CN111033235A - 用于活体内小动物荧光层析成像的快速宽场照明扫描的系统和方法 - Google Patents

用于活体内小动物荧光层析成像的快速宽场照明扫描的系统和方法 Download PDF

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Abstract

本文呈现用于层析成像的系统和方法，所述系统和方法实现通过来自一个或多个激发源的一个或多个激发光的光束跨越大视场对多个激发位置的快速照明。本文所描述的方法利用检流计光学扫描器以跨越对应于待成像的视场的扫描区扫描激发光的光束通过多个位置。在某些实施例中，本文所描述的系统和方法利用具有具体定制形状的激发光的光束以跨越大扫描区维持小光点大小。由本文所描述的方法提供的在大区上扫描同时仍维持小光点大小的能力允许对大的或多个受试者的准确高分辨率层析成像，进而扩展层析成像系统的能力。

Description

用于活体内小动物荧光层析成像的快速宽场照明扫描的系统 和方法
交叉引用部分
本申请要求2017年7月19日提交且标题为“用于活体内小动物荧光层析成像的快速宽场照明扫描的系统和方法(SYSTEMS AND METHODS FOR RAPID WIDE FIELDILLUMINATION SCANNING FOR IN VIVO SMALL ANIMAL FLUORESCENCE TOMOGRAPHICIMAGING)”的第15/654,442号美国非临时申请的优先权，所述美国非临时申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及用于成像的系统和方法。更确切地说，在某些实施例中，本发明涉及用于在宽视场上的快速层析成像的系统和方法。
背景技术
例如肿瘤学、传染病学和药物发现的各种领域中的大量研究人员执行小动物的活体内成像。存在各种各样的涉及动物的活体内成像的技术，举例来说，生物发光、荧光、层析摄影术和多模成像技术。
许多成像模态是层析方法。层析摄影术是基于检测透射通过样本或从样本发出的光以获得图像或推断正研究的样本的光学性质。举例来说，层析成像可用以重构正研究的受试者的关注区内的组织吸收图。在其它应用中，层析成像用以生成关注区中存在的例如荧光发射体等探测体的空间分布图。层析成像因此允许以非侵入性方式构造对象的内部结构的详细图像以及受试者的关注区内的探测体的分布。
光学层析成像可提供从例如微型CT或磁共振成像(magnetic resonanceimaging，MRI)等非光学成像技术无法获得的与正研究的受试者内的生物过程分析相关的有价值信息。举例来说，在光学波长处的组织吸收图能够提供与血红蛋白浓度和组织氧合状态有关的生物功能信息，所述信息可用以检测某些类型的肿瘤。另外，与X射线成像或MRI技术相比，光学吸收另外提供改进的对比度以用于定位某些器官，例如心脏。
光学层析摄影术也可用以绘制所施用的或内源发光探测体的空间分布图，所述探测体例如荧光或生物发光探测体。举例来说，荧光探测体吸收在对象内部传播的光且在比对象内部的吸收光更长的波长(更低的能量)发射光，从而允许在动物和人类的完整组织中的功能和分子特征的非侵入性活体内研究。荧光光学层析摄影术系统进而实现分子成像，其可用以视觉上指示作为疾病基础的分子异常，而不是像常规成像方法那样仅对可疑分子异常区域中的解剖结构进行成像。分子目标的特定成像提供疾病的较早检测和表征，以及治疗功效的较早和直接分子评估。说明性荧光光学层析摄影术系统在第US2004/0015062号美国专利申请公开案中描述，其文字以全文引用的方式并入本文中。
在光学层析成像中，以激发光照射待成像的区(例如，受试者；例如，受试者内的关注区)内的多个位置。在荧光成像应用中，在由激发光照射的给定位置内的荧光物质吸收激发光且发出荧光，所述荧光由一个或多个检测器检测。以此方式，针对多个照明位置中的每一个记录表示所发出荧光的检测器信号。对应于针对照明位置中的每一个检测到的荧光的数据用作层析重构技术中的输入，所述技术重构对象的区内的荧光发射体的分布。对对象的特定区有效地成像需要照射所述区内的足够数目和密度的位置以便提供充分数据用于层析重构。
因此，需要能够快速照射包括待成像的一个或多个对象的宽视场内的多个位置的改进的用于层析成像的系统和方法。此类系统和方法与活体内小动物层析成像具有特定相关性。
发明内容
本文呈现用于层析成像的系统和方法，所述系统和方法实现通过来自一个或多个激发源的一个或多个激发光的光束跨越宽视场对多个激发位置的快速照明。本文所描述的方法利用检流计光学扫描器以跨越对应于待成像的视场的扫描区扫描激发光的光束通过多个位置。在某些实施例中，本文所描述的系统和方法利用具有具体定制形状的激发光的光束以跨越大扫描区维持小光点大小。由本文所描述的方法提供的在大区上扫描同时仍维持小光点大小的能力允许对大的或多个受试者的准确高分辨率层析成像，进而扩展层析成像系统的能力。举例来说，在某些实施例中，本文所描述的层析成像方法允许例如多个小动物等多个受试者一起快速成像，进而促进小动物的活体内层析成像。
特别地，在某些实施例中，本文所描述的光束成形方法允许使用具有约(例如，大于或近似等于)100mW的输出功率的广泛多种高功率激光器。确切地说，在某些实施例中，使用利用激发光的聚焦而不是准直光束的光束成形方法。许多高功率激光器从大输出区域发射激发光的高度发散光束，所述光束相应地难以进行准直。通过克服此挑战，本文所描述的光束成形方法在可用于层析成像的激发源(例如，激光器)的类型方面实现增加的灵活性。这提供若干优点。
举例来说，高功率激光器有利于厚对象(例如，受试者；例如，小动物)的层析成像，因为它们允许将足够功率递送到对象内较深的位置以便激发位于该处的荧光物质。这对于包括例如组织等高度吸收性和/或散射(例如，漫射)介质的对象(例如，受试者；例如，小动物)是特别相关的，其中激发光的光束在传播穿过对象时显著衰减。
此外，通过允许使用广泛多种高功率激光器而不仅仅是可容易准直的那些，本文所描述的方法极大地增加可用于成像的激发波长的范围。特定激光发射的波长无法任意选择，而是以复杂方式取决于激光器的一系列相互依存的性质，例如激光腔类型、使用的特定增益介质和给定的泵浦方案。因此，各种类型的激光器以有限、离散的一组波长产生激发光。举例来说，虽然光纤激光器在某些情况下可产生激发光的充分准直光束，但它们利用有限的一组元素(例如，稀土元素)作为增益介质，并且因此被限于以近红外光谱区中的有限一组波长发射光。因此，适应多种类型的激发源的能力显著地促进可经由多种激发波长激发的多种荧光探测体的成像。
可在本文所描述的层析成像系统和方法中使用的激发光波长范围内的灵活性也促进多光谱成像。在某些实施例中，多光谱成像涉及以各自具有相异波长的激发光的多个光束照射一个或多个对象。在某些实施例中，每一激发光的光束因此激发且造成从所述一个或多个对象内的相异荧光物质的荧光发射。因此，通过在每一激发波长连续执行层析成像，可获得表示所述一个或多个受试者内的多种荧光物质中的每一种的分布的层析图像。这允许例如执行涉及多种类型的细胞和/或蛋白质的共同定位的研究(例如，每一类型以不同荧光探测体标记)。此类研究对于理解各种疾病的机制和其治疗是高度相关的。
在某些实施例中，本文所描述的层析成像方法还通过实现将多个激发源并入到单个系统中且以稳健且高效方式切换而促进多光谱成像。确切地说，在某些实施例中，多个激发源中的每一个被对准而使得其相应激发光的光束被沿着对应光学路径朝向检流计光学扫描器引导，所述对应光学路径从其它光学路径偏移对应偏移角。这允许多个激发源安装于固定位置中，且避免使用电动台在激发源之间进行切换的需要，使用电动台在激发源之间进行切换是除了缓慢且复杂之外还因随时间的例行使用和/或由于机械振动而容易发生未对准的方法。组合在多个高功率激发源之间快速切换和快速扫描的能力极大地促进多光谱成像应用。
在一个方面中，本发明是针对一种用于在宽视场上快速扫描激发光以用于跨越对象平面定位的一个或多个受试者的层析成像的系统，所述系统包括：(a)激发源，其可操作以发射激发光的光束(例如，用于所述一个或多个受试者内的荧光物质的激发)，其中所述激发源被对准以沿着从所述激发源的输出(例如，光纤耦合源或光纤激光器的光纤的远端；例如，自由空间激光器的激光孔径)到包括一个或多个旋转检流计镜的检流计光学扫描器的光学路径引导激发光的光束；(b)检流计光学扫描器，其中所述检流计光学扫描器被对准且可操作以经由所述一个或多个旋转检流计镜的反射将激发光的光束引导到对象平面的扫描区内的多个位置(例如，离散激发位置)，以使得在所述一个或多个检流计镜旋转时，跨越扫描区扫描激发光的光束[例如，朝向扫描区内的多个离散激发位置(例如，一次一个地)]，进而实现跨越对象平面定位的所述一个或多个受试者的照明；(c)一个或多个检测器，其被对准且可操作以检测由于激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的一个或多个荧光物质发射的荧光[例如，由于通过朝向所述多个离散激发位置中的每一个引导的激发光的光束的激发，例如，一个或多个检测器被对准且可操作以检测对应于离散激发位置中的每一个的荧光发射图像(例如，2D图像)]；(d)处理器；以及(e)存储器，其具有存储于其上的指令，其中所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据[例如，包括在跨越扫描区朝向多个离散激发位置中的每一个引导的激发光的激发之后检测到的荧光发射信号(例如，图像，例如，2D图像)的数据]；以及使用对应于检测到的荧光的数据获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，检流计光学扫描器定位于沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置(例如，扫描区的中心位置)的最小长度光学路径测得的特定距离，以基于所述一个或多个检流计镜的一个或多个最大旋转角度产生所要大小的扫描区。
在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的所要大小是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的所要大小是从100到200mm(例如，从100到150mm；例如，近似140mm)。
在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离是从150到250mm(例如，近似200mm)。
在某些实施例中，激发源可操作以从其输出发射激发光的光束作为聚焦光束，所述聚焦光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时汇聚[例如，以使得在对象平面处的激发光的光束的光点大小(例如，直径)小于在激发源的输出处的激发光的光束的初始光点大小(例如，直径)]。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的聚焦光束在扫描区内的所有位置具有小于或近似等于1mm的光点大小。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的聚焦光束具有半角发散
Figure BDA0002394810390000061
以使得
Figure BDA0002394810390000062
其中：wmax是在扫描区内的激发光的光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，在待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的光束在其光束腰位置处的光点大小，d1是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的最小距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的中心位置测得)，且d2是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的拐角处的位置测得；例如，其中d2大于d1)。
在某些实施例中，d1是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，d1小于300mm(例如，小于250mm)。在某些实施例中，d1是从100mm到500mm(例如，从150到250mm；例如，从200到250mm；例如，从220到250mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)且大于d1。在某些实施例中，d2小于500mm(例如，小于250mm)且大于d1。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm；例如，从220到250mm)且大于d1。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的聚焦光束的半角发散小于或等于25毫弧度(例如，小于或等于20毫弧度；例如，小于或等于15毫弧度)。
在某些实施例中，激发源可操作以从其输出发射激发光的光束作为准直光束，所述准直光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时发散(例如，缓慢地发散)。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的准直光束的直径在扫描区内的所有位置具有小于或近似等于1mm的光点大小。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的准直光束具有半角发散
Figure BDA0002394810390000071
以使得
Figure BDA0002394810390000072
其中：wmax是扫描区内的激发光的准直光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的准直光束的光束在其光束腰位置处的光点大小[例如，其中光束腰位置位于激发源的输出(例如，自由空间激光器的激光孔径)处]，d0 (1)是沿着从激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径的距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的拐角处的位置测得)。
在某些实施例中，d0 (1)是至少50mm(例如，至少100mm)。在某些实施例中，d0 (1)小于或等于250mm(例如，小于或等于200mm)。在某些实施例中，d0 (1)是从50mm到200mm(例如，从50到180mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm)。在某些实施例中，d2小于或等于500mm(例如，小于或等于250mm)。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm)。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的准直光束的半角发散小于或等于5毫弧度(例如，小于或等于2毫弧度；例如，小于或等于1.5毫弧度；例如，小于或等于1.25毫弧度)。
在某些实施例中，系统包括定位于从激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径中的光束成形光学器件，其中所述光束成形光学器件是以下各项中的至少一个：(A)聚焦光学器件，其中所述聚焦光学器件被对准以使得在通过聚焦光学器件之后，激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时汇聚[例如，以使得在对象平面处的激发光的光束的光点大小(例如，直径)小于在聚焦光学器件处的激发光的光束的初始大小(例如，直径)]；以及(B)准直光学器件，其中所述准直光学器件被对准以使得在通过准直光学器件之后，激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时发散(例如，缓慢地发散)。
在某些实施例中，光束成形光学器件是聚焦光学器件。
在某些实施例中，聚焦光学器件被定位[例如，相对于(i)检流计光学扫描器和(ii)激发源的输出(例如，光束激发光从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径)]以使得激发光的光束的光点大小的直径在扫描区内的所有位置小于或近似等于1mm。
在某些实施例中，在通过聚焦光学器件之后的激发光的光束的半角发散
Figure BDA0002394810390000081
使得
Figure BDA0002394810390000082
其中：wmax是激发光的光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的光束在光束腰处的光点大小，d1是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的中心位置测得)，且d2是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的拐角处的位置测得；例如，其中d2大于d1)。
在某些实施例中，d1是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，d1小于300mm(例如，小于250mm)。在某些实施例中，d1是从100mm到500mm(例如，从150到250mm；例如，从200到250mm；例如，从220到250mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)且大于d1。在某些实施例中，d2小于500mm(例如，小于250mm)且大于d1。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm；例如，从220到250mm)且大于d1。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，在通过聚焦光学器件之后的激发光的光束的半角发散小于或等于25毫弧度(例如，小于或等于20毫弧度；例如，小于或等于15毫弧度)。
在某些实施例中，光束成形光学器件是准直光学器件。
在某些实施例中，所述准直光学器件被定位[例如，相对于(i)检流计光学扫描器和(ii)激发源的输出(例如，激发光的光束从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径]以使得激发光的光束的光点大小的直径在扫描区内的对象平面的所有位置小于或近似等于1mm。
在某些实施例中，在通过准直光学器件之后的激发光的光束的半角发散
Figure BDA0002394810390000091
使得
Figure BDA0002394810390000092
其中：wmax是扫描区内的激发光的光束的所要光点大小的上限[例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度，wbw是激发光的光束在光束腰位置处的光点大小[例如，其中光束腰位置位于激发源的输出处(例如，激发光从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径)]，d0 (2)是沿着从激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径测得的从准直光学器件到检流计光学扫描器的距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到扫描区的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的拐角处的位置测得)。
在某些实施例中，d0 (2)是至少50mm(例如，至少100mm)。在某些实施例中，d0 (2)小于或等于250mm(例如，小于或等于200mm)。在某些实施例中，d0 (2)是从50mm到200mm(例如，从50到180mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm)。在某些实施例中，d2小于或等于500mm(例如，小于或等于250mm)。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm)。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，在通过准直光学器件之后的激发光的光束的半角发散小于或等于5毫弧度(例如，小于或等于2毫弧度；例如，小于或等于1.5毫弧度；例如，小于或等于1.25毫弧度)。
在某些实施例中，激发源的功率大于或近似等于100mW(例如，大于或近似等于200mW；例如，大于或近似等于200mW；例如，大于或近似等于300mW)。
在某些实施例中，所述激发源是光纤耦合激光器或光纤激光器，且所述激发光的光束从其发射的所述激发源的输出是所述光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的远端。
在某些实施例中，光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的纤芯直径是从5μm到400μm(例如，其中光纤是具有从5到10μm的纤芯直径的单模光纤；例如，其中光纤是具有从50到400μm的纤芯直径的多模光纤)。在某些实施例中，光纤的数值孔径(NA)是从0.1到0.3(例如，从0.1到0.25；例如，从0.15到0.25)。
在某些实施例中，激发源是自由空间激光器，其中激发光的光束从其发射的激发源的输出是自由空间激光器的激光孔径。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器包括包括多个像素的焦平面阵列(FPA)检测器(例如，CCD相机；例如，CMOS相机)，其中FPA检测器被对准以对扫描区进行成像(例如，以使得FPA检测器的视场包括扫描区)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器包括包括多个光纤的光纤束，所述光纤中的每一个被对准以收集从扫描区内的不同位置发射的光且将所收集的光导引到对应的单元素检测器(例如，Si PD)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以按透照法几何形状检测从荧光物质发射的荧光，其中激发光的光束是从对象平面的第一侧朝向对象平面引导，且所述一个或多个检测器被对准且可操作以检测在从对象平面的相对第二侧(例如，与第一侧相对)向外的方向上发射的荧光(例如，其中所述一个或多个检测器在对象平面的与检流计光学扫描器相对的侧上)。
在某些实施例中，所述一个或多个受试者是小动物(例如，小鼠、大鼠、田鼠、兔子、仓鼠和类似大小的动物)。
在某些实施例中，所述一个或多个受试者中的至少一个的厚度是近似1cm。
在某些实施例中，所述系统包括可操作以固定多个小动物的动物固持器(例如，其中动物固持器包括多个底座，每一底座可操作以在成像期间固定小动物)。
在某些实施例中，动物固持器包括一个或多个光学挡板[例如，所述一个或多个挡板中的每一个对应于在基本上垂直于对象平面的方向上向前(例如，在激发光的光束入射于对象平面上的方向上)和/或向后(例如，在激发光的光束入射于对象平面上的方向的相反方向上)从动物固持器向外突出的结构，每一挡扳对具有激发光和/或所发射荧光的波长的光是基本上不透明的，且位于小动物由动物固持器固定的两个位置之间(例如，以便减少/消除串扰)]。
在某些实施例中，在活体内执行层析成像。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以检测透射通过所述一个或多个受试者或从所述一个或多个受试者反射的激发光[例如，所述一个或多个检测器被对准且可操作以检测对应于离散激发位置中的每一个的激发图像(例如，2D图像)]，且所述指令使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据[例如，所述数据包括当激发光跨越扫描区朝向多个离散激发位置中的每一个引导时在激发光透射通过所述一个或多个受试者或激发光由所述一个或多个受试者反射之后检测到的激发信号(例如，激发图像(例如，2D图像))]；以及使用对应于检测到的激发光的数据和对应于检测到的荧光的数据获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，检流计光学扫描器被对准且可操作以通过将激发光的光束引导到扫描区内的多个离散激发位置而跨越扫描区扫描激发光的光束，其中对于每一离散激发位置，所述一个或多个受试者中的定位于被朝向离散激发位置引导的激发光的光束的路径中的给定受试者在受试者的表面上的对应照明位置由激发光的光束照射，以使得激发光的光束在对应照明位置入射于给定受试者的表面上且在受试者内漫射，进而实现给定受试者内的荧光物质(例如，所述一个或多个荧光物质)的激发(例如，由于激发光从对应照明位置的漫射；例如，进而实现在对应照明位置入射到受试者上的激发光漫射到其中的位于受试者的表面下方的对应漫射体积内的荧光物质的激发)，所述一个或多个检测器被对准且可操作以针对每一离散激发位置检测对应荧光发射图像(例如，2D图像)，所述荧光发射图像表示检测到的由定位于被引导到离散激发位置的激发光的光束的路径中的给定受试者内的荧光物质发射的荧光，进而实现多个荧光发射图像的检测，每一荧光发射图像对应于离散激发位置，且所述指令使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据，对应于检测到的荧光的所述数据包括所述多个荧光发射图像；以及使用所述多个荧光发射图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以针对每一离散激发位置检测对应激发图像，所述对应激发图像表示当激发光的光束在对应照明位置入射于给定受试者的表面上时透射通过给定受试者或由给定受试者反射的激发光，以使得检测到多个激发图像，每一激发图像对应于离散激发位置，且所述指令使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于检测到的激发光的所述数据包括所述多个激发图像；以及使用所述多个荧光发射图像和所述多个激发图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
