CN111051888B - 真菌感染的诊断和风险分层 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对侵袭性真菌感染(IFI)/侵袭性真菌疾病(IFD)并且特别是与败血症或败血性休克相关的侵袭性真菌感染(IFI)/侵袭性真菌疾病(IFD)进行诊断和/或风险分层的方法，其中从待检查的患者测定标志物肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR‑proADM)，或包含在标志物组合(组、簇)中者。此外，本发明涉及用于执行所述方法的诊断测定法和试剂盒。

Description

真菌感染的诊断和风险分层
技术领域
本发明涉及一种对真菌感染，特别是与败血症或败血性休克相关的侵袭性真菌感染(下文缩写为“IFI”)和侵袭性真菌疾病(下文简称为“IFD”)进行诊断和/或风险分层的方法，其中从待检查的患者测定标志物肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)，或包含在标志物组合(组、簇)中者。此外，本发明涉及用于执行所述方法的诊断测定法和试剂盒。
背景技术
所述前体肽尤其包含在N端的21个氨基酸的信号序列，被称为“肾上腺髓质素前肽原”(pre-proADM)(Kitamura K,Sakata J,Kangawa K,Kojima M,Matsuo H,Eto T.Cloningand characterization of cDNA encoding a precursor for human adrenomedullin,《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem Biophys Res Commun)1993:194:720-725)。
Pre-proADM包含185个氨基酸，并具有根据SEQ ID No:1的序列(图1)。pre-pro-ADM的已知片段包括PAMP(AA 22-41)(SEQ ID No:2)、MR-pro-ADM(中区肾上腺髓质素原)(AA 45-92)(SEQ ID No:3)、ADM(肾上腺髓质素)(AA 95-146)(SEQ ID No:4)、CTpro-ADM(肾上腺素)(AA153-185)(SEQ ID No:5)和“肾上腺髓质素原”(proADM)(AA 22-185)(SEQID No:6)。
众所周知的肽肾上腺髓质素(ADM)是包含52个氨基酸(SEQ ID No:4)并且包含pre-proADM的第95至146位氨基酸的肽，它由pre-proADM通过蛋白水解裂解形成。然而，不利的是，由于肾上腺髓质素缺乏稳定性，以及其在血浆中的寿命短(Lewis LK,Smith MW,Yandle TG,Richards AM,Nicholls MG.Adrenomedullin measured in human plasma byradioimmunoassay:plasma concentration,adsorption,and storage.《临床化学》(ClinChem.)44:571-7,1998)，通常无法进行可靠的诊断。
迄今为止，在pre-proADM裂解中形成的肽片段中实质上只有少许片段已被更精确地表征，特别是生理活性肽肾上腺髓质素(ADM)和“PAMP”，PAMP是一种包含20个氨基酸(22-41)的肽，其跟在pre-proADM中信号肽的21个氨基酸之后。
此外，现有技术描述了如何在诊断中测定肾上腺髓质素原(proADM)和肾上腺髓质素(EP0622458B1；Lewis LK,Smith MW,Yandle TG,Richards AM,NichollsMG.Adrenomedullin(1-52)measured in human plasma by radioimmunoassay:plasmaconcentration,adsorption,and storage.《临床化学》(Clin Chem)1998；44:571-7；UedaS,Nishio K,Minamino N,Kubo A,Akai Y,Kangawa K等,Increased plasma levels ofadrenomedullin in patients with systemic inflammatory response syndrome.《美国呼吸与重症护理医学杂志》(Am J Respir Crit Care Med)1999；160:132-6；Kobayashi K,Kitamura K,Etoh T,Nagatomo Y,Takenaga M,Ishikawa T等,Increased plasmaadrenomedullin levels in chronic congestive heart failure.《美国心脏杂志》(AmHeart J)1996；131:994-8；Kobayashi K,Kitamura K,Hirayama N,Date H,Kashiwagi T,Ikushima I等,Increased plasma adrenomedullin in acute myocardial infarction.《美国心脏杂志》(Am Heart J)1996；131:676-80.)，特别是用于诊断败血症的目的(EP1121600B1)。
此外，为了诊断目的，在EP1488209B1中公开了肾上腺髓质素原的另一个片段，即所谓的中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)(Struck J,Tao C,Morgenthaler NG,BergmannA.Identification of an Adrenomedullin precursor fragment in plasma of sepsispatients.《肽》(Peptides)2004；25:1369-72；Morgenthaler NG,Struck J,Alonso C,Bergmann A.Measurement of mid-regional pro-adrenomedullin in plasma with animmunoluminometric assay.《临床化学》(Clin Chem)2005；51:1823-9；Christ-Crain M,Morgenthaler NG,Stolz D,Muller C,Bingisser R,Harbarth S等,Pro-adrenomedullinto predict severity and outcome in community-acquired pneumonia[ISRCTN04176397].《重症护理》(CritCare)2006；10:R96；Christ-Crain M,MorgenthalerNG,Struck J,Harbarth S,Bergmann A,Muller B.Mid-regional pro-adrenomedullin asa prognostic marker in sepsis:an observational study.《重症护理》(Crit Care)2005；9:R816-24)。
EP0622458B1中还描述了用于诊断的肾上腺髓质素原(前体)的N端片段，例如PAMP(Hashida S,Kitamura K,Nagatomo Y,Shibata Y,Imamura T,Yamada K等,Developmentof an ultra-sensitive enzyme immunoassay for human pro-adrenomedullin N-terminal peptide and direct measurement of two molecular forms of PAMP inplasma from healthy subjects and patients with cardiovascular disease.《临床生物化学》(Clin Biochem)2004；37:14-21)。
EP2111552B1中也描述了用于诊断的肾上腺髓质素原(前体)的C端片段，即CT-pro-ADM(肾上腺素)。
尽管真菌感染的患者群体似乎很小，但由于免疫功能低下的患者数量不断增加，对具有相关合并症的老年患者进行更积极的外科手术治疗以及肿瘤疾病的数量不断增加，IFI/IFD的数量正在增长(Bassetti M,Righi E,Costa A等,(2006)Epidemiologicaltrends in nosocomial candidemia in intensive care.《BMC传染病》(BMC Infect Dis)6:21)。在这种情况下，在欧洲以下三种真菌物种似乎最相关：白色念珠菌(Candidaalbicans/C.albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata/C.glabrata)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(Lichtenstern C,Herold C,Mieth M等,(2015)Relevance ofCandida and other mycoses for morbidity and mortal ity in severe sepsis andseptic shock due to peritonitis.《真菌病》(Mycoses)58:399-407)。
已知患有IFI/IFD的患者与败血症相关的死亡率很高，对于念珠菌属而言高达42％，并且对于曲霉属(Aspergillus spp.)而言甚至更高(Shorr AF,Gupta V,Sun X等,(2009)Burden of early-onset candidemia:analysis of culture-positivebloodstream infections from a large U.S.database.《重症护理医学》(Crit CareMed)37:2519-2526；quiz 2535,Trof RJ,Beishuizen A,Debets-Ossenkopp YJ等,(2007)Management of invasive pulmonary aspergillosis in non-neutropenic criticallyill patients.《重症护理医学》(Intensive Care Med)33:1694-1703)。
