CN111032022B - 用于治疗癌症和眼疾病的白蛋白纳米粒 - Google Patents

用于治疗癌症和眼疾病的白蛋白纳米粒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用作药物的包含芯的纳米粒，所述芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，所述芯任选地涂覆有非离子聚合物；涉及包含所述纳米粒的药物组合物，以及其在治疗癌症和眼疾病中的用途。

Description

用于治疗癌症和眼疾病的白蛋白纳米粒
技术领域
本发明涉及纳米尺寸的药物递送系统，并且更具体地涉及包含白蛋白基质和单克隆抗体的纳米粒，其用于治疗癌症和眼疾病。
背景技术
单克隆抗体已经成为一组感兴趣的糖蛋白，其用于不同的治疗领域，例如癌症、自身免疫性和慢性炎性疾病以及移植排斥的治疗。目前，有约30种单克隆抗体得到监管机构(FDA&EMEA)的批准。
这些单克隆抗体之一是贝伐单抗，其是靶向VEGF-A(血管内皮生长因子，vascularendothelial growth factor)的免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，并且包含VEGF的四种主要同工型。其于2004年被FDA批准用于转移性结直肠癌的一线治疗，并且之后也被批准用于其他癌症，例如非小细胞肺癌或转移性乳腺癌。最近，贝伐单抗已经开始用于治疗眼疾病，包括角膜或视网膜新生血管形成(neovascularization)、糖尿病视网膜病变和衰老有关黄斑变性。
表面施加于眼的表面是用于药物施用的常见途径。但是，保护性机制(溜走(slinking)、流泪和引流)会通过迅速去除制剂而降低药物的生物利用度。在过去的几年中，玻璃体内注射贝伐单抗已经被发现是用于湿法治疗衰老有关黄斑变性、增生型糖尿病视网膜病变和脉络膜新生血管形成的非常有效的方法。短期结果表明，玻璃体内贝伐单抗耐受良好，并且与大多数患者中的视觉敏锐度改善、视网膜厚度降低和血管造影渗漏降低有关。但是，为了实现并维持视力的改善，需要重复注射和随访。这带来了并发症(例如眼内炎)的高风险，以及与将针头插入眼中相关的重复疼痛、恐惧和忧虑。此外，玻璃体内注射贝伐单抗的半衰期仅为约3天。
在癌症治疗的情况下，目前的治疗策略通常涉及侵入过程，包括应用导管进行化学治疗以缩小肿瘤，然后再通过手术将其切除。为改善癌症治疗效果而进行的研究努力已经大大改善了患者生存，但是，与毒副作用和患者中的差生活质量相关的问题仍然是主要问题。
因此，需要开发有效的药物递送方法，以使贝伐单抗以及其他单克隆抗体递送对癌症和眼疾病的治疗具有较小的侵袭性和持久性。
从这个意义上讲，纳米粒已经成为用于药物施用的合适载剂，并在眼科领域以及癌症治疗中取得了有希望的结果。有大量多种的材料可用于制备这样的纳米尺寸的递送系统。例如，已经将单克隆抗体贝伐单抗并入PLGA的纳米粒中用于衰老有关黄斑变性的治疗[Hao et al.,American Association of Pharmaceutical Scientists(AASP)AnnualMeeting and Exposition,Los Angeles,California,2009年11月；Li,F.et al.,The OpenOphthalmology Journal,2012,6,54-58]，以及用于视网膜和脉络膜新生血管形成治疗[Pan CKet al.,J.Ocul.Pharmacol.Ther.,2011,27(3),219-224；Varshochian,R.et al.,European Journal of Pharmaceutical Sciences,2013,50,341-352]。
然而，天然生物聚合物优于合成材料。在该方面，由于人血清白蛋白具有生物相容性、可生物降解性、无毒和无免疫原性的事实，因此其已被广泛用于制备用于药物递送的纳米粒。由于白蛋白纳米粒与多种药物的高结合能力和良好的耐受性而没有任何严重的副作用，因此其引起了相当大的关注。
在过去的几年里，已经提出了大量多种用于制备白蛋白纳米粒的物理化学方法，包括热凝胶化、乳化和去溶剂化(凝聚)。在任何情况下，基于去溶剂化的过程由于其简单性和可重复性而似乎是最受欢迎的。然而，刚刚获得的纳米粒是不稳定的，并且必须进行物理、化学或酶促稳定的补充步骤，以为了延长其在水性环境中的半衰期和/或防止蛋白质的大团聚体的形成。
