CN111032674A - 蛋白质纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过使用三色谱柱过程，包括在含羟基磷灰石和/或氟磷灰石的材料上进行的色谱法，从包含蛋白质和杂质的样品中纯化所述蛋白质的方法，所述蛋白质例如是Fc融合蛋白或抗体。本发明还涉及包含可通过本发明方法获得的纯化蛋白质的药物组合物。
Description
发明领域
本发明涉及通过使用三色谱柱过程，包括在含羟基磷灰石和/或氟磷灰石的材料上进行的色谱法，从包含所述蛋白质和杂质的样品中纯化所述蛋白质的方法，所述蛋白质例如是Fc融合蛋白或抗体。本发明还涉及包含可通过本发明方法获得的纯化蛋白质的药物组合物。
发明背景
当生产蛋白质(例如融合蛋白或抗体)用于治疗用途时，重要的是去除过程相关的杂质，因为它们可能是有毒的。过程相关的杂质通常包括HCP(宿主细胞蛋白)、DNA和rPA(残留蛋白A)。HCP是杂质的重要来源，由于它们在分子质量、等电点和结构上的高度复杂性和异质性，可能代表着严峻的挑战。因此，必须使治疗性蛋白质表现出非常低水平的HCP：应特别强调优化在下游工艺(即纯化工艺)中减少HCP的技术。此外，下游工艺必须以符合相应上游工艺产生的质量的方式进行调整。对于任何种类的治疗性蛋白质，还必须将与产品相关的杂质(例如聚集体或蛋白质片段)降低到最低水平。
对于那些愿意生产生物仿制药的人，还有一个额外的因素需要考虑：电荷变体。实际上，酸性和碱性电荷变体的含量必须位于参考产品定义的生物仿制药范畴(corridor)之内。考虑到上游和下游工艺均可改电荷变体，因此下游工艺必须适应这一挑战。
另外，对于任何种类的治疗性蛋白质，纯化应最大程度减少与过程相关的蛋白质损失，并在每个过程步骤中达到可接受的产量。
需要找到最佳的纯化顺序，以保证根据质量标准对产物和工艺相关杂质的整体清除，同时将由于纯化过程引起的蛋白质损失降至最低。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种从包含蛋白质和杂质的样品中纯化蛋白质的方法，所述蛋白质为例如Fc融合蛋白或抗体，其中该方法包括以下步骤：(a)使含有蛋白质和杂质的样品与蛋白A色谱材料(树脂或膜)在一定条件下接触，使得蛋白质与色谱材料结合且至少一部分杂质不与色谱材料结合；(b)从蛋白A色谱材料中洗脱蛋白质，以获得洗脱液；(c)在一定条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与色谱材料结合；(d)在一定条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液包含比步骤(b)的洗脱液更低水平的杂质；(e)在一定条件下将步骤(d)的含有蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与色谱材料结合；和(f)在一定条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的杂质。
另一方面，本发明还提供一种获得单体形式蛋白质的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)使含有单体形式、聚集形式或片段形式的蛋白质的样品与蛋白A色谱材料(树脂或膜)在一定条件下接触，使得单体形式的蛋白质与色谱材料结合且至少一部分聚集形式和片段形式的蛋白质不与色谱材料结合；(b)从蛋白A色谱材料中洗脱单体形式的蛋白质，以获得洗脱液；(c)在一定条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与色谱材料结合；(d)在一定条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(b)的洗脱液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质；(e)在一定条件下将步骤(d)的含有单体形式的蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与色谱材料结合；和(f)在一定条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质。
根据本发明的待纯化的蛋白质(也称为目标蛋白质)可以是Fc融合蛋白(也称为目标Fc融合蛋白)或抗体(也称为目标抗体)。Fc融合蛋白优选包含Fc部分或者是基于抗体部分的融合蛋白。目标抗体可以是嵌合抗体，人源化抗体或全人抗体，或其他类型的抗体，例如SEED体。
本发明的混合模式色谱材料(也称为色谱载体)可以是树脂或膜的形式，并具有以下两种或更多种功能的组合：例如阳离子交换，阴离子交换，疏水相互作用，亲水相互作用，氢键结合。优选地，步骤(c)的混合模式色谱载体选自例如Capto-MMC或Capto-Adhere，步骤(e)的混合模式色谱载体选自羟基磷灰石和/或氟磷灰石。
定义
术语“抗体”及其复数指代“多个抗体”尤其包括多克隆抗体，亲和纯化的多克隆抗体，单克隆抗体和抗原结合片段。抗体也称为免疫球蛋白。还包括基因工程的完整抗体或片段，例如嵌合抗体，人源化抗体，人或全人抗体，以及合成的抗原结合肽和多肽。SEED体也包括在内。术语SEED体(用于链交换工程结构域的SEED；复数形式：多个SEED体)是指包含人IgG和IgA CH3结构域衍生物的特定类型的抗体，其形成互补的人SEED CH3异二聚体，该异二聚体由人IgG和IgA CH3序列的交替片段组成。它们是不对称融合蛋白。Davis等人在2010([1]或US 8,871,912([2])中描述了SEED体和SEED技术，其全部内容并入本文。
术语“单克隆抗体”是指作为独特母细胞的克隆的抗体。
术语“人源化”免疫球蛋白(或“人源化抗体”)是指包含人骨架区和来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供骨架区的人免疫球蛋白称为“受体”(通过将非人CDR移植到人骨架区和恒定区上或通过将整个非人可变结构域整合到人恒定区(嵌合)上来进行人源化)。恒定区不必完整地存在，但如果存在，则它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％或更高程度的相同。因此，如果需要调节效应子功能，则人源化免疫球蛋白的所有部分，除了可能的CDR和重链恒定区中的一些残基之外，基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。通过使抗体人源化，可以延长生物半衰期，并减少对人给药后发生不利的免疫反应的可能性。