败血症通常是由宿主对感染的反应失调引起的(Singer M,Deutschman CS,Seymour CW等,(2016)The Third International Consensus Definitions for Sepsisand Septic Shock(Sepsis-3).《美国医学会杂志》(Jama)315:801-81)，最常由细菌引起，而真菌或病毒感染则较不常见(Eggimann P,Garbino J,Pittet D(2003)Epidemiology ofCandida species infections in critically ill non-immunosuppressed patients.《柳叶刀传染病》(Lancet Infect Dis)3:685-702)。因此，真菌血症仅存在于未选择的败血症病例的3％中(Eggimann(同上))。反之，真菌是在腹膜炎中从腹部病灶中回收的最常分离的物种之一，并且众多患者在住院期间发生真菌定殖(Eggimann(同上))。
特别是在患有真菌血症的患者中，诊断弱点可能是造成这种惊人死亡率的重要原因。仅一小部分受影响的患者显示出阳性血液培养，并且已知在培养基上的真菌生长非常缓慢。因此，一些研究表明，IFI/IFD在重症患者中最常被漏诊(Combes A,Mokhtari M,Couvelard A等,(2004)Cl inical and autopsy diagnoses in the intensive careunit:a prospective study.《内科学文献》(Arch Intern Med)164:389-392)。
所有这些相当于，错过了挽救生命的抗真菌治疗，或起始延迟了至少2到3天(AbeM,Kimura M,Araoka H等,(2016)Is initial serum(1,3)-beta-d-glucan trulyassociated with mortality in patients with candidaemia？《临床微生物与感染》(Clin Microbiol Infect)22:576)。已知这种延迟与死亡率增加相关。
迄今为止，需要提出一种可靠的IFI/IFD诊断，或进行(风险)分层，特别是在进一步的临床决策方面，尤其是在真菌感染，特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的严重程度方面。
然而，未公开肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)对于IFI/IFD诊断的适用性，同样，也未公开与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的诊断。
发明内容
本发明的目的是提供用于对真菌感染，特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD进行诊断和/或风险分层的改进方法。
该目的通过用于真菌感染，特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的体外诊断和/或风险分层的方法来实现，其中从待检查的患者测定标志物肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)，或包含在标志物组合(组、簇)中者(下文称为根据本发明的方法)。然而，中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)是一个优选的实施方案，并显示出很大的血浆稳定性，这是特别有利的。
根据本发明的所述片段优选是指群组PAMP(SEQ ID No:2)、MR-pro-ADM(中区肾上腺髓质素原)(SEQ ID No:3)、ADM(肾上腺髓质素)(SEQ ID No:4)、CT-pro-ADM(肾上腺素)(SEQ ID No:5)中的至少一种。
此外，根据本发明的肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)可以显示出修饰，例如糖化、脂化或衍生化。
在一个方面，提供了一种用于对侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)进行体外诊断和/或风险分层的方法。所述方法包括从待检查的患者测定肾上腺髓质素原(proADM)(SEQ ID No:6)、其部分肽或片段、或中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)(SEQID No:3)的(i)水平或量，(ii)与参考样本相比的量的变化，或(iii)存在。
在另一方面，提供了一种用于对与败血症和/或败血性休克相关的侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)进行体外诊断和/或风险分层的方法。所述方法包括从待检查的患者测定肾上腺髓质素原(proADM)(SEQ ID No:6)、其部分肽或片段、或中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)(SEQ ID No:3)的(i)水平或量，(ii)与参考样本相比的量的变化，或(iii)存在。
在另一方面，提供了一种治疗侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)的方法。所述方法包括从待检查的患者测定肾上腺髓质素原(proADM)(SEQ ID No:6)、其部分肽或片段、或中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)(SEQ ID No:3)的(i)水平或量，(ii)与参考样本相比的量的变化，或(iii)存在。所述方法还包括，如果检测到proADM或MR-proADM，或者如果proADM或MR-proADM的量超过正常健康患者或具有真菌感染或侵袭性真菌疾病的患者的水平，则对该患者进行治疗。治疗可以包括例如通过静脉内施用向患者施用抗真菌剂。在一些实施方案中，IFI或IFD与败血症或败血性休克相关。在一些实施方案中，抗真菌剂选自多烯抗真菌药(例如(脂质体)两性霉素B)，棘球菌素(例如卡泊芬净)，唑类抗真菌药(例如氟康唑)，烯丙胺和吗啉抗真菌药，以及抗代谢物抗真菌药(例如5-氟胞嘧啶)。
在上述方面的一些实施方案中，其片段选自PAMP(SEQ ID No:2)、MR-proADM(中区肾上腺髓质素原)(SEQ ID No:3)、ADM(肾上腺髓质素)(SEQ ID No:4)和CT-pro-ADM(肾上腺素)(SEQ ID No:5)。
在上述方面的一些实施方案中，侵袭性真菌感染(IFI)或侵袭性真菌疾病(IFD)由念珠菌属、白色念珠菌、光滑念珠菌、曲霉属烟曲霉引起。
在上述方面的一些实施方案中，另外用来自待检查患者的选自以下的至少一种其它标志物和/或临床评分和/或临床参数进行测定：C反应蛋白(CRP)，细胞因子如TNF-α，例如白介素(例如IL-10、IL-6、IL-22、IL17A和IL-17B、白介素-1β)，降钙素原及其片段，心房利钠肽原及其片段(例如ANP和pro ANP)，精氨酸原加压素及其片段(例如AVP、pro-AVP以及和肽素)，血管紧张素II，内皮素-1，葡聚糖，干扰素γ(INF-γ)，β-D-葡聚糖，半乳甘露聚糖，和粘附分子例如VCAM或ICAM，序贯器官衰竭估计评分(SOFA)，简化急性生理评分(SAPSII评分)，急性生理和慢性健康评估II(APACHE II)评分，肺炎严重程度指数(PSI)评分，年龄，性别，家族史，种族，体重，体重指数(BMI)，收缩压，舒张压，心率，体温。
在上述方面的一些实施方案中，对标志物进行平行测定或同时测定。
在上述方面的一些实施方案中，对至少一个患者样本进行测定。
在上述方面的一些实施方案中，使用自动分析设备或诊断测定法进行测定。
在上述方面的一些实施方案中，通过快速检验来进行测定，尤其是利用单参数或多参数测定。
在上述方面的一些实施方案中，患者的分层是针对临床决策，尤其是通过用于处理或治疗侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)，特别是与败血症和/或败血性休克相关的侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)的药物进行进一步治疗。在一些实施方案中，所述患者选自重症患者，特别是由于药物或疾病或由于诱导、增强或抑制免疫应答的手段而被免疫调节的那些患者，包括免疫受损的患者和/或严重的中性粒细胞减少症、癌症患者。
在上述方面的一些实施方案中，对以下中的一项或多项进行诊断和/或风险分层：(i)预后，(ii)预防，(iii)早期检测和通过鉴别诊断进行的检测，(iv)评估严重程度；以及(v)评估侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)，特别是与败血症和/或败血性休克相关的侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)的病程，作为治疗的伴随手段。
在上述方面的一些实施方案中，在出现症状(t＝0)后，截止值(阈值)等于或高于6.99nmol/L，在一天(t＝1d)后，截止值(阈值)等于或高于8.53nmol/L，在两天(t＝2d)后，截止值(阈值)等于或高于5.10nmol/L的肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)，是显著的(特异性的)并且指示所述诊断和/或风险分层。
在上述方面的一些实施方案中，在出现症状(t＝0)后，在一天(t＝1d)后，在两天(t＝2d)后，肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的水平小于5nmol/L表明该患者未患有侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)。