一般来说，白蛋白的交联是用于稳定白蛋白纳米粒的最流行的策略之一。Elzoghby et al.[Journal of Controlled Release,2012,157,168-182]汇编了用于制备白蛋白纳米粒的不同方法及将其作为活性药物递送系统的用途。特别提及了关于纳米粒在水性介质中的不稳定性，这要求将其进行交联，其引用戊二醛作为本领域中使用的常见的化学交联剂。Lohcharoenkal,W.et al.[BioMed Research International,2014]还提到白蛋白纳米粒的不稳定性，因为其如果不进行交联就会溶解或聚结以形成单独的相。Llabotet al.[19th International Symposium on Microencapsulation,2013]介绍了与包封有贝伐单抗的Gantrez交联的白蛋白纳米粒，以及其在角膜血管形成中的用途。
因此，交联稳定了白蛋白纳米粒并减少了酶促降解以及活性成分从纳米粒的递送。
然而，尽管戊二醛对稳定纳米粒高度有效，但是其使用仍是有问题的，这主要是由于其毒性阻碍了将其用于体内递送的用途。因此，至关重要的是尽可能完全地去除交联剂。此外，戊二醛可影响生物大分子，更特别地蛋白质药物、抗体和肽在纳米粒中的稳定性，因为其与大分子中存在的官能团(例如伯胺残基)反应，从而导致大分子活性的重要丧失。
为了解决这个重要缺点，已经提出了不同的策略来硬化或稳定刚形成的白蛋白纳米粒，而无需使用有毒试剂。其中，纳米粒的稳定化可通过热处理、高流体动力压力或与京尼平(genipin)或转谷氨酰胺酶的酶促交联来获得。
表面涂层也已经用于稳定白蛋白纳米粒。例如，阳离子聚合物(例如聚赖氨酸或聚乙烯亚胺)已经用于涂覆牛血清白蛋白纳米粒以改善其稳定性[Wang et al.,Pharm.Res.,2008,25(12),2896-2909]。
WO2013/042125描述了并入贝伐单抗的戊二醛交联的牛血清白蛋白纳米球以及随后将所述纳米球包封在离子PLGA的覆盖物中的制备。
WO2011/053803还涉及具有聚合物壳的纳米粒，所述聚合物壳包封用于治疗眼疾病的治疗剂(例如贝伐单抗)。
鉴于以上所有，需要适当的递送系统以保持单克隆抗体的完整性和活性并控制其从纳米粒释放。
发明内容
本发明的作者已经发现，在白蛋白基质中包载单克隆抗体(例如贝伐单抗)提供了在水溶液中具有高稳定性的纳米粒，并且出乎意料地，所述纳米粒不需要通过其他手段进行交联或稳定，因此一旦将其递送，就允许维持3D结构以及抗体的生物活性。与此相比，并且如以下实验部分中所示，戊二醛的使用(在现有技术中使用的稳定白蛋白纳米粒的最常见的交联剂)使抗体失活，因此使得使用交联纳米粒用于包封这类活性成分变得不可行。
作者还测试了用非离子聚合物(例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(hydroxypropyl methyl cellulose phthalate，HPMC-P)和聚乙二醇35,000(polyethylenglycol 35,000，PEG35)以及
Figure GDA0003732665210000041
S-100)装饰的非交联纳米粒，并观察到抗体的完整性也得到维持。
除此之外，按照以下本文中所述的方法，可将负载单克隆的白蛋白纳米粒制备为干粉，其准备通过简单添加水或水溶液以分散和重构。
此外，如通过在角膜新生血管形成动物模型中获得的生物活性数据所指出的，本发明的纳米粒允许持续释放单克隆抗体并构成对于体内应用非常感兴趣的药物递送系统。
此外，用涂覆有非离子聚合物的白蛋白纳米粒进行的生物分布测定指出，其能够聚集在肿瘤组织中，因此使其成为用于将单克隆抗体释放到那些受影响的组织中的非常有前途的纳米粒系统。
实际上，体内实验表明本发明的纳米粒能够在肿瘤组织中释放单克隆抗体，因为当与在水溶液中施用相同的单克隆抗体相比，血清中存在较低浓度的所述抗体。此外，肿瘤的体积显著降低。
因此，本发明的第一个方面涉及用于医学的纳米粒，其中所述纳米粒包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯任选地涂覆有非离子聚合物。
本发明的第二个方面涉及药物组合物，其包含：
-多个纳米粒，所述纳米粒包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯任选地涂覆有非离子聚合物；和
-可药用赋形剂、载体或载剂。
在另一个方面，本发明涉及用于医学的本发明的所述药物组合物。
本发明的另一个方面是用于治疗眼疾病的纳米粒，其中所述纳米粒包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯任选地涂覆有非离子聚合物。
本发明的另一个方面是用于治疗癌症的纳米粒，其中所述纳米粒包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯任选地涂覆有非离子聚合物。
最后，本发明的另一个方面涉及包含固体芯的纳米粒，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物。