术语“全人”免疫球蛋白(或“全人”抗体)是指既包含人骨架区又包含人CDR的免疫球蛋白。恒定区不必完整地存在，但如果存在，则它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％或更高程度的相同。因此，如果需要调节效应子功能或药代动力学性质，则全人免疫球蛋白的所有部分，除了可能在重链恒定区中的少数残基外，基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。在一些情况下，可以将氨基酸突变引入CDR、骨架区或恒定区中，以提高结合亲和力和/或降低免疫原性和/或改善抗体的生化/生物物理性质。
术语“重组抗体”(或“重组免疫球蛋白”)是指通过重组技术产生的抗体。由于重组DNA技术在抗体产生中的相关性，因此不必局限于天然抗体中发现的氨基酸序列；抗体可以重新设计以获得所需的特性。可能的变化是多种多样的，范围从仅改变一个或几个氨基酸到完全重新设计例如可变结构域或恒定区。通常，进行恒定区的改变以改善、减少或改变特征，例如补体固定(例如补体依赖性细胞毒性，CDC)，与Fc受体的相互作用，以及其他效应子功能(例如抗体依赖性细胞毒性，ADCC)，药物动力学特性(例如，与新生儿Fc受体FcRn结合)。为了改善抗原结合特性，对可变结构域进行改变。除抗体外，免疫球蛋白还可以多种其他形式存在，包括双抗体，线性抗体，多价或多特异性杂交抗体。
术语“单体形式”、“聚集形式”和“片段形式”应根据公知常识来理解。因此，术语“单体形式”是指不与第二相似分子结合的Fc融合蛋白或抗体，术语“聚集形式”(也称为高分子量物质；HMW)是指与第二相似分子共价或非共价结合的Fc融合蛋白或抗体，术语“片段形式”(也称为低分子量物质；LMW)涉及Fc融合蛋白或抗体的单个部分(例如轻链和/或重链)。“单体形式”并不意味着蛋白质(例如Fc融合蛋白或抗体)100％为单体形式，而是仅仅是基本上为单体形式，即至少95％为单体形式，或优选97％为单体形式，或者甚至更优选至少98％为单体形式。由于单体形式、聚集形式和片段形式之间存在平衡(三种物质的总量＝100％)，因此当聚集形式和片段形式减少时，单体形式增加。
“总纯化因子”是指所分析物质的“总减少因子”，从而可以更好地纯化目标蛋白质(例如单体形式)。总纯化因子越高，效果越好。
术语“Fc融合蛋白”涵盖至少两种蛋白质或至少两种蛋白片质段的组合(也称为融合)以获得一种单一蛋白质，其包括Fc部分或抗体部分。
根据本领域使用术语“缓冲液”。“平衡缓冲液”是用于制备色谱材料以接收待纯化样品的缓冲液。“加载缓冲液”是指用于将样品加载到色谱材料或过滤器上的缓冲液。“洗涤缓冲液”是用于洗涤树脂的缓冲液。根据色谱的模式，将允许去除杂质(在结合/洗脱模式下)或收集纯化的样品(在流通模式下)。“洗脱缓冲液”是指用于将样品与色谱材料解除结合的缓冲液。由于加载/洗涤缓冲液和洗脱缓冲液之间离子强度的变化，所以这是可行的。含有抗体的纯化样品因此将作为洗脱液收集。
术语“色谱材料”或“层析材料”(也称为色谱载体或层析载体)，例如“树脂”或“膜”，是指可以将待纯化的分子与杂质分离的任何固相/膜。所述树脂、膜或色谱材料可以是亲和性、阴离子型、阳离子型、疏水性或混合模式的树脂/色谱材料。
可以根据本发明产生的已知抗体的实例包括但不限于阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、卡那基单抗(canakinumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺珠单抗(denosumab)、依库珠单抗(eculizumab)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、匹姆单抗(pidilizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、司妥昔(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、尤特科单抗(ustekinumab)或维多珠单抗(vedolizomab)。
根据标准(国际单位制(SI))使用单位、前缀和符号。
发明详述
A.概述
发明人发现，使用以下流程：“蛋白A色谱”，随后在流通中进行第一“混合模式色谱”，然后还在流通中进行第二“混合模式色谱”，可以例如减少蛋白质样品中杂质(例如聚集体和低分子量物质)的量，同时将HCP保持在可接受的范围内。
根据本发明的方法，要纯化的蛋白质(例如抗体或Fc融合蛋白)样品优选在收获时获得，或者如果样品在纯化之前要保持一定时间，则优选在收获后获得。
因此，在第一方面，本发明提供了一种从含有蛋白质和杂质的样品中纯化蛋白质的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)使含有蛋白质和杂质的样品与亲和色谱材料(树脂或膜)在一定条件下接触，使得蛋白质与色谱材料结合且至少一部分杂质不与色谱材料结合；(b)从亲和色谱材料中洗脱蛋白质，以获得洗脱液；(c)在一定条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与色谱材料结合；(d)在一定条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液包含比步骤(b)的洗脱液更低水平的杂质；(e)在一定条件下将步骤(d)的含有蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与色谱材料结合；和(f)在一定条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的杂质。
在第二方面中，本发明描述了一种获得单体形式的蛋白质的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)使含有单体形式、聚集形式或片段形式的蛋白质的样品与亲和色谱材料(树脂或膜)在一定条件下接触，使得蛋白质与色谱材料结合且至少一部分聚集形式和片段形式的蛋白质不与色谱材料结合；(b)从亲和色谱材料中洗脱单体形式的蛋白质，以获得洗脱液；(c)在一定条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与色谱材料结合；(d)在一定条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(b)的洗脱液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质；(e)在一定条件下将步骤(d)的含有单体形式的蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与色谱材料结合；和(f)在一定条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质。