在上述方面的一些实施方案中，在出现症状(t＝0)后，肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的水平小于2nmol/L表明该患者未患有侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)。
在另一方面，提供了用于对侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)，特别是与败血症和/或败血性休克相关的侵袭性真菌感染(IFI)和/或侵袭性真菌疾病(IFD)进行体外诊断和/或风险分层的试剂盒或诊断测定法。所述试剂盒包含用于测定肾上腺髓质素原(proADM)(SEQ ID No:6)或其部分肽或片段，特别是其中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)(SEQ ID No:3)，或包含在标志物组合中者和/或根据权利要求5所述的临床评分和/或临床参数的检测试剂，以及辅助物质。
附图说明
图1示出了preproADM的序列(SEQ ID No.1)以及相关的部分序列和片段。
图2A和图2B示出了败血性休克患者中的白介素(IL)-17A的血浆浓度。在图2A中，在患有败血性休克并伴有真菌感染(灰色方框)、真菌定殖(灰色平面框)或无任何真菌发现(白色框)的患者中测量血浆IL-17A浓度。在败血性休克发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)收集血浆样本。方框图中的数据以须结束时的中位数、第25个百分位数、第75个百分位数与第10个百分位数以及第90个百分位数给出。关于符号表示和更高的显著性等级：p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
图2B示出了所有参与患者在败血症发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)以及第7天(T3)关于预测直至第28天的真菌感染时利用白介素(IL)-17A的接受者操作特征(ROC)。
图3A和图3B示出了败血性休克患者中的中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的血浆浓度。
在图3A中，在患有败血性休克并伴有真菌感染(灰色方框)、真菌定殖(灰色平面框)或无任何真菌发现(白色框)的患者中测量MR-proADM的血浆浓度。在败血性休克发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)收集血浆样本。方框图中的数据以须结束时的中位数、第25个百分位数、第75个百分位数与第10个百分位数以及第90个百分位数给出。关于符号表示和更高的显著性等级：p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
图3B示出了所有参与患者在败血症发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)以及第7天(T3)关于预测直至第28天的真菌感染时利用中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的接受者操作特征(ROC)。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
根据本发明的“诊断”包括确定、监测、确认、亚分类和预测相关疾病、病症、并发症或风险。“确定”涉及意识到疾病、病症、并发症或风险。“监测”涉及跟踪已经被诊断的疾病、病症、并发症或风险，例如分析疾病的进展或特定治疗对疾病或病症的进展的影响。“确认”涉及加强或证实已经使用其它指标或标志物进行的诊断。“亚分类”涉及根据所诊断的疾病、病症、并发症或风险的不同亚类进一步限定诊断，例如根据疾病的轻度和重度形式限定。“预测”涉及在其它症状或标志物变得明显或已经显著改变之前对疾病病症或并发症进行预后。
根据本发明，术语“诊断”可以包括发现具有IFI/IFD，特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD，且预后较差的患者，以进行强化诊断和治疗/处理IFI/IFD，目的是尽可能有利地允许IFI/IFD的进程。
在本发明中，术语“风险分层”涉及根据受试者的进一步预后将受试者分为不同的风险组。风险分层还涉及应用预防和/或治疗措施的分层。
因此，特别有利的是，借助于根据本发明的方法可以进行可靠的诊断和/或风险分层。根据本发明的方法允许做出临床决策，从而导致对重症患者的真菌感染的更快速诊断。根据本发明的方法允许临床决策，其导致对IFI/IFD，特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的更快速诊断。这样的临床决策还包括使用药物进一步治疗，以处理或治疗IFI/IFD，特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD。
适当的治疗要求IFI/IFD的早期诊断和鉴别，特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD，甚至在急诊室就诊时，还要结合临床决策。由于IFI/IFD的临床症状尚不明确，并且最近用于检测真菌病原体的诊断工具也存在相关弱点，因此，由例如细菌或病毒病原体引起的其它传染病的鉴别和划界以及IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的鉴定是必不可少的。
这样的临床决策还包括通过用于处理或治疗IFI/IFD，特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的药物来进一步治疗，其中使用至少一种抗真菌剂，如多烯抗真菌药(例如(脂质体)两性霉素B)，棘球菌素(例如卡泊芬净)，唑类抗真菌药(例如氟康唑)，烯丙胺和吗啉抗真菌药，抗代谢物抗真菌药(例如5-氟胞嘧啶)。
在根据本发明的方法的另一优选实施方案中，进行诊断和/或风险分层以评估真菌感染，特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的病程。
在根据本发明的方法的另一优选实施方案中，在IFI/IFD的病程中进行诊断和/或风险分层，以作为治疗的伴随手段并调整治疗性处理，例如机械通气、肾脏替代治疗或抗真菌治疗。
治疗性处理的调整还可以包括决定是否像以前那样进一步处理受试者或是否适应处理。例如，治疗性处理的调整可以是将受试者保持在重症监护病房(ICU)或急诊室(ED)或是否被释放。
在根据本发明的方法的另一优选实施方案中，根据本发明的实施方案的对IFI/IFD的早期检测或早期诊断是在出现症状(t＝0)之后，或在一天(t＝1d)之内或之后，或在两天(t＝2d)之内或之后进行的。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD进行诊断和/或风险分层的方法，或者涉及根据以上实施方案之一，对IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD进行早期或鉴别诊断或预后的体外诊断方法，其中在出现症状(t＝0)之后，截止值(阈值)等于或高于6.99nmol/L，在一天(t＝1d)后截止值(阈值)等于或高于8.53nmol/L，在两天(t＝2d)后截止值(阈值)等于或高于5.10nmol/L的肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)，是显著的(特异性的)并指示所述诊断和/或风险分层(参见图3)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD进行诊断和/或风险分层的方法，或者涉及根据以上实施方案之一，对IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD进行早期或鉴别诊断或预后的体外诊断方法，其中在出现症状(t＝0)之后，在一天(t＝1d)后，在两天(t＝2d)后，肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)水平小于5nmol/L指示该患者未患有IFI/IFD。因此，患者应通过此类排除诊断来排除IFI/IFD(参见图3)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD进行诊断和/或风险分层的方法，或者涉及根据以上实施方案之一，对IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD进行早期或鉴别诊断或预后的体外诊断方法，其中在出现症状(t＝0)后，肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的水平小于2nmol/L指示该患者未患有IFI/IFD。因此，患者应通过此类排除诊断来排除IFI/IFD(参见图3)。