在某些实施例中，检流计光学扫描器可操作以通过将激发光的光束引导到扫描区内的多个离散激发位置而跨越扫描区扫描激发光的光束，其中：离散激发位置被布置成若干集合，每一集合包括多个离散激发位置，给定集合的每一离散激发位置对应于所述一个或多个受试者中的不同受试者(例如，其中每一集合包括对应于所述一个或多个受试者中的每一受试者的离散激发位置)，所述检流计光学扫描器可操作以每次一个集合地扫描激发光的光束，从而将激发光的光束引导到给定集合内的每一离散激发位置，然后继续到下一集合(例如，将激发光的光束引导到第一集合内的每一离散激发位置，然后将激发光的光束引导到第二集合内的每一离散激发位置)，且检流计光学扫描器可操作以在对应于所述一个或多个检测器的曝光窗口的时间内扫描激发光的光束通过给定集合的所有离散激发位置，且所述一个或多个检测器被对准且可操作以针对离散激发位置的每一集合检测对应荧光发射图像，所述荧光发射图像表示检测到的由于被引导到给定集合内的每一激发位置的激发光对所述一个或多个受试者内的所述一个或多个荧光物质的激发而在所述一个或多个检测器的曝光窗口期间发射的荧光(例如，以使得每一荧光发射图像是多受试者荧光发射图像，所述多受试者荧光发射图像表示检测到的从所述一个或多个受试者中的每一个内由每一受试者内的荧光物质发射的荧光)。
在某些实施例中，对应于检测到的荧光的数据针对离散激发位置的每一集合包括对应荧光发射图像，且所述指令使所述处理器使用数据荧光发射图像(例如，每一图像对应于离散激发位置的集合)获得(例如，计算)所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，所述指令使所述处理器针对所述一个或多个受试者中的每一受试者：针对对应于离散激发位置集合的每一荧光发射图像，确定与受试者相关联的荧光发射图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的从受试者内发射的荧光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的荧光发射图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光图像对应于离散激发位置集合；以及使用与受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像获得(例如，计算)受试者的层析图像(例如，3D层析图像)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以针对离散激发位置的每一集合检测对应激发图像，所述对应激发图像表示由于被引导到给定集合内的每一激发位置的激发光的光束对所述一个或多个受试者的照明而在所述一个或多个检测器的曝光窗口期间检测到的透射通过所述一个或多个受试者或由所述一个或多个受试者反射的激发光(例如，以使得每一激发图像是表示检测到的透射通过所述一个或多个受试者中的每一个或由所述一个或多个受试者中的每一个反射的激发光的多受试者激发图像)，且所述指令使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于检测到的激发光的所述数据针对离散激发位置的每一集合包括所述对应激发图像；以及使用荧光发射图像和激发图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像(例如，通过执行层析重构；例如，使用荧光发射图像和激发图像，所述图像中的每一个对应于离散激发位置的集合)。
在某些实施例中，所述指令使所述处理器针对所述一个或多个受试者中的每一受试者：针对对应于离散激发位置集合的每一荧光发射图像，确定与受试者相关联的荧光发射图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的从受试者内发射的荧光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的荧光发射图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光发射图像对应于离散激发位置集合；以及针对对应于离散激发位置集合的每一激发图像，确定与受试者相关联的激发图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的透射通过受试者或由受试者反射的激发光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的激发图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者激发图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者激发图像，其中每一单个受试者激发图像对应于离散激发位置集合；以及使用与受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像和与受试者相关联的所述多个单个受试者激发图像获得(例如，计算)受试者的层析图像(例如，3D层析图像)。
在另一方面中，本发明是针对一种用于在宽视场上快速扫描来自多个激发源的激发光以用于跨越对象平面定位的一个或多个受试者的层析成像的系统，所述系统包括：(a)多个激发源，其中：每一激发源可操作以发射相应激发光的光束(例如，用于所述一个或多个受试者内的荧光物质的激发)，第一激发源被对准以沿着从第一激发源的输出到包括一个或多个旋转检流计镜的检流计光学扫描器的第一光学路径引导其相应激发光的光束，且除第一激发源外的每一激发源被对准以沿着从其输出到检流计光学扫描器的相应光学路径以相对于第一光学路径的对应偏移角引导其相应激发光的光束；(b)检流计光学扫描器，其中检流计光学扫描器被对准且可操作以针对每一激发源经由所述一个或多个旋转检流计镜的反射将由激发源发射的相应激发光的光束引导到对象平面的相应扫描区内的相应多个位置(例如，离散激发位置)，以使得在所述一个或多个检流计镜旋转时，跨越相应扫描区(例如，朝向相应扫描区内的多个离散激发位置引导)扫描由激发源发射的相应激发光的光束(例如，每一相应扫描区与所述多个激发源中的激发源相关联)，进而实现跨越对象平面定位的所述一个或多个受试者的照明；(c)一个或多个检测器，其被对准且可操作以检测由于来自所述多个激发源中的至少一个的激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的一个或多个荧光物质发射的荧光[例如，由于被朝向用于激发源的相应扫描区内的所述多个离散激发位置中的每一个引导的从至少一个激发源发射的激发光的激发，例如，一个或多个检测器被对准且可操作以检测对应于离散激发位置中的每一个的荧光发射图像(例如，2D图像)]；(d)处理器；以及(e)存储器，其具有存储于其上的指令，其中指令在由所述处理器执行时使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据(例如，所述数据包括在通过跨越所述至少一个激发源的相应扫描区朝向所述多个激发位置中的每一个引导的激发光的激发之后检测到的荧光发射信号(例如，图像；例如，2D图像))；以及使用对应于检测到的荧光的数据获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，每一激发源发射具有在所述一个或多个受试者内的对应荧光物质的激发(吸收)带内的相异激发波长的激发光(例如，其中每一相异激发波长是在从400nm到1300nm范围内的波长)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以检测由于来自所述多个激发源中的两个或更多个激发源中的每一个的激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的所述一个或多个荧光物质发射的荧光[例如，针对所述两个或更多个激发源中的每一个，所述一个或多个检测器被对准且可操作以检测由于从激发源发射的激发光的激发而由所述一个或多个荧光物质中的相关联荧光物质发射的荧光(例如，其中相关联荧光物质响应于来自激发源的激发光的激发而发射荧光)]。
在某些实施例中，对应于检测到的荧光的数据针对所述多个激发源中的两个或更多个激发源中的每一个包括在通过跨越激发源的相应扫描区朝向多个激发位置中的每一个引导的激发光的激发之后检测到的相关联荧光发射信号的集合(例如，图像；例如，2D图像)，且所述指令使所述处理器针对所述两个或更多个激发源中的每一个使用相关联荧光发射信号获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像的相应集合(例如，通过执行层析重构)，进而获得所述两个或更多个激发源中的每一个的一个或多个层析图像的集合。
在某些实施例中，激发源中的每一个的相应扫描区中的每一个的至少一部分彼此重叠以产生共享扫描区。
在某些实施例中，所述检流计光学扫描器定位于沿着从所述检流计到所述共享扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的特定距离，以基于所述一个或多个检流计镜的一个或多个最大旋转角度产生所要大小的共享扫描区。
在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的共享扫描区的所要大小是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的共享扫描区的所要大小是从100到200mm(例如，从100到150mm；例如，近似140mm)。
在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到共享扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离是从150到250mm(例如，近似200mm)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源是聚焦激发源，所述聚焦激发源可操作以从其输出发射其相应激发光的光束作为聚焦光束，所述聚焦光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时汇聚[例如，以使得在对象平面处的激发光的光束的光点大小(例如，直径)小于在激发源的输出处的激发光的光束的初始光点大小(例如，直径)]。
在某些实施例中，从聚焦激发源的输出发射的激发光的聚焦光束在扫描区内的所有位置具有小于或近似等于1mm的光点大小。
在某些实施例中，从聚焦激发源的输出发射的激发光的聚焦光束具有半角发散
Figure BDA0002394810390000181
以使得
Figure BDA0002394810390000182
其中：wmax是在聚焦激发源的相应扫描区内的激发光的聚焦光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的聚焦光束在其光束腰位置处的光点大小，d1是沿着从检流计光学扫描器到聚焦激发源的相应扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的最小距离(例如，从检流计光学扫描器到聚焦激发源的相应扫描区的中心位置测得)，且d2是沿着从检流计光学扫描器到聚焦源的相应扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到聚焦激发源的相应扫描区的拐角处的位置测得；例如，其中d2大于d1)。
在某些实施例中，d1是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，d1小于300mm(例如，小于250mm)。在某些实施例中，d1是从100mm到500mm(例如，从150到250mm；例如，从200到250mm；例如，从220到250mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)且大于d1。在某些实施例中，d2小于500mm(例如，小于250mm)且大于d1。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm；例如，从220到250mm)且大于d1。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，从聚焦激发源的输出发射的激发光的聚焦光束的半角发散小于或等于25毫弧度(例如，小于或等于20毫弧度；例如，小于或等于15毫弧度)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源是准直激发源，所述准直激发源可操作以从其输出发射其相应激发光的光束作为准直光束，所述准直光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时发散(例如，缓慢地发散)。
在某些实施例中，从准直激发源的输出发射的激发光的准直光束在扫描区内的所有位置具有直径小于或近似等于1mm的光点大小。
在某些实施例中，从准直激发源的输出发射的激发光的准直光束具有半角发散
Figure BDA0002394810390000191
以使得
Figure BDA0002394810390000192
其中：wmax是准直激发源的相应扫描区内的激发光的准直光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的准直光束的光束在其光束腰位置处的光点大小[例如，其中光束腰位置位于激发源的输出处(例如，自由空间激光器的激光孔径)]，d0 (1)是沿着从准直激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径的距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到准直激发源的相应扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到准直源的相应扫描区的拐角处的位置测得)。
在某些实施例中，d0 (1)是至少50mm(例如，至少100mm)。在某些实施例中，d0 (1)小于或等于250mm(例如，小于或等于200mm)。在某些实施例中，d0 (1)是从50mm到200mm(例如，从50到180mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm)。在某些实施例中，d2小于或等于500mm(例如，小于或等于250mm)。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm)。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，从准直激发源的输出发射的激发光的准直光束的半角发散小于或等于5毫弧度(例如，小于或等于2毫弧度；例如，小于或等于1.5毫弧度；例如，小于或等于1.25毫弧度)。
在某些实施例中，所述系统针对所述多个激发源中的至少一个激发源包括与激发源相关联且定位于从相关联激发源的输出到检流计光学扫描器的相应光学路径中的光束成形光学器件，且其中所述光束成形光学器件是以下各项中的至少一个：(A)聚焦光学器件，其中所述聚焦光学器件被对准以使得在通过聚焦光学器件之后，从相关联激发源的输出发射的相关联激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时汇聚[例如，以使得在对象平面处的相关联激发光的光束的光点大小(例如，直径)小于在聚焦光学器件处的相关联激发光的光束的初始大小(例如，直径)]；以及(B)准直光学器件，其中所述准直光学器件被对准以使得在通过准直光学器件之后，从相关联激发源的输出发射的相关联激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时发散(例如，缓慢地发散)。
在某些实施例中，光束成形光学器件是聚焦光学器件。
在某些实施例中，聚焦光学器件被定位[例如，相对于(i)检流计光学扫描器以及(ii)相关联激发源的输出(例如，相关联光束激发光从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，相关联激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径)]以使得相关联激发光的光束的光点大小在相关联激发源的相应扫描区内的所有位置直径小于或近似等于1mm。
在某些实施例中，在通过聚焦光学器件之后相关联激发光的光束的半角发散
Figure BDA0002394810390000201
使得
Figure BDA0002394810390000202
其中：wmax是相关联激发光的光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是相关联激发光的光束在光束腰位置处的光点大小，d1是沿着从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的最小距离(例如，其中最小距离d1是从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区的中心位置测得)，且d2是沿着从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，其中d2是从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区的拐角处的位置测得；例如，其中d2大于d1)。
在某些实施例中，d1是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，d1小于300mm(例如，小于250mm)。在某些实施例中，d1是从100mm到500mm(例如，从150到250mm；例如，从200到250mm；例如，从220到250mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)且大于d1。在某些实施例中，d2小于500mm(例如，小于250mm)且大于d1。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm；例如，从220到250mm)且大于d1。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，在通过聚焦光学器件之后的相关联激发光的光束的半角发散小于或等于25毫弧度(例如，小于或等于20毫弧度；例如，小于或等于15毫弧度)。
在某些实施例中，光束成形光学器件是准直光学器件。
在某些实施例中，准直光学器件被定位[例如，相对于(i)检流计光学扫描器以及(ii)相关联激发源的输出(例如，激发光的光束从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径]以使得相关联激发光的光束的光点大小在相关联激发源的相应扫描区内的对象平面处的所有位置直径小于或近似等于1mm。
在某些实施例中，在通过准直光学器件之后的相关联激发光的光束的半角发散
Figure BDA0002394810390000221
使得
Figure BDA0002394810390000222
其中：wmax是相关联激发源的相应扫描区内的相关联激发光的光束的所要光点大小的上限[例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度]，wbw是相关联激发光的光束在光束腰位置处的光点大小[例如，其中光束腰位置位于相关联激发源的输出处(例如，激发光从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，相应激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径)]，d0 (2)是沿着从相关联激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径测得的从准直光学器件到检流计光学扫描器的距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区的最大长度光学路径的最大距离(例如，其中d2是从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区的拐角处的位置测得)。
在某些实施例中，d0 (2)是至少50mm(例如，至少100mm)。在某些实施例中，d0 (2)小于或等于250mm(例如，小于或等于200mm)。在某些实施例中，d0 (2)是从50mm到200mm(例如，从50到180mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm)。在某些实施例中，d2小于或等于500mm(例如，小于或等于250mm)。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm)。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，在通过准直光学器件之后的相关联激发光的光束的半角发散小于或等于5毫弧度(例如，小于或等于2毫弧度；例如，小于或等于1.5毫弧度；例如，小于或等于1.25毫弧度)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源的功率大于或近似等于100mW(例如，大于或近似等于200mW；例如，大于或近似等于200mW；例如，大于或近似等于300mW)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源是光纤耦合激光器或光纤激光器，且激发光的光束从其发射的至少一个激发源的输出是光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的远端。
在某些实施例中，光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的纤芯直径是从5μm到400μm(例如，其中光纤是具有从5到10μm的纤芯直径的单模光纤；例如，其中光纤是具有从50到400μm的纤芯直径的多模光纤)。在某些实施例中，光纤的数值孔径(NA)是从0.1到0.3(例如，从0.1到0.25；例如，从0.15到0.25)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源是自由空间激光器，其中激发光的光束从其发射的至少一个激发源的输出是自由空间激光器的激光孔径。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器包括包括多个像素的焦平面阵列(FPA)检测器(例如，CCD相机；例如，CMOS相机)，其中FPA检测器被对准以对激发源中的每一个的每一相应扫描区的至少一部分进行成像(例如，以使得FPA检测器的视场包括每一相应扫描区的至少一部分)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器包括包括多个光纤的光纤束，所述光纤中的每一个被对准以收集从扫描区内的不同位置发射的光且将所收集的光导引到对应的单元素检测器(例如，Si PD)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以按透照法几何形状检测从荧光物质发射的荧光，其中每一相应激发光的光束是从对象平面的第一侧朝向对象平面引导，且所述一个或多个检测器被对准且可操作以(例如，对准)检测在从对象平面的相对第二侧(例如，与第一侧相对)向外的方向上发射的荧光(例如，其中所述一个或多个检测器在对象平面的与检流计光学扫描器相对的侧上)。
在某些实施例中，所述一个或多个受试者是小动物(例如，小鼠、大鼠、田鼠、兔子、仓鼠和类似大小的动物)。
在某些实施例中，所述一个或多个受试者中的至少一个的厚度是近似1cm。
在某些实施例中，所述系统包括可操作以固定多个小动物的动物固持器(例如，其中动物固持器包括多个底座，每一底座可操作以在成像期间固定小动物)。
在某些实施例中，动物固持器包括一个或多个光学挡板[例如，所述一个或多个挡板中的每一个对应于在基本上垂直于对象平面的方向上向前(例如，在激发光的光束入射于对象平面上的方向上)和/或向后(例如，在激发光的光束入射于对象平面上的方向的相反方向上)从动物固持器向外突出的结构，每一挡扳对具有激发光和/或所发射荧光的波长的光是基本上不透明的，且位于小动物由动物固持器固定的两个位置之间(例如，以便减少/消除串扰)]。
在某些实施例中，在活体内执行层析成像。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以针对所述多个激发源中的至少一个激发源检测由至少一个激发源发射的透射通过所述一个或多个受试者或从所述一个或多个受试者反射的激发光[例如，所述一个或多个检测器被对准且可操作以检测对应于至少一个激发源的相应扫描区内的离散激发位置中的每一个的激发图像(例如，2D图像)]，且所述指令使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据[例如，所述数据包括在当跨越至少一个激发源的相应扫描区朝向多个离散激发位置中的每一个引导激发光时激发光透射通过所述一个或多个受试者或激发光由所述一个或多个受试者反射之后检测到的激发信号(例如，激发图像(例如，2D图像))]；以及使用对应于检测到的激发光的数据和对应于检测到的荧光的数据获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，针对所述多个激发源中的至少一个激发源：检流计光学扫描器被对准且可操作以通过将相应激发光的光束引导到相应扫描区内的多个离散激发位置而跨越激发源的相应扫描区扫描由激发源发射的相应激发光的光束，其中针对每一离散激发位置，定位于朝向离散激发位置引导的相应激发光的光束的路径中的所述一个或多个受试者中的给定受试者在受试者的表面上的对应照明位置由相应激发光的光束照射，以使得相应激发光的光束在对应照明位置入射于给定受试者的表面上且在受试者内漫射，进而实现给定受试者内的(例如，所述一个或多个荧光物质中的)荧光物质的激发(例如，由于激发光从对应照明位置的漫射；例如，进而实现位于在对应照明位置入射到受试者上的激发光漫射到其中的在受试者的表面下方的对应漫射体积内的荧光物质的激发)，所述一个或多个检测器被对准且可操作以针对每一离散激发位置检测对应荧光发射图像(例如，2D图像)，所述荧光发射图像表示检测到的由定位于被引导到离散激发位置的相应激发光的光束的路径中的给定受试者内的荧光物质发射的荧光，进而实现多个荧光发射图像的检测，每一荧光发射图像对应于激发源的相应扫描区内的离散激发位置，且所述指令使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据，对应于检测到的荧光的数据包括针对激发源检测到的所述多个荧光发射图像；以及使用针对激发源检测到的所述多个荧光发射图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