在整个本发明的上下文中，要去除的杂质优选自包含以下所列物质和由以下所列物质组成的组：目标蛋白质的聚集体或所述目标蛋白质的片段或其混合物，一种或多种宿主细胞蛋白质，内毒素，病毒，核酸分子，脂质，多糖及其任何组合。
根据本发明的待纯化的蛋白质可以是任何种类的抗体，例如单克隆抗体，或Fc融合蛋白。当目标蛋白质是Fc融合蛋白时，其包含Fc部分或衍生自抗体部分或抗体片段，并且包含所述抗体部分或片段的至少CH2/Ch3结构域。当目标蛋白质是单克隆抗体时，它可以是嵌合抗体，人源化抗体或全人抗体或其任何片段。首先，可以在原核或真核细胞，例如细菌，酵母细胞，昆虫细胞或哺乳动物细胞中产生要纯化的目标蛋白质。优选地，目标蛋白质已经在重组哺乳动物细胞中产生。所述哺乳动物宿主细胞(本文也称为哺乳动物细胞)包括但不限于HeLa，Cos，3T3，骨髓瘤细胞系(例如NS0，SP2/0)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个优选的实施方式中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如CHO-S细胞和CHO-k1细胞。对本发明中使用的细胞系(也称为“重组细胞”或“宿主细胞”)进行基因工程改造以表达目标蛋白质。用于基因工程改造细胞和/或细胞系以表达目标多肽的方法和载体是本领域技术人员众所周知的；例如，Sambrook等人([3])或Ausubel等人([4])说明了各种技术。根据所述方法产生的目标蛋白质称为重组蛋白质。重组蛋白质通常被分泌到培养基中，从该培养基中可以回收重组蛋白质。然后可以使用已知方法和可从供应商处购得的产品纯化或部分纯化回收的蛋白质。纯化的蛋白质可以配制成药物组合物。用于药物组合物的合适制剂包括雷明顿药学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(1995年更新；[5])中所述的那些。
通常，根据本发明的方法在室温(15℃至25℃之间)下进行，除了步骤(a)的加载通常在2℃至8℃之间进行/开始，这是因为含有待纯化的蛋白质的样品在按照标准程序(见[6])收获后通常在低温条件下(通常在2℃至8℃之间)储存。
包含纯化的抗体的步骤f)的回收样品优选包含的聚集体的水平比步骤(a)的样品中的聚集体水平低至少50％，优选比步骤(a)的样品中的聚集体水平低至少60％，更优选比步骤(a)的样品中的聚集体水平低至少70％，更优选比步骤(a)的样品中的聚集体水平低至少80％。类似地，所述回收的样品优选包含的片段的水平比步骤(a)的样品中的片段水平低至少10％，或更优选包含的片段的水平比步骤(a)的样品中的片段水平低至少20％。HCP的含量优选低于典型的可接受限值100ppm。
优选地，本文所述的纯化方法包括的色谱步骤不超过三个。更优选地，本文所述的纯化方法仅由三个色谱步骤(即亲和色谱步骤和两个混合模式色谱步骤)组成，任选地包括过滤步骤和/或其他病毒灭活步骤。甚至更优选地，本文所述的纯化方法仅由三个根据特定模式进行的色谱步骤组成：以结合/洗脱模式进行的亲和色谱步骤和以流通模式进行的两个混合模式色谱步骤，任选地包括过滤步骤和/或其他病毒灭活步骤。
对于部分或全部步骤，可以“逐步”或以连续模式进行本文所述的纯化方法。
B.亲和色谱步骤(步骤(a)和(b))
B.1.概述
术语“蛋白A色谱”是指使用蛋白A的亲和色谱技术，其中蛋白A通常固定在固相上。蛋白A是一种表面蛋白，最初存在于金黄色葡萄球菌细菌的细胞壁中。现在，存在天然原始或重组产生的各种蛋白A，也可能包含一些突变。该蛋白具有特异性结合免疫球蛋白(如IgG抗体或任何Fc融合蛋白)的Fc部分的能力。
蛋白A色谱是用于纯化抗体和Fc融合蛋白的最常见的亲和色谱之一。通常，待纯化溶液中的抗体(或Fc融合蛋白)通过其Fc部分可逆地结合至蛋白A。相反，(大多数)杂质流过色谱柱，并通过洗涤步骤消除。因此，需要将抗体(或Fc融合蛋白)从色谱柱或亲和树脂上洗脱，以收集用于后续的纯化步骤。
在本发明的整个上下文中，步骤(a)中的蛋白A色谱材料非限制性地选自例如下组：MABSELECTTM，MABSELECTTM SuRe，MABSELECTTM SuRe LX，AMSPHERETM A3，
AF-rProtein A-650F，
AF-HC，
Ultra，
Ultra Plus或
以及它们的任意组合。在一些实施方式中，蛋白A配体固定在选自下组的树脂上：基于葡聚糖的基质，基于琼脂糖的基质，基于聚苯乙烯的基质，基于亲水性聚乙烯乙基的基质，基于刚性聚甲基丙烯酸酯的基质，基于多孔聚合物的基质，基于受控孔玻璃的基质，以及它们的任意组合。或者，将蛋白A配体固定在膜上。
此步骤的目的是捕获澄清收获物中存在的目标蛋白质，将其浓缩并去除大多数与过程相关的杂质(例如HCP，DNA，细胞培养液的成分)。
B.2.平衡和加载
在本发明的整个上下文中，将在步骤(a)中与亲和色谱材料接触的包含目标蛋白质的样品是水溶液的形式。它可以是粗制收获物，澄清的收获物，或者甚至可以是在缓冲水溶液中预先平衡的样品。
在纯化样品之前，必须对蛋白A材料进行平衡。用缓冲水溶液进行该平衡。合适的缓冲水溶液(或缓冲液)包括但不限于磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，乙酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液。用于该步骤的缓冲水溶液优选基于乙酸钠或磷酸钠。优选地，缓冲溶液的浓度为(约)10mM至(约)40mM，pH为(约)6.5至(约)8.0。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)15mM至(约)30mM，pH为(约)6.8至(约)7.5。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)15.0mM、(约)16.0mM、(约)17.0mM、(约)17.0mM、(约)18.0mM、(约)19.0mM、(约)20.0mM、(约)21.0mM、(约)22.0mM、(约)23.0mM、(约)24.0mM或(约)25.0mM，其pH为(约)6.5、(约)6.6、(约)6.7、(约)6.8、(约)6.9、(约)7.0、(约)7.1、(约)7.2、(约)7.3、(约)7.4和(约)7.5。
在根据本发明的一种方法中使用的缓冲水溶液还可以包含浓度为(约)100mM至(约)200mM，优选浓度为(约)125mM至(约)180mM的盐，例如(约)130mM、(约)135mM、(约)140mM、(约)145mM、(约)150mM、(约)155mM、(约)160mM、(约)165mM或(约)170mM。合适的盐包括但不限于氯化钠。