附图说明
图1.贝伐单抗/白蛋白比对所得纳米粒有效负载(payload)的影响。将单克隆抗体和蛋白质孵育10分钟之后制备纳米粒。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图2.负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP)的TEM照片。
图3.A)人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、戊二醛(glutaraldehyde，GLU)、HAS与戊二醛的物理混合物(HSA-GLU)，以及与戊二醛交联的纳米粒(NP-GLU)的FT-IR谱。B)人血清白蛋白(HSA)、贝伐单抗(bevacizumab，BEVA)、HSA与贝伐单抗的物理混合物(HSA-BEVA)，以及负载贝伐单抗的纳米粒(B-NP)的FT-IR谱。
图4.贝伐单抗(BEVA)、负载贝伐单抗的纳米粒(B-NP)和人血清白蛋白(HSA)的X射线谱。
图5.以下物质的DTA热分析图：A)天然人血清白蛋白(HSA)和贝伐单抗(BEVA)；B)人血清白蛋白(HSA)与贝伐单抗(BEVA)的物理混合物(physical mixture，PM)，以及负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP)；C)天然人血清白蛋白(HSA)和戊二醛(GLU)；D)人血清白蛋白(HSA)与戊二醛(GLU)的物理混合物(PM)，以及与戊二醛交联的白蛋白纳米粒(NP-GLU)。
图6.用戊二醛交联的空纳米粒(NP-GLU)和负载贝伐单抗的纳米粒(B-NP)在pH7.4的水溶液中分散之后平均尺寸的演变。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图7.在PBS(pH 7.4)中孵育之后，贝伐单抗从人血清白蛋白纳米粒的释放谱。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图8.用PEG35聚乙二醇化的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP-PEG35)的TEM显微照片。
图9.在PBS(pH 7.4)的(…---)负载贝伐单抗的NP(B-NP)；(—)涂覆有PEG35的负载贝伐单抗的NP(B-NP-PEG35)；(…)涂覆有
Figure GDA0003732665210000061
S-100的负载贝伐单抗的NP(B-NP-S-100)；(---)涂覆有HPMC-P的负载贝伐单抗的NP(B-NP-HPMC-P)中孵育之后，贝伐单抗从白蛋白纳米粒的释放谱。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图10.纳米粒的基于微流控的自动化电泳(L：梯状带(Ladder)；1：涂覆有PEG35的空纳米粒(NP-PEG35)；2：负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP)；3：涂覆有PEG35的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP-PEG35)；4：人血清白蛋白(HSA)；5：贝伐单抗)。
图11.在向Wistar大鼠眼施用之后，与99mTc标记的B-NP-PEG35(下行)相比99mTc标记的B-NP(上行)的体内SPECT-CT图像。每行中的图像对应于在图中指示的时间点研究的同一动物。眼施用之后4小时至8小时，活性消失，而B-NP-PEG35在眼中保留至少8小时。
图12.眼施用99mTc-B-NP纳米粒之后不同区域中放射性量发展的时间-活性曲线。在图中所示的区域上绘制感兴趣的体积(Volume of interest，VOI)，并从每个VOI获得平均值计数，对数据进行衰变校正并进行绘制。
图13.向Wistar大鼠静脉内施用之后，与99mTc标记的B-NP-PEG35(下行)相比99mTc标记的B-NP(上行)的体内SPECT-CT图像。每行中的图像对应于在图中指示的时间点研究的同一动物。
图14.时间线示意图显示在0小时(第0天)发生的角膜烧灼(cauterization)和在24小时(第1天)的第一次治疗。
图15.用以下治疗的动物的角膜照片：(A)生理血清[对照(-)]；(B)
Figure GDA0003732665210000062
(4mg/mL贝伐单抗)；(C)负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP)；(D)涂覆有PEG 35,000的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP-PEG35)；(E)：人血清白蛋白溶液(human serumalbumin，HSA)；(F)：/>