在某些实施例中，针对所述多个激发源中的至少一个激发源：所述一个或多个检测器被对准且可操作以针对激发源的相应扫描区内的每一离散激发位置检测对应激发图像，所述激发图像表示当相应激发光的光束在对应照明位置入射于给定受试者的表面上时由激发源发射的透射通过给定受试者或由给定受试者反射的激发光，进而实现多个激发图像的检测，每一激发图像对应于激发源的相应扫描区内的离散激发位置，且所述指令使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于检测到的激发光的所述数据包括针对激发源检测到的所述多个激发图像；以及使用针对激发源检测到的所述多个荧光发射图像和针对激发源检测到的所述多个激发图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
在某些实施例中，针对所述多个激发源中的至少一个激发源(例如，针对所述多个激发源中的每一激发源)：检流计光学扫描器可操作以通过将相应激发光的光束引导到激发源的相应扫描区内的多个离散激发位置而跨越相应扫描区扫描相应激发光的光束，其中：离散激发位置被布置成若干集合，每一集合包括多个离散激发位置，给定集合的每一离散激发位置对应于所述一个或多个受试者中的不同受试者(例如，其中每一集合包括对应于所述一个或多个受试者中的每一受试者的离散激发位置)，检流计光学扫描器可操作以每次一个集合地扫描相应激发光的光束，将相应激发光的光束引导到给定集合内的每一离散激发位置，然后继续到下一集合(例如，将相应激发光的光束引导到第一集合内的每一离散激发位置，然后将相应激发光的光束引导到第二集合内的每一离散激发位置)，且检流计光学扫描器可操作以在对应于所述一个或多个检测器的曝光窗口的时间内扫描相应激发光的光束通过给定集合的所有离散激发位置，且所述一个或多个检测器被对准且可操作以针对离散激发位置的每一集合检测对应荧光发射图像，所述荧光发射图像表示检测到的由于由激发源发射且被引导到给定集合内的每一激发位置的激发光对所述一个或多个受试者内的所述一个或多个荧光物质的激发而在所述一个或多个检测器的曝光窗口期间发射的荧光(例如，以使得每一荧光发射图像是表示检测到的从所述一个或多个受试者中的每一个内由每一受试者内的荧光物质发射的荧光的多受试者荧光发射图像)。
在某些实施例中，对应于检测到的荧光的数据针对离散激发位置的每一集合包括对应荧光发射图像，且所述指令使所述处理器使用荧光发射图像(例如，每一荧光发射图像对应于离散激发位置集合)获得(例如，计算)所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，所述指令使所述处理器针对所述一个或多个受试者中的每一受试者：针对对应于离散激发位置集合的每一荧光发射图像，确定与受试者相关联的荧光发射图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的从受试者内发射的荧光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的荧光发射图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光图像对应于离散激发位置集合；以及使用与受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像获得(例如，计算)受试者的层析图像(例如，3D层析图像)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以针对离散激发位置的每一集合检测对应激发图像，所述对应激发图像表示由于被引导到给定集合内的每一激发位置的激发光的相应光束对所述一个或多个受试者的照明而在所述一个或多个检测器的曝光窗口期间检测到的透射通过所述一个或多个受试者或由所述一个或多个受试者反射的激发光(例如，以使得每一激发图像是表示检测到的透射通过所述一个或多个受试者中的每一个或由所述一个或多个受试者中的每一个反射的激发光的多受试者激发图像)，且所述指令使所述处理器：接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于检测到的激发光的所述数据针对离散激发位置的每一集合包括所述对应激发图像；以及使用荧光发射图像和激发图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像(例如，通过执行层析重构；例如，使用荧光发射图像和激发图像，所述图像中的每一个对应于离散激发位置的集合)。
在某些实施例中，所述指令使所述处理器针对所述一个或多个受试者中的每一受试者：针对对应于离散激发位置集合的每一荧光发射图像，确定与受试者相关联的荧光发射图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的从受试者内发射的荧光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的荧光发射图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光发射图像对应于离散激发位置集合；以及针对对应于离散激发位置集合的每一激发图像，确定与受试者相关联的激发图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的透射通过受试者或由受试者反射的激发光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的激发图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者激发图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者激发图像，其中每一单个受试者激发图像对应于离散激发位置集合；以及使用与受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像和与受试者相关联的所述多个单个受试者激发图像获得(例如，计算)受试者的层析图像(例如，3D层析图像)。
在另一方面中，本发明是针对一种用于在宽视场上快速扫描激发光以用于跨越对象平面定位的一个或多个受试者的层析成像的方法，所述方法包括：(a)用来自激发源的激发光的光束照射所述一个或多个受试者，其中激发源被对准以沿着从激发源的输出到包括一个或多个旋转检流计镜的检流计光学扫描器的光学路径引导激发光的光束，其中检流计光学扫描器被对准且可操作以经由所述一个或多个旋转检流计镜的反射将激发光的光束引导到对象平面的扫描区内的多个位置(例如，多个离散激发位置)，以使得在所述一个或多个检流计镜旋转时，跨越扫描区扫描激发光的光束(例如，朝向多个离散激发位置引导)，进而实现跨越对象平面定位的所述一个或多个受试者的照明，以及(b)用一个或多个检测器检测由于激发光的激发从所述一个或多个受试者内的荧光物质发射的荧光[例如，由于朝向所述多个离散激发位置中的每一个引导的激发光的激发，例如，一个或多个检测器被配置成检测对应于离散激发位置中的每一个的荧光发射图像(例如，2D图像)]；(c)由计算装置的处理器接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据(例如，所述数据包括在通过朝向扫描区内的多个激发位置中的每一个引导的激发光的激发之后检测到的荧光发射信号(例如，图像，例如，2D图像))；以及(d)由处理器使用对应于检测到的荧光的数据获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，检流计光学扫描器定位于沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置(例如，扫描区的中心位置)的最小长度光学路径测得的特定距离，以基于所述一个或多个检流计镜的一个或多个最大旋转角度产生所要大小的扫描区。
在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的所要大小是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。
在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的所要大小是从100到200mm(例如，从100到150mm；例如，近似140mm)。
在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离是从150到250mm(例如，近似200mm)。
在某些实施例中，激发源可操作以从其输出发射激发光的光束作为聚焦光束，所述聚焦光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时汇聚[例如，以使得在对象平面处的激发光的光束的光点大小(例如，直径)小于在激发源的输出处的激发光的光束的初始光点大小(例如，直径)]。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的聚焦光束在扫描区内的所有位置具有小于或近似等于1mm的光点大小。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的聚焦光束具有半角发散
Figure BDA0002394810390000291
以使得
Figure BDA0002394810390000292
其中：wmax是在扫描区内的激发光的光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，在待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的光束在其光束腰位置处的光点大小，d1是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的最小距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的中心位置测得)，且d2是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的拐角处的位置测得；例如，其中d2大于d1)。
在某些实施例中，d1是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，d1小于300mm(例如，小于250mm)。在某些实施例中，d1是从100mm到500mm(例如，从150到250mm；例如，从200到250mm；例如，从220到250mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)且大于d1。在某些实施例中，d2小于500mm(例如，小于250mm)且大于d1。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm；例如，从220到250mm)且大于d1。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的聚焦光束的半角发散小于或等于25毫弧度(例如，小于或等于20毫弧度；例如，小于或等于15毫弧度)。
在某些实施例中，激发源可操作以从其输出发射激发光的光束作为准直光束，所述准直光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时发散(例如，缓慢地发散)。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的准直光束的直径在扫描区内的所有位置具有小于或近似等于1mm的光点大小。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的准直光束具有半角发散
Figure BDA0002394810390000301
以使得
Figure BDA0002394810390000302
其中：wmax是扫描区内的激发光的准直光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的准直光束的光束在其光束腰位置处的光点大小[例如，其中光束腰位置位于激发源的输出(例如，自由空间激光器的激光孔径)处]，d0 (1)是沿着从激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径的距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的拐角处的位置测得)。
在某些实施例中，d0 (1)是至少50mm(例如，至少100mm)。在某些实施例中，d0 (1)小于或等于250mm(例如，小于或等于200mm)。在某些实施例中，d0 (1)是从50mm到200mm(例如，从50到180mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm)。在某些实施例中，d2小于或等于500mm(例如，小于或等于250mm)。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm)。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，从激发源的输出发射的激发光的准直光束的半角发散小于或等于5毫弧度(例如，小于或等于2毫弧度；例如，小于或等于1.5毫弧度；例如，小于或等于1.25毫弧度)。
在某些实施例中，光束成形光学器件定位于从激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径中，其中所述光束成形光学器件是以下各项中的至少一个：(A)聚焦光学器件，其中所述聚焦光学器件被对准以使得在通过聚焦光学器件之后，激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时汇聚[例如，以使得在对象平面处的激发光的光束的光点大小(例如，直径)小于在聚焦光学器件处的激发光的光束的初始大小(例如，直径)]；以及(B)准直光学器件，其中所述准直光学器件被对准以使得在通过准直光学器件之后，激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时发散(例如，缓慢地发散)。
在某些实施例中，光束成形光学器件是聚焦光学器件。
在某些实施例中，聚焦光学器件被定位[例如，相对于(i)检流计光学扫描器以及(ii)激发源的输出(例如，光束激发光从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径)]以使得激发光的光束的光点大小在扫描区内的所有位置直径小于或近似等于1mm。
在某些实施例中，在通过聚焦光学器件之后的激发光的光束的半角发散
Figure BDA0002394810390000321
使得
Figure BDA0002394810390000322
其中：wmax是激发光的光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的光束在光束腰处的光点大小，d1是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的中心位置测得)，且d2是沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的拐角处的位置测得；例如，其中d2大于d1)。
在某些实施例中，d1是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，d1小于300mm(例如，小于250mm)。在某些实施例中，d1是从100mm到500mm(例如，从150到250mm；例如，从200到250mm；例如，从220到250mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)且大于d1。在某些实施例中，d2小于500mm(例如，小于250mm)且大于d1。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm；例如，从220到250mm)且大于d1。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，在通过聚焦光学器件之后的激发光的光束的半角发散小于或等于25毫弧度(例如，小于或等于20毫弧度；例如，小于或等于15毫弧度)。
在某些实施例中，光束成形光学器件是准直光学器件。
在某些实施例中，准直光学器件被定位[例如，相对于(i)检流计光学扫描器以及(ii)激发源的输出(例如，激发光的光束从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径]以使得激发光的光束的光点大小在扫描区内的对象平面处的所有位置直径小于或近似等于1mm。
在某些实施例中，在通过准直光学器件之后的激发光的光束的半角发散
Figure BDA0002394810390000331
使得
Figure BDA0002394810390000332
其中：wmax是扫描区内的激发光的光束的所要光点大小的上限[例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度，wbw是激发光的光束在光束腰位置处的光点大小[例如，其中光束腰位置位于激发源的输出处(例如，激发光从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径)]，d0 (2)是沿着从激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径测得的从准直光学器件到检流计光学扫描器的距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到扫描区的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到扫描区的拐角处的位置测得)。
在某些实施例中，d0 (2)是至少50mm(例如，至少100mm)。在某些实施例中，d0 (2)小于或等于250mm(例如，小于或等于200mm)。在某些实施例中，d0 (2)是从50mm到200mm(例如，从50到180mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm)。在某些实施例中，d2小于或等于500mm(例如，小于或等于250mm)。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm)。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，在通过准直光学器件之后的激发光的光束的半角发散小于或等于5毫弧度(例如，小于或等于2毫弧度；例如，小于或等于1.5毫弧度；例如，小于或等于1.25毫弧度)。
在某些实施例中，激发源的功率大于或近似等于100mW(例如，大于或近似等于200mW；例如，大于或近似等于200mW；例如，大于或近似等于300mW)。
在某些实施例中，所述激发源是光纤耦合激光器或光纤激光器，且所述激发光的光束从其发射的所述激发源的输出是所述光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的远端。
在某些实施例中，光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的纤芯直径是从5μm到400μm(例如，其中光纤是具有从5到10μm的纤芯直径的单模光纤；例如，其中光纤是具有从50到400μm的纤芯直径的多模光纤)。在某些实施例中，光纤的数值孔径(NA)是从0.1到0.3(例如，从0.1到0.25；例如，从0.15到0.25)。
在某些实施例中，激发源是自由空间激光器，其中激发光的光束从其发射的激发源的输出是自由空间激光器的激光孔径。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器包括包括多个像素的焦平面阵列(FPA)检测器(例如，CCD相机；例如，CMOS相机)，其中FPA检测器被对准以对扫描区进行成像(例如，以使得FPA检测器的视场包括扫描区)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器包括包括多个光纤的光纤束，所述光纤中的每一个被对准以收集从扫描区内的不同位置发射的光且将所收集的光导引到对应的单元素检测器(例如，Si PD)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以按透照法几何形状检测从荧光物质发射的荧光，其中激发光的光束是从对象平面的第一侧朝向对象平面引导，且所述一个或多个检测器被对准且可操作以检测在从对象平面的相对第二侧(例如，与第一侧相对)向外的方向上发射的荧光(例如，其中所述一个或多个检测器在对象平面的与检流计光学扫描器相对的侧上)。
在某些实施例中，所述一个或多个受试者是小动物(例如，小鼠、大鼠、田鼠、兔子、仓鼠和类似大小的动物)。
在某些实施例中，所述一个或多个受试者中的至少一个的厚度是近似1cm。
在某些实施例中，使用可操作以固定多个小动物的动物固持器跨越对象平面定位所述一个或多个受试者(例如，其中动物固持器包括多个底座，每一底座可操作以在成像期间固定小动物)。
在某些实施例中，动物固持器包括一个或多个光学挡板[例如，所述一个或多个挡板中的每一个对应于在基本上垂直于对象平面的方向上向前(例如，在激发光的光束入射于对象平面上的方向上)和/或向后(例如，在激发光的光束入射于对象平面上的方向的相反方向上)从动物固持器向外突出的结构，每一挡扳对具有激发光和/或所发射荧光的波长的光是基本上不透明的，且位于小动物由动物固持器固定的两个位置之间(例如，以便减少/消除串扰)]。
在某些实施例中，在活体内执行层析成像。
在某些实施例中，所述方法包括：用所述一个或多个检测器检测透射通过所述一个或多个受试者或从所述一个或多个受试者反射的激发光[例如，检测对应于离散激发位置中的每一个的激发图像(例如，2D图像)]，且由处理器接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据[例如，所述数据包括当激发光跨越扫描区朝向多个离散激发位置中的每一个引导时在激发光透射通过所述一个或多个受试者或激发光由所述一个或多个受试者反射之后检测到的激发信号(例如，激发图像(例如，2D图像))]；以及由处理器使用对应于检测到的激发光的数据和对应于检测到的荧光的数据获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，步骤(a)包括使用检流计光学扫描器将激发光的光束引导到扫描区内的多个离散激发位置，其中针对每一离散激发位置，所述一个或多个受试者中的定位于朝向离散激发位置引导的激发光的光束的路径中的给定受试者在受试者的表面上的对应照明位置由激发光的光束照射，以使得激发光的光束在对应照明位置入射于给定受试者的表面上且在受试者内漫射，进而激发给定受试者内(例如，所述一个或多个荧光物质中的)荧光物质(例如，由于激发光从对应照明位置的漫射；例如，进而激发位于在对应照明位置入射到受试者上的激发光漫射到其中的在受试者的表面下方的对应漫射体积内的荧光物质)，步骤(b)包括针对每一离散激发位置检测对应荧光发射图像(例如，2D图像)，所述荧光发射图像表示检测到的由于给定受试者内的荧光物质的激发而从定位于朝向离散激发位置引导的激发光的光束的路径中的给定受试者内发射的荧光，进而检测多个荧光发射图像，每一荧光发射图像对应于离散激发位置，步骤(c)包括接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据，对应于检测到的荧光的数据包括所述多个荧光发射图像，且步骤(d)包括使用所述多个荧光发射图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
在某些实施例中，步骤(b)包括针对每一离散激发位置用所述一个或多个检测器检测对应激发图像，所述激发图像表示当激发光的光束在对应照明位置入射于定位于朝向离散激发位置引导的激发光的光束的路径中的给定受试者的表面上时透射通过给定受试者或由给定受试者反射的激发光，进而检测多个激发图像，每一激发图像对应于离散激发位置，步骤(c)包括接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于检测到的激发光的数据包括所述多个激发图像，且步骤(d)包括使用所述多个荧光发射图像和所述多个激发图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
在某些实施例中，步骤(a)包括使用检流计光学扫描器将激发光的光束引导到扫描区内的多个离散激发位置，其中：离散激发位置被布置成若干集合，每一集合包括多个离散激发位置，给定集合的每一离散激发位置对应于所述一个或多个受试者中的不同受试者(例如，其中每一集合包括对应于所述一个或多个受试者中的每一受试者的离散激发位置)，所述检流计光学扫描器可操作以每次一个集合地扫描激发光的光束，从而将激发光的光束引导到给定集合内的每一离散激发位置，然后继续到下一集合(例如，将激发光的光束引导到第一集合内的每一离散激发位置，然后将激发光的光束引导到第二集合内的每一离散激发位置)，且检流计光学扫描器可操作以在对应于所述一个或多个检测器的曝光窗口的时间内扫描激发光的光束通过给定集合的所有离散激发位置，且步骤(b)包括针对离散激发位置的每一集合检测荧光发射图像，每一荧光发射图像表示检测到的由于被引导到给定集合内的每一激发位置的激发光对所述一个或多个受试者内的所述一个或多个荧光物质的激发而在所述一个或多个检测器的曝光窗口期间发射的荧光(例如，以使得每一荧光发射图像是多受试者荧光发射图像，所述多受试者荧光发射图像表示检测到的从所述一个或多个受试者中的每一个内由每一受试者内的荧光物质发射的荧光)。
在某些实施例中，对应于检测到的荧光的数据针对离散激发位置的每一集合包括对应荧光发射图像，且步骤(d)包括使用荧光发射图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像(例如，通过执行层析重构；例如，使用荧光发射图像，每一荧光发射图像对应于离散激发位置的集合)。
在某些实施例中，步骤(d)包括针对所述一个或多个受试者中的每一受试者：针对对应于离散激发位置的每一集合的每一荧光发射图像确定与受试者相关联的荧光发射图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的从受试者内发射的荧光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的荧光发射图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光图像对应于离散激发位置集合；以及使用与受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像获得(例如，计算)受试者的层析图像(例如，3D层析图像)。