技术人员将选择适当的条件进行平衡和加载，以使待纯化的蛋白质与亲和色谱材料结合。相反，至少一部分杂质将流过色谱材料。例如，用于平衡的缓冲水溶液包含(约)25mM的磷酸钠且pH为7.0±0.2，并且氯化钠的浓度为(约)150mM。
B.3.洗涤
在加载(步骤(a))后，将亲和色谱材料用更多的与平衡缓冲液相同的溶液或不同的溶液或两者的组合洗涤一次或两次。对于平衡和加载步骤，合适的缓冲水溶液(或缓冲液)包括但不限于磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，乙酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液。洗涤步骤对于去除未结合的杂质是必要的。
优选地，洗涤是一步进行的，即用一种缓冲液进行。优选地，洗涤缓冲液是乙酸盐缓冲液(例如乙酸钠缓冲液)，其浓度为(约)40mM至(约)70mM，pH为(约)5.0至(约)6.0。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)45mM至(约)65mM，pH为(约)5.2至(约)5.8。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)50mM、(约)51mM、(约)52mM、(约)53mM、(约)54mM、(约)55mM、(约)56mM、(约)57mM、(约)58mM、(约)59mM或(约)60mM，其pH为(约)5.2、(约)5.3、(约)5.4、(约)5.5、(约)5.6、(约)5.7和(约)5.8。
或者，用两种不同的缓冲液分两步进行洗涤。优选地，第一洗涤缓冲液是乙酸盐缓冲液(例如乙酸钠缓冲液)，其浓度为(约)40mM至(约)70mM，pH为(约)5.0至(约)6.0。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)45mM至(约)65mM，pH为(约)5.2至(约)5.8。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)50mM、(约)51mM、(约)52mM、(约)53mM、(约)54mM、(约)55mM、(约)56mM、(约)57mM、(约)58mM、(约)59mM或(约)60mM，其pH为(约)5.2、(约)5.3、(约)5.4、(约)5.5、(约)5.6、(约)5.7和(约)5.8。优选地，第二洗涤缓冲液类似于平衡/加载缓冲液。
在根据本发明的一种方法中使用的缓冲水溶液还可以包含盐。优选地，如果存在盐并且该方法包括两次洗涤步骤，则所述盐在第一洗涤缓冲液中的浓度将高于在第二洗涤缓冲液中的浓度。优选地，如果存在盐，洗涤缓冲液中的盐浓度(当只有1步时)或第一洗涤缓冲液中的盐浓度(当2步时)的范围为(约)1.0M至(约)2.0M，优选浓度为(约)1.25M至1.80M，例如(约)1.3M、(约)1.3.5M、(约)1.4M、(约)1.45M、(约)1.5M、(约)1.55M、(约)1.6M、(约)1.65M或(约)1.70M。如果存在盐，第二洗涤缓冲液中盐的浓度范围优选为(约)100mM至(约)200mM，优选浓度范围为(约)125mM至180mM，例如为(约)130mM、(约)135mM、(约)140mM、(约)145mM、(约)150mM、(约)155mM、(约)160mM、(约)165mM或(约)170mM。合适的盐包括但不限于氯化钠，氯化钾，氯化铵，乙酸钠，乙酸钾，乙酸铵，钙盐和/或镁盐。
技术人员将选择适当的条件进行洗涤步骤，以使待纯化的蛋白质保持与亲和色谱材料的结合。相反，由于洗涤缓冲液，至少一部分杂质将继续流过色谱材料。作为非限制性实例，在两步洗涤中，如果平衡缓冲液包含(约)25mM的磷酸钠，浓度为(约)150mM的盐且pH值为7.0±0.2，则可以用包含(约)55mM的磷酸盐，浓度为(约)1.5M的盐且pH值为5.5±0.2的洗涤缓冲液进行第一步洗涤，并用与平衡缓冲液相同的洗涤缓冲液进行第二步洗涤。
B.4.洗脱
然后可以使用干扰亲和色谱材料与待纯化蛋白质的Fc部分/恒定结构域结合的溶液(称为洗脱缓冲液)洗脱目标蛋白质(步骤(b))。该洗脱缓冲液可以包含乙酸、甘氨酸、柠檬酸盐/酯或柠檬酸。优选地，缓冲溶液是乙酸缓冲液，其浓度范围为(约)40mM至(约)70mM。更优选地，缓冲溶液的浓度范围为(约)45mM至(约)65mM。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)50mM、(约)51mM、(约)52mM、(约)53mM、(约)54mM、(约)55mM、(约)56mM、(约)57mM、(约)58mM、(约)59mM或(约)60mM。可以通过降低色谱材料以及粘附在其上的蛋白质的pH来进行洗脱。例如，洗脱缓冲液的pH可以为等于或小于(约)4.5，或者等于或小于(约)4.0。优选为(约)2.8至(约)3.7，例如2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5或3.6。洗脱缓冲液任选地包括离液剂。
技术人员将选择适当的条件进行洗脱步骤，以使待纯化的蛋白质从亲和色谱材料中释放出来。作为非限制性实例，洗脱(即步骤(b)的洗脱)可以用包含(约)55mM乙酸且pH为3.2±0.2的洗脱缓冲液进行。
C.混合模式色谱步骤
C.1.概述
根据本发明的混合模式色谱材料(也称为混合模式色谱载体)是指涉及以下两种或多种功能(但不限于)的组合的色谱材料：阳离子交换，阴离子交换，疏水相互作用，亲水相互作用，氢键结合或金属亲和作用。因此，该材料包含两种不同类型的配体。固相可以是基质，例如树脂，多孔颗粒，无孔颗粒，膜或整料。
C.2.第一混合模式色谱(步骤(c)和(d))
在本发明的整个上下文中，步骤(c)的优选的混合模式色谱载体选自下组：Capto-MMC、Capto-Adhere、Capto adhere Impress、MEP Hypercel和ESHMUNO HCX。优选是具有阴离子交换性质的载体，例如Capto-Adhere。或者，混合模式色谱材料可以是膜，例如NatrixHD-SB。
优选地，在加载之前，将亲和色谱处理之后回收的洗脱液(即步骤(b)的洗脱液)调节至6.5至8.5的pH，例如pH为6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1或8.2。例如，可以使用TRIS和/或NaOH的浓溶液进行pH调节。目的是使步骤(b)的洗脱液的pH和电导率与将要进行的步骤(c)的这些参数类似。所述洗脱液因此将是经调节的洗脱液。如果例如步骤(c)将在8.0±0.2的pH下进行，则步骤(b)的洗脱液必须调节至8.0±0.2的pH。类似地，如果步骤(c)要用盐进行，则将相同的盐条件用于上述调节。
