD4+T细胞中的百分比结果图。
图4是TH1细胞和TH17细胞FACS检测结果及其在CD4+T细胞中的百分比结果图。
图5是TH1细胞和TH17细胞FACS检测结果及其在CD4+T细胞中的百分比结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所涉及到的MS的动物模型选择实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)小鼠模型，符合诊断标准，健康对照组小鼠的神经系统功能指标均正常。
以下实施例中用到的主要试剂材料包括：粪便DNA抽提试剂盒(天根)；流式抗体(eb公司)；胎牛血清(Gbico)；1640培养基(BI)；ELISA试剂盒(eb公司)；TB green(Takara公司)。
以酸鱼乳杆菌10851为例，研究酸鱼乳杆菌对自身免疫性疾病的治疗作用，所用的酸鱼乳杆菌10851采购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
酸鱼乳杆菌10851(L.acidipiscis 10851)培养基的组成成分如下(每1000mL体系)：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，CaCO3 20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH6.8；121℃高压灭菌20min。
实施例1 EAE小鼠肠道菌群组成的变化
1、实验方法
用MOG35-55肽段免疫CD44KO(CD44KO小鼠)组和WT(C57BL/6野生型小鼠)组的小鼠建立EAE模型：于小鼠皮下注射200uL的CFA，CFA含有150μg MOG35-55及灭活结核分枝杆菌(6mg/mL)；免疫后第0天(当天)和第2天，分别向小鼠腹腔注射200ng和400ng百日咳毒素。
收集WT组和CD44KO组小鼠的粪便样品，采用改进的CTAB方法进行粪便样品中总DNA的提取，提取后的DNA使用Nanodrop 2000(Thermo Scientific)进行浓度及纯度的测定，在MOG35-55肽段免疫后第15天，对小鼠肠道菌群16srRNAV4进行测序分析，判断EAE小鼠肠道菌群组成的变化。
2、实验结果
EAE小鼠肠道菌群组成如图1所示，EAE小鼠肠道菌群组成的变化结果如图2所示，从图1和图2可以看出，CD44KO组和WT组小鼠的肠道菌群组成有显著差异；其中，酸鱼乳杆菌10851的数量在CD44KO小鼠中显著地增高，说明酸鱼乳杆菌10851和EAE/MS的关系最为密切，其在多发性硬化的发病中起关键作用。
实施例2 酸鱼乳杆菌10851对Treg细胞、TH1细胞和TH17细胞分化的影响
CD4辅助性T细胞(T helper，Th)在MS发病过程中被认为起到最重要的作用，Th细胞在病变形成早期就已经出现；Th细胞本身包含很多亚型，如Th1、Th2、Th17、Treg等，已知CD4+T细胞亚群TH1和TH17促进炎症，TH2和Treg则可抑制炎症的发生。细胞因子是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应等生物学功能，其中，IFN-γ、IL-17为常见的炎性细胞因子，具有促炎作用，同时促进CD4+T细胞向TH1和TH17炎性亚群的分化；相反，IL-10和IL-13为抗炎细胞因子，能够促进保护性Treg、TH2细胞产生。
因此，本实施例利用以下方法研究酸鱼乳杆菌10851对Treg细胞、TH1细胞和TH17细胞分化的影响，以测定酸鱼乳杆菌对自身免疫性疾病的治疗作用，具体的实验方法和实验结果如下：
1、实验方法
酸鱼乳杆菌10851或大肠杆菌(以下简称E.coli)在MRS液体细菌培养基中37℃摇菌扩增24h，得酸鱼乳杆菌10851或E.coli菌液，3000g离心5分钟，弃上清，得到酸鱼乳杆菌10851或E.coli沉淀；PBS重悬后继续离心3000g离心5分钟，弃上清后重复洗涤一次后计数酸鱼乳杆菌10851或E.coli的个数；
C57BL/6雌性小鼠(10只)随机分为两组：大肠杆菌组和酸鱼乳杆菌保护组，给所有小鼠均灌喂抗生素(青霉素和链霉素混合液，各1g/L水溶液，100μL，一天一次，连续两天，并同时给予含青霉素和链霉素的水)；在第二次灌喂抗生素的24小时之后，E.coli组和L.acidipiscis组小鼠灌喂6×108个E.coli或酸鱼乳杆菌10851(0.2mL，一天一次，隔天一次，共两次)。7天后，用MOG35-55肽段免疫所有小鼠，建立EAE模型。