在本发明的上下文中，“败血症”是指对感染的全身反应。或者，败血症可被视为SIRS与确诊的感染过程或感染的组合。败血症可被表征为由感染和全身性炎症反应共同存在所定义的临床综合征(Levy MM等,2001SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS InternationalSepsis Definitions Conference.《重症护理医学》(Crit Care Med.)2003年4月；31(4):1250-6)。本文使用的术语“败血症”包括但不限于败血症、严重败血症和败血性休克。在这种情况下，严重败血症是指与器官功能障碍相关的败血症、灌注不足异常或败血症引起的低血压。灌注不足异常包括乳酸性酸中毒，少尿和精神状态的急性改变。败血症诱发的低血压定义为在没有其它低血压原因(例如心源性休克)的情况下，存在收缩压小于约90mm Hg或比基线降低约40mm Hg以上。败血性休克定义为严重败血症，尽管有足够的液体复苏，但败血症诱发的低血压持续存在，同时存在灌注不足异常或器官功能异常(Bone RC,BalkRA.,Cerra FB.,Dellinger,RP.,Fein AM.,Knaus WA.,Schein RM.,Sibbald WJ.,Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use ofinnovative therapies insepsis.The ACCP/SCCM Consensus ConferenceCommittee.American College of Chest Physicians/Society of Critical CareMedicine.《胸科学》(Chest)1992,101(6),1644-55)。
术语“败血症”还包括基于SEPSIS-2定义的严重败血症或败血性休克(Bone等,2009)。术语“败血症”还包括属于SEPSIS-3定义的受试者(Singer M.,Deutschmann CS,Seymour CW,Shankar-Hari M,Annane D,Bauer M.,Bellomo R.,Bernard GR,Chiche JD,Coopersmith CM,Hotchkiss RS,Levy MM,Marshall JC,Martin GS,Opal SM,Rubenfeld,van der Poll T,Vincent JL,Angus DC.The Third International ConsensusDefinitions for Sepsis and Septic Shock(Sepsis-3).《美国医学会杂志》(JAMA)2016,315(8),801-810)。
本文使用的术语“败血症”涉及败血症发展中的所有可能阶段。
如本文所用，本发明范围内的“感染”是指由潜在的病原剂/病原体、生物体和/或微生物侵入正常无菌组织或体液引起的病理过程，并且优选地涉及真菌、细菌、病毒和/或寄生虫的感染。因此，感染可以是细菌感染、病毒感染和/或真菌感染。感染可以是局部感染或全身感染。此外，遭受感染的受试者可以同时遭受一种以上的感染源。例如，受试者可以遭受病毒感染和真菌感染；细菌感染和真菌感染，以及细菌感染、真菌感染和病毒感染。
特别地，受试者患有败血症、严重败血症或败血性休克。此外，受试者可能患有呼吸道疾病，优选下呼吸道感染。如本文所用，呼吸道疾病包括影响使高等生物体中的气体交换成为可能的器官和组织的病理状况，并且还包括上呼吸道、气管、支气管、细支气管、肺泡、胸膜和胸膜腔以及呼吸神经和肌肉的状况。
此外，受试者可能患有腹部疾病，优选地是包括胃肠道(胃、大肠、小肠)、肝脏、脾脏和胰腺的腹部区域的感染。
在根据本发明的方法的另一个优选的实施方案中，从待检查的患者中取出体液样本，特别是血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、唾液、痰液和胸腔积液，优选全血、血清或血浆或其混合物，并在体外/离体即在人类或动物体外进行诊断。另外，本领域技术人员将认识到，在分级分离或纯化程序，例如将全血分离成血清或血浆成分之后，将更容易分析一些测试样本。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，样本选自血液样本、血清样本、血浆样本、脑脊髓液样本、唾液样本和尿液样本或任何一种前述样本的提取物。优选地，样本是血液样本，最优选地是血清样本或血浆样本。
诊断和/或风险分层可基于在至少一个患者样本中测定成熟的肾上腺髓质素或肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)，及其存在的量或水平，或与参考相比的量或水平的变化来进行。
在本发明的上下文中，术语“水平”或“量”涉及取自患者的样本中的肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的浓度(优选以重量/体积；w/v表示)。
在本发明的范围内，术语“IFI/IFD”应理解为由欧洲癌症/侵袭性真菌感染(IFI)研究和治疗组织合作组；美国国家过敏和传染病研究所真菌疾病研究组(EORTC/MSG)共识组在2002年和2008年所描述(Ascioglu S,Rex JH,de Pauw B,Bennett JE,Bille J,Crokaert F,Denning DW,Donnelly JP,Edwards JE,Erjavec Z,Fiere D,Lortholary O,Maertens J,Meis JF,Patterson TF,Ritter J,Selleslag D,Shah PM,Stevens DA,WalshTJ；Invasive Fungal Infections Cooperative Group of the European Organizationfor Research and Treatment of Cancer；Mycoses Study Group of the NationalInstitute of Allergy and Infectious Diseases；《临床传染病》(Clin Infect Dis.)2002年1月1日；34(1):7-14.电子出版于2001年11月26日；De Pauw B,Walsh TJ,DonnellyJP,Stevens DA,Edwards JE,Calandra T,Pappas PG,Maertens J,Lortholary O,Kauffman CA,Denning DW,Patterson TF,Maschmeyer G,Bille J,Dismukes WE,Herbrecht R,Hope WW,Kibbler CC,Kullberg BJ,Marr KA,Munoz P,Odds FC,PerfectJR,Restrepo A,Ruhnke M,Segal BH,Sobel JD,Sorrell TC,Viscoli C,Wingard JR,Zaoutis T,Bennett JE；European Organization for Research and Treatment ofCancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group；National Institute ofAllergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group(EORTC/MSG)ConsensusGroup.《临床传染病》(Clin Infect Dis.)2008年6月15日；46(12):1813-21.doi:10.1086/588660)。
在本发明的范围内，术语“IFI/IFD”也具有全身性、一般性、深层、内脏性和严重性的、威胁生命的真菌感染的含义，而不是表面的、局部的、定殖的、良性的、自限性的真菌疾病或感染。
术语“IFI/IFD”涵盖不良事件的风险，如死亡和增加的发病率。如本文所用，术语“患者”是指正在接受医疗护理或者由于疾病而应接受医疗护理的活的人类或非人类生物体。这包括正在接受病理迹象检查的没有明确疾病的人。因此，本文所述的方法和测定法适用于人类和兽医学疾病。
根据本发明的用于诊断或风险分层的优选患者是重症患者，特别是由于药物或疾病或者由于诱导、增强或抑制免疫应答的手段而受到免疫调节的患者，包括免疫功能低下的患者，例如接受移植的患者，重度中性粒细胞减少症患者或癌症患者。因此，对于根据本发明的风险分层，上述患者是优选的。
根据本发明的用于诊断或风险分层的优选患者可以是被诊断患有败血症、严重败血症或败血性休克的重症患者，或具有根据传染病但无明显败血症症状的患者，具有局部感染(例如呼吸道、泌尿道、腹部、皮肤、粘膜、生殖器、中枢神经系统)的患者，接受机械通气、输液、肾脏替代治疗的患者，接受抗真菌治疗的患者，接受外科手术(尤其是肝脏外科手术)的患者，具有肝硬化的患者以及遭受创伤(多发伤)的患者。
本发明的方法可以用于患者管理，指的是：
·入住医院或重症监护病房的决定，
·将患者转移到专科医院或专科医院病房的决定，
·对从重症监护病房或医院提早出院的评估，
·资源分配(例如医师和/或护理人员、诊断、治疗方法)。
因此，本发明涉及对IFI/IFD、特别是由念珠菌属(例如白色念珠菌、光滑念珠菌)、曲霉属(例如烟曲霉)等引起的IFI/IFD的诊断和/或风险分层，所述菌种是造成IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的最常见病原体。
在一个非常优选的实施方案中，本发明涉及与败血症和/或败血性休克相关的IFI/IFD的诊断和/或风险分层。
术语“与败血症和/或败血性休克相关的IFI/IFD”特别包括这些适应症的合并症，即，除了现有的潜在疾病(指数疾病)即IFI/IFD，还有现有的、在诊断上可区分的疾病谱即确定败血症和/或败血性休克，即存在相关的疾病谱。如果及时将抗真菌剂(药物)应用于患者，则该方法可以防止由于首次IFI/IFD引起的败血症和/或败血性休克的不良后果。
在另一个实施方案中，肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的测定可以另外与其它标志物一起进行，其中肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)以标志物组合(组、簇)包含，特别优选地已经指示IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的那些。
为此，本发明涉及根据本发明的方法的一个实施方案，其中另外用来自待检查患者的选自以下的至少一种其它标志物或临床评分或临床参数进行测定：C反应蛋白(CRP)，细胞因子，如TNF-α，例如白介素，例如IL-10、IL-6、IL-22、IL17A和IL-17B，白介素-1β，降钙素原及其片段，心房利钠肽原及其片段(ANP、pro ANP)，精氨酸原加压素及其片段(AVP、pro-AVP、和肽素)，血管紧张素II，内皮素-1，葡聚糖，干扰素γ(INF-γ)，β-D-葡聚糖，半乳甘露聚糖，和粘附分子如VCAM或ICAM，序贯器官衰竭估计评分(SOFA)，简化急性生理评分(SAPSII评分)，急性生理和慢性健康评估II(APACHE II)评分，肺炎严重程度指数(PSI)评分，年龄，性别，家族史，种族，体重，体重指数(BMI)，收缩压，舒张压，心率，体温。