Figure GDA0003732665210000063
(EYLEA)；(G)：地塞米松(dexamethasone，DEXA)。
图16.病变面积，其表示为受烧伤影响的角膜面积的百分比。在不同组的病变之间未发现统计学显著差异。数据显示为平均值±SD(n＝9)。
图17.侵袭面积(Invasion area，IA)，其是其中存在血管的角膜面积的一部分。数据显示为平均值±SD(n＝9)。
*p<0.01ANOVA，随后进行Tukey检验，与对照(-)显著不同
**p<0.01ANOVA，随后进行Tukey检验，与BEVA显著不同
***p<0.005ANOVA，随后进行Tukey检验，与B-NP显著不同
图18.由病变归一化的新生血管形成面积。数据显示为平均值±SD(n＝9)。
*p<0.01ANOVA，随后进行Tukey检验，与对照(-)显著不同
**p<0.005ANOVA，随后进行Tukey检验，与BEVA显著不同
图19.用贝伐单抗治疗的正常和新生血管角膜的角膜切片的显微照片。(e，上皮层；s，基质；ac，前房；v，基质微血管)。A)大鼠正常角膜的显微照片，其显示完整的上皮(e)，包含规则平行胶原蛋白层的基质，其中间有扁平的角膜细胞；B)来自用负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP)治疗的组的大鼠角膜的显微照片。角膜厚度在正常范围内，完整的上皮和间质略微混乱和松散，具有非常少的浸润。C)来自用负载贝伐单抗并涂覆有PEG35的白蛋白纳米粒(B-NP-PEG35)治疗的组的大鼠角膜的显微照片。正常上皮、大量基质微血管(v)。角膜厚度在正常值内；D&E)：来自用贝伐单抗治疗的组的大鼠角膜的显微照片。上皮保留且肥大、与基质分离。基质增厚伴有大量混乱的成纤维细胞、强烈的细胞浸润和水肿(*)；F)来自用生理血清治疗的组的大鼠角膜的显微照片。角膜内的严重改变，中心侵蚀随着厚度的增加而增加。强烈的纤维化伴有大量混乱的成纤维细胞、中度炎性浸润和新生血管形成(v)。由上皮细胞形成的囊肿(c)，其显示试图进行异常修复。比例尺，200μm，H.E.X100。
图20.用涂覆有PEG35的白蛋白纳米粒(NP-PEG35)治疗的动物中腿部和颈部肿瘤的肿瘤与非肿瘤比。值对应于静脉内(i.v.)施用经放射性标记的纳米粒之后1小时(蓝条)和4小时(红条)获得的来自三只动物的平均值。
图21.肿瘤体积(mm3)。数据显示为平均值±SD(n≥6)。
*p<0.05ANOVA，随后进行Tukey检验，与生理血清显著不同。
**p<0.01ANOVA，随后进行Tukey检验，与生理血清显著不同。
图22.贝伐单抗血清浓度(μg/mL)相对于时间(天)。
具体实施方式
如前所述，本发明的第一个方面涉及用于医学的纳米粒，其中所述纳米粒包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯任选地涂覆有非离子聚合物。
在一个特定的实施方案中，本发明涉及用于医学的纳米粒，其中所述纳米粒包含固体芯，所述固体芯由非交联白蛋白基质和单克隆抗体组成，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯任选地涂覆有非离子聚合物。
在另一个特定的实施方案中，本发明涉及用于医学的纳米粒，其中所述纳米粒由固体芯组成，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯任选地涂覆有非离子聚合物。
在另一个特定的实施方案中，本发明涉及用于医学的纳米粒，其中所述纳米粒由固体芯组成，所述固体芯由非交联白蛋白基质和单克隆抗体组成，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯任选地涂覆有非离子聚合物。
如本文中所使用的，术语“纳米粒”是指具有球形或准球形形状并且平均尺寸小于1μm的胶体系统。在一个特定的实施方案中，纳米粒的平均尺寸为100至900nm，更优选150至800nm，甚至更优选200至500nm，并且更优选200至400nm。
“平均尺寸”应理解为在水性介质中一起移动的纳米粒群的平均直径。这些系统的平均尺寸可通过本领域技术人员已知的标准方法来测量，并且例如在以下的实验部分中描述。
在本发明的上下文中，术语纳米粒是指纳米球或经装饰的纳米球。
“纳米球”应理解为固体非交联白蛋白基质或连续的白蛋白材料，其中单克隆抗体分布在整个所述基质中，因此不具有明显的芯/壳结构。
“经装饰的纳米球”应理解为如上所限定的纳米球，其中固体非交联白蛋白基质涂覆有非离子聚合物或用其进行装饰。
因此，本发明的纳米粒不存在不是非离子聚合物的任何其他聚合物涂层。