在某些实施例中，步骤(b)包括针对离散激发位置的每一集合检测对应激发图像，每一激发图像表示检测到的由于被引导到给定集合内的每一激发位置的激发光的光束对所述一个或多个受试者的照明而在所述一个或多个检测器的曝光窗口期间透射通过所述一个或多个受试者或由所述一个或多个受试者反射的激发光(例如，以使得每一激发图像是表示检测到的透射通过所述一个或多个受试者中的每一个或由所述一个或多个受试者中的每一个反射的激发光的多受试者激发图像)，步骤(c)包括接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于检测到的激发光的所述数据针对离散激发位置的每一集合包括所述对应激发图像；且步骤(d)包括使用荧光发射图像和激发图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像(例如，通过执行层析重构；例如，使用荧光发射图像和激发图像，所述图像中的每一个对应于离散激发位置的集合)。
在某些实施例中，步骤(d)包括：针对对应于离散激发位置的每一集合的每一荧光发射图像，确定与受试者相关联的荧光发射图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的从受试者内发射的荧光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的荧光发射图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光发射图像对应于离散激发位置的集合；针对对应于离散激发位置的每一集合的每一激发图像，确定与受试者相关联的激发图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的透射通过受试者或由受试者反射的激发光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的激发图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于离散激发位置集合的单个受试者激发图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者激发图像，其中每一单个受试者激发图像对应于离散激发位置的集合；以及使用与受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像和与受试者相关联的所述多个单个受试者激发图像获得(例如，计算)受试者的层析图像(例如，3D层析图像)。
在另一方面中，本发明是针对一种用于在宽视场上快速扫描来自多个激发源的激发光以用于跨越对象平面定位的一个或多个受试者的层析成像的方法，所述方法包括：(a)用由多个激发源中的相应一个发射的至少一个激发光的光束照射所述一个或多个受试者，其中：(i)第一激发源被对准以沿着从第一激发源到包括一个或多个旋转检流计镜的检流计光学扫描器的第一光学路径引导其相应激发光的光束，(ii)除第一激发源外的每一激发源被对准以沿着朝向检流计光学扫描器的相应光学路径以相对于从第一激发源到检流计光学扫描器的第一光学路径的对应偏移角引导其相应激发光的光束，(iii)检流计光学扫描器被对准且可操作以针对每一激发源经由所述一个或多个旋转检流计镜的反射将由激发源发射的相应激发光的光束引导到对象平面的相应扫描区内的相应多个位置，以使得在所述一个或多个检流计镜旋转时，跨越相应扫描区(例如，朝向相应扫描区内的多个离散激发位置引导)扫描由激发源发射的相应激发光的光束(例如，每一相应扫描区与所述多个激发源中的激发源相关联)，进而实现跨越对象平面定位的所述一个或多个受试者的照明[例如，其中定位于朝向受试者后方的给定离散激发位置引导的激发光的路径中的扫描区附近(例如，在前方；例如，在该处)的给定受试者被激发光照射，以使得朝向受试者后方的给定离散激发位置引导的激发光在相关联照明位置照射在受试者的表面上，且在受试者内漫射，进而实现与来自相关联照明位置的激发光的漫射相关联(例如，由其限定)的位于受试者的表面下方的体积内的荧光物质的激发]；(b)用一个或多个检测器检测由于来自所述多个激发源中的至少一个的激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的一个或多个荧光物质发射的荧光[例如，由于在激发源的相应扫描区内的所述多个离散激发位置中的每一个从至少一个激发源发射的激发光的激发，例如，一个或多个检测器被配置成检测对应于离散激发位置中的每一个的荧光发射图像(例如，2D图像)]；(c)由计算装置的处理器接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据(例如，所述数据包括在跨越至少一个激发源的相应扫描区的所述多个激发位置的至少一部分中的每一个处的激发之后检测到的荧光发射信号(例如，图像；例如，2D图像))；以及(d)由处理器使用对应于检测到的荧光的数据获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，每一激发源发射具有在所述一个或多个受试者内的对应荧光物质的激发(吸收)带内的相异激发波长的激发光(例如，其中每一相异激发波长是在从400nm到1300nm的范围内的波长)。
在某些实施例中，步骤(b)包括检测由于来自所述多个激发源中的两个或更多个激发源中的每一个的激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的所述一个或多个荧光物质发射的荧光[例如，针对由于从激发源发射的激发光的激发而由所述一个或多个荧光物质中的相关联荧光物质(例如，其中相关联荧光物质响应于来自相关联激发源的激发光的激发而发射荧光)发射的两个或更多个荧光中的每一个进行检测]。
在某些实施例中，对应于检测到的荧光的数据针对所述多个激发源中的两个或更多个激发源中的每一个包括在通过跨越激发源的相应扫描区朝向多个激发位置中的每一个引导的激发光的激发之后检测到的相关联荧光发射信号的集合(例如，图像；例如，2D图像)，且步骤(c)包括针对所述两个或更多个激发源中的每一个使用相关联荧光发射信号获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像的相应集合(例如，通过执行层析重构)，进而获得所述两个或更多个激发源中的每一个的一个或多个层析图像的集合。
在某些实施例中，激发源中的每一个的相应扫描区中的每一个的至少一部分彼此重叠以产生共享扫描区。
在某些实施例中，所述检流计光学扫描器定位于沿着从所述检流计到所述共享扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的特定距离，以基于所述一个或多个检流计镜的一个或多个最大旋转角度产生所要大小的共享扫描区。
在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的共享扫描区的所要大小是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的共享扫描区的所要大小是从100到200mm(例如，从100到150mm；例如，近似140mm)。
在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到共享扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离是从150到250mm(例如，近似200mm)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源是聚焦激发源，所述聚焦激发源可操作以从其输出发射其相应激发光的光束作为聚焦光束，所述聚焦光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时汇聚[例如，以使得在对象平面处的激发光的光束的光点大小(例如，直径)小于在激发源的输出处的激发光的光束的初始光点大小(例如，直径)]。
在某些实施例中，从聚焦激发源的输出发射的激发光的聚焦光束在扫描区内的所有位置具有小于或近似等于1mm的光点大小。
在某些实施例中，从聚焦激发源的输出发射的激发光的聚焦光束具有半角发散
Figure BDA0002394810390000411
以使得
Figure BDA0002394810390000412
其中：wmax是在聚焦激发源的相应扫描区内的激发光的聚焦光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的聚焦光束在其光束腰位置处的光点大小，d1是沿着从检流计光学扫描器到聚焦激发源的相应扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的最小距离(例如，从检流计光学扫描器到聚焦激发源的相应扫描区的中心位置测得)，且d2是沿着从检流计光学扫描器到聚焦源的相应扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到聚焦激发源的相应扫描区的拐角处的位置测得；例如，其中d2大于d1)。
在某些实施例中，d1是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，d1小于300mm(例如，小于250mm)。在某些实施例中，d1是从100mm到500mm(例如，从150到250mm；例如，从200到250mm；例如，从220到250mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)且大于d1。在某些实施例中，d2小于500mm(例如，小于250mm)且大于d1。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm；例如，从220到250mm)且大于d1。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，从聚焦激发源的输出发射的激发光的聚焦光束的半角发散小于或等于25毫弧度(例如，小于或等于20毫弧度；例如，小于或等于15毫弧度)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源是准直激发源，所述准直激发源可操作以从其输出发射其相应激发光的光束作为准直光束，所述准直光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时发散(例如，缓慢地发散)。
在某些实施例中，从准直激发源的输出发射的激发光的准直光束在扫描区内的所有位置具有直径小于或近似等于1mm的光点大小。
在某些实施例中，从准直激发源的输出发射的激发光的准直光束具有半角发散
Figure BDA0002394810390000431
以使得
Figure BDA0002394810390000432
其中：wmax是准直激发源的相应扫描区内的激发光的准直光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是激发光的准直光束的光束在其光束腰位置处的光点大小[例如，其中光束腰位置位于激发源的输出处(例如，自由空间激光器的激光孔径)]，d0 (1)是沿着从准直激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径的距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到准直激发源的相应扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，从检流计光学扫描器到准直源的相应扫描区的拐角处的位置测得)。
在某些实施例中，d0 (1)是至少50mm(例如，至少100mm)。在某些实施例中，d0 (1)小于或等于250mm(例如，小于或等于200mm)。在某些实施例中，d0 (1)是从50mm到200mm(例如，从50到180mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm)。在某些实施例中，d2小于或等于500mm(例如，小于或等于250mm)。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm)。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，从准直激发源的输出发射的激发光的准直光束的半角发散小于或等于5毫弧度(例如，小于或等于2毫弧度；例如，小于或等于1.5毫弧度；例如，小于或等于1.25毫弧度)。
在某些实施例中，针对所述多个激发源中的至少一个激发源，与激发源相关联的光束成形光学器件定位于从相关联激发源的输出到检流计光学扫描器的相应光学路径中，且其中所述光束成形光学器件是以下各项中的至少一个：(A)聚焦光学器件，其中所述聚焦光学器件被对准以使得在通过聚焦光学器件之后，从相关联激发源的输出发射的相关联激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时汇聚[例如，以使得在对象平面处的相关联激发光的光束的光点大小(例如，直径)小于在聚焦光学器件处的相关联激发光的光束的初始大小(例如，直径)]；以及(B)准直光学器件，其中所述准直光学器件被对准以使得在通过准直光学器件之后，从相关联激发源的输出发射的相关联激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时发散(例如，缓慢地发散)。
在某些实施例中，光束成形光学器件是聚焦光学器件。
在某些实施例中，聚焦光学器件被定位[例如，相对于(i)检流计光学扫描器以及(ii)相关联激发源的输出(例如，相关联光束激发光从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，相关联激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径)]以使得相关联激发光的光束的光点大小在相关联激发源的相应扫描区内的所有位置直径小于或近似等于1mm。
在某些实施例中，在通过聚焦光学器件之后相关联激发光的光束的半角发散
Figure BDA0002394810390000441
使得
Figure BDA0002394810390000442
其中：wmax是相关联激发光的光束的所要光点大小的上限(例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)，wbw是相关联激发光的光束在光束腰位置处的光点大小，d1是沿着从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离(例如，其中最小距离d1是从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区的中心位置测得)，且d2是沿着从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离(例如，其中d2是从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区的拐角处的位置测得；例如，其中d2大于d1)。
在某些实施例中，d1是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)。在某些实施例中，d1小于300mm(例如，小于250mm)。在某些实施例中，d1是从100mm到500mm(例如，从150到250mm；例如，从200到250mm；例如，从220到250mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm；例如，至少200mm)且大于d1。在某些实施例中，d2小于500mm(例如，小于250mm)且大于d1。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm；例如，从220到250mm)且大于d1。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，在通过聚焦光学器件之后的相关联激发光的光束的半角发散小于或等于25毫弧度(例如，小于或等于20毫弧度；例如，小于或等于15毫弧度)。
在某些实施例中，光束成形光学器件是准直光学器件。
在某些实施例中，准直光学器件被定位[例如，相对于(i)检流计光学扫描器以及(ii)相关联激发源的输出(例如，激发光的光束从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径]以使得相关联激发光的光束的光点大小在相关联激发源的相应扫描区内的对象平面处的所有位置直径小于或近似等于1mm。
在某些实施例中，在通过准直光学器件之后的相关联激发光的光束的半角发散
Figure BDA0002394810390000451
使得
Figure BDA0002394810390000452
其中：wmax是相关联激发源的相应扫描区内的相关联激发光的光束的所要光点大小的上限[例如，近似1mm，例如，待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度]，wbw是相关联激发光的光束在光束腰位置处的光点大小[例如，其中光束腰位置位于相关联激发源的输出处(例如，激发光从其发射的光纤耦合激发源或光纤激光器的光纤的远端；例如，相应激发光的光束从其发射的自由空间激光器的激光孔径)]，d0 (2)是沿着从相关联激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径测得的从准直光学器件到检流计光学扫描器的距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区的最大长度光学路径的最大距离(例如，其中d2是从检流计光学扫描器到相关联激发源的相应扫描区的拐角处的位置测得)。
在某些实施例中，d0 (2)是至少50mm(例如，至少100mm)。在某些实施例中，d0 (2)小于或等于250mm(例如，小于或等于200mm)。在某些实施例中，d0 (2)是从50mm到200mm(例如，从50到180mm)。在某些实施例中，d2是至少100mm(例如，至少150mm)。在某些实施例中，d2小于或等于500mm(例如，小于或等于250mm)。在某些实施例中，d2是从50到500mm(例如，从100到250mm；例如，从150到250mm)。在某些实施例中，wmax小于或等于2mm(例如，小于或等于1.5mm；例如，小于或等于1mm)。在某些实施例中，wmax是近似1mm。在某些实施例中，wmax是近似0.5mm。
在某些实施例中，在通过准直光学器件之后的相关联激发光的光束的半角发散小于或等于5毫弧度(例如，小于或等于2毫弧度；例如，小于或等于1.5毫弧度；例如，小于或等于1.25毫弧度)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源的功率大于或近似等于100mW(例如，大于或近似等于200mW；例如，大于或近似等于200mW；例如，大于或近似等于300mW)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源是光纤耦合激光器或光纤激光器，且激发光的光束从其发射的至少一个激发源的输出是光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的远端。
在某些实施例中，光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的纤芯直径是从5μm到400μm(例如，其中光纤是具有从5到10μm的纤芯直径的单模光纤；例如，其中光纤是具有从50到400μm的纤芯直径的多模光纤)。在某些实施例中，光纤的数值孔径(NA)是从0.1到0.3(例如，从0.1到0.25；例如，从0.15到0.25)。
在某些实施例中，所述多个激发源中的至少一个激发源是自由空间激光器，其中激发光的光束从其发射的至少一个激发源的输出是自由空间激光器的激光孔径。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器包括包括多个像素的焦平面阵列(FPA)检测器(例如，CCD相机；例如，CMOS相机)，其中FPA检测器被对准以对每一激发源的每一相应扫描区的至少一部分进行成像(例如，以使得FPA检测器的视场包括每一相应扫描区的至少一部分)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器包括包括多个光纤的光纤束，所述光纤中的每一个被对准以收集从扫描区内的不同位置发射的光且将所收集的光导引到对应的单元素检测器(例如，Si PD)。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器被对准且可操作以按透照法几何形状检测从荧光物质发射的荧光，其中每一相应激发光的光束是从对象平面的第一侧朝向对象平面引导，且所述一个或多个检测器被对准且可操作以(例如，对准)检测在从对象平面的相对第二侧(例如，与第一侧相对)向外的方向上发射的荧光(例如，其中所述一个或多个检测器在对象平面的与检流计光学扫描器相对的侧上)。
在某些实施例中，所述一个或多个受试者是小动物(例如，小鼠、大鼠、田鼠、兔子、仓鼠和类似大小的动物)。
在某些实施例中，所述一个或多个受试者中的至少一个的厚度是近似1cm。
在某些实施例中，使用可操作以固定多个小动物的动物固持器跨越对象平面定位所述一个或多个受试者(例如，其中动物固持器包括多个底座，每一底座可操作以在成像期间固定小动物)。
在某些实施例中，动物固持器包括一个或多个光学挡板[例如，所述一个或多个挡板中的每一个对应于在基本上垂直于对象平面的方向上向前(例如，在激发光的光束入射于对象平面上的方向上)和/或向后(例如，在激发光的光束入射于对象平面上的方向的相反方向上)从动物固持器向外突出的结构，每一挡扳对具有激发光和/或所发射荧光的波长的光是基本上不透明的，且位于小动物由动物固持器固定的两个位置之间(例如，以便减少/消除串扰)]。
在某些实施例中，在活体内执行层析成像。
在某些实施例中，步骤(b)包括用所述一个或多个检测器针对所述多个激发源中的至少一个激发源检测由所述至少一个激发源发射的透射通过所述一个或多个受试者或从所述一个或多个受试者反射的激发光[例如，检测对应于所述至少一个激发源的相应扫描区内的离散激发位置中的每一个的激发图像(例如，2D图像)]，步骤(c)包括接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据[例如，所述数据包括当朝向跨越所述至少一个激发源的相应扫描区的多个离散激发位置中的每一个引导激发光时在激发光透射通过所述一个或多个受试者或激发光由所述一个或多个受试者反射之后检测到的激发信号(例如，激发图像(例如，2D图像))]，且步骤(d)包括使用对应于检测到的激发光的数据和对应于检测到的荧光的数据获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，针对所述多个激发源中的至少一个激发源：步骤(a)包括使用检流计光学扫描器将相应激发光的光束引导到相应扫描区内的多个离散激发位置，其中针对每一离散激发位置，所述一个或多个受试者中的定位于朝向离散激发位置引导的相应激发光的光束的路径中的给定受试者在受试者的表面上的对应照明位置被相应激发光的光束照射，以使得相应激发光的光束在对应照明位置入射于给定受试者的表面上且在受试者内漫射，进而激发给定受试者内(例如，所述一个或多个荧光物质中的)荧光物质(例如，由于激发光从对应照明位置的漫射；例如，进而激发位于在对应照明位置入射到给定受试者上的激发光漫射到其中的在受试者的表面下方的对应漫射体积内的荧光物质)，步骤(b)包括针对每一离散激发位置，检测对应荧光发射图像(例如，2D图像)，所述荧光发射图像表示检测到的由于给定受试者内的荧光物质的激发而从定位于朝向离散激发位置引导的相应激发光的光束的路径中的给定受试者内发射的荧光，进而检测多个荧光发射图像，每一荧光发射图像对应于激发源的相应扫描区内的离散激发位置，步骤(c)包括接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据，对应于检测到的荧光的数据包括针对激发源检测到的所述多个荧光发射图像，且步骤(d)包括使用针对激发源检测到的所述多个荧光发射图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
在某些实施例中，针对所述多个激发源中的至少一个激发源：步骤(b)包括针对激发源的相应扫描区内的每一离散激发位置用所述一个或多个检测器检测对应激发图像，所述激发图像表示当相应激发光的光束在对应照明位置入射于给定受试者的表面上时由激发源发射的透射通过给定受试者或由给定受试者反射的激发光，进而检测多个激发图像，每一激发图像对应于激发源的相应扫描区内的离散激发位置，步骤(c)包括接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于检测到的激发光的所述数据包括针对激发源检测到的所述多个荧光发射图像，且步骤(d)包括使用针对激发源检测到的所述多个荧光发射图像和针对激发源检测到的所述多个激发图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
在某些实施例中，针对所述多个激发源中的至少一个激发源(例如，针对所述多个激发源中的每一激发源)：步骤(a)包括使用检流计光学扫描器以将由激发源发射的相应激发光的光束引导到激发源的相应扫描区内的多个离散激发位置，其中：离散激发位置被布置成若干集合，每一集合包括多个离散激发位置，给定集合的每一离散激发位置对应于所述一个或多个受试者中的不同受试者(例如，其中每一集合包括对应于所述一个或多个受试者中的每一受试者的离散激发位置)，检流计光学扫描器可操作以每次一个集合地扫描相应激发光的光束，将相应激发光的光束引导到给定集合内的每一离散激发位置，然后继续到下一集合(例如，将相应激发光的光束引导到第一集合内的每一离散激发位置，然后将相应激发光的光束引导到第二集合内的每一离散激发位置)，且检流计光学扫描器可操作以在对应于所述一个或多个检测器的曝光窗口的时间内扫描相应激发光的光束通过给定集合的所有离散激发位置，且步骤(b)包括针对离散激发位置的每一集合检测对应荧光发射图像，所述荧光发射图像表示检测到的由于由激发源发射且被引导到给定集合内的每一激发位置的激发光对所述一个或多个受试者内的所述一个或多个荧光物质的激发而在所述一个或多个检测器的曝光窗口期间发射的荧光(例如，以使得每一荧光发射图像是表示检测到的从所述一个或多个受试者中的每一个内由每一受试者内的荧光物质发射的荧光的多受试者荧光发射图像)。
在某些实施例中，对应于检测到的荧光的数据针对离散激发位置的每一集合包括对应荧光发射图像，且步骤(d)包括使用荧光发射图像(例如，每一荧光发射图像对应于离散激发位置集合)获得(例如，计算)所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像(例如，通过执行层析重构)。