在加载经调节的洗脱液之前，将第一混合模式色谱材料用缓冲水溶液(平衡缓冲液)平衡。合适的缓冲水溶液(或缓冲液)包括但不限于磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，乙酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液。优选地，缓冲溶液(例如磷酸钠缓冲液)的浓度为(约)20mM至(约)60mM，pH为(约)6.5至(约)8.5。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)30mM至(约)50mM，pH为(约)6.5至(约)8.5。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)35mM、(约)36mM、(约)37mM、(约)38mM、(约)39mM、(约)40mM、(约)41mM、(约)42mM、(约)43mM、(约)44mM或(约)45mM，其pH为(约)6.8、(约)6.9、(约)7.0、(约)7.1、(约)7.2、(约)7.3、(约)7.4、(约)7.5、(约)7.6、(约)7.7、(约)7.8、(约)7.9、(约)8.0、(约)8.1或(约)8.2。
在根据本发明的一种方法中使用的缓冲水溶液还可以包含浓度为(约)50mM至(约)1M，优选浓度为(约)85mM至500mM的盐，例如(约)100mM、(约)150mM、(约)200mM、(约)250mM、(约)300mM、(约)350mM、(约)400mM、(约)450mM或(约)500mM。合适的盐包括但不限于氯化钠和/或氯化钾。
平衡缓冲液也将用于在流通液中“推动”未结合的目标蛋白质，以回收所述纯化的抗体/蛋白质(步骤d)。所述流通液在柱的底部被回收。相反，至少一部分杂质与色谱材料结合。
一旦混合模式色谱材料达到平衡，就可以加载步骤(b)的洗脱液(或经调节的洗脱液)。未结合的目标蛋白质将通过添加平衡缓冲液来推动并在柱的底部回收。
在本发明的上下文中，技术人员将为该第一混合模式色谱步骤选择合适的条件，以使待纯化的蛋白质不与第一混合模式色谱材料结合，即为了使其流过色谱材料。鉴于待纯化的蛋白质的pI(等电点)，技术人员知道如何调整缓冲液的pH和/或盐条件。作为非限制性实例，例如，对于pI大于9.0的目标蛋白质，用于第一混合模式色谱步骤的平衡缓冲液可包含(约)40mM的磷酸钠，氯化钠浓度为(约)95mM，并且pH为8.0±0.2。加载是在相同条件下进行的。作为另一个非限制性实例，例如，对于pI为约8.5到约9.5的目标蛋白质，用于第一混合模式色谱步骤的平衡缓冲液可包含(约)40mM的磷酸钠，氯化钠浓度为(约)470mM，并且pH为(约)7.3±0.2。加载是在相同条件下进行的。
C.3.第二混合模式色谱(步骤(e)和(f))
在本发明的整个上下文中，用于第二混合模式色谱步骤(步骤(e))的优选的混合模式色谱载体包含选自下组的配体：基于羟基的配体和/或基于氟磷灰石的配体。这样的配体可用于例如树脂或膜之内的色谱材料中。
基于羟基磷灰石的配体包含具有结构式(Ca5(PO4)3OH)2的磷酸钙矿物。其主要相互作用模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和作用。包含所述基于羟基磷灰石的配体的混合模式色谱载体可以各种形式商购，包括但不限于陶瓷形式。陶瓷羟基磷灰石的商业实例包括但不限于CHTTM I型和CHTTM II型。陶瓷羟基磷灰石是多孔颗粒，并且可以具有各种直径，例如约20、40和80微米。
基于氟磷灰石的配体包含具有结构式Ca5(PO4)3F或Ca10(PO4)6F2的不溶性氟化磷酸钙矿物。其主要相互作用模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和作用。包含所述基于氟磷灰石的配体的混合模式色谱载体可以各种形式商购，包括但不限于陶瓷形式。陶瓷氟磷灰石的商业实例包括但不限于CFTTM I型和CFTTM II型。陶瓷氟磷灰石是球形多孔颗粒，可以具有各种直径，例如约10、20、40和80微米。
基于羟基氟磷灰石的配体包括具有结构式Ca10(PO4)6(OH)x(F)y的不溶性羟基化和不溶性氟化的磷酸钙矿物。其主要相互作用模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和作用。包含所述羟基氟磷灰石配体的混合模式色谱载体可以各种形式商购，包括但不限于陶瓷、结晶和复合形式。复合形式含有被围困在琼脂糖或其他珠的孔中的羟基氟磷灰石微晶。陶瓷羟基氟磷灰石树脂的一个实例是MPC陶瓷羟基氟磷灰石树脂TM，其结构式为(Ca10(PO4)6(OH)1.5(F)0.5)，是基于陶瓷磷灰石I型(40μm)混合模式树脂。
优选地，在加载之前，将第一混合模式色谱之后回收的流通液(即步骤(d)的洗脱液)调节至7.0至8.5的pH，例如pH为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1或8.2。例如，可以使用TRIS和/或NaOH的浓溶液进行调节。所述洗脱液因此将是经调节的洗脱液。目的是使步骤(d)的流通液变为适于加载到第二混合模式色谱上的条件。如果例如步骤(e)将在7.5±0.2的pH下进行，则步骤(d)的流通液必须被调节至7.5±0.2的pH。该调节步骤可以与浓缩步骤一起进行。在这种情况下，可以在第二混合模式色谱之前增加过滤步骤。可能需要进行的其他调节涉及盐和NaPO4。
在用经调节的含有目标蛋白质的流通液加载之前，将第一混合模式色谱材料用缓冲水溶液(平衡缓冲液)平衡。优选地，在第一混合模式色谱步骤(步骤(d))之后回收的流通液在加载到第二混合模式色谱材料(步骤(e))之前用缓冲水溶液进行平衡。合适的缓冲水溶液(或缓冲液)包括但不限于磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，乙酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液。优选地，缓冲溶液(例如磷酸钠缓冲液)的浓度为(约)1mM至(约)20mM，pH为(约)7.0至(约)8.5。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)2mM至(约)15mM，pH为(约)7.2至(约)7.8。更优选地，缓冲溶液的浓度为(约)2.5mM、(约)3.0mM、(约)3.5mM、(约)4.0mM、(约)4.5mM、(约)5.0mM、(约)5.5mM、(约)6.0mM、(约)6.5mM、(约)7.0mM、(约)8.0mM、(约)9.0mM、(约)10.0mM，其pH为(约)7.2、(约)7.3、(约)7.4、(约)7.5、(约)7.6、(约)7.7和(约)7.8。