特别地，体液中半乳甘露聚糖的检测被用于诊断人类的侵袭性真菌(曲霉病)感染。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的方法可以通过平行或同时测定标志物(例如具有96个腔以上的多孔滴定板)来进行，其中所述测定是在至少一个患者样本上进行的。
此外，根据本发明的方法及其测定可以使用自动分析设备，尤其是使用Kryptor(B.R.A.H.M.S GmbH，德国亨尼格斯多夫)来进行的。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法及其确定可以借助于快速检验(例如侧流检验)来进行，例如使用单参数或多参数确定。
此外，本发明涉及肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)，或包含在标志物组合(组、簇)中者的用途，其用于对IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD进行体外诊断和/或风险分层。如果需要，标志物组合可以含有另一个合适的标志物。
本文中测定(或测量或检测)肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的水平是使用如下所述的检测方法和/或诊断测定法进行的。
另一个目的是提供相应的诊断测定法，或将这种测定法用于实施根据本发明的方法的用途。
如本文中所提及，“测定法”或“诊断测定法”可以是在诊断领域中应用的任何类型。这样的测定法可以基于待检测的分析物与一种或多种具有特定亲和力的捕获探针(捕获分子)的结合。关于捕获分子与目标分子或相关分子之间的相互作用，亲和常数优选大于108M-1。
此外，标志物可以通过基于质谱的方法来确定，例如确定感兴趣的蛋白质或其片段的相对定量或确定其绝对定量的方法。
相对定量“rSRM”可以通过以下实现：
1.通过比较样本中检测到的给定目标片段肽的SRM(选定反应监测)特征峰面积与至少第二、第三、第四或更多个生物样本中目标片段肽的相同SRM特征峰面积，来确定目标蛋白存在的增加或减少。
2.通过比较样本中检测到的给定目标肽的SRM特征峰面积与源自不同且分离的生物源的其它样本中来自其它蛋白质的片段肽形成的SRM特征峰面积，来确定目标蛋白存在的增加或减少，其中针对一个肽片段的两个样本之间的SRM特征峰面积比较例如相对于每个样本中分析的蛋白质量进行归一化。
3.通过比较给定目标肽的SRM特征峰面积与相同生物样本内源自不同蛋白质的其它片段肽的SRM特征峰面积，来确定目标蛋白存在的增加或减少，以将组蛋白水平的变化相对于在各种细胞条件下不会改变其表达水平的其它蛋白质水平进行归一化。
4.这些测定法可应用于目标蛋白的未修饰片段肽和修饰片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，乙酰化，甲基化(单、二、三)，瓜氨酸化，泛素化，并且其中以与测定未修饰肽的相对量的相同方式来确定修饰肽的相对水平。
给定肽的绝对定量可通过以下实现：
1.将来自单个生物样本中的目标蛋白的给定片段肽的SRM/MRM特征峰面积与从生物样本掺入蛋白质裂解物中的内部片段肽标准物的SRM/MRM特征峰面积进行比较。内标可以是被询问的目标蛋白或被标记的重组蛋白的片段肽的被标记的合成形式。在消化之前(对于重组蛋白是强制的)或之后，将该标准物以已知量掺入样本中，并且可以分别确定生物样本中的内部片段肽标准物和天然片段肽的SRM/MRM特征峰面积，接着比较两个峰面积。这可以应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，乙酰化，甲基化(例如单甲基化、二甲基化或三甲基化)，瓜氨酸化，泛素化，并且其中修饰肽的绝对水平可以与测定未修饰肽的绝对水平相同的方式确定。
2.也可以使用外部校准曲线对肽进行定量。正态曲线法使用恒定量的重肽作为内标，并将变化量的轻质合成肽掺入样本中。需要使用与测试样本相似的代表性基质来构建标准曲线，以解决基质效应。此外，反向曲线方法可避免基质中内源分析物的问题，其中将恒定量的轻肽掺入到内源分析物的顶部以产生内标，并掺入变化量的重肽以产生一组浓度标准。将与正态或反向曲线进行比较的测试样本掺入一定量的标准肽，其量与掺入用于产生校准曲线的基质中的内标相同。
在本发明的上下文中，“捕获分子”是可用于结合样本中的目标分子或感兴趣的分子，即分析物(即在本发明的上下文中为心血管肽)的分子。因此，捕获分子必须在空间上和表面特征(例如表面电荷、疏水性、亲水性、存在或不存在路易斯供体和/或受体)方面充分成形，以特异性结合目标分子或感兴趣的分子。因此，结合可以例如通过捕获分子与目标分子或感兴趣的分子之间的离子、范德华、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或者上述相互作用中的两种或更多种的组合来介导。在本发明的上下文中，捕获分子可以例如选自包括核酸分子、碳水化合物分子、RNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白的群组。优选地，捕获分子是抗体，包括其与感兴趣的靶标或分子具有足够亲和力的片段，并且包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或源自其长度为至少12个氨基酸的变体链的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。
优选的检测方法包括各种形式的免疫测定法，例如放射免疫测定法(RIA)、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于的珠粒阵列、蛋白质微阵列测定法和快速检验形式，例如免疫层析条带检验。
所述测定法可以是同质或异质测定法，竞争性和非竞争性夹心测定法。在一个特别优选的实施方案中，所述测定法为夹心测定法的形式，其为非竞争性免疫测定法，其中待检测和/或定量的分子与第一抗体和第二抗体结合。所述第一抗体可以结合至固相，例如珠粒，孔或其它容器的表面，芯片或条带，并且第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适当的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。“夹心测定法”涉及的一般组成和程序是本领域技术人员公认且已知的。(The ImmunoassayHandbook,David Wild编,Elsevier LTD,Oxford；第3版(2005年5月)；Hultschig C等,《化学生物学最新观点》(Curr Opin Chem Biol.)2006年2月；10(1):4-10))。
在一个特别优选的实施方案中，所述测定法包含至少一个或两个捕获分子，优选抗体，它们均以分散体的形式存在于液体反应混合物中，其中第一标记组分连接至第一捕获分子，其中所述第一标记组分是基于荧光猝灭或化学发光猝灭或扩增的标记系统的一部分，并且将所述标记系统的第二标记组分连接到第二捕获分子，以便在两个捕获分子与分析物结合后产生可测量的信号，从而允许检测包含样本的溶液中所形成的夹心复合物。
甚至更优选地，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料，特别是花青型染料的组合。
在本发明的上下文中，基于荧光的测定法包括使用染料，其可以例如选自包括以下的群组：FAM(5-羧基荧光素或6-羧基荧光素)，VIC，NED，荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，IRD-700/800，花青染料如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7，黄原(Xanthen)，6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)，TET，6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲基荧光素(JOE)，N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)，5-羧基罗丹明-6G(R6G5)，6-羧基罗丹明-6G(RG6)，罗丹明，罗丹明绿，罗丹明红，罗丹明110，BODIPY染料如BODIPY TMR，俄勒冈州绿，香豆素如伞形酮，苯甲酰亚胺如Hoechst 33258；菲啶，如得克萨斯红、Yakima黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭，吖锭染料，咔唑染料，吩噁嗪染料，卟啉染料，聚次甲基染料等。
在本发明的上下文中，基于化学发光的测定法包括染料的使用，其基于在Kirk-Othmer,《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology),第4版,执行编辑J.I.Kroschwitz；编辑M.Howe-Grant,John Wiley&Sons,1993,第15卷,第518-562页中关于化学发光材料所述的物理原理。优选的化学发光染料是吖锭酯。
在本发明的范围内，这种诊断测定法在最广泛的意义上特别理解为用于实施根据本发明的方法的设备。
在本发明的范围内，用于检测和测量生物标志物的诊断测定法可以与用于检测真菌病原体或真菌分子的测定方法相结合。为了检测真菌病原体或真菌分子，可以应用分子诊断应用(例如PCR)或质谱法。而且，优选抗体或检测剂，其特异性地检测真菌的一部分，特别是例如活性的生长中的真菌的一部分，例如菌丝，或无性生殖体的一部分，例如孢子(所谓的ISCA诊断)。