在一个优选的实施方案中，本发明的纳米粒是这样的纳米粒，其中当固体芯被涂覆时，纳米粒不存在不是非离子聚合物的任何其他聚合物涂层。尽管本发明的纳米粒不需要涂层聚合物，但是发明人已经发现当纳米粒不存在不是非离子聚合物的任何其他聚合物涂层时，所述颗粒与当使用离子涂层的相同颗粒相比展示出有利的效果。例如，当本发明的纳米粒涂覆有离子聚合物时，所述颗粒显示出非常快速的抗体释放谱(爆发释放)。
因此，当本发明中使用的纳米粒未涂覆有非离子聚合物时，根据上述限定，所述纳米粒应被认为是纳米球，而当本发明中使用的纳米粒涂覆有非离子聚合物时，同样根据上述限定，所述纳米粒应被认为是经装饰的纳米球。
与其中通过其他手段使白蛋白基质交联或稳定的现有技术中使用的纳米粒相比，本发明中使用的纳米粒的特征在于具有非交联白蛋白基质的固体芯，其理解为这样的由白蛋白与单克隆抗体之间的局部相互作用产生的有组织的结构或模式。因此，在本发明的范围内，纳米粒正在形成固体基质系统。
因此，术语“固体芯”是指固体非交联基质型结构，其中白蛋白形成连续结构，其中单克隆抗体分布(优选均匀地分布)在整个基质中。
因此，本发明中使用的纳米粒的固体芯不具有区别的外部和内部结构，并且因此，单克隆抗体分布(更优选均匀地分布)在整个白蛋白基质中，但不包封或限制在其中央腔中。
在一个特定的实施方案中，本发明中使用的纳米粒是如上所限定的纳米球。更特别地，在所述纳米粒中，固体芯未涂覆有非离子聚合物。如通篇全文所述以及还在实施例中显示的，本发明的纳米粒是稳定的并且不需要任何包封。在本发明的上下文中，术语“稳定的”是指颗粒稳定性的提高，以使得所述颗粒可在医学中使用而没有材料的任何分解。因此，在一个特定的实施方案中，本发明的纳米粒是存在或不存在任选的涂层聚合物的稳定的纳米粒。
在另一个特定的实施方案中，本发明中使用的纳米粒是如上所限定的经装饰的纳米球，即包含固体白蛋白基质的固体芯或连续的白蛋白材料或者由其组成，其中单克隆抗体分布在整个所述基质中，并且其中固体芯涂覆有非离子聚合物。
实际上，本发明的另外的方面涉及包含固体芯的纳米粒，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物。
更特别地，本发明还涉及包含固体芯的纳米粒，所述固体芯由非交联白蛋白基质和单克隆抗体组成，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物。
同样特别地，本发明涉及由固体芯组成的纳米粒，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物。
甚至更特别地，本发明还涉及由固体芯组成的纳米粒，所述固体芯由非交联白蛋白基质和单克隆抗体组成，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物。
白蛋白
如本文中所使用的，术语“白蛋白”是指球状带负电荷的蛋白质家族，其中最常见的是血清白蛋白。白蛋白家族的所有蛋白质都是水溶性的，其可在浓盐溶液中适度溶解，并经历热变性。白蛋白通常存在于血浆中，与其他血液蛋白的不同之处在于其不是糖基化的。
白蛋白的一般结构的特征在于数个长的α螺旋允许其维持相对静止的形状，这对于调节血压至关重要。
在一个特定的实施方案中，白蛋白是血清白蛋白。血清白蛋白在肝中产生并溶解在血浆中，是哺乳动物中最丰富的蛋白质。
更优选地，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)，甚至更优选地，血清白蛋白是人血清白蛋白。
人血清白蛋白由ALB基因编码，而其他哺乳动物形式(例如牛血清白蛋白)在化学上是类似的。
人血清白蛋白的分子量为约65.000Da并且由585个氨基酸组成。HSA的氨基酸序列总共包含17个二硫化桥、一个游离硫醇(Cys34)和单色氨酸(Trp214)。
单克隆抗体
如本文中所使用的术语“单克隆抗体”(mAb或moAb)是指由B淋巴细胞的单个克隆或由仅分泌一种类型的抗体分子的被称为杂交瘤的单个细胞产生的抗体或抗体片段。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由抗体产生细胞和骨髓瘤或其他自穿透细胞系(self-penetrating cell line)的融合制造杂交抗体形成细胞。
单克隆抗体具有单价亲和力，因为其与相同的表位(抗体识别的抗原部分)结合。考虑到几乎任何物质，都有可能产生与该物质特异性结合的单克隆抗体。
为了本发明的目的，待并入纳米粒的白蛋白基质中的单克隆抗体应对眼组织内或癌组织内的至少一个靶标具有亲和力，或应对组织本身具有亲和力。例如，靶标可以是与眼病症或与癌症相关的受体或与眼病症或癌症相关的蛋白质。
在一个特定的实施方案中，单克隆抗体选自：贝伐单抗
