CN111034711B

CN111034711B - 高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法

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Publication number: CN111034711B
Application number: CN201911318425.6A
Authority: CN
Inventors: 李锋; 苏学明; 许嘉慧; 谢朝岱; 厉大伟
Original assignee: Hainan Yiling Medical Industry & Development Co ltd
Current assignee: Hainan Yiling Medical Industry & Development Co ltd
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN111034711A

Abstract

本发明提供一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法，该组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素和至少两种抗菌剂组成；本发明提供的组合物及方法在不灭活、无需判断污染源且保证细胞活性的基础上，可强效清除大部分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、支原体，解除细胞系污染状态并使其能够再次被利用。

Description

高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，特别涉及一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法。

背景技术

细胞培养是体外扩增细胞的一种常规实验技术，细胞培养成功的关键之一是控制污染，细菌、真菌、支原体都是引起培养细胞污染的微生物。

目前培养的细胞一旦发生细菌、真菌或支原体污染，研究人员大多的解决方式是灭活后丢弃。重新复苏冻存细胞再培养传代。但是如果细胞是非常珍贵无法替代的，上述操作存在巨大的浪费。如何在发现污染后，成功挽救珍稀细胞系，是许多实验室遇到的难题。

抗生素的联合用药由来已久，抗生素联合应用的目的是在于获得最佳协同作用，提高疗效。联合用药时应根据杀菌的机理及抑菌的快慢进行合理组合，通常繁殖期杀菌剂加静止期杀菌剂有协同作用，繁殖期杀菌剂和速效抑菌剂有拮抗作用，繁殖期杀菌剂加慢效抑菌剂无影响，静止期杀菌剂加速效抑菌剂有协同使用，速效抑菌剂加慢效抑菌剂有协同作用。在用药时应发挥协同和相加作用，避免拮抗。传统理论认为，三种或更多抗生素联合对药效的增益不明显，甚至药物之间的相互作用会导致它们丧失基本的疗效。

传统清除微生物污染的方法手段相当有限。当发现污染时，微生物已进入快速增殖期，随着时间的持续，对细胞系的毒性也会随之加大。研究人员必须迅速做出决策-判定污染源及使用的抗生素方案。此时所做的决策往往是主观经验性的，所使用的抗生素组合经常为青链霉素、环丙沙星、庆大霉素、两性霉素B等抗生素中1-2种。添加抗生素后，微生物的增殖虽被一定程度的抑制，但离杀灭还有一段时间过程，期间微生物的代谢产物对培养中的细胞毒害作用仍旧持续。

由于上述方法学的限制：无法准确快速判断污染的微生物种类和数量、无法准确快速判断污染的微生物对应用抗生素的敏感性、使用抗生素选择的组合方案起效时间缓慢，以致错失最佳的细胞拯救时间、清除污染的成功率低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法。

本发明其中一个技术方案提供一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素和至少两种抗生素组成。

利用多种抗生素的联用能有效对抗耐药细菌；整体产生的效果比单个成分效果的总和好。利用抗生素组合处理方案，最终可解除细胞系污染状态并使其能够再次被利用，并有效避免细胞资源的浪费。

进一步改进的方案中，所述抗生素选自多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂、棘白菌素类抗生素或青霉素类抗生素。

进一步改进的方案中，所述组合物由质量比为1-100:5-60:10-80:10-80:0.0025-5:0.01-4的喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂组成；优选由质量比为6:20:15:12:2:0.8的喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂组成。

进一步改进的方案中，所述组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、棘白菌素类抗生素和青霉素类抗生素组成，其中喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、棘白菌素类抗生素和青霉素类抗生素的比例为1-100μg：50-200IU：0.25-25μg：50-200IU；优选为6μg：100IU：15μg：100IU。

进一步改进的方案中，所述喹诺酮类抗生素选自诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、左旋氧氟沙星、培氟沙星、二氟沙星、达诺沙星、莫西沙星、克林沙星、吉米沙星、加替沙星或曲伐沙星中的一种；优选莫西沙星；