在某些实施例中，步骤(d)包括针对所述一个或多个受试者中的每一受试者：针对对应于离散激发位置的每一集合的每一荧光发射图像，确定与受试者相关联的荧光发射图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的从受试者内发射的荧光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的荧光发射图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光图像对应于离散激发位置的集合；以及使用与受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像获得(例如，计算)受试者的层析图像(例如，3D层析图像)。
在某些实施例中，步骤(b)包括针对离散激发位置的每一集合检测对应激发图像，所述激发图像表示检测到的由于被引导到给定集合内的每一激发位置的相应激发光的光束对所述一个或多个受试者的照明而在所述一个或多个检测器的曝光窗口期间透射通过所述一个或多个受试者或由所述一个或多个受试者反射的激发光(例如，以使得每一激发图像是表示检测到的透射通过所述一个或多个受试者中的每一个或由所述一个或多个受试者中的每一个反射的激发光的多受试者激发图像)，步骤(c)包括接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于检测到的激发光的所述数据针对离散激发位置的每一集合包括所述对应激发图像；且步骤(d)包括使用荧光发射图像和激发图像获得(例如，计算)所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像(例如，通过执行层析重构；例如，使用荧光发射图像和激发图像，所述图像中的每一个对应于离散激发位置的集合)。
在某些实施例中，步骤(d)包括针对所述一个或多个受试者中的每一受试者：针对对应于离散激发位置的每一集合的每一荧光发射图像，确定与受试者相关联的荧光发射图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的从受试者内发射的荧光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的荧光发射图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光发射图像对应于离散激发位置集合；针对对应于离散激发位置的每一集合的每一激发图像，确定与受试者相关联的激发图像的一部分(例如，所确定部分表示检测到的透射通过受试者或由受试者反射的激发光；例如，使用共同对齐的明亮场图像来识别对应于受试者的激发图像的空间区)，进而确定与受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者激发图像，进而确定与受试者相关联的多个单个受试者激发图像，其中每一单个受试者激发图像对应于离散激发位置集合；以及使用与受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像和与受试者相关联的所述多个单个受试者激发图像获得(例如，计算)受试者的层析图像(例如，3D层析图像)。
附图说明
通过参考结合附图进行的以下描述，本发明的前述和其它目的、方面、特征和优点将变得更明显且更好理解，附图中：
图1A是根据说明性实施例的示出用于跨越大视场快速扫描激发光的光束的系统的布局的示意图。
图1B是根据说明性实施例的示出用于跨越大视场快速扫描激发光的光束的系统的布局的示意图，所述系统包含光束成形光学器件。
图2是根据说明性实施例的示出系统的示意图，其中多个激发源经由线性平台单独地对准到检流计光学扫描器。
图3A是根据说明性实施例的示出用于将多个激光器同时对准到检流计光学扫描器的系统的布局的示意图。
图3B是根据说明性实施例的示出检流计光学扫描器的检流计镜对来自三个不同激光器的激发光的三个光束的反射的示意图。
图4是根据说明性实施例的示出系统的示意图，其中三个激光器同时对准到包括两个旋转检流计镜的检流计光学扫描器。
图5是根据说明性实施例的宽视场透照法激发系统的一组两张照片。
图6是根据说明性实施例的示出在对象平面处测得的来自自由空间二极管激光器的激发光的光束沿着两个维度的线性宽度扫描的一组绘图。
图7是根据说明性实施例的示出扫描区内的多个激发位置及其与跨越对象平面定位的多个受试者的位置的关系的一组两个图像。
图8A是根据说明性实施例的示出激发光的聚焦光束通过对象平面的发散的示意图。
图8B是根据说明性实施例的用于确定激发光的聚焦光束的半角发散的等式的推导。
图8C是根据说明性实施例的示出激发光的准直光束通过对象平面的发散的示意图。
图8D是根据说明性实施例的用于确定激发光的准直光束的半角发散的等式的推导。
图9是根据说明性实施例的示出激发光的准直光束的传播的示意图。
图10是根据说明性实施例的示出决定激发光的准直光束的初始直径的因素的示意图。
图11是根据说明性实施例的示出激发光的聚焦光束的传播的示意图。
图12是根据说明性实施例的示出决定激发光的聚焦光束的初始直径的因素的示意图。
图13是根据说明性实施例的用于经由激发光的光束的快速扫描获得一个或多个对象的层析图像的过程的框流程图。
图14是某些实施例中使用的示例性云计算环境的框图。
图15是某些实施例中使用的实例计算装置和实例移动计算装置的框图。
图16是根据说明性实施例的经由本文所描述的光束扫描方法针对三个小鼠获得的三维层析图像的俯视图和侧视图的集合。
本发明的特征及优点将从以下在结合图式时所阐述的详细描述变得更显而易见，其中相同参考符号始终识别对应元件。在图式中，相同参考标号通常指示相同、功能上相似及/或结构上相似的元件。
定义
近似：如本文中所用，术语“近似”或“约”在应用于所关注的一个或多个值时是指与所陈述参考值类似的值。在某些实施例中，除非另有说明或另外从上下文显而易见，否则术语“近似”或“约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低范围内的值范围，且此类数字超过可能值的100％的情况除外。
图像：如本文所使用的，术语“图像”--例如，哺乳动物的3-D图像--包含任何视觉表示，如照片、视频帧、流式视频、以及照片、视频帧或流式视频的任何电子、数字或数学模拟。在某些实施例中，本文描述的任何设备包含用于显示图像或由处理器产生的任何其它结果的显示器。在某些实施例中，本文描述的任何方法包含显示图像或通过所述方法产生的任何其它结果的步骤。
3D，三维：如本文所使用，参考“图像”的术语“3D”或“三维”意味着传达关于三个维度的信息。3D图像可以被再现为三维数据集和/或可以被显示为一组二维表示，或者显示为三维表示。在某些实施例中，3D图像表示为体素(例如，体积像素)数据。
图：如本文所使用，术语“图”应理解成意味着含有空间相关信息的视觉显示，或可以被解译以用于视觉显示的任何数据表示。举例来说，给定体积的三维图可以包含在贯穿所述体积的三个空间维度中变化的给定量的值的数据集。三维图可以在二维中(例如，在二维屏幕上或在二维打印输出上)显示。
荧光图像，发射图像：如本文所使用，术语“荧光图像”和“发射图像”应理解为意味着在对应于荧光剂或探测体的发射波长的波长处获取的图像。
激发图像：如本文所使用，术语“激发图像”应理解成意味着在对应于由激发源发出的激发光的波长的波长处获取的图像。
电磁辐射，辐射：如本文所使用，术语“电磁辐射”和“辐射”应理解成意味着在电和磁性组件的空间中与彼此且与传播方向成直角且彼此同相的自我传播的波。电磁辐射包含：无线电波，微波，红色、红外和近红外光，可见光，紫外光，X射线和γ射线。
光学路径：如本文所使用，术语“光学路径”指代光束在传播且由光学系统的各种光学元件(例如，透镜、镜、偏振器、分光器及类似物)引导时行进的路径。光学元件可以通过例如反射、折射及类似机制等多种物理机制引导光束。从第一点到第二点的光学路径指代考虑第一和第二点之间的任何光学元件的引导(例如，经由反射、折射及类似方法)光束从第一点行进到第二点的路径。
光学路径长度，沿着光学路径的距离：如本文所使用，术语“光学路径长度”指代光束在两个点之间传播时遵循的光学路径的几何长度。类似地，术语“距离”当指代沿着特定光学路径的距离时，指代光束当沿着特定光学路径传播时行进的几何距离。
检测器：如本文所使用，术语“检测器”包含电磁辐射的任何检测器，包含但不限于CCD相机、光电倍增管、光电二极管，和雪崩光电二极管。
检流计光学扫描器：如本文所使用，术语“检流计光学扫描器”指代包括一个或多个旋转检流计镜的光学系统组件。检流计光学扫描器允许跨越目标平面中远离检流计光学扫描器给定距离的多个位置扫描光束。这是通过沿着适当对准的光学路径将光束引导到检流计光学扫描器来实现。引导到检流计光学扫描器中的光束由所述一个或多个检流计镜依次反射且在由一个或多个光学扫描角度限定的方向上朝向目标平面向外引导。通常，每一光学扫描角度与特定检流计镜相关联且由相关联检流计镜反射光束的角度确定。旋转给定检流计镜会改变其反射光束的角度，且因此改变相关联光学扫描角度。因此，旋转检流计光学扫描器的检流计镜会改变所述一个或多个光学扫描角度并且因此改变从检流计光学扫描器向外引导光束的方向。在旋转给定检流计镜时，其相关联光学扫描角度变化，且其与目标平面相交的位置沿着特定方向变化。
在某些实施例中，检流计光学扫描器包括单个检流计镜，其可用以沿着目标平面中的特定方向扫描光束通过多个位置。检流计镜的旋转因此扫描光束跨越对象平面的一维扫描区(例如，线)。
在某些实施例中，检流计光学扫描器包括两个旋转检流计镜以使得光束可沿着两个方向扫描通过多个位置。一起旋转两个检流计镜因此允许跨越目标平面的二维区光栅化扫描光束。在某些实施例中，检流计镜对准以使得第一检流计镜在第一方向上改变第一光学扫描角度且第二检流计镜在基本上正交于第一方向的第二方向上改变第二光学扫描角度。第一光学扫描角度的变化(例如，经由第一检流计镜的旋转)改变了从检流计光学扫描器向外引导的光束在第一方向上与目标平面相交的位置。第二光学扫描角度的变化(例如，经由第二检流计镜的旋转)改变了从检流计光学扫描器向外引导的光束在第二方向上与目标平面相交的位置。因此，第一和第二检流计镜可一起旋转以跨越目标平面的二维扫描区光栅化扫描光束。
如本文所使用，将光束引导“到检流计光学扫描器”应理解成意味着沿着适当对准的光学路径将光束引导到检流计光学扫描器以使得其入射于检流计光学扫描器包括的一个或多个检流计镜中的每一个上且由所述每一个检流计镜反射。如本文所使用，到检流计光学扫描器的距离(例如，沿着特定光学路径，从特定位置)应理解成意味着到光束入射于其上的第一检流计镜的距离。如本文所使用，距检流计光学扫描器的距离(例如，沿着特定光学路径，到特定位置)应理解成意味着距被引导到检流计光学扫描器的光束入射于其上的第一检流计镜的距离，包含所述光束在由检流计光学扫描器包括的任何其它镜反射时行进的距离。
前向模型：如本文所使用，术语“前向模型”应理解成意味着在给定介质中从源到检测器的光传播(例如，光子输送)的物理模型。
层析图像：如本文所使用，术语“层析图像”可以例如指代光学层析图像、x射线层析图像、由磁共振生成的层析图像、正电子发射层析(positron emission tomography，PET)、磁共振(magnetic resonance，MR)、单光子发射计算机层析(single photonemission computed tomography，SPECT)和/或超声波，和这些的任何组合。
漫射介质，漫射的介质：如本文所使用，术语“漫射介质”和“漫射的介质”可互换地使用，且应理解成意味着其中波由于在原本均质的介质内的小颗粒(散射体)而经历多个散射事件从而使其相随机化的介质；在此情况下研究平均波强度。平均波强度将遵循漫射方程，其本身表现为“漫射波”且与表面和边界相互作用。
对象平面：如本文所使用，术语“对象平面”指代在待成像的一个或多个对象(例如，受试者)处或接近于所述对象定位的光学成像系统的理想化二维成像平面。
激发源：如本文所使用，术语“激发源”指代用以将光提供到光学系统以用于荧光的光学激发的光源，例如激光。在某些实施例中，激发源从激发源的输出发射激发光的光束。通过将来自激发源的输出的激发光的光束引导到光学系统的各种光学组件(例如，光学器件、镜、检流计光学扫描器及类似物)，随后可以将来自激发源的激发光提供到光学系统。
光学器件：如本文所使用，术语“光学器件”指代用以使用一个或多个透镜使光束成形的一系列一个或多个光学元件。当本文中描述光学器件(例如，聚焦光学器件；例如准直光学器件)的各种参数，例如焦距、通光孔径及类似参数时，它们应理解为指代光学器件的性质，即，光学器件包括的所有光学元件的净影响，而不是光学器件的个别元件中的任一个的性质。
光点大小：如本文所使用，术语“光点大小”指代在特定位置且在基本上正交于光束的传播方向的正交平面中测得的光束的直径的度量。在某些实施例中，光点大小指代对应于沿着所述正交平面内的线在沿着所述线的第一和第二位置之间测得的距离的光束的直径的度量，其中信号表示光束的强度(例如，如由检测器检测到)下降到低于光束的最大强度的预定义分数(例如，最大强度的二分之一；例如，最大强度的1/e2)。举例来说，光点大小可以对应于沿着正交平面中的特定线(例如，沿着x轴的线；例如，单独y轴的线)测得的半峰全宽。在某些实施例中，光点大小指代对应于沿着如上文所描述的正交平面内的不同线各自测得的两个或更多个距离的函数的光束的直径的度量。举例来说，可以测得光点大小作为沿着正交平面内的第一线测得的第一距离和沿着正交平面内的第二线测得的第二距离中的最大值。在某些实施例中，第二线正交于第一线。
受试者：如本文所使用，术语“受试者”指代被成像的个人。在某些实施例中，受试者是人类。在某些实施例中，受试者是小动物。
小动物：如本文所使用，“小动物”指代可用显微CT和/或微型MR成像器成像的小哺乳动物。在一些实施例中，“小动物”指代小鼠、大鼠、田鼠、兔子、仓鼠和类似大小的动物。
具体实施方式
可设想要求保护的发明的系统、架构、装置、方法和过程包括使用来自本文中所描述的实施例的信息开发的变型和改编。如本说明书所设想的，可以执行本文描述的系统、架构、装置、方法和过程的适配和/或修改。
在整个说明书中，在将物品、装置、系统和架构描述为具有、包括或包含特定组件，或在将过程和方法描述为具有、包括或包含特定的步骤时，可以预期的是，附加存在本发明的物品、装置、系统和架构，其基本上由所列举的组件组成，或由所列举的组件组成，并且存在根据本发明的过程和方法，其基本上由所列举的处理步骤组成，或由所列举的处理步骤组成。
应理解，步骤次序或用于执行某些动作的次序是不重要的，只要本发明保持可操作即可。而且，两个或两个以上步骤或动作可以同时进行。
本文提到的任何出版物，例如，在背景技术部分中，并不是承认所述出版物作为关于本文提出的任何权利要求的现有技术。背景技术部分是出于清楚的目的而存在，并且不意味是关于任何权利要求的现有技术的描述。
如前所述，文档通过引用并入本文。在特定术语的含义存在任何矛盾的情况下，以上面“定义”部分中提供的含义为准。
提供标题是为了方便读者-标题的存在和/或排列并非旨在限制本文所述主题的范围。
本文所描述的是促进在宽视场上的快速层析成像的系统和方法。确切地说，在某些实施例中，本文所描述的系统和方法允许激发光的光束跨越对象平面的大扫描区快速扫描通过多个位置。以此方式，在激发光的光束在从检流计光学扫描器被引导到扫描区内的各种位置时的路径中跨越对象平面定位的一个或多个受试者在激发光的光束于位置之间扫描时在多个照明位置被照射。
确切地说，在某些实施例中，激发光的光束由检流计光学扫描器引导到扫描区内的多个离散激发位置。定位在被引导到给定激发位置的激发光光束的光学路径内的给定受试者在受试者的表面的相关联照明位置处被激发光光束照射。激发光的光束在相关联照明位置处入射于受试者的表面上，且在受试者内漫射。当激发光在受试者内漫射时，其激发受试者内(例如，在对应于照明位置的漫射体积内)的荧光物质，且致使荧光物质发出荧光。
当激发光束在激发位置之间扫描时，与每一激发位置相关联的所得荧光由一个或多个检测器检测。对应于检测到的荧光的数据随后用以创建所述一个或多个受试者的层析图像(例如，三维层析图像)。
在某些实施例中，将激发光的光束引导到对象平面的光学元件和检测器按透照法几何形状对准。在透照法中，从对象平面的一侧照射所述一个或多个受试者，且检测向外且远离对象平面的相对侧发射的荧光。以此方式，在一侧(例如，背侧)上照射所述一个或多个受试者中的每一个，且检测在受试者的另一侧(例如，腹部侧)上发射的荧光。
在某些实施例中，将激发光的光束引导到对象平面的光学元件和检测器按落射照明(例如，反射)几何形状对准。在落射照明中，在对象平面的一侧照射所述一个或多个受试者，且检测在对象平面的同一侧上向外发射的荧光。
在某些实施例中，此透照法方法提供优于落射照明或反射几何形状的若干优点。这些优点包含在组织内较深的改进成像(深度灵敏度)和减少的激发光泄漏，这些对于荧光光学层析摄影术特别相关。
常规的基于透射照明的荧光光学层析摄影术系统使用扫描光纤来照射将在多个激发位置成像的受试者。激发源耦合到扫描光纤以使得激发光从其远端发射出去。光纤的远端安装在一个或多个线性平移台上且紧靠对象平面放置。为了跨越对象平面扫描多个位置，所述光纤由线性平移台沿着平行于对象平面的方向物理上平移(例如，沿着两个维度光栅化扫描)，从而维持光纤的远端与对象平面之间的固定距离。
聚焦光学器件附接到光纤的远端以将从光纤发射的光聚焦为较小(例如，直径小于1mm)而变为对象平面处的聚焦光点。由于固定且小(例如，小于115mm)的光纤末端到对象平面距离，光学要求相对地放松，且通常使用相对短焦距(例如，小于30mm)聚焦光学器件来实现对象平面处的所需光点大小。
因此，此类常规层析成像系统受到跨越扫描区物理上平移光纤末端以便照射受试者内的多个位置的需要的限制。光纤末端的物理平移是缓慢的过程。此外，为了在大的区域上成像和例如对多个受试者成像，可能需要多个扫描照明光纤(例如，每一受试者一个)。此方法显著地增加系统复杂性。
本文所描述的方法利用一种光学系统设计，所述设计解决了这些限制，且消除了电动台跨越扫描区平移光纤末端的需要，进而显著增加扫描速度。如在下文中将描述，在某些实施例中，本文所描述的系统和方法利用具有具体定制形状的激发光的光束来维持激发光的光束在跨越扫描区扫描时的小光点大小(例如，直径小于或等于1mm)。在大的区上扫描同时仍维持小光点大小的能力允许在可容纳大的和/或多个受试者的大视场上的准确高分辨率层析成像。
举例来说，在某些实施例中，本文所描述的层析成像系统和方法允许使用单个扫描对例如多个小动物等多个受试者一起快速成像。另外，如在下文中将详细描述，在某些实施例中，快速扫描检流计光学扫描器的使用允许层析成像方法，其中在检测器(例如，CCD相机)的单个曝光期间将激发光的光束引导到多个激发位置。这允许例如在检测器的单个曝光期间检测来自多个受试者中的每一个的荧光信号，且减少获得受试者中的每一个的层析图像所需的时间。
描述的光束成形方法也可以通过减少激发光的光束的大小远离对象平面变化的量以及允许使用高功率激光，来促进厚对象的成像。
另外，本文所描述的系统和方法包含实现将多个激发源并入到单个系统中并以稳健且高效方式切换的方法。此方法移除了在不同测量可能需要的不同激发源之间切换的需要，从而消除在激发源之间切换所需的耗时对准，这也引入了可变性(例如，从测量到测量；例如，由于重新对准激发源的需要)。在某些实施例中，用于将多个激发源并入到单个系统中的方法也促进了多光谱成像应用。
A.借助旋转检流计镜的光束扫描
在某些实施例中，本文所描述的系统和方法利用检流计光学扫描器跨越对象平面的多个位置扫描激发光的光束。图1A示出用于使用检流计光学扫描器106跨越对象平面112的扫描区116快速扫描激发光的光束的光学系统100a布局的实例。如图1A所示，可操作以发射激发光的光束的激发源102被对准以将来自其输出104的激发光的光束沿着光学路径105从输出104引导到检流计光学扫描器106。
检流计光学扫描器106包括一个或多个旋转检流计镜。检流计光学扫描器106被对准且可操作以经由所述一个或多个旋转检流计镜(例如，108)的反射将激发光的光束引导到对象平面的扫描区116内的多个位置。检流计光学扫描器的旋转检流计镜(例如，108)在由一个或多个光学扫描角度限定的方向上朝向对象平面112反射激发光的光束。在所述一个或多个检流计镜旋转时，光学扫描角度且因此激发光的光束被朝向对象平面引导的方向变化。以此方式，在一个或多个检流计镜旋转时，跨越扫描区扫描激发光的光束。
检流计镜能够以足够速度旋转以在约100μs的时间中在大到140mm乘140mm的扫描区中扫描激发光的光束通过多个点。另外，如在下文中将描述，检流计镜可充分快速旋转以在检测器的单个曝光窗口期间将激发光的光束引导到扫描区内的多个激发位置。
在某些实施例中，每一扫描角度与特定检流计镜的旋转相关联且由其决定。通常，每一检流计镜在给定旋转平面内旋转，并且因此改变其在对应扫描平面内的相关联光学扫描角度。因此，通过改变其在对应扫描平面内的相关联光学扫描角度，给定检流计镜可旋转以改变沿着跨越对象平面的特定方向的激发光的光束的位置。因此，每一检流计镜与跨越对象平面的特定方向相关联，且控制(例如，经由其旋转)沿着所述方向的激发光的光束的扫描。
在某些实施例中，本文所描述的光束扫描方法利用包括两个检流计镜的检流计光学扫描器106，所述两个检流计镜被对准以便在跨越对象平面的两个正交方向上扫描激发光的光束。第一检流计镜沿着跨越对象平面的相关联第一方向(例如，x方向)扫描激发光的光束。第二检流计镜沿着跨越对象平面的相关联第二方向(例如，y方向)扫描激发光的光束。在某些实施例中，第一和第二检流计镜一起的旋转跨越对象平面的二维扫描区光栅化扫描激发光的光束。在某些实施例中，通过第一和第二检流计镜的最大旋转角度和从检流计光学扫描器106到对象平面112的距离确定扫描区的大小。
图1A示出光学系统布局和激发光的光束行进的路径如何沿着第一方向与扫描区大小相关，所述第一方向与第一检流计镜相关联(例如，由其扫描)。图1A的插图中示出第一检流计镜108。如图1A所示，在第一检流计镜108的最小旋转角度处，激发光的光束在朝向对象平面的最小第一光学扫描角度处被引导到对象平面112。激发光的光束沿着从检流计光学扫描器106到对象平面112内的扫描区116的中心的最小长度光学路径110a行进最小距离d1(154)。
当第一检流计镜108在正方向上旋转以产生最大第一光学扫描角度时，激发光的光束在正方向上在最大第一光学扫描角度θopt处被引导到对象平面112内的位置(158)。当激发光的光束在正方向上在最大第一光学扫描角度处被引导到对象平面112(158)时，其在沿着第一方向(例如，x方向)的正方向上沿着从检流计光学扫描器到扫描区116的第一边缘的最大长度光学路径110b行进最大距离d2(156)。检流计镜108可以在相反(例如，负)方向上旋转到最大角度以沿着第一方向将激发光的光束沿着光学路径110c引导到扫描区116的第二(例如，相对)边缘。
在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器106到对象平面112的最小长度光学路径130a的最小距离d1(154)和由第一检流计镜108产生的最大第一光学扫描角度决定了沿着第一方向的扫描大小。因此，基于图1A中示出的几何形状，为了产生沿着第一方向具有所要大小的扫描区，检流计光学扫描器106可被定位以使得d1＝X tanΘopt，其中X是沿着第一维度的扫描区116的中心到边缘距离(例如，以使得沿着给定维度的所要扫描大小是2X)且Θopt是通过第一检流计镜108的旋转可实现的最大光学扫描角度。通常，给定光学扫描角度是控制所述给定光学扫描角度的相关联检流计镜的旋转角度的两倍。因此，在某些实施例中，最大第一光学扫描角度是第一检流计镜的最大旋转角度的两倍。
在某些实施例中，上文对于确定通过第一检流计镜的旋转产生的沿着第一维度的扫描区116的大小所描述的相同考虑可用以确定沿着由检流计光学扫描器106的第二检流计镜扫描的第二方向的扫描区116的大小。以此方式，基于一个或多个(例如，第一和第二)检流计镜的一个或多个最大旋转角度，检流计光学扫描器106可被定位沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的特定距离，以产生所要大小的扫描区。对于二维扫描区，最小长度光学路径对应于从检流计光学扫描器到二维扫描区的中心位置的光学路径，如上文描述的一维实例中那样。然而，具有长度d2的最大长度光学路径对应于从检流计光学扫描器到二维扫描区的拐角处的位置的光学路径。
在某些实施例中，所要扫描大小被设定成允许跨越对象平面定位的多个受试者小动物在单个扫描中成像。举例来说，图1A示出跨越扫描区的三个受试者114a、114b和114c位置。可以基于待成像的受试者的所要数目、其大小和受试者之间的分离来设定扫描区的大小。举例来说，为了对各自为25mm宽且间距45mm的三个小鼠进行成像，140mm乘140mm的扫描大小是适当的。
在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的大小(例如，所要扫描大小)是至少100mm。在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的大小(例如，所要扫描大小)是至少150mm。在某些实施例中沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的大小(例如，所要扫描大小)是至少200mm。在某些实施例中，沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的大小(例如，所要扫描大小)是从100到500mm。在某些实施例中沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的大小(例如，所要扫描大小)是从100到200mm。在某些实施例中沿着第一维度和/或第二维度的扫描区的大小(例如，所要扫描大小)是从100到150mm。
在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离d1是至少100mm。在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离d1是至少150mm。在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离d1是至少200mm。在某些实施例中，在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离d1是从150mm到250mm。在某些实施例中，沿着从检流计光学扫描器到扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离d1是近似200mm。
在某些实施例中，系统包括用于在成像期间固定多个小动物的动物固持器。动物固持器可以放置在对象平面处在扫描区中以允许激发光的光束扫描其固持的动物，以使得朝向扫描区内的给定激发位置引导的激发光入射于特定受试者上，从而造成在激发光于表面下方和受试者内漫射时其内的荧光物质的激发。
B.激发源光束成形