Figure GDA0003732665210000111
其抑制被称为“血管内皮生长因子”(vascular endothelial growth factor，VEGF)的天然蛋白的功能，该天然蛋白刺激新血管形成；兰尼单抗/>
Figure GDA0003732665210000112
其可与VEGF-A强结合；曲妥珠单抗/>
Figure GDA0003732665210000113
其识别在实体瘤中过表达的HER-2受体；西妥昔单抗/>
Figure GDA0003732665210000114
其识别EGFR受体，和利妥昔单抗/>
Figure GDA0003732665210000115
其识别CD20。
在一个优选的实施方案中，选择一种或更多种抗VEGF抗体(或其片段)以并入白蛋白基质中，从而允许靶向血管内皮生长因子(VEGF)本身。因此，在一个优选的实施方案中，单克隆抗体选自贝伐单抗和兰尼单抗，更优选地是贝伐单抗。
在另一个优选的实施方案中，选择一种或更多种抗VEGF R2抗体(或其片段)以并入白蛋白基质中，从而允许靶向表达血管内皮生长因子受体2(VEGF R2)的细胞，例如视网膜色素上皮细胞。抗VEGF R2单克隆抗体的实例包括但不限于mAb克隆Avas12a1和mAb 2C3。
上皮细胞(例如视网膜色素上皮细胞)过表达VEGF和VEGFR2受体例如与衰老有关黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)相关。
在另一个优选的实施方案中，单克隆抗体是眼靶向剂，即对由涉及眼病症的眼组织产生的或与其相关的抗原具有特异性的抗体。
在一个特定的实施方案中，单克隆抗体/白蛋白重量比为0.01至0.5，更优选0.01至0.2。已经观察到单克隆抗体/白蛋白重量比小于0.01的纳米粒随时间不稳定。
非离子聚合物
如本文中所使用的术语“非离子聚合物”是指在纳米粒的制备条件下不显示净电荷的亲水聚合物。此外，所述非离子聚合物应该是可生物降解的，即其在体内使用期间降解，以及是生物相容的，即对其接触的活体组织或活体系统基本无毒或没有有害影响。
用于本发明的合适的非离子聚合物的实例是聚乙烯醇；聚乙烯吡咯烷酮；聚烯丙醇；聚乙烯基甲基醚；聚乙烯醇缩醛；聚亚烷基醇；任选地用至少一个烷基、羟烷基、烷氧基烷基或两个或更多个这样的基团的组合取代的多糖；聚酯；聚酰胺、聚氨酯和聚醚。
一些优选的多糖包括但不限于黄原胶、瓜尔胶、淀粉、纤维素、葡聚糖和前述两种或更多种的组合。
淀粉包含例如玉米淀粉和羟丙基淀粉。
纤维素包括例如烷基纤维素(例如C1-C6-烷基纤维素，包括甲基纤维素、乙基纤维素和正丙基纤维素)；经取代的烷基纤维素(包括羟基-C1-C6-烷基纤维素和羟基-C1-C6-烷基-C1-C6-烷基纤维素，例如羟乙基纤维素、羟基正丙基纤维素、羟基正丁基纤维素、羟丙基甲基纤维素和乙基羟乙基纤维素)。
在一个特定的实施方案中，非离子聚合物选自：多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚酯和聚亚烷基二醇。优选地，非离子聚合物是选自以下的水溶性纤维素：羟乙基纤维素，羟基正丙基纤维素、羟基正丁基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和乙基羟乙基纤维素；淀粉；葡聚糖；选自商品名为Eudagrit的化合物的聚酯；或聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇或聚丙二醇。
在另一个特定的实施方案中，非离子聚合物选自：羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、淀粉、葡聚糖70、
Figure GDA0003732665210000121
NM；/>
Figure GDA0003732665210000122
NE、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。聚乙二醇根据其分子量优选为PEG-10,000、PEG-20,000或PEG-35,000。
优选地，非离子聚合物选自：羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和PEG 35,000。更优选地，非离子聚合物选自：羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和PEG 35,000。甚至更优选地，非离子聚合物是PEG35,000。
非离子聚合物充当白蛋白纳米粒的涂层，其赋予更大的稳定性，并且通常允许提高待负载在纳米粒中的单克隆抗体的量。已经表明涂层的存在不会显著影响纳米粒的物理特性。仅取决于涂层的性质，尺寸和ζ电位可略微提高或降低。