所述氨基糖苷类抗生素选自硫酸新霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素或阿米卡星中的一种；优选阿米卡星或链霉素；

所述多肽类抗生素选自选自多粘菌素B、多粘菌素E、杆菌肽、短杆菌肽或万古霉素中的一种；优选万古霉素；

所述头孢菌素类抗生素选自头孢克肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他定、头孢哌酮、头孢他美酯、头孢米诺钠、头孢匹罗或头孢吡肟中的一种；优选头孢曲松；

所述吡格类抗生素选自咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑或泊沙康唑中的一种；优选伊曲康唑；

所述嘧啶类抗菌剂选自氟胞嘧啶；

所述棘白菌素类抗生素选自卡泊芬净、米卡芬净或阿尼芬净中的一种；优选米卡芬净；

所述青霉素类抗生素选自氨苄西林钠、阿莫西林、青霉素、羧苄西林、哌拉西林、美西林或替莫西林中的一种；优选青霉素。

本发明所述的抗生素及其类似物、衍生药、前药、代谢物和药物活性盐，可通过微生物发酵、化学改造、化学合成或商业途径得到。

本发明另一个技术方案提供一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的冻存液，该冻存液包括85％-95％无血清培养基或完全培养基、5％-15％DMSO和高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物。

其中无血清培养基包括但不限于LONZA12-725FμItraCΜLTΜREM；完全培养基包括但不限于由90％的DMEM和10％的FBS组成。

进一步改进的方案中，高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂组成；其在冻存液内的终浓度分别为：喹诺酮类抗生素1-100μg/mL，优选6μg/mL，氨基糖苷类抗生素5-60μg/mL，优选20μg/mL，多肽类抗生素10-80μg/mL，优选15μg/mL、头孢菌素类抗生素10-80μg/mL，优选12μg/mL、吡格类抗生素0.0025-5μg/mL，优选2μg/mL、嘧啶类抗菌剂0.01-4μg/mL，优选0.8μg/mL。

本发明所提供的冻存液一方面可直接中断微生物的增殖趋势，暂停微生物对培养细胞的毒害作用。同时为抗生素的起效争取足够的时间。另一方面，本发明所述的冻存液含有一组具有协同增效作用的抗真菌、细菌、支原体的抗生素组合物。抗生素联合起到更佳的效果，在抗生素选择压力及时间压力下，逐步清除污染。

本发明另一个技术方案提供一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的复苏培养液，所述复苏培养液包括100％完全培养基和高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物。

进一步改进的方案中，高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、棘白菌素类抗生素和青霉素类抗生素组成，其在复苏培养液内的终浓度分别为喹诺酮类抗生素1-100μg/mL，优选6μg/mL，氨基糖苷类抗生素50-200IU/mL，优选100IU/mL，棘白菌素类抗生素0.25-25μg/mL，优选：15μg/mL和青霉素类抗生素50-200IU/mL，优选100IU/mL。

本发明所述的复苏培养液含有另外一组具有协同增效作用的抗生素组合物。可在上述冻存液清除污染微生物及抗生素后效应基础上，继续放大抗生素组合药物治疗的作用。

本发明另一个技术方案提供一种高效清除培养过程中微生物污染的方法，该方法包括如下步骤：

(1)生理盐水洗涤污染的细胞，离心；

(2)弃上清，加入冻存液重悬细胞，转移入冻存管内；

(3)冻存管置于程序降温盒内，程序降温；

(4)10-15天后，取出细胞，复苏，用复苏培养液接种细胞，进行培养。

本发明的冻存液在不影响细胞状态的条件下，具有广泛的抗菌谱，能够同时抑制及清除绝大部分革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌、支原体。且在冻存状态下，暂停微生物对细胞系的持续毒害。使用的复苏培养液含有另外一组具有协同增效作用的抗生素组合物。可在上述冻存液清除污染微生物及抗生素后效应基础上，继续放大抗生素组合药物治疗的作用。