在某些实施例中，本文所描述的光束扫描技术中使用的激发光的光束被成形以使得在扫描区内的所有位置处维持所需的光点大小。举例来说，对于例如组织等漫射介质中的层析成像，通常使用低于漫射介质的散射长度的光点大小。对于与小动物的活体内成像相关的典型组织，例如肌肉，散射长度使得使用小于或等于1mm的光点大小。在某些实施例中，使用近似0.5mm的光点大小。
贯穿大扫描区维持此类小的对象平面光点大小是不容易的。确切地说，上文描述的基于检流计光学扫描器的方法允许快速扫描激发光的光束通过延伸跨越对象平面的大扫描区。然而，在跨越对象平面的位置之间扫描激发光的光束时，激发光的光束从检流计光学扫描器行进到对象平面处的给定位置的距离在位置之间变化。
为了确保满足光点大小要求，本文所描述的系统和方法可以利用两个光束成形方法中的一个用于贯穿扫描区维持所要光点大小。
在第一方法中，使用激发光的准直光束。理想地，激发光的准直光束在传播时维持基本上固定的大小。实际上，准直光束在传播时缓慢发散。在第二方法中，使用激发光的聚焦光束。聚焦光束在传播时汇聚直到其在光束腰位置达到最小大小，之后所述光束发散且大小增加。
激发光的适当成形的准直和/或聚焦光束可以直接由激发源自身产生或经由光束成形光学器件的使用产生。举例来说，在某些实施例中，激发源自身直接发射满足在下文中描述的特定要求的激发光的准直或平缓聚焦的光束。这可以经由为提供适当成形的激发光的光束(例如，由激光器制造商)专门设计的激发源实现。在某些实施例中，光束成形光学器件定位于从激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径中以对激发光的光束进行成形。光束成形光学器件可为使激发光的光束准直的准直光学器件或产生激发光的平缓聚焦光束的聚焦光学器件。
在某些实施例中，是否使用激发光的准直或聚焦光束以及是否应当从激发源直接输出或通过使用光束成形光学器件(例如，准直光学器件；例如，聚焦光学器件)获得的选择取决于成像系统的所要性质，例如在扫描区内的激发光束的光点大小的上限、所要扫描大小及类似性质。将使用的特定激发源的性质也是相关的。
确切地说，在某些实施例中，本文所描述的系统和方法使用激光器，例如自由空间激光器、光纤激光器和光纤耦合激光器。自由空间激光器发射激发光直接进入自由空间，以使得自由空间激光器的输出104是从中发射激发光的激光孔径。光纤激光器和光纤耦合激光器从光纤的远端输出激发光。对应于光纤激光器或光纤耦合激光器的激发源102的输出104是光纤激光器或光纤耦合激光器的光纤的远端。
在某些实施例中，光纤激光器和光纤耦合激光器与例如准直光学器件和/或聚焦光学器件等光束成形光学器件的使用特别兼容。
B.i激发光的成形光束的直接输出
图1A示出直接从激发源102的输出104行进到检流计光学扫描器106的激发光的光束。在某些实施例中，激发源被设计成使得其可操作以直接从其输出104发射激发光的适当成形光束。因此，在某些实施例中，沿着从激发源到检流计光学扫描器的光学路径或沿着从检流计光学扫描器到对象平面的光学路径未放置聚焦或准直光学器件。
在某些实施例中，检流计光学扫描器106的检流计镜的大小部分地设定了在激发源102的输出104处的激发光的光束的初始光束直径。确切地说，在激发源的输出处的初始光束直径连同沿着从激发源102的输出104到检流计光学扫描器106的光学路径105的距离d0 (1)(150)被设定成使得在检流计光学扫描器106处的激发光的光束的光点大小小于检流计光学扫描器106的检流计镜的大小wgalvo(162)。在某些实施例中，检流计光学扫描器的检流计镜的大小可接受具有直径从3到5mm的光点大小的激发光的光束。
在某些实施例中，从激发源发射的激发光的光束被成形以使得其在扫描区内的所有位置的光点大小都低于最小所要光点大小。如上文所论述，在某些实施例中，在扫描区内的最小光点大小由其中将执行成像的介质的散射长度决定。因此，在某些实施例中，对于在例如组织等漫射介质中的成像，激发光的光束被成形以在扫描区内的所有位置实现直径低于1mm的光点大小。在某些实施例中，激发光的光束被成形以实现近似0.5mm的光点大小。
在跨越扫描区扫描激发光的光束时，沿着从激发源的输出到检流计光学扫描器以及从检流计光学扫描器到对象平面的光学路径测得的工作距离变化。激发光的光束的适当成形允许在扫描区内的所有位置满足光点大小要求，即使在工作距离随着扫描激发光的光束变化时。举例来说，图1A的示意图示出一维扫描的最小和最大工作距离，其中跨越扫描区的第一维度扫描激发光的光束。如图1A所示，沿着从检流计光学扫描器106到扫描区116的最小长度光学路径的最小距离d1(154)由通过第一检流计镜108的旋转产生的最大第一光学扫描角度θopt和所要扫描大小2X决定。因此，从激发源104的输出到扫描区116的最小工作距离由下方的等式(1)给出。
Figure BDA0002394810390000671
在上面的等式(1)中，d0 (1)对应于沿着从激发源到检流计光学扫描器的光学路径的距离。在某些实施例中，d0 (1)具有在从50mm到180mm的范围内的值。
当激发光的光束沿着第一维度被引导到扫描区的边缘处的位置时，激发光的光束沿着从检流计光学扫描器到扫描区的所述边缘处的所述位置的最大长度光学路径110b行进最大距离d2(156)。因此，激发光的光束行进由下方的等式(2)给定的从激发源的输出104到对象平面的最大工作距离。
Figure BDA0002394810390000681
上面的基于跨越扫描区的第一维度的一维扫描的等式(1)和(2)可容易地延伸到描述用于二维扫描的最小和最大激光工作距离。如果分别相对于二维扫描确定d1和d2两者，那么下面的等式(3)、(4)和(5)对于二维扫描是有效的。即，使得d1被视为沿着从检流计光学扫描器到二维扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的最小距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到二维扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离。因此，在某些实施例中，对于二维扫描区，沿着其测得d1的最小长度光学路径是从检流计光学扫描器到二维扫描区的中心位置的光学路径。在某些实施例中，对于二维扫描区，沿着其测得d2的最大长度光学路径是从检流计光学扫描器到二维扫描区的拐角的光学路径。在某些实施例中，对于二维扫描，X被视为沿着从扫描区的中心到扫描区的拐角的对角线的距离。沿着从激发源102的输出104到检流计光学扫描器106的光学路径的距离d0 (1)与扫描是否沿着单个方向或在二维扫描区内无关。
在某些实施例中，为了在扫描区内的所有位置维持光点大小，激发源输出激发光的准直或聚焦光束。准直和聚焦光束在它们传播通过光学系统时都改变大小。光束的大小在传播时变化的速率由发散角决定，所述发散角是光束汇聚或发散的角度。光束具有最小光点大小的位置称为光束腰位置。在光束腰位置处的光束的最小光点大小称为光束腰直径wbw。
准直光束
在某些实施例中，激发源输出激发光的准直光束。理想地，激发光的准直光束在传播时维持基本上固定的大小。实际上，准直光束缓慢发散，以使得光束腰位于激发源102的输出104(例如，自由空间激光的激光孔径；例如，光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的远端)处。
在某些实施例中，为了使激发光的光束的光点大小小于在扫描区内的所有位置的最大所要光点大小，激发源被设计成发射具有小于上限的半角发散
Figure BDA0002394810390000682
的准直光束，以使得满足下方的等式(3)。在下方的等式(3)中，wmax是在扫描区内的激发光的光束的所要光点大小的上限(例如，1mm，例如，在待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)。
图8C示出激发光的准直光束在沿着到扫描区的最大长度工作距离从其光束腰位置(例如，在激发源的输出处)行进时的实例横截面几何形状，其中所述光束具有wbw的直径。如图8B所示，激发光的准直光束802b在传播时发散，并且在某些实施例中，当其向扫描区行进最大距离do (1)+d2时达到最大光点大小。图8D示出下方的等式(3)的实例推导。在某些实施例中，满足下方的等式(3)确保了最大光点大小小于wmax以使得在扫描区内的所有位置的光点大小维持低于wmax。
Figure BDA0002394810390000691
聚焦光束
在某些实施例中，激发源输出激发光的聚焦光束。聚焦光束在传播时汇聚直到在其光束腰位置处达到其最小大小，然后发散。在某些实施例中，聚焦光束被成形以使得其在对象平面附近在由下方等式(4)给定的位置处达到其光束腰。
Figure BDA0002394810390000692
这允许在对象平面附近达到聚焦光束的最小光点大小。然而，应注意，由于从激发源102的输出104到对象平面112的工作距离随着激发光的光束扫描通过扫描区116而变化，因此扫描区中的各种位置将是在光束腰位置之前和之后的不同距离。因此，在某些实施例中，激发源发射充分缓慢地汇聚(例如，在朝向其光束腰位置的方向上传播时)和发散(例如，在远离其光束腰位置传播时)的激发光的聚焦光束，以使得激发光的光束的光点大小小于在扫描区内的所有位置的最大所要光点大小。
确切地说，对于在由上方等式(4)指定的位置到达其光束腰位置的激发光的聚焦光束，激发源被设计成发射具有小于上限的半角发散
Figure BDA0002394810390000702
的聚焦光束，以使得满足下方的等式(5)。如下方的等式(3)中，wmax是在扫描区内的激发光的光束的所要光点大小的上限(例如，1mm，例如，在待成像的受试者的漫射介质(例如，组织)内的激发光的散射长度)。图8A示出下方等式(5)所基于的激发光的聚焦光束802a在其光束腰附近的实例横截面几何形状。下方等式(5)的实例推导在图8B中示出。如图8A所示，在某些实施例中，等式(5)确保激发光的光束的光点大小当光束向扫描区中的位置行进最小激光工作距离时以及当光束向扫描区中的位置行进最大激光工作距离时都维持在小于wmax。
Figure BDA0002394810390000701
因此，被设计成发射具有上述性质的激发光的准直或聚焦光束的激发源允许针对扫描区内的所有位置维持必要的光点大小。
B.ⅱ用于产生激发光的成形光束的光束成形光学器件
在某些实施例中，经由光束成形光学器件实现具有适当形状的激发光的光束。举例来说，转向图1B，示出利用光束成形光学器件的光学系统100b的布局的实例。在某些实施例中，光束成形光学器件122定位于从激发源到检流计光学扫描器的光学路径中(105a和105b一起)。光束成形光学器件122定位于距激发源的输出104的距离151以及距检流计光学扫描器的距离d0 (2)(152)。以此方式，由激发源102发射的激发光的光束沿着从激发源的输出104到光束成形光学器件122的光学路径105a且沿着从光束成形光学器件122到检流计光学扫描器106的光学路径105b行进。
光束成形光学器件可以用于产生激发光的准直或聚焦光束。确切地说，在某些实施例中，光束成形光学器件是准直光学器件，其被对准以使得在通过准直光学器件之后，激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器和(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时维持缓慢发散的基本上固定的大小。在某些实施例中，光束成形光学器件是聚焦光学器件，其中所述聚焦光学器件被对准以使得在通过聚焦光学器件之后，激发光的光束在(i)朝向检流计光学扫描器以及(ii)从检流计光学扫描器到对象平面行进时汇聚[例如，以使得在对象平面处的激发光的光束的大小(例如，直径)小于在聚焦光学器件处的激发光的光束的初始大小(例如，直径)]。
光束成形光学器件(例如，准直光学器件，例如，聚焦光学器件)的参数(例如，焦距)和其在光学系统中的位置(例如，沿着从激发源的输出到检流计光学扫描器的光学路径)被确定以使得当激发光的光束通过光束成形光学器件时产生具有适当性质的激发光的准直或聚焦光束。
经由光束成形光学器件的使用产生的激发光的光束的性质类似于上文关于直接从激发源以期望形状输出的激发光的光束所描述的那些性质。然而，如下文中所描述，与激发源102的输出104相反，相对于光束成形光学器件122的位置测量工作距离和初始光束直径。
在某些实施例中，类似于直接由激发源成形的激发光的光束，检流计光学扫描器106的检流计镜的大小部分地设定了激发光的光束的初始光束直径。在使用光束成形光学器件的情况下，在光束成形光学器件122的位置处测量初始光束直径。确切地说，在光束处的初始光束直径连同沿着从光束成形光学器件到检流计光学扫描器106的光学路径105b的距离d0 (2)(152)被设定以使得在检流计光学扫描器106处的激发光的光束的光点大小小于检流计光学扫描器106的检流计镜的大小wgalvo(162)。在某些实施例中，检流计光学扫描器的检流计镜的大小可接受具有直径从3到5mm的光点大小的激发光的光束。
在某些实施例中，光束成形光学器件用以产生激发光的适当成形光束(例如，在其通过光束成形光学器件之后)以使得其在扫描区内的所有位置的光点大小低于最小所要光点大小，即使在激发光的光束扫描通过扫描区时也是如此。如上文所论述，在某些实施例中，在扫描区内的最小光点大小由其中将执行成像的介质的散射长度决定。因此，在某些实施例中，对于在例如组织等漫射介质中的成像，激发光的光束被成形以在扫描区内的所有位置实现直径低于1mm的光点大小。在某些实施例中，激发光的光束被成形以实现在扫描区内的所有位置的近似0.5mm的光点大小。
在光束成形光学器件用以产生激发光的准直或聚焦光束的情况下，沿着从光束成形光学器件到检流计光学扫描器以及从检流计光学扫描器到对象平面的光学路径测量工作距离。在跨越扫描区扫描激发光的光束时，从光束成形光学器件到对象平面的工作距离变化。类似于图1A，图1B示出一维扫描的最小和最大工作距离，其中跨越扫描区的第一维度扫描激发光的光束。沿着从检流计光学扫描器106到扫描区116的最小长度光学路径的最小距离d1(154)是由通过第一检流计镜108的旋转产生的最大第一光学扫描角度θopt和所要扫描大小2X决定。因此，从光束成形光学器件到扫描区116的最小工作距离由下方等式(6)给定。
Figure BDA0002394810390000721
当激发光的光束沿着第一维度被引导到扫描区的边缘处的位置时，激发光的光束沿着从检流计光学扫描器到扫描区的所述边缘处的所述位置的最大长度光学路径行进最大距离d2(156)。因此，激发光的光束行进由下方等式(6)给定的从光束成形光学器件122到对象平面112的最大工作距离。
Figure BDA0002394810390000722
上面的基于跨越扫描区的第一维度的一维扫描的等式(6)和(7)可容易地延伸到描述用于二维扫描的最小和最大激光工作距离。如果分别相对于二维扫描确定d1和d2两者，那么下面的等式(8)至(11)对于二维扫描是有效的。即，使得d1被视为沿着从检流计光学扫描器到二维扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的最小距离，且d2是沿着从检流计光学扫描器到二维扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离。确切地说，如上文所论述，在某些实施例中，对于二维扫描区，沿着其测得d1的最小长度光学路径是从检流计光学扫描器到二维扫描区的中心位置的光学路径。在某些实施例中，对于二维扫描区，沿着其测得d2的最大长度光学路径是从检流计光学扫描器到二维扫描区的拐角的光学路径。在某些实施例中，对于二维扫描，X被视为沿着从扫描区的中心到扫描区的拐角的对角线的距离。沿着从激发源102的输出104到检流计光学扫描器106的光学路径的距离d0 (1)与扫描是否沿着单个方向或在二维扫描区内无关。
在某些实施例中，光束成形光学器件用以产生激发光的适当成形光束以便维持在扫描区内的所有位置的光点大小。准直光学器件可用以产生激发光的准直光束，且聚焦光学器件可用以产生激发光的聚焦光束。如上文所论述，准直和聚焦光束在传播通过光学系统时改变大小，且大小的变化可通过例如发散角、光束腰位置和光束腰直径wbw等参数来描述。
准直光束
在某些实施例中，光束成形光学器件是使激发光的光束准直进而产生激发光的准直光束的准直光学器件。理想地，激发光的准直光束在传播时维持基本上固定的大小，而实际上，准直光束在传播远离准直光学器件时缓慢地发散。因此，准直光束的光束腰位于准直光学器件122处，且准直光束的大小在其朝向检流计光学扫描器并且接着朝向对象平面传播时扩展。在某些实施例中，下方的等式(8)指定由准直光学器件产生的激发光的准直光束的半角发散
Figure BDA0002394810390000732
的上限，以便使激发光的光束的光点大小小于在扫描区内的所有位置的最大所要光点大小。上文关于等式(3)所描述的图8C和图8D类似地示出下方等式(8)的基础，其中d0 (1)被d0 (2)替换。
Figure BDA0002394810390000731
在某些实施例中，例如准直光学器件的焦距(例如，有效焦距)等参数连同例如激发源的输出发散和输出面积等激发源的性质一起决定了由给定准直光学器件产生的准直光束的初始光束直径和半角发散。对于用作激发源102的自由空间激光器，输出发散对应于自由空间激光器的本征发散(例如，对应于紧接在从激光孔径退出自由空间激光器之后的激发光的光束的半角发散的本征发散)，且输出面积是激光孔径的面积。当激发源102是光纤激光器或光纤耦合激光器，这两者都从光纤的远端输出激发光时，输出发散对应于光纤的远端的数值孔径NA，且输出面积由光纤的远端的纤芯直径a决定。
聚焦光束
在某些实施例中，光束成形光学器件122是产生激发光的聚焦光束的聚焦光学器件。聚焦光束在传播时汇聚直到在其光束腰位置处达到其最小大小，然后发散。在某些实施例中，聚焦光学器件用以使聚焦光束成形以使得其在对象平面附近在由下方等式(9)给定的位置到达其光束腰。
Figure BDA0002394810390000741
如同直接从激发源的输出104产生的聚焦光束，这允许在对象平面附近达到聚焦光束的最小光点大小。考虑关于由聚焦光学器件产生的聚焦光束的半角发散类似于上文关于直接由激发源输出的聚焦光束所论述的那些内容。确切地说，对于在由上方等式(9)指定的位置到达其光束腰位置的激发光的聚焦光束，聚焦光学器件用以产生具有小于上限的半角发散
Figure BDA0002394810390000743
的聚焦光束，以使得满足下方的等式(10)(与等式(5)相同)。上文关于等式(5)所描述的图8A和图8B对于下方的等式(10)也是说明性的。
Figure BDA0002394810390000742
在某些实施例中，聚焦光学器件的参数连同例如激发源的输出发散和输出面积等激发源的性质一起决定了由给定聚焦光学器件产生的聚焦光束的初始光束直径和半角发散。
B.ⅲ具有光束成形光学器件的实例光学系统设计
下文描述准直光学器件和聚焦光学器件的使用的实例设计考虑。实例示出使用准直光学器件和聚焦光学器件使从光纤耦合激光器的光纤输出的激发光的光束成形的初始光束直径和光束发散考虑。
如图9所示，在准直方法中，激发光在退出激发源的输出904时发散，且在准直光学器件922处达到初始光束直径。在某些实施例中，为了产生准直光束，激发源(例如，904)的输出定位于准直光学器件的焦点处，以使得从激发源的输出到准直光学器件922的距离951对应于准直光学器件的有效焦距(effective focal length，EFL)。在通过准直光学器件之后，在其经由检流计光学扫描器的一个或多个检流计镜的反射从准直光学器件行进到对象平面时以较慢速率发散。在图9中出于清楚起见仅示出单个检流计镜，且激发光的准直光束当由两个检流计镜引导时类似地传播。
在某些实施例中，准直光学器件的性质以及激发源输出决定了激发光的准直光束传播的初始光束直径和发散角。举例来说，当准直光学器件用以使从光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤远端输出的激发光的光束准直时，初始光束直径BD初始由准直光学器件的EFL和光纤的数值孔径NA决定。产生的激发准直光束的半角发散由准直光学器件的EFL和在发射激发光的远端处光纤的纤芯的直径a。初始光束直径BD初始是经由下方的等式(11)确定，如图10中所图示，且全角发散由下方的等式(12)确定(例如，使得半角发散是经由下方等式(12)计算的全角发散的一半)。
BD初始＝2×EFL×NA (11)
Figure BDA0002394810390000751
在某些情况下，纤芯直径和数值孔径充分小且准直光学器件的EFL充分大，使得经由上方等式(11)和(12)确定的半角发散和初始光束直径足够小而跨越扫描区满足光点大小要求。举例来说，对于具有5μm直径纤芯和0.12的NA的光纤，用于近似180mm的工作距离的具有2mm的EFL的准直光学器件，可产生跨越扫描区的小于1mm的光点大小。在某些实施例中，对于较大工作距离，实施准直光学器件以产生较低半角发散。举例来说，对于具有5μm直径纤芯和0.1的NA的光纤，可使用适合于200mm的最大工作距离的2mm EFL准直光学器件实现1.25毫弧度的半角发散。
在某些情况下用以从光纤耦合源输出激发光的标准光纤的性质使得使用标准光纤准直仪作为准直光学器件无法产生适当成形的准直光束。举例来说，典型光纤NA是从0.15或0.22，且光纤准直仪的标准焦距范围是从4mm到20mm。将以短焦距光纤准直仪和小发散光纤实现最小光束直径。NA＝0.15和EFL＝4mm的最小值导致如上方等式(11)确定的1.2mm的初始光束直径。如所论述，对于激发光的准直光束，光束腰位于准直光学器件处且光点大小随着准直光束传播(例如，随着距准直光学器件的距离增加)而增加。
因此，在对象平面处低于1mm的光点大小经由此配置将无法实现。在例如此情况下，下文描述的其中使用聚焦光学器件来产生激发光的平缓聚焦光束的方法允许使用具有使准直具有挑战性的输出性质的激发源。如图11所示，在聚焦方法中，激发光在退出激发源的输出1104时发散，且在聚焦光学器件处达到初始光束直径。在通过聚焦光学器件1122之后，在其经由检流计光学扫描器的一个或多个检流计镜从聚焦光学器件行进到对象平面附近的光束腰位置时汇聚。在通过光束腰位置之后，激发光的聚焦光束发散。如同图9，在图10中出于清楚起见仅示出单个检流计镜，且激发光的准直光束当由两个检流计镜引导时类似地传播。
在此实例中，聚焦光学器件在大工作距离上实现小光点大小方面提供优于准直方法的优点。在实例光学系统中，光学布局参数如下：d0 (2)＝100mm，X＝50mm，d1＝200mm，且d2＝206mm。
与聚焦光学器件相关的参数包含其有效焦距(EFL)和通光孔径(CA)。通光孔径定义聚焦光学器件可从其收集光的区域的物理直径。在聚焦方法中，从聚焦光学器件1122到激发源的输出104的距离1151从聚焦光学器件移位，且称为物距o(1151)。可以类似于上文关于准直光学器件所描述的方式，基于初始光束直径BDi和聚焦光学器件的参数确定物距o(1151)，如图12中所图示。在实例光学系统中，期望小于3mm的光束直径以使得光束可以耦合到检流计光学扫描器而无需过量填充检流计镜。在某些实施例中，聚焦光学器件的通光孔径也必须大于初始光束直径。
Figure BDA0002394810390000771
在某些实施例中，使用物距o和系统的近似工作距离(例如，近似200mm)确定用于聚焦光学器件的所需EFL的从10到15mm的近似范围。通过聚焦光学器件透镜，激发光的光束在朝向光束腰位置传播时汇聚。光学系统被对准以使得由聚焦光学器件产生的激发光的聚焦光束的光束腰位置对应于如等式(9)中所描述的平均工作距离。由等式(9)给定的平均工作距离是303mm。从聚焦光学器件到光纤耦合激光器的输出(例如，光纤耦合激光器的光纤的远端)的距离o是使用等式9中示出的薄透镜等式计算的，其中像距i接近为由等式(9)给定的工作距离。
Figure BDA0002394810390000772
因此，对于10mm的物距o和303mm的像距i，找到9.68mm的EFL的值。
基于聚焦光学器件的放大率和光纤耦合激光器的光纤的纤芯直径计算在光束腰处的光点大小直径。放大率M被计算为平均工作距离与从光纤激光器的输出到聚焦光学器件的距离o的比率。使用上方的值(例如，303mm的平均工作距离和距离o＝10.34mm，放大率是近似30。以等式10计算在光束腰处的光点大小直径。
光点直径＝M×a (15)
放大率M连同纤芯直径a决定了在光束腰位置的光点大小。单模光纤具有近似8μm的标准纤芯直径，而多模光纤可具有至少范围从50μm-200μm的纤芯直径。因此，用作光纤耦合源的输出的单模光纤提供了近似0.24mm的在光束腰位置的光点大小直径，而多模光纤至多提供1.5mm的在光束腰位置的光点大小直径(例如，对于50μm纤芯直径)。
因此，对于300mm的长工作距离和小初始光束直径(3mm)，满足了对于所有工作距离维持a<1mm光点的发散要求。
B.ⅳ基于激发光束发散的光学组件的定位
在某些实施例中，下方的等式(16a)、(16b)和(17)反映了使各种光学组件的定位与激发光的光束的发散性质相关的额外设计考虑。
举例来说，下方的等式(16a)使距产生激发光的准直光束的激发源的输出的距离与针对准直光的特定光束的最大可行工作距离相关。最大可行工作距离是从激发源的输出处的光束腰到激发光的准直光束达到最大所要光点大小wmax的点的距离(例如，使得在激发光的准直光束行进较大距离时，光束的光点大小超过wmax)。在某些实施例中，最大可行工作距离取决于在激发源的输出处的初始光束直径以及激发光的光束的半角发散。在某些实施例中，检流计光学扫描器的检流计镜的所要扫描大小和最大旋转角度规定了最大光学路径长度d2。因此，在最大可行工作距离和d2固定的情况下，上方等式(2)变成：
Figure BDA0002394810390000781
类似地，对于激发光的准直光束，等式(7)用以确定下方的等式(16b)。
Figure BDA0002394810390000782
相似考虑可用以确定聚焦光束配置的d1的可能值。在某些实施例中，聚焦光束的半角发散连同聚焦光束的光点大小决定了聚焦深度。聚焦深度指代在光束腰位置的两侧上光束腰的光点大小达到对应于最大所要光点大小wmax的值的两个位置之间的距离。在某些实施例中，如果(i)激发光的光束沿着最小长度光学路径行进的距离d1和(ii)激发光的光束沿着最大长度光学路径行进的距离d2之间的差大于聚焦深度，那么激发光的光束的光点大小在扫描区内的某些位置将超过所要最大光点大小。因此，对于固定所要扫描大小，下方的等式(17)提供用于距对象平面距离d1来定位检流计的指导。在下方的等式(17)中，参数X对应于从2D扫描区的中心到拐角测得的沿着对角线的距离。
Figure BDA0002394810390000791
C.经由光束扫描的层析成像