在一个特定的实施方案中，非离子聚合物/白蛋白比为0.02至5(w/w)，更优选0.05至2(w/w)。
在另一个特定和任选的实施方案中，本发明中使用的纳米粒还包含用于在干燥纳米粒或通过常规方法(例如通过喷雾干燥)干燥包含纳米粒的混悬液的过程期间保护白蛋白基质的化合物，以下被称为“保护剂”。所述保护剂不形成纳米粒的固体基质的一部分，而是充当填充剂以有效方式促进纳米粒的干燥，从而维持其结构。实际上，任何符合那些特性的化合物都可用作保护剂。在一个具体的实施方案中，所述保护剂是糖类。
可在本发明范围内使用的保护剂的非限制性说明性实例包括：乳糖、甘露糖醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、山梨糖醇等，以及具有益生元特性的物质，例如如低聚果糖、果胶、菊粉、低聚糖(例如低聚半乳糖、人乳低聚糖)、乳果糖、膳食纤维等，及其任意组合。在一个具体的实施方案中，保护剂选自：乳糖、甘露糖醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、山梨糖醇、及其组合。优选地，保护剂是蔗糖。如果用于本发明的纳米粒包含保护剂，则按重量比计的白蛋白基质和保护剂可在宽范围内变化；然而，在一个特定的实施方案中，白蛋白:保护剂按重量比计为1:0.1至5，通常1:0.5至4，优选约1:1。
在一些实施方案中，本发明中使用的纳米粒包含至少一种显像剂，其允许通过使得在治疗递送之前、期间或之后对颗粒位置进行成像来对治疗剂进行图像引导的靶向递送。多种显像剂适合于与纳米粒的表面偶联，其包括但不限于：荧光显像剂(例如吲哚菁绿、菁5、菁7、菁9、荧光素和绿色荧光蛋白)、放射性核素标记的显像剂(例如包含碘124、99mTc的试剂)和磁共振显像剂(例如钆造影剂)。
本发明中使用的纳米粒可以以可控过程递送单克隆抗体。这样的控制可允许在延长的时间段内递送单克隆抗体。例如，考虑递送可在1至30天的时期内发生。除了适于以可控的方式递送治疗剂之外，纳米粒还可适于提供用于在递送治疗剂之前、期间和之后对颗粒进行检测和成像的多种选择。
用于本发明的纳米粒可任选地包含第二单克隆抗体或治疗剂，以为了还提供组合治疗。
所述治疗剂包括例如其他蛋白质(例如降钙素、胰岛素或环孢霉素A)。
第二单克隆抗体可以是以上本文中提到的那些抗体中的任何一种，例如贝伐单抗
Figure GDA0003732665210000141
兰尼单抗/>
Figure GDA0003732665210000142
曲妥珠单抗/>
Figure GDA0003732665210000143
西妥昔单抗
Figure GDA0003732665210000144
或利妥昔单抗/>
Figure GDA0003732665210000145
用于制备纳米粒的方法
用于本发明的纳米粒可通过在纯化和干燥之前在水性环境中沉淀蛋白质(白蛋白和单克隆抗体)来制备。
该过程包括：
a)制备白蛋白与单克隆抗体的水溶液；
b)将步骤a)的水溶液滴定至pH为4至5；
c)向步骤b)的水溶液添加去溶剂(desolvating agent)。
该方法基于去溶剂化过程，其中在恒定的搅拌、温度和pH条件下，通过缓慢添加(例如滴加)去溶剂(通常为有机溶剂，例如乙醇、丙酮或THF)使白蛋白与单克隆抗体的水溶液缓慢地去溶剂化。
在一个特定的实施方案中，用于制备步骤a)的水溶液的白蛋白是人血清白蛋白或牛血清白蛋白，更优选地是人血清白蛋白。
在另一个特定的实施方案中，用于制备步骤a)的水溶液的单克隆抗体选自贝伐单抗
Figure GDA0003732665210000146
兰尼单抗/>
Figure GDA0003732665210000147
曲妥珠单抗/>
Figure GDA0003732665210000148
西妥昔单抗
Figure GDA0003732665210000149
或利妥昔单抗/>
Figure GDA00037326652100001410
更优选地，单克隆抗体是贝伐单抗或兰尼单抗，甚至更优选地是贝伐单抗。
白蛋白和单克隆抗体的溶液可通过本领域技术人员已知的常规方法(例如通过将白蛋白和单克隆抗体添加至水溶液)来制备。
白蛋白和单克隆抗体优选在室温下(即在18℃至25℃，优选20℃至22℃的温度下)混合。
可添加至水溶液的白蛋白的量可在宽范围内变化，然而，在一个特定的实施方案中，添加至所述水溶液的量为0.1％和10％(w/v)，优选0.5％至5％(w/v)，甚至更优选1％至2％(w/v)。
同样，可添加至水溶液的单克隆抗体的量可在宽范围内变化，然而，在一个特定的实施方案中，添加至所述水溶液的量为0.005％至1％(w/v),优选0.01％至0.5％(w/v)，甚至更优选0.01％至0.4％(w/v)。
在一个特定的实施方案中，将白蛋白和单克隆抗体添加至水溶液，使得单克隆抗体:白蛋白重量比为0.01至0.5，更优选为0.01至0.2。