本发明还涉及一种试剂盒或这种试剂盒在IFI/IFD、特别是与败血症或败血性休克相关的IFI/IFD的体外诊断或风险分层中的用途，其中特别是考虑到上述实施方案，在待研究的患者中测定肾上腺髓质素原(proADM)或其部分肽或片段，特别是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)，或包含在标志物组合(组、簇)中者。此类检测试剂包含捕获分子如抗体等。
本发明的方法可以部分地由计算机实现或由计算机系统支持。在计算机系统中，所测定的标志物水平可以与受试者的其它标志物水平和/或参数组合，以计算指示诊断、预后、风险评估和/或风险分层的评分。例如，所测定的值可以被输入(由医疗专业人员手动输入或者由已经测定了相应标志物水平的设备自动输入)到计算机系统中。所述计算机系统可以直接位于护理点(例如ICU或ED)，或者其可以位于经由计算机网络(例如经由互联网)连接的远程位置。通常，计算机系统将值(例如标志物水平或诸如年龄、血压、体重、性别等参数)存储在计算机可读介质上，并基于预定义和/或预存储的参考水平或参考值来计算评分。所得评分将为用户(通常是医疗专业人员，例如医师)显示和/或打印。替代地或另外，将为用户(通常是医疗专业人员，例如医师)显示和/或打印相关的预后、诊断、评估或分层。
以下实施例和附图用于更详细地解释本发明，但本发明不限于这些实施例和附图。在说明书中任何地方使用这些和其它实施例仅是说明性的，而绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样，本发明不限于这里描述的任何特定的优选实施方案。实际上，在阅读本说明书后，本发明的许多修改和改变对本领域技术人员而言是显而易见的，并且在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以作出这种改变。因此，本发明仅由所附权利要求的条款以及那些权利要求所赋予的等同物的全部范围来限制。
实施例：
实施例1
研究设计。观察性临床研究已获得当地伦理委员会(海德堡医学院伦理委员会，试验代码S-097/2013/德国临床试验注册号：DRKS00005463)的批准，并于2013年11月至2015年1月之间在德国海德堡大学医院外科重症监护室进行。所有研究患者或其法定代理人均签署了知情同意书。在该研究中，根据《败血症生存运动：2012年国际严重败血症和败血性休克管理指南》(Surviving Sepsis Campaign:International Guidelines forManagement of Severe Sepsis and Septic Shock 2012)的标准，总共招募了50名患有败血性休克的患者(Dellinger RP,Levy MM,Rhodes A等,(2013)Surviving sepsiscampaign:international guidelines for management of severe sepsis and septicshock:2012.Crit Care Med41:580-637)。败血性休克患者的治疗包括早期目标指导治疗(Romani L(2004)Immunity to fungal infections.《自然评论：免疫学》(Nat RevImmunol)4:1-23)，消除败血症病灶和广谱抗菌(Romani L(2004)Immunity to fungalinfections.《自然评论：免疫学》(Nat Rev Immunol)4:1-23；Schroeder M,Simon M,Katchanov J等,(2016)Does galactomannan testing increase diagnostic accuracyfor IPA in the ICU？A prospective observational study.《重症护理》(Crit Care)20:139；Zedek DC,Miller MB(2006)Use of galactomannan enzyme immunoassay fordiagnosis of invasive aspergillosis in a tertiary-care center over a 12-monthperiod.《临床微生物学杂志》(J Clin Microbiol)44:1601)。
在败血症发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)收集血液样本。收集了相关基线数据(人口统计学数据、主要感染部位)，临床数据(疾病严重程度评分，如简化急性生理评分(SAPS II)、序贯器官衰竭估计评分(SOFA)和急性生理健康评估评分(APACHE II)，手术程序，抗真菌治疗，结果参数)以及常规感染参数(例如白细胞、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、体温)。
免疫测定法。使用试剂盒(Pyroquant Diagnostik GmbH)根据制造商的说明书来测量BG的血浆浓度。MR-proADM的血浆浓度是使用TRACE(时间分辨扩增穴状化合物发射)技术与新型夹心免疫测定法(Kryptor Compact Plus分析仪，BRAHMS，德国亨尼格斯多夫)结合测量的。在所有患者中，所有时间点的血浆样本中的GM浓度均采用酶联免疫测定法(PlateliaTM Aspergillus AG，Biorad，慕尼黑)进行测量。使用相同的技术测量支气管肺泡灌洗液(BALF)中的GM浓度，但仅在怀疑为侵袭性曲霉病(IA)的选定病例中进行。以下GM浓度用作截止值：血浆>0.5，BALF>1.0。
流式细胞术。在FACSVerse流式细胞仪(BD Biosciences，德国海德堡)上根据制造商的说明书使用多重测定法(人类Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒，BD Biosciences，德国海德堡)测量II-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α和IFN-γ的血浆浓度。
临床微生物学。
血液培养。在海德堡大学医院如其它地方所述常规进行血液培养测试(GumbingerC,Hug A,Murle B等,(2013)Early blood-based microbiological testing wasineffective in severe stroke patients.《神经科学杂志》(J Neurol Sci)325:46-50)。
使用无菌技术经由直接静脉穿刺(例如肘前静脉)获得全血样本，并且将10mL血液接种到需氧和厌氧液体培养基(BACTEC PLUS，BD Biosciences，德国海德堡)中。将培养物温育5天(BACTEC，BD Biosciences，德国海德堡)，并根据批准的内部医院标准技术对阳性培养物进行分析，包括通过VITEK2(Biomerieux，德国努尔丁根)或MALDI TOF(Bruker，美国威斯康星州麦迪逊)和自动化抗微生物敏感性测试(VITEK 2)鉴定。
在气管分泌物、伤口拭子和引流液中基于培养物的诊断程序。
简言之，将气管抽吸物和引流液手动涂在Columbia(BD)、巧克力(bM)、MacConkey(bM)、Schaedler和卡那霉素-万古霉素(BD，双板)和发色念珠菌琼脂(BD)上，同时通过PREVI IsolaTM仪器在相同琼脂类型上对伤口拭子进行半自动接种。除了如所述将Schaedler-KV双板在厌氧室(GasPak；Becton，美国新泽西州富兰克林湖狄金森)中于37℃温育48小时之外，所有板都在5％CO2中于37℃温育24至48小时(Mischnik A,Mieth M,Busch CJ等,(2012)First evaluation of automated specimen inoculation for woundswab samples by use of the Previ Isola system compared to manual inoculationin a routine laboratory:finding a cost-effective and accurate approach.《临床微生物学杂志》(J Clin Microbiol)50:2732-2736)。通过MALDI-ToF质谱法鉴定细菌和真菌菌落，并在VITEKII仪器(bM)上进行自动AST。
群组定义。呼吸道或引流液中的念珠菌属被分类为定殖。在伴有肺浸润的深呼吸道标本中血液培养、术中拭子和曲霉属菌均呈阳性结果被分类为感染。
抗念珠菌抗体滴度。使用Behring ELISA处理器(BEP III，Siemens HealthcareDiagnostics，德国马尔堡)如制造商说明书中所述使用Serion ELISA classicTM白色念珠菌IgA/lgG/lgM(ESR 117A/G/M，Virion Serion，德国维尔茨堡)检测并定量血清中的白色念珠菌特异性IgM、IgA和IgG抗体(Zou M,Tang L,Zhao S等,(2012)Systematic reviewand meta-analysis of detecting galactomannan in bronchoalveolar lavage fluidfor diagnosing invasive aspergillosis.PLoS One 7:e43347)。
统计分析。将所得数据输入电子数据库(Excel 2010；Microsoft公司，美国雷德蒙德)，并使用SPSS软件(21.0版；SPSS公司，美国芝加哥)进行评估。使用绝对频率和相对频率汇总分类数据。量化数据使用附有四分位数的中位数进行汇总。Kolmogorov-Smirnov检验用于检查正态分布。由于非正态分布的数据，因此使用非参数方法进行评估(对于分类数据为卡方检验，对于连续数据为Mann-Whitney U检验)。使用ROC分析计算出用于检测真菌感染的适当截止值。P值<0.05被认为具有统计学显著性。关于符号表示和更高的显著性等级：p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
结果