在某些实施例中，通过允许激发光的光束扫描通过扫描区内的多个位置，同时维持小光点大小，上文描述的方法实现宽视场上的快速层析成像。图13示出使用本文所描述的光束扫描方法对跨越对象平面定位的一个或多个受试者进行成像的实例过程1300。在某些实施例中，在第一步骤1310中，如上文关于图1A和图1B所描述跨越扫描区116扫描激发光的光束。可以使用先前部分中描述的任何光束成形方法使激发光的光束适当地成形以便维持扫描区116上的所要光点大小。
在激发光的光束被引导到扫描区内的特定激发位置时，其在受试者的表面上的对应照明位置照射定位于激发光的光束的路径中的给定受试者。如先前所论述，入射于受试者的表面上的光在受试者内漫射，且激发受试者内的荧光物质，从而造成荧光的发射。
在某些实施例中，在激发光的光束跨越扫描区从激发位置引导到激发位置时，一个或多个检测器检测由于受试者内的荧光物质的激发而从给定受试者内发射的荧光(1320)。所述一个或多个检测器可以按落射照明几何形状或按透照法几何形状对准。
图1A和图1B示出透照法几何形状的实例，示出定位于对象平面的与扫描光学检流计相对的侧处的检测器120。荧光通常在所有方向上发射，且图示由检测器检测到的从三个受试者114a、114b、114c中的每一个发射的荧光118a、118b、118c的部分。
在某些实施例中，所述一个或多个检测器在所述一个或多个受试者被照射时检测荧光。在某些实施例中，使用包括被对准以对整个扫描区进行成像的多个像素的焦平面阵列(focal plane array，FPA)。FPA检测器的实例包含CCD相机、CMOS相机和包括多个像素的其它检测器。入射于FPA检测器上的荧光由多个像素检测到，使得可记录表示入射于检测器区域上的荧光的强度分布的荧光发射图像。在某些实施例中，一束光纤可被布置成类似于FPA检测器来起作用，且用以记录2D发射图像。所述一束光纤可被对准以使得其近侧(输入)末端收集在多个位置发射的荧光。每一光纤可在相对的远侧末端对准(例如，附接)到对应单个元件检测器，所述检测器检测由光纤近端收集且沿着光纤的长度被导引以照射检测器的作用区域的光。以此方式，所述束的每一光纤类似于FPA检测器的像素来起作用，且所述束连同多个单个元件检测器用以记录发射图像。
在某些实施例中，在扫描激发光的光束时，所述一个或多个检测器(例如，使用FPA；例如，使用光纤束的多个检测器)记录多个荧光发射图像。
在某些实施例中，针对每一离散激发位置记录荧光发射图像。以此方式记录的每一荧光发射图像因此与相异的激发位置相关联，且表示响应于通过将激发光的光束引导到相关联激发位置而照射一个或所述一个或多个受试者而发射的荧光。
在某些实施例中，对应于检测到的荧光的数据由计算装置的处理器接收和/或存取(1330)且用以获得(例如，计算)所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像(1340)。举例来说，可以使用针对离散激发位置中的每一个记录的荧光发射图像计算(例如，经由层析重构技术)层析图像。确切地说，在某些实施例中，可获得跨越扫描区定位的一个或多个受试者中的每一个的层析图像。
举例来说，在对多个受试者进行成像的情况下，每一受试者可与荧光发射图像的一部分相关联。确切地说，当多个受试者跨越扫描区定位时，每一受试者可与扫描区内的激发位置的不同部分相关联。举例来说，如果对三个受试者进行成像，那么第一受试者被定位以使得当激发光的光束被引导到所述多个激发位置的第一部分中的每一个时照射第一受试者。因此，第一受试者与激发位置的第一部分相关联。第二受试者类似地与激发位置的第二部分相关联，且第三受试者类似地与激发位置的第三部分相关联。
因此，对于给定受试者，可识别针对与受试者相关联的激发位置记录的荧光发射图像，且用作层析重构技术的输入以便获得给定受试者的层析图像。可针对跨越扫描区定位的每一受试者重复此过程。
在某些实施例中，除荧光之外，还通过检测透射通过所述一个或多个受试者(例如，透照法几何形状中)或从所述一个或多个受试者反射(例如，落射照明几何形状中)的激发光来执行层析成像。在层析重构方法中可使用对应于检测到的激发光的数据连同对应于检测到的荧光的数据以获得所述一个或多个受试者的层析图像。
举例来说，在跨越扫描区扫描激发光的光束时，以类似于用以记录荧光发射图像的方式，可由所述一个或多个检测器记录表示检测到的透射通过所述一个或多个受试者或由所述一个或多个受试者反射的激发光的多个激发图像。确切地说，在激发光的光束被引导到扫描区内的特定激发位置时，其在受试者的表面上的对应照明位置照射定位于激发光的光束的路径中的给定受试者。激发光的一部分可以透射通过受试者，且激发光的一部分可以被反射。在某些实施例中，在激发光的光束跨越扫描区从激发位置引导到激发位置时，所述一个或多个检测器检测透射通过所述一个或多个受试者或由所述一个或多个受试者反射的激发光。所述一个或多个检测器可以按落射照明几何形状对准，以便检测反射的激发光，或按透照法几何形状对准，以便检测透射的激发光。
在某些实施例中，类似于检测到的荧光发射图像，可通过焦平面阵列检测器(例如，CCD相机、CMOS相机及类似物)或使用如上文所描述的光纤束的多个检测器检测激发图像。在某些实施例中，如同荧光发射图像，可针对扫描区内的多个离散激发位置中的每一个记录激发图像。记录的激发图像可与记录的荧光图像组合使用以获得所述一个或多个受试者的层析图像。
在某些实施例中，为了检测荧光，将荧光滤光器放置于所述一个或多个检测器前方。荧光滤光器对具有对应于所发射荧光的波长的波长的光是基本上透明的，且对处于包含激发光的波长的其它波长的光是基本上不透明的。荧光滤光器因此选择性地传递发射的荧光，从而允许其由所述一个或多个检测器检测，且阻挡激发光，从而允许荧光的选择性检测。在某些实施例中，为了检测激发光，移除荧光滤光器。如果待检测的透射或反射激发光的强度(例如，强度)基本上大于发射荧光的强度，那么此方法可以是适当的。在某些实施例中，通过将第二滤光器-激发滤光器-放置于所述一个或多个滤光器的前方来检测激发光，其中激发滤光器对具有激发光的波长的光是基本上透明的，且对具有发射荧光的波长的光是基本上不透明的。
在某些实施例中，执行两次扫描以检测荧光和激发光。在第一扫描中，将荧光滤光器放置于所述一个或多个检测器的前方，且针对扫描区内的激发位置中的每一个检测荧光(例如，荧光发射图像)。在第二扫描中移除荧光滤光器，或将选择性地传递激发光的激发滤光器放置于所述一个或多个检测器的前方，且针对扫描区内的激发位置中的每一个检测激发光(例如，激发图像)。在某些实施例中，执行单个扫描，且对于扫描区内的每一激发位置以在适当的位置的荧光滤光器检测荧光，之后在移除荧光滤光器或用激发滤光器代替的情况下检测激发光。
在某些实施例中，借助于使用本文所描述的光束扫描方法快速扫描激发光的光束的能力，可使用多路复用方法，其中每一荧光发射图像与多个激发位置相关联。在此方法中，离散激发位置布置成多个集合，每个集合包括多个激发位置。并非以顺序方式在激发位置之间光栅化扫描激发光的光束(例如，将激发光的光束引导到第一激发位置，随后是邻近激发位置等等)，以逐集合方式扫描激发光的光束。检流计光学扫描器每次一个集合地扫描激发光的光束通过离散激发位置，从而将激发光的光束引导到给定集合内的每一离散激发位置，然后前进到下一集合。
在某些实施例中，检流计光学扫描器的快速扫描能力允许在对应于所述一个或多个检测器的曝光窗口的时间周期期间一个接一个地将激发光的光束引导到集合的离散激发位置中的每一个。每一荧光发射图像表示在对应于曝光窗口的时间周期内由所述一个或多个检测器检测到的荧光。通过在所述一个或多个检测器的曝光窗口期间扫描激发光的光束到多个激发位置，记录与激发位置集合相关联的荧光图像。以此方式记录的每一荧光发射因此与激发位置集合相关联，且表示检测到的响应于通过将激发光的光束引导到相关联集合的每一激发位置而照射一个或所述一个或多个受试者而发射的荧光。
在某些实施例中，此方法可用于减少获得多个受试者的层析图像所需要的时间量和荧光发射图像的数目。如上文所论述，每一受试者与扫描区内的激发位置的一部分相关联。
激发位置集合可被布置成使得每一集合包括与每一受试者相关联的激发位置。在用以记录荧光发射图像的给定曝光窗口期间，激发光的光束照射第一受试者(例如，在曝光窗口的三分之一期间)，随后是第二受试者(例如，在曝光窗口的三分之二期间)，以及第三受试者(例如，在曝光窗口的最后三分之一期间)。可以此方式记录多个荧光发射图像，每一图像对应于不同集合。因此，每一荧光发射图像是表示从不同受试者中的每一个内发射的荧光的多受试者发射图像。因此，可将所记录荧光发射图像的数目减小对应于所成像受试者的数目的倍数。
在某些实施例中，多个受试者之间的空间分离用以针对每一受试者确定与所述受试者相关联的每一多受试者荧光发射图像的一部分(例如，表示由于通过将激发光的光束引导到与受试者相关联的激发位置而照射受试者而发射的荧光的部分)。举例来说，在某些实施例中，共同对齐的明亮场图像用以识别对应于受试者的荧光发射图像的空间区。以此方式，可确定与受试者相关联的多个单受试者荧光发射图像。对于每一受试者，确定的与受试者相关联的单受试者荧光发射图像可用作层析重构技术的输入以便获得受试者的层析图像。
在某些实施例中，上文描述的多路复用扫描方法也可用于激发光的检测，且还使用对应于检测到的激发光的数据与对应于检测到的荧光的数据的组合以获得所述一个或多个受试者的层析图像。
D.多激光器宽场透射照明方案
在某些实施例中，本文所描述的系统和方法实现使用多个激发源以使用激发光的多个光束执行层析成像。光-机械对准用以将激发光的多个光束引导到检流计光学扫描器以如上文所描述扫描激发光的光束。对于每一激发源，上文描述的光束成形方法中的任一个可用以提供激发光的对应光束，所述光束被适当地成形以便维持在扫描区内的所有位置的所要光点大小。
在某些实施例中，使用电动平台对准多个激发源以将其激发光的相应光束从其输出一次一个地引导到检流计光学扫描器。图2示出系统的实例，其中三个激发源(例如，激光器)204a、204b和204c的输出并排安装在线性平移台220上。激发源中的两个是光纤耦合激光器。示出光纤耦合激光器(204a和204c)中的每一个的作为耦合到激光器的光纤的远端的输出安装在线性平移台上。输出204b是激光器的激光孔径的自由空间激光器也示出安装在线性平移台上。
线性平移台可移动以对准给定激发源的输出以将来自给定源的输出的激发光的光束引导到检流计光学扫描器，以使得可如上文相对于图1A所描述跨越对象平面的扫描区扫描所述光束。此方法允许每一激发源利用检流计光学扫描器的检流计镜的全角度能力。
在某些实施例中，本文所描述的系统和方法利用静态设计，其中多个激发源同时安装于固定位置中且被对准以将其相应激发光的光束引导到检流计光学扫描器。静态设计方法避免了对电动台的需要，电动台可能是缓慢的，增加复杂性，且因振动而引入未对准的风险等等。
图3A是示出三个激发源(例如，激光器)102a、102b和102c同时对准到检流计光学扫描器106的示意图。第一激发源102a被对准以将其激发光的光束沿着第一光学路径305a从其输出引导到检流计光学扫描器。其它激发源102b和102c中的每一个被对准以将其相应激发光的光束沿着光学路径从其输出以相对于第一光学路径305a的对应偏移角引导到检流计光学扫描器106。激发源102b沿着光学路径305b将从其输出发射的激发光的光束引导到检流计光学扫描器106，以偏移角θ2相对于第一光学路径305a偏移。激发源102c沿着光学路径305c将从其输出发射的激发光的光束引导到检流计光学扫描器106，以偏移角θ3相对于第一光学路径偏移。
检流计光学扫描器经由其包括的一个或多个检流计镜的反射朝向对象平面引导激发光的光束中的每一个。因此可经由检流计光学扫描器106的检流计镜的旋转跨越对象平面的相应扫描区扫描来自相应激发源的激发光的每一光束。由于每一激发源将其相应激发光的光束引导到检流计光学扫描器106的偏移角，检流计光学扫描器朝向对象平面112引导激发光的光束的光学扫描角度彼此偏移。确切地说，如图3A所示，对于检流计光学扫描器106的第一检流计镜108的给定旋转角度，激发光的三个光束中的每一个以相异的光学扫描角度被引导到对象平面。在某些实施例中，对于激发光的给定光束，其被引导到对象平面的光学扫描角度由其被从其对应激发源的输出引导到检流计光学扫描器的偏移角决定。因此，对于检流计光学扫描器的所述一个或多个检流计镜的给定旋转角度，来自所述三个激发源的激发光的光束被沿着相异的光学路径朝向对象平面引导。
举例来说，如图3A所示，在第一检流计镜108的给定旋转角度，来自第一激发源102a的激发光的第一光束被沿着第一光学路径310a从检流计光学扫描器106引导到对象平面112。来自第二激发源102b的激发光的光束沿着第二光学路径310b被引导到对象平面，所述第二光学路径以偏移角θ2相对于从检流计光学扫描器到对象平面的第一光学路径偏移，所述偏移角对应于光学路径305b从光学路径305a偏移的角度。类似地，来自第三激发源102c的激发光的光束沿着第三光学路径310c被引导到对象平面，所述第三光学路径以偏移角θ3相对于从检流计光学扫描器到对象平面的第一光学路径偏移，所述偏移角对应于光学路径305c从光学路径305a偏移的角度。
因此，在第一检流计镜108旋转时，跨越相异的扫描区扫描激发光的每一光束，所述相异的扫描区相对于来自其它激发源的激发光的其它光束的扫描区沿着与第一检流计镜108相关联的方向(例如，第一方向)移位。举例来说，如图3A所示，跨越第一扫描区116a扫描来自第一激发源的激发光的第一光束。跨越第二扫描区116b扫描来自第二激发源的激发光的第二光束，所述第二扫描区相对于第一扫描区116a在正方向上沿着第一维度移位。类似地，跨越第三扫描区116c扫描来自第三激发源的激发光的第三光束，所述第三扫描区也沿着第一维度相对于第一扫描区116b移位。在图3A中，出于清楚起见，扫描区116a、116b、116c在垂直于对象平面(例如，相对于页竖直)的方向上彼此偏移，每一扫描区实际上位于对象平面112上。三个扫描区的一部分重叠。此重叠区对应于共享扫描区，激发光的三个光束中的每一个扫描跨越所述共享扫描区。因此，跨越共享扫描区定位的一个或多个受试者可被来自三个激发源中的每一个的激发光的光束照射。
转向图3B，可如下确定沿着扫描区的特定维度的共享扫描区的大小。图3B示出第一检流计镜108在单个平面中对激发光的三个光束的反射，使得在第一检流计镜108旋转时，所述光束扫描跨越其相应扫描区中的每一个的第一维度。对于“在轴上”被引导到检流计扫描仪的激发光的第一光束，沿着第一维度的对应第一扫描区的大小La由下方的等式(18)给出，其中θopt是与第一检流计镜相关联的最大第一光学扫描角度。分别在正和负方向上的最大和最小共享扫描角度分别由等式(19)和(20)给定。
La＝2d1tan(θopt) (18)
θmax＝θopt-θ3 (19)
θmin＝θopt-θ2 (20)
如果来自第二和第三激发源的激发光的光束被引导到检流计光学扫描器的偏移角是相同的，θ2＝θ3，且沿着第一维度的共享扫描大小L共享由下方的等式(21)给定。
L共享＝2d1tan(θopt-θ2) (21)
当使用两个检流计镜以跨越二维扫描区扫描激发光的光束时，可使用相似方法以确定与第二检流计镜相关联的沿着第二维度的共享扫描大小(例如，L(2) 共享)。在某些实施例中，检流计光学扫描器沿着从检流计光学扫描器到共享扫描区内的位置(例如，共享扫描区的中心位置)的最小长度光学路径放置于特定距离354以产生所要大小的共享扫描区。可使用与上文关于单个激发源的光学布局所论述的那些考虑相似的考虑以及等式(18)到(21)来确定共享扫描区的大小。
图4示出系统，其中三个激光器的输出404a、404b和404c沿着单个方向(例如，竖直方向；例如，在沿着y轴的方向上)偏移以使得与第二和第三激发源相关联的偏移角位于单个平面中。
在某些实施例中，激发源可以沿着多个轴线在多个方向上彼此偏移。举例来说，在图4中示出的系统中，可以通过以沿着垂直于页的轴线(例如，沿着z轴)的偏移定位其输出来调节额外激发源。以此方式对准多个激发源的多个输出以使得它们沿着多个方向和多个轴线彼此偏移提供了用于安装激发源极的输出的较大区域，且允许更多源耦合到检流计光学扫描器。
在某些实施例中，来自每一激发源的激发光的每一光束可以经由上文描述的光束成形方法中的任一个来成形。举例来说，输出中的两个404a和404b是光纤耦合激光器的光纤的远端。每一光纤耦合激光器具有定位于从其输出到检流计光学扫描器106的相应光学路径中的聚焦光学器件122a和122b。第三激发源402c是自由空间激光器。在从自由空间激光器的输出404c到检流计光学扫描器106的光学路径中未定位光束成形光学器件。自由空间激光器可以被工程化以根据上文描述的光束成形方法输出激发光的聚焦或准直光束，以获得在其相应扫描区内的所有位置的所要光点大小。
图4中示出的检流计光学扫描器106包括两个镜108a和108b以用于跨越对象平面沿着正交方向扫描来自激发源中的每一个的激发光的光束。
在某些实施例中，距光束成形光学器件或激发源450的输出的最小距离是基于激发源输出之间的空间分离和偏移角确定以便适应来自激发源的激发光的多个光束。在某些实施例中，最小距离450大于(i)最小激光器分离和(ii)激发源偏移角中的一个(例如，最小绝对值偏移角)的余切的乘积。
在某些实施例中，以类似于上文针对激发光的单个光束关于图13所描述的方式执行使用激发光的多个光束的层析成像。确切地说，上文描述的过程1300可以针对每一激发源执行，以使得获得各自对应于不同激发源的多个层析图像的集合。如图3A所示，类似于上文关于图1A和图1B所描述的透照法几何形状可以用于以多个激发源进行层析成像。
在某些实施例中，使用多个激发源获得多个层析图像的能力允许多光谱成像。在某些实施例中，多光谱成像涉及以具有相异波长的激发光的多个光束照射一个或多个对象。因此，可如上文所描述对准的每一多个激发源可各自用以提供具有相异激发波长的激发光的光束。在某些实施例中，每一相异的激发波长用以激发不同荧光物质。举例来说，在从400nm到1300nm的光谱范围内的多个激发波长可用以激发多个不同荧光物质。在某些实施例中，来自每一激发源的激发光的每一光束因此激发且造成从所述一个或多个受试者内的相异荧光物质的荧光发射。因此，通过在每一激发波长连续执行层析成像，可获得表示所述一个或多个受试者内的多种荧光物质中的每一种的分布的层析图像。
E.设置验证和实验结果
图5示出使用上文描述的同时对准多个激发源的方法的实验层析成像系统的两个图像。图5中示出系统具有两个自由空间激光器502a和502b作为激发源。使用的自由空间激光器的实例包含自由空间二极管激光器和自由空间二极管泵浦固态(diode pumped solidstate，DPSS)激光器。光学系统中使用的自由空间激光器被制造称直接输出激发光的适当成形光束，如上文所描述。在光学系统中还测试光纤激光器和光纤耦合激光器。与光纤激光器和光纤耦合激光器组合使用光束成形光学器件以实现跨越扫描区的所要光点大小。
如图5B的图像中所示，每一激光器被对准以将其激发光的光束从其输出引导到包括两个旋转检流计镜的双轴检流计光学扫描器506，以使得可以跨越二维扫描区光栅化扫描激发光的光束。能够在成像期间固定三个小动物小鼠的动物固持器580近似放置在对象平面处。CCD相机520被对准以使用折叠路径镜584对扫描区域进行成像。
在激发源中的每一个的扫描区内，在跨越动物固持器的多个位置以激光束测绘器检验对象平面处的光点大小。对于测试的每一激光器，在扫描区内的激发光的光束的光点大小跨越全扫描区测得为直径小于1mm。
图6示出在扫描区内的一个位置的激光器中的一个的图形详细的X和Y线性轮廓。对于绘图600a和600b中的每一个，x轴表示以μm为单位的距离且y轴表示与在给定位置的激发光的光束的强度成比例的检测到的信号。绘图600a示出沿着x方向的激发光的光束的强度的变化且绘图600b示出沿着y方向的激发光的光束的强度的变化。在x和y方向上测得激发光的光束的宽度为检测到的信号下降到其最大值的1/e2的位置之间的距离。如图6所示，沿着x方向的宽度测得为796.50μm且沿着y方向的宽度测得为801.78μm，两者都小于1mm。
激发光的光束的光点大小贯穿整个扫描区维持低于1mm。图7示出两个图像，展示贯穿大扫描区内的多个激发位置可获得的一致小的光点大小。图7的图像700a示出跨越扫描区的多个激发位置。为了获得图7A的图像，将一张纸放置于动物固持器上以充当漫射半透明基板。针对每一激发位置由CCD相机拍摄图像。随后将所有图像堆叠在一起，导致图7A中示出的网格状图像。图7A的图像中的暗点是由于动物固持器的孔和其它遮挡，且不代表变化的光点大小。图像700b是固定于动物固持器中的三个小鼠的明亮场图像。图像700a和700b处于相同比例且在空间上对准，以使得图像700a与图像700b的重叠示出所述多个激发位置与由动物固持器固定的三个小鼠的位置的关系。因此，结合在一起，两个图像700a和700b示出如何跨越全部三个动物位置满足相等光点大小。
图16示出使用本文所描述的快速宽场透照法层析成像方法针对三个小鼠形状体模获得的层析图像集合。获得的层析图像是3D图像，示出在三个小鼠形状体模中的每一个内的荧光物质的分布。针对三个小鼠形状体模中的每一个获得3D层析图像。示出3D层析图像的俯视图1610和侧视图1620。图像1610c是定位于扫描区的左侧的小鼠形状体模的层析图像的俯视图，图像1610a是定位于扫描区的中心处的小鼠形状体模的层析图像的俯视图，且图像1610b是定位于扫描区的右侧的小鼠形状体模的层析图像的俯视图。图像1620c是定位于扫描区的左侧的小鼠形状体模的层析图像的侧视图，图像1620a是定位于扫描区的中心处的小鼠形状体模的层析图像的侧视图，且图像1620b是定位于扫描区的右侧的小鼠形状体模的层析图像的侧视图。图16中示出的3D层析图像展示在多个受试者定位的大扫描区上执行层析成像的能力。
F.应用
在某些实施例中，本文所描述的系统和方法实现快速宽场透照法光学层析摄影术。在某些实施例中，本文所描述的方法允许单次扫描中的多受试者成像。在某些实施例中，使用多个激发源用于快速宽场层析成像。在某些实施例中，本文所描述的光学系统布局和光束成形方法适用于其中使用具有点照明(例如，使用小光点大小)和多个光源的快速宽场扫描的任何系统。
G.计算机系统和网络架构
如图14所示，示出且描述用于提供本文所描述的宽场透射照明层析成像的系统和方法的网络环境1400的实施方案。简洁概括地说，现参考图14，示出且描述示例性云计算环境1400的框图。云计算环境1400可以包含一个或多个资源提供者1402a、1402b、1402c(统称为1402)。每一资源提供者1402可以包含计算资源。在一些实施方式中，计算资源可以包含用于处理数据的任何硬件和/或软件。举例来说，计算资源可包含能够执行算法、计算机程序和/或计算机应用程序的硬件和/或软件。在一些实施方案中，示例性计算资源可包含具有存储和检索能力的应用程序服务器和/或数据库。每一资源提供者1402可以连接到云计算环境1400中的任何其它资源提供者1402。在一些实施方式中，资源提供者1402可以通过计算机网络1408连接。每一资源提供者1402可以通过计算机网络1408连接到一个或多个计算装置1404a、1404b、1404c(统称为1404)。
云计算环境1400可以包含资源管理器1406。资源管理器1406可以通过计算机网络1408连接到资源提供者1402和计算装置1404。在一些实施方式中，资源管理器1406可以促进一个或多个资源提供者1402向一个或多个计算装置1404提供计算资源。资源管理器1406可以从特定计算装置1404接收对计算资源的请求。资源管理器1406可以识别能够提供计算装置1404所请求的计算资源的一个或多个资源提供者1402。资源管理器1406可以选择资源提供者1402来提供计算资源。资源管理器1406可以促进资源提供者1402与特定计算装置1404之间的连接。在一些实施方式中，资源管理器1406可以在特定资源提供者1402与特定计算装置1404之间建立连接。在一些实施方式中，资源管理器1406可以将特定计算装置1404重定向到具有所请求计算资源的特定资源提供者1402。
图15示出可用以实施本发明中描述的技术的计算装置1500和移动计算装置1550的实例。计算装置1500既定表示各种形式的数字计算机，例如膝上型计算机、桌上型计算机、工作站、个人数字助理、服务器、刀片服务器、大型计算机和其它适当计算机。移动计算装置1550既定表示各种形式的移动装置，例如个人数字助理、蜂窝式电话、智能电话和其它相似计算装置。此处展示的组件、其连接和关系以及其功能有意仅作为实例，且并不有意作为限制。
计算装置1500包括处理器1502、存储器1504、存储装置1506、连接到存储器1504和多个高速扩展端口1510的高速接口1508、以及连接到低速扩展端口1514和存储装置1506的低速接口1512。处理器1502、存储器1504、存储装置1506、高速接口1508、高速扩展端口1510和低速接口1512中的每一个使用各种总线互连，并且可以安装在共同主板上或以其它适当的方式安装。处理器1502可以处理用于在计算装置1500内执行的指令，包含存储在存储器1504中或存储装置1506上的指令，所述指令用于在外部输入/输出装置，如耦合到高速接口1508的显示器1516，上显示GUI的图形信息。在其它实施方式中，可以适当地使用多个处理器和/或多个总线连同多个存储器和存储器类型。此外，可以连接多个计算装置，每一装置提供必要的操作的部分(例如，作为服务器组、一组刀片服务器或多处理器系统)。因此，在本文使用术语，其中多个功能被描述为由“处理器”执行时，这包括其中多个功能由任何数量的计算装置(一个或多个)的任何数量的处理器(一个或多个)执行的实施例。此外，在功能被描述为由“处理器”执行的情况下，这涵盖其中所述功能由任何数目的计算装置(一个或多个)(例如，分布式计算系统中)的任何数目的处理器(一个或多个)执行的实施例。
存储器1504将信息存储在计算装置1500内。在一些实施方式中，存储器1504是一个或多个易失性存储器单元。在一些实施方案中，存储器1504是一个或多个非易失性存储器单元。存储器1504也可以是另一形式的计算机可读介质，例如磁盘或光盘。
存储装置1506能够为计算装置1500提供大容量存储。在一些实施方式中，存储装置1506可以是或包含计算机可读媒体，如软盘装置、硬盘装置、光盘装置或磁带装置、闪存或其它类似的固态存储装置、或一组装置，包含存储区域网络或其它配置中的装置。指令可存储在信息载体中。所述指令在由一个或多个处理装置(例如，处理器1502)执行时执行例如上述方法的一或多个方法。指令也可由一个或多个存储装置存储，所述存储装置例如计算机或机器可读介质(例如，存储器1504、存储装置1506或处理器1502上的存储器)。
高速接口1508管理计算装置1500的带宽密集型操作，而低速接口1512管理较低带宽密集型操作。此类功能的分配仅是实例。在一些实施方案中，高速接口1508耦合到存储器1504、显示器1516(例如，通过图形处理器或加速器)和可以接受各种扩展卡(未图示)的高速扩展端口1510。在所述实施方式中，低速接口1512耦合到存储装置1506和低速扩展端口1514。可以包含各种通信端口(例如，USB、以太网、无线以太网)的低速扩展端口1514可以例如通过网络适配器耦合到例如键盘、指向装置、扫描仪等一个或多个输入/输出装置或例如交换机或路由器等联网装置。