本发明提供的一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法在不灭活、无需判断污染源且保证细胞活性的基础上，可强效清除大部分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、支原体，解除细胞系污染状态并使其能够再次被利用。

附图说明

图1为一种贴壁细胞系高效清除培养过程中微生物污染的方法流程图；

图2为一种悬浮细胞系高效清除培养过程中微生物污染的方法流程图；

图3为细菌污染Hela细胞经实施例9的方法处理后的细胞形态对照图；a为细菌污染的Hela细胞，b为实施例9的方法处理后的Hela细胞；

图4为真菌污染Hela细胞经实施例9的方法处理后的细胞形态对照图；c为真菌污染的Hela细胞，d为实施例9的方法处理后的Hela细胞；

图5为细菌污染HepG2细胞经实施例9的方法处理后的细胞形态对照图；

e为真菌污染的HepG2细胞，f为实施例9的方法处理后的HepG2细胞；

图6为细菌污染的Jμrkat细胞经实施例10的方法处理后的细胞形态对照图；

g为真菌污染的Jμrkat细胞，h为实施例10的方法处理后的Jμrkat细胞。

具体实施方式

实施例1

一种高效清除培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由万古霉素、头孢曲松、莫西沙星、阿米卡星、伊曲康唑和氟胞嘧啶组成；其中，万古霉素、头孢曲松、莫西沙星、阿米卡星、伊曲康唑和氟胞嘧啶的质量比为15：12：6：20：2：0.8。

实施例2

一种高效清除培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由万古霉素、头孢曲松、莫西沙星、阿米卡星、伊曲康唑和氟胞嘧啶组成；其中，万古霉素、头孢曲松、莫西沙星、阿米卡星、伊曲康唑和氟胞嘧啶的质量比为10：10：1：5：0.0025：0.01。

实施例3

一种高效清除培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由万古霉素、头孢曲松、莫西沙星、阿米卡星、伊曲康唑和氟胞嘧啶组成；其中，万古霉素、头孢曲松、莫西沙星、阿米卡星、伊曲康唑和氟胞嘧啶的质量比为80：80：100：60：5：4。

实施例4

一种高效清除培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由青霉素、链霉素、米卡芬净和莫西沙星组成；其中青霉素、链霉素、米卡芬净和莫西沙星的比例关系为100IU：100IU：15μg：6μg。

实施例5

一种高效清除培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由青霉素、链霉素、米卡芬净和莫西沙星组成；其中青霉素、链霉素、米卡芬净和莫西沙星的比例关系为50IU：50IU：0.25μg：1μg。

实施例6

一种高效清除培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由青霉素、链霉素、米卡芬净和莫西沙星组成；其中青霉素、链霉素、米卡芬净和莫西沙星的比例关系为200IU：200IU：25μg：100μg。

实施例7

一种高效清除培养过程中微生物污染的冻存液，该冻存液包括90％无血清培养基、10％DMSO和实施例1的组合物，其中，实施例1组合物各成分在冻存液内的终浓度为万古霉素15μg/mL、头孢曲松12μg/mL、莫西沙星6μg/mL、阿米卡星20μg/mL、伊曲康唑2μg/mL和氟胞嘧啶0.8μg/mL。

实施例8

一种高效清除培养过程中微生物污染的复苏培养液，该复苏培养液由100％完全培养基和实施例4的组合物组成，其中实施例4的组合物中各成分在复苏培养液内的终浓度为青霉素100IU/mL、链霉素100IU/mL、米卡芬净15μg/mL、莫西沙星6μg/mL。