患者特征。本研究中纳入总共50名败血性休克患者。表1中呈现了患者的特征。潜在的败血症病灶是腹部(n＝43；86％)，其次是肺(n＝6；12％)以及泌尿生殖道(n＝1；2％)。28天和90天的总死亡率分别是22％(n＝11)和34％(n＝17)。ICU停留时长以及住院时长的中位数分别是20天和44天。
表1.患者特征(n＝50)
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数据以数字(带有相应的百分比值)或中位数(附有四分位数)呈现。
真菌病原体和感染部位。
基于培养物的微生物学诊断。通过基于培养物的微生物学诊断评估，真菌病原体存在于33名患者(66.0％)中，而17名患者(34.0％)显示阴性真菌培养物。分别在25名(75.8％)或8名(24.2％)的患者中的一个或多个位置发现了真菌分离株，它们位于以下部位：呼吸道(n＝17；51.5％)、腹部(n＝21；63.6％)和血液培养物(n＝3；9.1％)。表1呈现了具有或不具有真菌病原体的患者的特征。在纳入研究之前，具有真菌病原体的患者接受了肝脏手术的可能性更高，并且肾脏替代疗法的需求已显著增加。关于发病率的其它标志物，真菌阳性患者显示机械通气持续时间显著延长，并且气管切开术的需求倾向于增加。此外，具有真菌病原体的患者的ICU停留时长和住院时长均显著延长。令人惊讶的是，不具有真菌病原体的患者的28天死亡率显著增加，而90天死亡率显示相当。
根据方法章节中所述的群组定义，分别在22名(44.0％)和11名(22.0％)患者中发现了定殖和感染。在定殖患者中，有8名(16.0％)参与者仅在呼吸道分泌物中显示念珠菌属(5x白色念珠菌，1x白色念珠菌和光滑念珠菌，2x白色念珠菌和念珠菌属)，而在6名(12.0％)患者中仅可从引流液中培养念珠菌属(3x白色念珠菌，2x光滑念珠菌，1x白色念珠菌和光滑念珠菌)。反之，有8名(16.0％)患者在两方面定殖(4x白色念珠菌，1x白色念珠菌和念珠菌属，3x白色念珠菌和光滑念珠菌)。在感染患者中，在3名(6.0％)患者(2x白色念珠菌，1x光滑念珠菌)中发现了真菌血症，并且7名(14.0％)患者(4x白色念珠菌，1x光滑念珠菌，1x克柔念珠菌，1x白色念珠菌和光滑念珠菌)发现了阳性腹部伤口拭子。此外，在1名(2.0％)患者中，在呼吸道分泌物中分离出烟曲霉。关于风险因素，在真菌感染患者中，在纳入研究之前进行肝脏手术以及观测到肝硬化的可能性更高。此外，在遭受真菌感染的患者中，ICU停留以及机械通气持续时间显著延长，并且气管切开术的需求显著增加。尽管显示发病率增加，但感染和未感染患者在28天和90天的死亡率没有显著差异。
抗真菌治疗。在研究参与期间，50名患者中共有21名(42.0％)接受了抗真菌治疗。在不具有任何真菌分离株的17名患者中，有2名(11.8％)患者接受了经验性抗真菌治疗。在其余的33名具有真菌分离株的患者中，有19名(57.6％)接受了抗真菌治疗，其中有15名(78.9％)患者开始特异性治疗。反之，在其余4例(21.1％)中，根据经验疗法开始治疗，随后在所有这些患者中停止治疗。在7名(33.3％)患者中，最初的抗真菌治疗在疾病过程中发生了变化。
(1,3)-β-D-葡聚糖(BG)。在整个研究期间，三个亚组之间的BG血浆浓度相当，因此无法预测真菌感染的诊断价值(数据未示出)。即使在患有念珠菌血症的患者中，BG血浆浓度也没有可靠地增加。
半乳甘露聚糖(GM)。50名患者中有46名(92.0％)的GM血浆浓度仍低于<0.5的截止值。相反，有4名患者(8.0％)的GM血浆浓度偶尔升高，超过了截止值，而没有IA的任何其它(临床、放射、培养)征象或风险因素(数据未示出)。在这些情况下，GM血浆浓度升高最有可能归因于潜在的抗生素疗法(例如哌拉西林-他唑巴坦)，众所周知这与GM浓度升高有关(Boonsarngsuk,V.；Niyompattama,A.；Teosirimongkol,C.；Sriwanichrak,K.False-positive serum and bronchoalveolar lavage aspergillus galactomannan assayscaused by different antibiotics.Scand.《传染病杂志》(J.Infect.Dis.)2010,42,461-468；Metan,G.The interaction between piperacillin-tazobactam and aspergillusgalactomannan antigenemia assay:Is the story over？《感染》(Infection)2013,41,293-294)。
如通过对BALF中的烟曲霉进行培养检测所评估，一名患者表现出IA诊断，这通过高分辨率计算机断层扫描技术得到证实。此外，BALF中的GM浓度增加到截止值以上，而GM血浆浓度在所有时间点都保持在截止值以下。除了败血性休克以及每名男性已有的肥胖症和胰岛素依赖性糖尿病外，患者没有患IA的经典易患风险因素(例如中性粒细胞减少症，用细胞毒剂治疗的血液肿瘤疾病，皮质类固醇摄入，先天性或后天性免疫缺陷)。所述患者用脂质体两性霉素B治疗6周，这导致BALF中的GM降至截止值以下。而且，在治疗期结束后，BALF的培养对于烟曲霉仍保持阴性。
抗念珠菌抗体滴度。在没有任何真菌发现的患者亚组(n＝17)中，有4名患者(23.5％)呈现“假”阳性抗念珠菌抗体滴度(>1:320)，而定殖患者(n＝22)中81.8％(n＝18)显示阳性测试结果。遭受真菌感染的患者(n＝11)也有81.8％(n＝9)显示阳性测试结果，但不幸的是，两名呈现念珠菌血症的患者(在败血症发作时)未显示出阳性抗念珠菌抗体滴度。
关于真菌免疫，应特别注意INF-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17以及MR-proADM的血浆水平。从败血症发作后的第7天(T3)开始，与两个对照组相比，真菌感染患者的促炎性细胞因子INF-γ血浆水平分别显著升高。这种INF-γ增加与感染患者中免疫抑制性细胞因子IL-10和IL-4的大量释放同时发生。与在不同时间点具有真菌定殖或没有任何真菌发现的败血症患者相比，真菌感染患者的血浆IL-6水平显著升高，尤其是在疾病的早期阶段(例如在T0、T1时)。同时，与败血症发作后前7天内具有真菌定殖或没有任何真菌发现的败血症患者相比，遭受真菌感染的败血症患者中IL-17A显著增加(图2A)。
因此，如通过ROC分析所评估，发现IL-17A是适用于早期鉴定真菌感染患者的工具(真菌感染患者相对于非感染患者的ROC-AUC(＝不具有任何真菌分离株的患者+定殖患者)，例如在t0：0.714；截止值14.165pg/ml→敏感性0.818；1-特异性0.323，t1：0.776；截止值：14.22pg/ml→敏感性0.818；1-特异性0.29，t2：0.865；截止值15.00pg/ml→敏感性0.818；1-特异性0.194，等等)(图2B)。
MR-proADM的血浆水平也是如此，与定殖患者以及无任何真菌发现的患者相比，感染患者中的MR-proADM血浆水平显著增加(图3A)。因此，如通过接收者操作特征(ROC)分析所评估，表明MR-proADM是适用于鉴定真菌感染患者的工具(真菌感染患者相对于非感染患者(＝参见上文)的ROC曲线下面积(AUC)，例如，在t0：0.738；截止值：6.99nmol/l→敏感性0.727；1-特异性0.333，t1：0.755；截止值：8.53nmol/l→敏感性0.727；1-特异性0.212，t2：0.774；截止值5.10nmol/l→敏感性0.818；1-特异性0.273，等等)(图3B)。
表2.不同感染和炎症标志物的血浆水平。
数据以附有四分位数(Q1、Q3)的中位数呈现。
图例：+＝无真菌分离株的患者相对于定殖患者，++＝无真菌分离株的患者相对于感染患者，+++＝定殖患者相对于感染患者。在败血性休克发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)时收集血浆样本，p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
数据以附有四分位数(Q1、Q3)的中位数呈现。
图例：+＝无真菌分离株的患者相对于定殖患者，++＝无真菌分离株的患者相对于感染患者，+++＝定殖患者相对于感染患者。在败血性休克发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)时收集血浆样本，p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
数据以附有四分位数(Q1、Q3)的中位数呈现。
图例：+＝无真菌分离株的患者相对于定殖患者，++＝无真菌分离株的患者相对于感染患者，+++＝定殖患者相对于感染患者。在败血性休克发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)时收集血浆样本，p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
数据以附有四分位数(Q1、Q3)的中位数呈现。
图例：+＝无真菌分离株的患者相对于定殖患者，++＝无真菌分离株的患者相对于感染患者，+++＝定殖患者相对于感染患者。在败血性休克发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)时收集血浆样本，p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
数据以附有四分位数(Q1、Q3)的中位数呈现。
图例：+＝无真菌分离株的患者相对于定殖患者，++＝无真菌分离株的患者相对于感染患者，+++＝定殖患者相对于感染患者。在败血性休克发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)时收集血浆样本，p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
数据以附有四分位数(Q1、Q3)的中位数呈现。