在根据本发明的一种方法中使用的缓冲水溶液还可以包含浓度为(约)50mM至(约)1M，优选浓度为(约)85mM至500mM的盐，例如(约)100mM、(约)150mM、(约)200mM、(约)250mM、(约)300mM、(约)350mM、(约)400mM、(约)450mM或(约)500mM。合适的盐包括但不限于氯化钠和/或氯化钾。
平衡缓冲液也将用于在流通液中“推动”未结合的目标蛋白质(例如，抗体或Fc融合蛋白)，以回收所述纯化的蛋白质(步骤f)。所述流通液在柱的底部被回收。相反，至少一部分杂质与色谱材料结合。
一旦混合模式色谱材料达到平衡，就可以加载步骤(d)的洗脱液(或经调节的洗脱液)。未结合的目标蛋白质将通过添加平衡缓冲液来推动并在柱的底部回收。
在本发明的上下文中，技术人员将为该第二混合模式色谱步骤选择合适的条件(根据待纯化的蛋白质的pI)，以使待纯化的蛋白质不与第一混合模式色谱材料结合，即为了使其流过色谱材料。作为非限制性实例，例如，对于pI大于9.0的目标蛋白质，第二混合模式色谱步骤可以在包含5mM磷酸钠，170mM氯化钠且pH 7.5±0.2的缓冲水溶液中进行。加载是在相同条件下进行的。作为非限制性实例，例如，对于pI为约8.5至约9.5的目标蛋白质，第二混合模式色谱步骤可以在包含3mM磷酸钠，470mM氯化钠且pH 7.5±0.2的缓冲水溶液中进行。加载是在相同条件下进行的。
C.4.替代方案
基于本公开，技术人员将理解，还可以将选自基于羟基的配体和/或基于氟磷灰石的配体的混合模式色谱载体用于第一混合模式步骤(步骤(c)-(d))，将选自Capto-MMC、Capto-Adhere、Capto adhere Impress、MEP Hypercel和ESHMUNO HCX的混合模式载体用于第二混合模式步骤(步骤(e)-(f))。
D.可能的其他步骤
D.1.病毒灭活
任选地，根据本发明的方法包括病毒灭活的步骤。该步骤优选在亲和色谱步骤和第一混合模式色谱步骤之间进行。这称为步骤(b’)。为了灭活病毒，亲和色谱步骤后回收的洗脱液(即步骤(b)的洗脱液)用浓酸性水溶液调节。调节期间要达到的pH优选在(约)3.0至(约)4.5的范围内，更优选在(约)3.2至(约)4.0的范围内，例如3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0。用于调节的酸性水溶液中盐的浓度为(约)1.5至(约)2.5。优选地，酸性水溶液中盐的浓度为(约)1.7至(约)2.3，例如1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2或2.3M。优选的酸性水溶液为乙酸。所得的经调节的洗脱液通常孵育约60±15分钟。
随后在孵育结束时，用浓的中性水溶液中和该物质。如果在步骤(c)之前要保持经过中和的样品，则中和期间要达到的pH优选在(约)4.5至(约)6.5的范围内，更优选在(约)4.8至(约)5.6的范围内，例如4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5或55.6。如果经过中和的样品直接用于步骤(c)，则在中和期间要达到的pH将与用于步骤(c)的pH相同，即6.5至8.5。用于中和的水溶液中盐的浓度为(约)1.0至(约)2.5。优选地，中性水溶液中盐的浓度为(约)1.0至(约)2.0，例如1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0M。优选的中性水溶液是Tris碱。
D.2.任选的过滤步骤
可以在纯化过程中添加各种过滤步骤。可能需要这样的步骤来进一步消除杂质，但也可以将其用于在下一个色谱步骤之前浓缩要纯化的样品，或者在下一个色谱步骤之前改变缓冲液。
例如，为了进一步减少洗脱液或经调节的洗脱液的杂质，在步骤(b)或(b’)之后，可以在第一混合模式色谱处理之前进行过滤步骤。该过滤步骤优选地用深度过滤器进行。所述步骤可以根据第一混合模式色谱处理进行。
在该过程中可以包括过滤步骤，例如深层过滤。例如，可以在亲和色谱处理之前不久添加该步骤，或者在第一混合模式色谱处理之后添加此步骤，如实施例2中所述。
在纯化过程中也可以进行切向流过滤(TFF)。例如，如果希望在加载到第二混合模式色谱上之前对来自步骤(d)的流通液进行浓缩，可以在步骤(e)之前不久进行TFF。此步骤(如果有)称为步骤(d’)。这样的过滤步骤可以用将用于第二混合模式色谱处理的平衡缓冲液进行。这样不仅可以浓缩流通液，还可以使其处于准备进行下一个色谱步骤的条件下。
实施例
I.细胞，细胞扩增和细胞生长
“mAb1”是针对细胞膜上发现的受体的人源化单克隆抗体。其等电点(pI)约为9.20-9.40。mAb1在CHO-K1细胞中产生。
“mAb2”是IgG1融合蛋白，其包含针对膜蛋白的一个部分(IgG部分，包含Fc结构域)，该部分与靶向可溶性免疫蛋白的第二部分连接。其等电点(pI)约为6.6-8.0。它在CHO-S细胞中表达。
“mAb3”是针对细胞膜上发现的受体的人源化单克隆抗体。其等电点(pI)约为8.5-9.5。mAb3在CHO-S细胞中产生。
细胞以补料分批培养的方式培养。将它们在36.5℃，5％CO2、90％湿度下孵育，并以320rpm的速度振摇。各补料分批培养持续14天。
II.分析方法
HCP含量(ppm)：使用以ng/mL为单位确定的HCP水平除以通过UV吸光度确定的mAb浓度(mg/mL)来计算以ppm为单位的HCP水平。
聚集形式的含量(HMW)(以蛋白质浓度的百分比表示)：使用标准方案通过SE-HPLC进行评估。
片段形式的含量(LMW)(以蛋白质浓度的百分比表示)：使用标准方案通过CE-SDS进行评估。
实施例1–按照标准方法纯化的MAb1
除了蛋白A步骤的加载步骤外，整个纯化过程都在室温(15-25℃)下进行，上述例外步骤是因为在纯化前澄清的收获物储存在2-8℃下。
根据标准纯化步骤纯化MAb1，包括“蛋白A色谱”，然后是结合洗脱中的第一“离子交换色谱”(IEX)，然后是流通中的第二IEX(也称为精化步骤)。
使用所述标准过程，获得以下结果：
| 杂质 | 蛋白A后 | 第一IEX后 | 第二IEX后 | 总纯化因子 |
| HCP | 250ppm | 50ppm | 5ppm | 50 |
| HMW | 1％ | 0,6％ | 0.6％ | 1.7 |
| LMW | 2.8％ | 3.1％ | 3％ | 0.9 |
实施例2–根据本发明方法纯化的MAb1
除了蛋白A步骤的加载步骤外，整个纯化过程都在室温(15-25℃)下进行，上述例外步骤是因为在纯化前澄清的收获物储存在2-8℃下。根据本发明，新方法已用于改善mAb1的纯化方案。此新方法的主要步骤是：
-蛋白A色谱(PUP)，