实施例9

本发明实施例9提供一种高效清除培养过程中微生物污染的方法，如图1所示，该方法包括如下步骤：

(1)将微生物污染的贴壁细胞上清液弃去，生理盐水洗涤细胞贴壁面三次；

(2)加入0.125％的胰蛋白酶对细胞进行消化；

(3)直至倒置显微镜下观察到细胞大部分(80％数量以上)由梭形变为圆形并脱落，然后加入完全培养基终止消化；

(4)轻轻吹打培养瓶，将所有的细胞收集至50mL离心管内，加适量生理盐水定容，4℃，200g离心10min；

(5)弃上清，按2*10⁶/mL的密度加入适量的冻存液重悬细胞，转移入冻存管内；

(6)冻存管置于程序降温盒内，转入-80℃冰箱中，12小时后转入-196℃的气相液氮罐内；

(7)10-15天后，取出液氮罐内的细胞，37℃水浴解冻复苏，用复苏培养液接种，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中进行培养；

(8)复苏第3天，全量更换复苏培养液；

(9)复苏第7天，弃去复苏培养液，加入新鲜完全培养基正常培养。

本实施例中，冻存液和复苏培养基的成分配比见下表：

如图3、图4和图5所示，细菌和真菌污染的Hela细胞和细菌污染的HepG2细胞，经过实施例9的方法处理后，于复苏第12天，显微镜下拍照，并取细胞悬液送检真菌、细菌、支原体、内毒素，结果发现，对照处理前的样本，处理后未检出真菌、细菌、支原体、且内毒素合格，说明该方法可以很好的清除贴壁细胞的微生物污染。

实施例10

本发明实施例10提供一种高效清除培养过程中微生物污染的方法，如图2所示，该方法包括如下步骤：

(1)将微生物污染的悬浮细胞转移至50mL离心管内，生理盐水定容，4℃，200g离心10min；

(2)弃上清，生理盐水重悬沉淀并定容，4℃，200g离心10min；

(3)弃上清，重复步骤(2)两次；

(4)弃上清，按2*10⁶/mL的密度加入冻存液重悬细胞，转移入冻存管内；

(5)冻存管置于程序降温盒内，转入-80℃冰箱中，12小时后转入-196℃的气相液氮罐内；

(6)10-15天后，取出液氮罐内的细胞，37℃水浴解冻复苏，用复苏培养液接种，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中进行培养；

(7)复苏第3天，全量更换复苏培养液；

(8)复苏第7天，弃去复苏培养液，加入新鲜完全培养基正常培养。

本实施例中，冻存液和复苏培养基的成分配比见下表：

如图6所示，细菌污染的Jμrkat细胞，经过实施例10的方法处理后，于复苏第12天，显微镜下拍照，并取细胞悬液送检真菌、细菌、支原体、内毒素，结果发现，对照处理前的样本，处理后未检出真菌、细菌、支原体、且内毒素合格，说明该方法可以很好的清除悬浮细胞内的微生物污染。

实验例1组合物的抗微生物污染效果

本发明提供的组合物的抗微生物污染结果见表1所示。

表1抗微生物污染实验结果

从上表中可以看出，本发明提供的化合物各成分之间可以起到高效的协同作用，对细胞培养过程中的细菌、真菌或支原体感染，均具有较强的抑制作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种高效清除培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由万古霉素、头孢曲松、莫西沙星、阿米卡星、伊曲康唑和氟胞嘧啶组成；其中，万古霉素、头孢曲松、莫西沙星、阿米卡星、伊曲康唑和氟胞嘧啶的质量比为15：12：6：20：2：0.8。

2.一种高效清除培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由青霉素、链霉素、米卡芬净和莫西沙星组成；其中青霉素、链霉素、米卡芬净和莫西沙星的比例关系为100 IU：100IU：15μg：6μg。

3.一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的冻存液，其特征在于，所述冻存液包括85%-95%无血清培养基或完全培养基、5%-15%DMSO和权利要求1所述的高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物。

4.一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的复苏培养液，其特征在于，所述复苏培养液包括100%完全培养基和权利要求2所述的高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物。

5.一种高效清除培养过程中微生物污染的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）生理盐水洗涤污染的细胞，离心；

（2）弃上清，加入权利要求3所述的冻存液重悬细胞，转移入冻存管内；

（3）冻存管置于程序降温盒内，程序降温；

（4）10-15天后，取出细胞，复苏，用权利要求4所述的复苏培养液接种细胞，进行培养。