计算装置1500可以多种不同的形式实施，如图中所示。举例来说，其可实施为标准服务器1520，或在此些服务器的群组中多次实施。另外，它可以在如膝上型计算机1522等个人计算机中实施。它还可以被实施为机架服务器系统1524的一部分。或者，来自计算装置1500的组件可以与移动装置(未示出)中如移动计算装置1550等其它组件组合。这种装置中的每一个可以包含计算装置1500和移动计算装置1550中的一个或多个，并且整个系统可以由彼此通信的多个计算装置构成。
移动计算装置1550包含处理器1552、存储器1564、例如显示器1554等输入/输出装置、通信接口1566和收发器1568、以及其它组件。移动计算装置1550也可以具备例如微型驱动器或其它装置等存储装置以提供额外存储。处理器1552、存储器1564、显示器1554、通信接口1566和收发器1568中的每一个是使用各种总线互连，且所述组件中的若干个可安装在共同母板上或适当时用其它方式安装。
处理器1552可以执行移动计算装置1550内的指令，包含存储在存储器1564中的指令。处理器1552可以被实施为芯片的芯片组，所述芯片包括单独的和多个模拟和数字处理器。处理器1552可以提供例如移动计算装置1550的其它组件(例如用户接口的控件)、由移动计算装置1550运行的应用程序和移动计算装置1550的无线通信的协调。
处理器1552可以通过耦合到显示器1554的控制接口1558和显示器接口1556与用户通信。显示器1554可以是例如TFT(薄膜晶体管液晶显示器)显示器或OLED(有机发光二极管)显示器，或其它适当的显示技术。显示器接口1556可包括用于驱动显示器1554以呈现图形和其它信息给用户的适当电路。控制接口1558可以从用户接收命令并将它们转换以提交给处理器1552。另外，外部接口1562可以提供与处理器1552的通信，以便实现移动计算装置1550与其它装置的近区通信。外部接口1562可例如在一些实施方案中用于有线通信或在其它实施方案中用于无线通信，且也可以使用多个接口。
存储器1564将信息存储在移动计算装置1550中。存储器1564可以被实施为一个或多个计算机可读介质、一个或多个易失性存储器单元、或者一个或多个非易失性存储器单元中的一个或多个。也可以提供扩展存储器1574且通过扩展接口1572连接到移动计算装置1550，所述扩展接口可包含例如单列直插存储器模块(Single In Line Memory Module，SIMM)卡接口。扩展存储器1574可以为移动计算装置1550提供额外的存储空间，或者还可以存储用于移动计算装置1550的应用程序或其它信息。具体地，扩展存储器1574可以包含用于执行或补充上述过程的指令，并且还可以包含安全信息。因此，例如，扩展存储器574可以作为移动计算装置1550的安全模块提供，并且可以编程而具有允许安全使用移动计算装置1550的指令。另外，安全应用程序可经由SIMM卡提供，连同额外信息，例如以不可破解的方式在SIMM卡上放置识别信息。
存储器可包含例如快闪存储器和/或NVRAM存储器(非易失性随机存取存储器)，如下文所论述。在一些实施方案中，指令存储于信息载体中，且指令在由一个或多个处理装置(例如，处理器1552)执行时执行一个或多个方法，例如上文所描述的那些方法。指令也可由一个或多个存储装置存储，所述存储装置例如一个或多个计算机或机器可读介质(例如，存储器1564、扩展存储器1574或处理器1552上的存储器)。在一些实施方案中，指令可例如经由收发器1568或外部接口1562在传播信号中接收。
移动计算装置1550可通过通信接口1566无线通信，所述通信接口必要时可包含数字信号处理电路。通信接口1566可提供在各种模式或协议下的通信，例如GSM话音呼叫(全球移动通信系统)、短消息服务(SMS)、增强型消息接发服务(EMS)、或MMS消息接发(多媒体消息接发服务)、码分多址(CDMA)、时分多址(TDMA)、个人数字蜂窝式(PDC)、宽带码分多址(WCDMA)、CDMA2000或通用包无线电服务(GPRS)及其它。此类通信可例如使用射频通过收发器1568发生。另外，短程通信可例如使用
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Wi-FiTM或其它此类收发器(未图示)发生。另外，全球定位系统(GPS)接收器模块1570可将额外的导航和位置相关无线数据提供到移动计算装置1550，其可在适当时由移动计算装置1550上运行的应用程序使用。
移动计算装置1550还可使用音频编解码器1560以音频方式通信，所述音频编解码器可接收来自用户的口头信息且将其转换为可用的数字信息。音频编解码器1560同样可以为用户产生可听声音，如通过例如移动计算装置1550的手机中的扬声器，。这样的声音可以包含来自语音电话呼叫的声音，可以包含记录的声音(例如，语音消息，音乐文件等)，并且还可以包含由在移动计算装置1550上操作的应用程序生成的声音。
移动计算装置1550可以以多种不同的形式实施，如图中所示。例如，它可以被实施为蜂窝式电话1580。它还可以被实施为智能电话1582、个人数字助理或其它类似移动装置的一部分。
此处描述的系统和技术的各种实施方案可在数字电子电路、集成电路、专门设计的专用集成电路(ASIC)、计算机硬件、固件、软件和/或其组合中实现。这些各种实施方案可包含一个或多个计算机程序中的实施方案，所述计算机程序可在可编程系统上执行和/或解译，所述可编程系统包含至少一个可编程处理器，它可以是专用的或通用的，经耦合以从存储系统、至少一个输入装置以及至少一个输出装置接收数据和指令，并且向存储系统、至少一个输入装置以及至少一个输出装置发射数据和指令。
这些计算机程序(也被称作程序、软件、软件应用程序或代码)包含用于可编程处理器的机器指令，且可以高级程序和/或面向对象的编程语言和/或以汇编/机器语言实施。如本文所使用，术语机器可读介质和计算机可读介质指代用以将机器指令和/或数据提供到可编程处理器的任何计算机程序产品、设备和/或装置(例如，磁盘、光盘、存储器、可编程逻辑装置(PLD))，包含接收机器指令作为机器可读信号的机器可读介质。术语机器可读信号指代用以将机器指令和/或数据提供到可编程处理器的任何信号。
为了提供与用户的交互，此处描述的系统和技术可在计算机上实施，所述计算机具有用于向用户显示信息的显示装置(例如，阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)监视器)以及用户可用来向计算机提供输入的键盘和指向装置(例如，鼠标或轨迹球)。其它种类的装置同样可用以提供与用户的交互；举例来说，提供到用户的反馈可为任何形式的感觉反馈(例如，视觉反馈、听觉反馈或触感反馈)；且来自用户的输入可以任何形式接收，包含声学、语音或触感输入。
这里描述的系统和技术可以在计算系统中实现，所述计算系统包含后端组件(例如，作为数据服务器)，或者包含中间件组件(例如，应用程序服务器)，或者包含前端组件(例如，具有图形用户界面或网络浏览器的客户端计算机，用户可以通过其与这里描述的系统和技术的实施方式进行交互)，或者此类后端、中间件或前端组件的任何组合。所述系统的组件可通过任何形式或媒体的数字数据通信(例如，通信网络)互连。通信网络的实例包含局域网(LAN)、广域网(WAN)和因特网。
计算系统可包含客户端和服务器。客户端和服务器一般远离彼此且通常通过通信网络交互。客户端与服务器的关系是借助于在相应计算机上运行并且彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序产生。
在一些实施方案中，本文所描述的任何模块可以分离、组合或并入到单个或组合模块中。图中描绘的任何模块并不希望将本文所描述的系统限制于其中示出的软件架构。
本文所描述的不同实施方案的元件可以组合以形成上文未具体阐述的其它实施方案。元件可以从本文所描述的方法、计算机程序、数据库等省略，而不会不利地影响其操作。另外，图式中所描绘的逻辑流程不需要按所显示的特定次序或顺序次序来实现期望的结果。各种单独元件可以组合成一个或多个个别元件以执行本文所描述的功能。在一些实施方案中，考虑到此处描述的系统和方法的结构、功能和设备。
贯穿其中将设备和系统描述为具有、包含或包括特定组件，或其中将过程和方法描述为具有、包含或包括特定步骤的整个描述内容，在此另外预期存在基本上由所述组件组成或由所述组件组成的本发明的设备和系统，并且存在基本上由所述处理步骤组成或由所述处理步骤组成的根据本发明的过程和方法。
应理解，步骤次序或用于执行某些动作的次序是不重要的，只要本发明保持可操作即可。而且，两个或更多个步骤或动作可以同时进行。
虽然已参考特定的优选实施例特定地示出并且描述本发明，但所属领域的技术人员应理解，可以在其中进行各种形式和细节的变化而不脱离由所附权利要求书界定的本发明的精神和范围。

Claims (35)

1.一种用于在宽视场上快速扫描激发光以用于跨越对象平面定位的一个或多个受试者的层析成像的系统，所述系统包括：
(a)激发源，其能够操作以发射激发光的光束，其中所述激发源被对准以沿着从所述激发源的输出到包括一个或多个旋转检流计镜的检流计光学扫描器的光学路径引导所述激发光的光束；
(b)所述检流计光学扫描器，其中所述检流计光学扫描器被对准且能够操作以经由所述一个或多个旋转检流计镜的反射将所述激发光的光束引导到所述对象平面的扫描区内的多个位置，以使得在所述一个或多个检流计镜旋转时，跨越所述扫描区扫描所述激发光的光束，进而实现跨越所述对象平面定位的所述一个或多个受试者的照明；
(c)一个或多个检测器，其被对准且能够操作以检测由于所述激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的一个或多个荧光物质发射的荧光；
(d)处理器；以及
(e)存储器，其具有存储在其上的指令，其中所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器：
接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据；以及
使用对应于所述检测到的荧光的所述数据获得所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述检流计光学扫描器定位于沿着从所述检流计光学扫描器到所述扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的特定距离，以基于所述一个或多个检流计镜的一个或多个最大旋转角度产生所要大小的扫描区。
3.根据权利要求2所述的系统，其中沿着第一维度和/或第二维度的所述扫描区的所述所要大小是至少100mm。
4.根据权利要求1所述的系统，其中沿着从所述检流计光学扫描器到所述扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离是从150到250mm。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述激发源能够操作以从其输出发射所述激发光的光束作为聚焦光束，所述聚焦光束在(i)朝向所述检流计光学扫描器以及(ii)从所述检流计光学扫描器到所述对象平面行进时汇聚。
6.根据权利要求5所述的系统，其中从所述激发源的所述输出发射的激发光的所述聚焦光束在所述扫描区内的所有位置具有小于或近似等于1mm的光点大小。
7.根据权利要求5所述的系统，其中从所述激发源的所述输出发射的激发光的所述聚焦光束具有半角发散
Figure FDA0002394810380000021
使得
Figure FDA0002394810380000022
其中：
wmax是在所述扫描区内的所述激发光的光束的所要光点大小的上限，
wbw是所述激发光的光束在其光束腰位置处的光点大小，
d1是沿着从所述检流计光学扫描器到所述扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的最小距离，且
d2是沿着从所述检流计光学扫描器到所述扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离。
8.根据权利要求6所述的系统，其中从所述激发源的所述输出发射的激发光的所述聚焦光束的半角发散小于或等于25毫弧度。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统包括定位于从所述激发源的所述输出到所述检流计光学扫描器的所述光学路径中的光束成形光学器件，其中所述光束成形光学器件是以下各项中的至少一个：
(A)聚焦光学器件，其中所述聚焦光学器件被对准以使得在通过所述聚焦光学器件之后，所述激发光的光束在(i)朝向所述检流计光学扫描器以及(ii)从所述检流计光学扫描器到所述对象平面行进时汇聚；以及
(B)准直光学器件，其中所述准直光学器件被对准以使得在通过所述准直光学器件之后，所述激发光的光束在(i)朝向所述检流计光学扫描器以及(ii)从所述检流计光学扫描器到所述对象平面行进时发散。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述光束成形光学器件是所述聚焦光学器件。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述聚焦光学器件被定位以使得所述激发光的光束的光点大小的直径在所述扫描区内的所有位置小于或近似等于1mm。
12.根据权利要求10所述的系统，其中在通过所述聚焦光学器件之后所述激发光的光束的半角发散
Figure FDA0002394810380000031
使得
Figure FDA0002394810380000032
其中：
wmax是所述激发光的光束的所要光点大小的上限，
wbw是所述激发光的光束在光束腰处的光点大小，
d1是沿着从所述检流计光学扫描器到所述扫描区内的位置的最小长度光学路径的最小距离，且
d2是沿着从所述检流计光学扫描器到所述扫描区内的位置的最大长度光学路径的最大距离。
13.根据权利要求10所述的系统，其中在通过所述聚焦光学器件之后所述激发光的光束的半角发散小于或等于25毫弧度。
14.根据权利要求1所述的系统，其中所述激发源的功率大于或近似等于100mW。
15.根据权利要求1所述的系统，其中所述激发源是光纤耦合激光器或光纤激光器，且所述激发光的光束从其发射的所述激发源的所述输出是所述光纤耦合激光器或光纤激光器的光纤的远端。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述光纤耦合激光器或光纤激光器的所述光纤的纤芯直径是从5μm到400μm。
17.根据权利要求15所述的系统，其中所述光纤的数值孔径(NA)是从0.1到0.3。
18.根据权利要求1所述的系统，其中所述一个或多个检测器被对准且能够操作以按透照法几何形状检测从所述荧光物质发射的所述荧光，其中所述激发光的光束是从所述对象平面的第一侧朝向所述对象平面引导，且所述一个或多个检测器被对准且能够操作以检测在从所述对象平面的相对第二侧向外的方向上发射的荧光。
19.根据权利要求1所述的系统，其中：
所述一个或多个检测器被对准且能够操作以检测透射通过所述一个或多个受试者或从所述一个或多个受试者反射的激发光，且
所述指令使所述处理器：
接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据；以及
使用对应于所述检测到的激发光的所述数据和对应于所述检测到的荧光的所述数据获得所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像。
20.根据权利要求1所述的系统，其中：
所述检流计光学扫描器被对准且能够操作以通过将所述激发光的光束引导到所述扫描区内的多个离散激发位置而跨越所述扫描区扫描所述激发光的光束，其中对于每一离散激发位置，所述一个或多个受试者中的定位于被朝向所述离散激发位置引导的所述激发光的光束的路径中的给定受试者在所述受试者的表面上的对应照明位置被所述激发光的光束照射，以使得所述激发光的光束在所述对应照明位置入射于所述给定受试者的所述表面上且在所述受试者内漫射，进而实现所述给定受试者内的荧光物质的激发，
所述一个或多个检测器被对准且能够操作以针对每一离散激发位置检测对应荧光发射图像，所述对应荧光发射图像表示检测到的由定位于被引导到所述离散激发位置的所述激发光的光束的路径中的给定受试者内的所述荧光物质发射的荧光，进而实现多个荧光发射图像的检测，每一荧光发射图像对应于离散激发位置，且
所述指令使所述处理器：
接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据，对应于所述检测到的荧光的所述数据包括所述多个荧光发射图像；以及
使用所述多个荧光发射图像获得所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
21.根据权利要求20所述的系统，其中：
所述一个或多个检测器被对准且能够操作以针对每一离散激发位置检测对应激发图像，所述对应激发图像表示当所述激发光的光束在所述对应照明位置入射于所述给定受试者的所述表面上时透射通过所述给定受试者或由所述给定受试者反射的激发光，以使得检测到多个激发图像，每一激发图像对应于离散激发位置，且
所述指令使所述处理器：
接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于所述检测到的激发光的所述数据包括所述多个激发图像；以及
使用所述多个荧光发射图像和所述多个激发图像获得所述一个或多个受试者的所述一个或多个层析图像。
22.根据权利要求1所述的系统，其中：
所述检流计光学扫描器能够操作以通过将所述激发光的光束引导到所述扫描区内的多个离散激发位置而跨越所述扫描区扫描所述激发光的光束，其中：
所述离散激发位置被布置成若干集合，每一集合包括多个离散激发位置，给定集合的每一离散激发位置对应于所述一个或多个受试者中的不同受试者，
所述检流计光学扫描器能够操作以每次一个集合地扫描所述激发光的光束，从而将所述激发光的光束引导到给定集合内的每一离散激发位置，然后继续到下一集合，且
所述检流计光学扫描器能够操作以在对应于所述一个或多个检测器的曝光窗口的时间内扫描所述激发光的光束通过给定集合的所有所述离散激发位置，且
所述一个或多个检测器被对准且能够操作以针对离散激发位置的每一集合检测对应荧光发射图像，所述对应荧光发射图像表示检测到的由于被引导到给定集合内的每一激发位置的激发光对所述一个或多个受试者内的所述一个或多个荧光物质的激发而在所述一个或多个检测器的所述曝光窗口期间发射的荧光。
23.根据权利要求22所述的系统，其中：
对应于所述检测到的荧光的所述数据针对离散激发位置的每一集合包括所述对应荧光发射图像，且
所述指令使所述处理器使用所述荧光发射图像获得所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述指令使所述处理器针对所述一个或多个受试者中的每一受试者：
针对对应于离散激发位置集合的每一荧光发射图像，进而确定与所述受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，确定与所述受试者相关联的所述荧光发射图像的一部分，进而确定与所述受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光图像对应于离散激发位置集合；以及
使用与所述受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像获得所述受试者的层析图像。
25.根据权利要求22所述的系统，其中：
所述一个或多个检测器被对准且能够操作以针对离散激发位置的每一集合检测对应激发图像，所述对应激发图像表示由于被引导到给定集合内的每一激发位置的所述激发光的光束对所述一个或多个受试者的照明而在所述一个或多个检测器的所述曝光窗口期间检测到的透射通过所述一个或多个受试者或由所述一个或多个受试者反射的激发光，且
所述指令使所述处理器：
接收和/或存取对应于检测到的激发光的数据，对应于所述检测到的激发光的所述数据针对离散激发位置的每一集合包括所述对应激发图像；以及
使用所述检测到的荧光发射图像和所述检测到的激发图像获得所述一个或多个受试者中的每一受试者的层析图像。
26.(原始)根据权利要求25所述的系统，其中所述指令使所述处理器针对所述一个或多个受试者中的每一受试者：
针对对应于离散激发位置集合的每一荧光发射图像，确定与所述受试者相关联的所述荧光发射图像的一部分，进而确定与所述受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者荧光发射图像，进而确定与所述受试者相关联的多个单个受试者荧光发射图像，其中每一单个受试者荧光发射图像对应于离散激发位置集合；以及
针对对应于离散激发位置集合的每一激发图像，确定与所述受试者相关联的所述激发图像的一部分，进而确定与所述受试者相关联且对应于所述离散激发位置集合的单个受试者激发图像，进而确定与所述受试者相关联的多个单个受试者激发图像，其中每一单个受试者激发图像对应于离散激发位置集合；以及
使用与所述受试者相关联的所述多个单个受试者荧光发射图像和与所述受试者相关联的所述多个单个受试者激发图像获得所述受试者的层析图像。
27.(原始)一种用于在宽视场上快速扫描来自多个激发源的激发光以用于跨越对象平面定位的一个或多个受试者的层析成像的系统，所述系统包括：
(a)多个激发源，其中：
每一激发源能够操作以发射相应激发光的光束，
第一激发源，其被对准以沿着从所述第一激发源的输出到包括一个或多个旋转检流计镜的检流计光学扫描器的第一光学路径引导其相应激发光的光束，且
除所述第一激发源外的每一激发源被对准以沿着从其输出到所述检流计光学扫描器的相应光学路径以相对于所述第一光学路径的对应偏移角引导其相应激发光的光束；
(b)所述检流计光学扫描器，其中所述检流计光学扫描器被对准且能够操作以针对每一激发源经由所述一个或多个旋转检流计镜的反射将由所述激发源发射的所述相应激发光的光束引导到所述对象平面的相应扫描区内的相应多个位置，以使得在所述一个或多个检流计镜旋转时，跨越所述相应扫描区扫描由所述激发源发射的所述相应激发光的光束，进而实现跨越所述对象平面定位的所述一个或多个受试者的照明；
(c)一个或多个检测器，其被对准且能够操作以检测由于来自所述多个激发源中的至少一个的所述激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的一个或多个荧光物质发射的荧光；
(d)处理器；以及
(e)存储器，其具有存储在其上的指令，其中所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器：
接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据；以及
使用对应于所述检测到的荧光的所述数据获得所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像。
28.根据权利要求27所述的系统，其中每一激发源发射具有在所述一个或多个受试者内的对应荧光物质的激发带内的相异激发波长的激发光。
29.根据权利要求27所述的系统，其中所述一个或多个检测器被对准且能够操作以检测由于来自所述多个激发源中的两个或更多个激发源中的每一个的所述激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的所述一个或多个荧光物质发射的荧光。
30.根据权利要求27所述的系统，其中：
对应于所述检测到的荧光的所述数据针对所述多个激发源中的两个或更多个激发源中的每一个包括在跨越所述激发源的所述相应扫描区朝向多个激发位置中的每一个引导的激发光的激发之后检测到的相关联荧光发射信号的集合，且
所述指令使所述处理器针对所述两个或更多个激发源中的每一个使用所述相关联荧光发射信号获得所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像的相应集合，进而获得所述两个或更多个激发源中的每一个的一个或多个层析图像的集合。
31.根据权利要求27所述的系统，其中所述激发源中的每一个的所述相应扫描区中的每一个的至少一部分彼此重叠以产生共享扫描区。
32.根据权利要求31所述的系统，其中所述检流计光学扫描器定位于沿着从所述检流计到所述共享扫描区内的位置的最小长度光学路径测得的特定距离，以基于所述一个或多个检流计镜的一个或多个最大旋转角度产生所要大小的共享扫描区。
33.根据权利要求32所述的系统，其中沿着第一维度和/或第二维度的所述共享扫描区的所述所要大小是至少100mm。
34.一种用于在宽视场上快速扫描激发光以用于跨越对象平面定位的一个或多个受试者的层析成像的方法，所述方法包括：
(a)用来自激发源的激发光的光束照射所述一个或多个受试者，其中所述激发源被对准以沿着从所述激发源的输出到包括一个或多个旋转检流计镜的检流计光学扫描器的光学路径引导所述激发光的光束，其中所述检流计光学扫描器被对准且能够操作以经由所述一个或多个旋转检流计镜的反射将所述激发光的光束引导到所述对象平面的扫描区内的多个位置，以使得在所述一个或多个检流计镜旋转时，跨越所述扫描区扫描所述激发光的光束，进而实现跨越所述对象平面定位的所述一个或多个受试者的照明，以及
(b)用一个或多个检测器检测由于所述激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的荧光物质发射的荧光；
(c)由计算装置的处理器接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据；以及
(d)由所述处理器使用对应于所述检测到的荧光的所述数据获得所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像。
35.一种用于在宽视场上快速扫描来自多个激发源的激发光以用于跨越对象平面定位的一个或多个受试者的层析成像的方法，所述方法包括：
(a)用由多个激发源中的相应一个发射的至少一个激发光的光束照射所述一个或多个受试者，其中：
(i)第一激发源被对准以沿着从所述第一激发源到包括一个或多个旋转检流计镜的检流计光学扫描器的第一光学路径引导其相应激发光的光束，
(ii)除所述第一激发源外的每一激发源被对准以沿着朝向所述检流计光学扫描器的相应光学路径以相对于从所述第一激发源到所述检流计光学扫描器的所述第一光学路径的对应偏移角引导其相应激发光的光束，
(iii)所述检流计光学扫描器被对准且能够操作以针对每一激发源经由所述一个或多个旋转检流计镜的反射将由所述激发源发射的所述相应激发光的光束引导到所述对象平面的相应扫描区内的相应多个位置，以使得在所述一个或多个检流计镜旋转时，跨越所述相应扫描区扫描由所述激发源发射的所述相应激发光的光束，进而实现跨越所述对象平面定位的所述一个或多个受试者的照明；
(b)用一个或多个检测器检测由于来自所述多个激发源中的至少一个的所述激发光的激发而从所述一个或多个受试者内的一个或多个荧光物质发射的荧光；
(c)由计算装置的处理器接收和/或存取对应于检测到的荧光的数据；以及
(d)由所述处理器使用对应于所述检测到的荧光的所述数据获得所述一个或多个受试者的一个或多个层析图像。
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