-混合模式色谱1(MM1)，
-混合模式色谱2(MM2)。
蛋白A步骤
在Prosep Ultra 
树脂(默克密理博公司(Merck Millipore))上进行蛋白A步骤，目标床高为20±2cm。在以下条件下进行此步骤：
1.平衡：至少(≥)5床体积(BV)的包含25mM NaPI(磷酸钠)+150mM NaCl的水溶液，pH为7.0。在平衡结束时，检测流出物的pH和电导率。在开始加载之前，pH和电导率应分别满足7.0±0.2和18±1mS/cm的建议值。
2.加载：在2-25℃的温度下，在最大填充床容量约为35-40g mAb1/L的情况下加载澄清收获物。
3.洗涤I：≥5BV的包含55mM乙酸钠、1.5M NaCl的溶液，pH为5.5。
4.洗涤II：≥3BV的包含25mM NaPI+150mM NaCl的溶液，pH为7.0。
5.洗脱：用pH为3.2的55mM乙酸进行。一旦在280nm处的吸光度达到25mAU/mm UV池路径，便立即收集洗脱液峰，并在280nm处的吸光度回到25mAU/mm UV池路径时立即停止收集。洗脱液体积应小于4BV。
低pH下的病毒灭活
通过在搅拌下添加2M乙酸溶液将蛋白A洗脱液调节至pH 3.5±0.2。一旦达到目标pH值，停止搅拌并将酸化的洗脱液孵育60±15分钟。孵育结束时，在搅拌下通过添加2MTris碱溶液将材料中和至pH 5.2±0.2。所得洗脱液(经过中和的洗脱液)可在2-8℃下储存至少3个月。
混合模式色谱1
用2M Tris将经过中和的洗脱液调节至pH 8.0±0.2，并用3M NaCl将其电导率提高至15.0±0.5mS/cm。然后将这种经过调节的洗脱液按照以下所述在Capto
(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上根据混合模式色谱处理进行深度过滤：
1.将深度过滤器(Millistack Pod，来自默克密理博公司)连接到色谱柱前面的纯化系统。
2.树脂的预平衡：≥3BV的500mM NaPI，pH 7.5
3.树脂的平衡：≥6BV的40mM NaPI，93mM NaCl，pH 8.0。
4.以100g/L的mAb1/L填充树脂的容量加载经过调节的洗脱液。一旦在280nm处的吸光度达到12.5mAU/mm UV池路径，立即开始收集流通液。
5.洗涤(＝推动)：4BV的40mM NaPI，93mM NaCl，pH 8.0。然后停止收集包含纯化的mAb1的流通液。
混合模式色谱2
在混合模式色谱2中进一步纯化之前，将来自混合模式色谱1的流通液通过TFF在Pellicon 3
30kDa膜(默克密理博公司)上浓缩。该步骤还可以将缓冲液交换为适合在CFT
II型(40um)(伯乐公司(Bio-Rad))上的氟磷灰石色谱步骤的加载的条件。
TFF步骤以如下方式进行：
1.过滤器(包括保留物和渗透物管路)的平衡：5mM NaPO4，170mM NaCl，pH 7.5的缓冲液。
2.以≤500g mAb1/m2的量加载来自混合模式色谱1的流通液
3.重滤器，≥9DV的与用于平衡的缓冲液相同的缓冲液
4.回收含有纯化mAb1的保留物。
混合模式色谱2的步骤如下进行：
1.预平衡：≥3BV的0.5M NaPI，pH 7.50。
2.平衡：≥5BV 5mM NaPI，170mM NaCl，pH7.5
3.以≤60g mAb1/L填充树脂的容量加载TFF保留物。一旦在280nm处的吸光度达到12.5mAU/mmUV池路径，立即开始收集流通液。
4.洗涤(＝推动)：≥6BV 5mM NaPI，170mM NaCl，pH7.5。然后停止收集包含纯化的mAb1的流通液。
使用所述新方法，获得以下结果：
实施例3–按照标准方法纯化的Mab2
除了蛋白A步骤的加载步骤外，整个纯化过程都在室温(15-25℃)下进行，上述例外步骤是因为澄清的收获物通常在低温下(即2-8℃下)储存。
根据标准纯化步骤纯化Mab2，包括“蛋白A色谱”，接着在流通中进行第一IEX，然后在结合洗脱中进行第二IEX。
使用所述标准过程，获得以下结果：
| 杂质 | 总纯化因子 |
| HMW | 1.9 |
实施例4–根据本发明方法纯化的Mab2
除了蛋白A步骤的加载步骤外，整个纯化过程都20℃到23℃之间的温度下进行，上述例外步骤是因为澄清的收获物通常在低温下(即2-8℃下)储存。此新方法的主要步骤与实施例2相似。已进行一些修改以适合mAb2的pI：
在混合模式色谱1的水平下
对经过中和的洗脱液进行渗析，以达到7.1±0.2的pH和33±0.5mS/cm的电导率。然后按照实施例2所述，将这种经过调节的洗脱液在
(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上进行混合模式色谱处理。另外：
1.树脂的平衡：≥6BV的40mM NaPI，340mM NaCl，pH 7.1。
2.以100g/L的mAb2/L填充树脂的容量加载经过渗析的溶液。一旦加载步骤开始，立即开始收集流通液。
3.洗涤(＝推动)：≥4BV的40mM NaPI，340mM NaCl，pH 7.1。当在280nm处的吸光度降低到低于100mAU/mmUV池路径时，停止收集含有纯化的mAb2的流通液。
在混合模式色谱2的水平下
在混合模式色谱2中进一步纯化之前，将流通缓冲液交换为适合在CFT
II型(40um)(伯乐公司)上的氟磷灰石色谱步骤的加载的条件。
混合模式色谱2的步骤如下进行：
1.预平衡：≥5BV的0.5M NaPI，pH 7.50。
2.平衡：≥15BV 3mM NaPI，420mM NaCl，pH7.5
3.以≤60g mAb2/L填充树脂的容量加载经过渗析的溶液。一旦加载步骤开始，立即开始收集流通液。
4.洗涤(＝推动)：≥6BV，3mM NaPI，420mM NaCl，pH7.5。当在280nm处的吸光度降低到低于100mAU/mmUV池路径时，停止收集含有纯化的mAb2的流通液。
使用所述新方法，获得以下结果：
| 杂质 | 总纯化因子 |
| HMW | 6.2 |
实施例5–按照标准方法纯化的Mab3
除了蛋白A步骤的加载步骤外，整个纯化过程都在室温(15-25℃)下进行，上述例外步骤是因为澄清的收获物通常在低温下(即2-8℃下)储存。根据实施例3纯化Mab3。
使用所述标准过程，获得以下结果：
| 杂质 | 总纯化因子 |
| HMW | 0.7 |
| LMW | 0.9 |
实施例6–根据本发明方法纯化的Mab3
除了蛋白A步骤的加载步骤外，整个纯化过程都20℃到23℃之间的温度下进行，上述例外步骤是因为澄清的收获物通常在低温下(即2-8℃下)储存。此新方法的主要步骤与实施例4相似。已进行一些修改以适合mAb3的pI：
在混合模式色谱1的水平下
对经过中和的洗脱液进行渗析，以达到7.3±0.2的pH和46±0.5mS/cm的电导率。然后按照实施例4所述，将这种经过调节的洗脱液在