图例：+＝无真菌分离株的患者相对于定殖患者，++＝无真菌分离株的患者相对于感染患者，+++＝定殖患者相对于感染患者。在败血性休克发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)时收集血浆样本，p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
数据以附有四分位数(Q1、Q3)的中位数呈现。
图例：+＝无真菌分离株的患者相对于定殖患者，++＝无真菌分离株的患者相对于感染患者，+++＝定殖患者相对于感染患者。在败血性休克发作(T0)以及其后第1天(T1)、第2天(T2)、第7天(T3)、第14天(T4)、第21天(T5)和第28天(T6)时收集血浆样本，p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：***。
本发明的范围不受本文描述的具体实施方案的限制。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前述描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。还应理解，所有值均为近似值，并提供用于描述。
在整个本申请中引用了专利、专利申请、出版物、产品描述和方案，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
序列表
<110> B.R.A.H.M.S GmbH
University Heidelberg
<120> 侵袭性真菌感染的诊断和风险分层
<130> BRA65WO
<140> EP17185036.5
<141> 2017-08-04
<160> 6
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 185
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe
1 5 10 15
Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys
20 25 30
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35 40 45
Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala
50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr
115 120 125
Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln
130 135 140
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Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu
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<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
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1 5 10 15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
20 25 30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
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<211> 52
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
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35 40 45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 5
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro
1 5 10 15
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20 25 30
Leu
<210> 6
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1 5 10 15
Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro
20 25 30
Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg
35 40 45
Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro
50 55 60
Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn
65 70 75 80
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Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp
100 105 110
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130 135 140
Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala
145 150 155 160
Pro His Phe Leu

Claims (19)

1.测定中区肾上腺髓质素原MR-proADM的检测试剂在制备用于对具有败血症的患者中的侵袭性真菌感染进行体外诊断和/或风险分层的产品中的用途，包括：
从所述患者提供血液样品；
测定MR-proADM的水平；
其中样品中MR-proADM的水平等于或高于阈值时指示所述患者具有侵袭性真菌感染；
其中样品中MR-proADM的水平低于阈值时指示所述患者不具有侵袭性真菌感染；和/或
其中样品中MR-proADM的水平指示风险分层，所述分层包括根据侵袭性真菌感染的预后将患者分为风险组。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述败血症是败血性休克。
3.根据权利要求1所述的用途，
其特征在于所述侵袭性真菌感染是由念珠菌属(Candida spp.)的真菌和/或曲霉属(Aspergillus spp.)的真菌引起的。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于念珠菌属(Candida spp.)的真菌选自白色念珠菌(C.albicans)和光滑念珠菌(C.glabrata)。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于曲霉属(Aspergillus spp.)的真菌是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。
6.根据权利要求1或3所述的用途，
其特征在于
另外从待检查的患者用选自以下的至少一种其它标志物进行测定：C反应蛋白，TNF-α，IL-10，IL-6，IL-22，IL17A，IL-17B，白介素-1β，降钙素原及其片段，心房利钠肽原，心房利钠肽，精氨酸原加压素，精氨酸加压素，肽素，血管紧张素II，内皮素-1，葡聚糖，干扰素γ，β-D-葡聚糖，半乳甘露聚糖，VCAM和ICAM。
7.根据权利要求6所述的用途，
其特征在于
另外从待检查的患者用选自以下的至少一种临床评分进行测定：序贯器官衰竭估计评分，简化急性生理评分，急性生理和慢性健康评估II评分，和肺炎严重程度指数评分。
8.根据权利要求7所述的用途，
其特征在于
另外从待检查的患者用选自以下的至少一种临床参数进行测定：年龄，性别，家族史，种族，体重，体重指数，收缩压，舒张压，心率，和体温。
9.根据权利要求6所述的用途，
其特征在于
进行MR-proADM和所述至少一种其它标志物的平行或同时测定。
10.根据权利要求6所述的用途，
其特征在于
对至少一个患者样本进行测定。
11.根据权利要求1或3所述的用途，
其特征在于
使用诊断测定法进行测定。
12.根据权利要求1或3所述的用途，
其特征在于
使用自动分析设备进行测定。
13.根据权利要求1或3所述的用途，
其特征在于通过快速检验进行测定，利用单参数或多参数测定。
14.根据权利要求1或3所述的用途，
其特征在于患者分层包括通过用于处理或治疗侵袭性真菌感染的药物的进一步治疗。
15.根据权利要求14所述的用途，
其中所述患者是由于药物或疾病或由于诱导、增强或抑制免疫应答的手段而受到免疫调节的重症患者。
16.根据权利要求1或3所述的用途，
其特征在于诊断和/或风险分层包括预后，预防，早期检测和通过鉴别诊断进行检测，用于评估严重程度，以及用于评估侵袭性真菌感染的病程。
17.根据权利要求1或3所述的用途，
其特征在于在出现症状后，阈值等于或高于6.99nmol/L的MR-proADM，在一天后，阈值等于或高于8.53nmol/L的MR-proADM，在两天后，阈值等于或高于5.10nmol/L的MR-proADM，这对于所述诊断和/或风险分层来说是显著的。
18.根据权利要求1或3所述的用途，
其特征在于在出现症状后，在一天后，或在两天后，MR-proADM的水平小于5nmol/L指示所述患者未患有侵袭性真菌感染。
19.根据权利要求1或3所述的用途，
其特征在于在出现症状后，MR-proADM的水平小于2nmol/L指示所述患者未患有侵袭性真菌感染。
CN201880050696.5A 2017-08-04 2018-08-06 真菌感染的诊断和风险分层 Active CN111051888B (zh)

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