EAE免疫15天后，取小鼠肠系膜淋巴细胞进行CD4+FoxP3+Treg细胞FACS检测；用小鼠脾脏单个细胞(无菌)分离得到小鼠幼稚CD4+T细胞，小鼠脾脏幼稚CD4+T细胞将用于体外诱导实验，诱导实验均分两组进行，使用无菌的12孔板进行培养，每孔1×106个CD4+T细胞，30μg/mL的MOG35–55刺激脾细胞24小时，anti-CD3(3μg/mL)包被培养板(4℃包被过夜)，PBS冲洗3次后加入可溶型anti-CD28(3μg/mL)于下列环境培养：
Th1:IL-12(10ng/mL)and anti–IL-4(10μg/mL)；
Th17:TGFβ1(10ng/mL)，IL-6(20ng/mL)，IL-23 at day 3(20ng/mL)；
anti–IL-4(10μg/mL)，anti–IL-12(10μg/mL)，and anti–IFN-γ(10μg/mL)；
第4天，用PMA和混合了monensin的ionomycin刺激细胞4–5小时后用Cytofix/Cytoperm intracellular staining kit进行细胞内染色并通过FACS检测TH1细胞、TH17细胞数量，同时采用ELISA技术检测培养液中细胞因子IFN-γ、IL-17、IL-10和IL-13的含量。
2、实验结果
CD4+FoxP3+Treg细胞FACS检测结果及其在CD4+T细胞中的百分比结果如图3所示，可以看出，与灌胃E.coli的对照组相比，灌胃酸鱼乳杆菌10851的实验组肠系膜中的Treg细胞的数量极显著增多(p＜0.01)，说明酸鱼乳杆菌10851能够显著促进Treg细胞的分化。
E.coli对照组和酸鱼乳杆菌10851(L.acidipiscis)实验组脾脏分离的幼稚CD4+T细胞经体外诱导后，TH1细胞和TH17细胞FACS检测结果及其在CD4+T细胞中的百分比结果如图4所示，可以看出，与对照组相比，实验组TH1细胞和TH17细胞的数量均极显著减少(p＜0.01)，说明酸鱼乳杆菌10851能够显著抑制TH1细胞和TH17细胞的分化。
培养液中细胞因子IFN-γ、IL-17、IL-10和IL-13的含量变化结果如图5所示，可以看出，细胞因子IFN-γ和IL-17的含量均极显著减少(p＜0.01)，而细胞因子IL-10和IL-13的含量均极显著增加(p＜0.01)；说明酸鱼乳杆菌10851能够显著抑制细胞因子IFN-γ和IL-17的产生，而显著促进细胞因子IL-10和IL-13的产生。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.酸鱼乳杆菌在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酸鱼乳杆菌为酸鱼乳杆菌10851。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述酸鱼乳杆菌10851为酸鱼乳杆菌10851活菌体或酸鱼乳杆菌10851培养上清液。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症、格雷夫斯病、自身免疫性肝病、自身免疫性脑炎、甲状腺自身免疫病、自身免疫性肾病、系统性血管炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、溃疡性结肠炎、皮肌炎、硬皮病、强直性脊柱炎或桥本甲状腺炎。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症。
6.根据权利要求1～5任一所述的应用，其特征在于，所述应用为酸鱼乳杆菌在制备促进Treg细胞分化、抑制TH1细胞或TH17细胞分化的药物中的应用。
7.根据权利要求1～5任一所述的应用，其特征在于，所述应用为酸鱼乳杆菌在制备抑制细胞因子IFN-γ或IL-17产生、促进细胞因子IL-10或IL-13产生的药物中的应用。
8.一种治疗自身免疫性疾病的药物，其特征在于，包含有效剂量的酸鱼乳杆菌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酸鱼乳杆菌为酸鱼乳杆菌10851。
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