(来自通用电气医疗集团)上进行混合模式色谱处理。另外：
1.树脂的平衡：≥6BV的40mM NaPI，470mM NaCl，pH 7.3。
2.洗涤(＝推动)：≥4BV的40mM NaPI，470mM NaCl，pH 7.3。
在混合模式色谱2的水平下
在混合模式色谱2中进一步纯化之前，将流通缓冲液交换为适合在CFT
II型(40um)(伯乐公司)上的氟磷灰石色谱步骤的加载的条件。混合模式色谱2的步骤按照实施例4中所述进行。
使用所述新方法，获得以下结果：
| 杂质 | 总纯化因子 |
| HMW | 4.3 |
| LMW | 1.2 |
结论
发明人发现，与标准方法(例如，如实施例1、3或5中所述)相比，使用本发明的方法(例如，如实施例2、4或6中所述)改进了各种抗体和Fc融合蛋白的纯化。特别是，可以进一步减少杂质如聚集体(HMW含量)和片段(LMW含量)的数量，同时将HCP保持在可接受的范围内(数据未显示)。
参考文献
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Claims (14)
1.一种从含有蛋白质和杂质的样品中纯化蛋白质的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述含有蛋白质和杂质的样品与蛋白A色谱材料(树脂或膜)在一些条件下接触，使得蛋白质与色谱材料结合且至少一部分杂质不与色谱材料结合；
(b)从蛋白A色谱材料中洗脱蛋白质，以获得洗脱液；
(c)在一些条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与该色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与该色谱材料结合；
(d)在一些条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液包含比步骤(b)的洗脱液更低水平的杂质；
(e)在一些条件下将步骤(d)的含有蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与色谱材料结合；和
(f)在一些条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的杂质。
2.一种获得单体形式的蛋白质的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)使含有单体形式、聚集形式或片段形式的蛋白质的样品与蛋白A色谱材料(树脂或膜)在一些条件下接触，使得单体形式的蛋白质与该色谱材料结合且至少一部分聚集形式和片段形式的蛋白质不与该色谱材料结合；
(b)从蛋白A色谱材料中洗脱单体形式的蛋白质，以获得洗脱液；
(c)在一些条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与该色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与该色谱材料结合；
(d)在一些条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(b)的洗脱液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质；
(e)在一些条件下将步骤(d)的含有单体形式的蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与该色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与该色谱材料结合；和
(f)在一些条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质。
3.如利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述蛋白质是Fc融合蛋白或抗体。
4.如前述权利要求中任一项的方法，其中，所述蛋白质是在重组哺乳动物细胞中产生的。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(c)或(e)的混合模式色谱材料呈现以下功能中的两种或更多种的组合：阳离子交换、阴离子交换、疏水相互作用、亲水相互作用、氢键结合、π-π键结合和金属亲和作用。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(c)的混合模式色谱材料选自下组：Capto-MMC和Capto-Adhere，并且步骤(e)的混合模式色谱材料选自下组：基于羟基磷灰石的配体、基于羟基氟磷灰石的配体或基于氟磷灰石的配体。
7.如权利要求6所述的方法，其中，步骤(e)的混合模式色谱材料是CFTI型或CFTII型的氟磷灰石配体。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将要在步骤a)中与蛋白A色谱材料接触的包含蛋白质的样品是水溶液的形式。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)之前，用缓冲水溶液平衡蛋白A色谱材料，所述缓冲水溶液包含20-30mM的磷酸钠，浓度为100-200mM的盐，并且pH值在6.5至约7.5的范围内。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，用洗脱缓冲液进行步骤(b)的洗脱，所述洗脱缓冲液包含40至70mM的乙酸，并且pH在3.0至约3.5的范围内。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)的洗脱液加载之前，用缓冲水溶液对步骤(c)的混合模式色谱材料进行平衡，所述缓冲水溶液包含30-50mM的磷酸钠，浓度为80-120mM的盐，并且pH值在7.5至约8.5的范围内。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(d)的回收的流通液加载之前，用缓冲水溶液对步骤(e)的混合模式色谱材料进行平衡，所述缓冲水溶液包含1-10mM的磷酸钠，任选的浓度为130-200mM的盐，并且pH值在7.0至约8.0的范围内。
13.如权利要求9、11和12中任一项所述的方法，其中，所述盐是氯化钠。
14.如权利要求1所述的方法，其中，所述杂质选自下组中的至少一种：待纯化的蛋白质的蛋白质聚集体或片段或其混合物，一种或多种宿主细胞蛋白质、内毒素、病毒、核酸分子、脂质、多糖以及它们的任意组合。
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