在一个优选的实施方案中，通过例如搅拌使白蛋白与单克隆抗体的水溶液进行均质化。
用于制备纳米粒的方法的步骤b)涉及将包含白蛋白和单克隆抗体的水溶液的pH降低至微酸性pH。这允许纳米粒在该方法的随后步骤中沉淀。这可通过向进行步骤a)之后获得的水溶液添加酸组分，例如HCl 1M来实现。
在一个特定的实施方案中，将水溶液在室温下孵育至少10分钟。
在用于制备纳米粒的方法的步骤c)中，将去溶剂添加至进行步骤b)之后获得的水溶液。
在一个优选的实施方案中，在搅拌下将去溶剂添加至进行步骤b)之后获得的水溶液。
在另一个优选的实施方案中，所述去溶剂是选自乙醇和四氢呋喃(tetrahydrofuran，THF)的有机溶剂，更优选地是乙醇。
在搅拌下将去溶剂缓慢添加至水溶液。更优选地，在搅拌所得混合物的同时，将去溶剂滴加至白蛋白与单克隆抗体的水溶液。
在一个优选的实施方案中，所述添加在惰性气氛下，例如在氮气气氛下进行。
在上述条件下，即在室温和搅拌下，向白蛋白与单克隆抗体的水溶液添加去溶剂之后，自发形成本发明的纳米粒。在一个具体的实施方案中，所述纳米粒混悬在其中已经获得所述纳米粒的介质中。
因此，本发明的方法允许通过简单的去溶剂化过程形成均匀分散的纳米粒，从而导致具有基质型结构的固体纳米球，其中单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中。
因此，通过该方法获得的纳米粒可被认为是自组装纳米粒，其是在添加去溶剂后通过单克隆抗体与白蛋白之间的局部相互作用而自发形成的。
用于产生纳米粒的方法可包括例如通过过滤技术、离心或超速离心纯化的另外的步骤。
同样，所述方法可包括干燥形成的纳米粒以为了获得粉末形式的本发明纳米粒的另外的步骤。所述纳米粒的这种呈递形式有助于其稳定性，并且进一步对其最终应用于药物产品特别有用。
在一个优选的实施方案中，将在进行步骤c)之后或已经纯化之后获得的纳米粒通过常规方法(例如真空干燥或有利地通过喷雾干燥或通过冷冻干燥(freeze-drying)(冻干(lyophilization)))进行干燥处理以干燥纳米粒。
在一个特定的实施方案中，该干燥处理，特别是当其通过喷雾干燥或通过冻干进行时，包括一旦形成纳米粒就向其添加保护剂。该保护剂(例如如糖类)在纳米粒干燥过程期间保护所述纳米粒。
可在本发明范围内用作保护剂的糖类的非限制性说明性实例包括：乳糖、甘露糖醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、山梨糖醇等，以及具有益生元特性的多糖，例如如低聚果糖、果胶、菊粉、低聚糖(例如低聚半乳糖、人乳低聚糖)、乳果糖、膳食纤维等，及其混合物。在一个具体的实施方案中，保护剂选自：乳糖、甘露糖醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、山梨糖醇、及其组合。如果纳米粒包含保护剂，则将其以合适的量添加；即使按重量比计的纳米粒的基质和保护剂可在宽范围内变化，在一个特定的实施方案中，白蛋白:保护剂按重量比计为1:0.1至5，通常1:0.5至4，优选约1:1。
纳米粒也可通过喷雾干燥来干燥。为此，将包含纳米粒和保护剂的混悬液引入喷雾干燥器中，并控制处理条件[进气温度、出气温度、气压、样品泵送速率、吸力和气流]。本领域技术人员可设置最适合每种情况的处理条件。
该方法允许获得干粉形式的纳米粒，这有助于其在受控或环境条件下在长期储存期间的稳定性，并且还可将其容易地并入不同的预期固体和液体产品中。
由于纳米粒是在添加保护剂之前形成的，因此这不会形成与白蛋白基质的任何缀合物或复合物。
在另一个特定的实施方案中，当待用于本发明的纳米粒涂覆有非离子聚合物时，可通过孵育已经按照如上所限定的方法的步骤a)至c)形成的白蛋白-单克隆纳米粒与非离子聚合物来获得所述经涂覆的纳米粒。
在一个特定的实施方案中，非离子聚合物可以是上述那些中的任何一种。优选地，所述非离子聚合物选自：羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、淀粉、葡聚糖70、
Figure GDA0003732665210000161
NM、/>
Figure GDA0003732665210000162
NE、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇(PEG)。更优选地，非离子聚合物选自：羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和PEG 35,000。
在一个特定的实施方案中，非离子聚合物/白蛋白比为0.02至5，更优选0.05至2。
在另一个特定的实施方案中，纳米粒在非离子聚合物中的孵育在少于1小时期间进行，更优选在少于45分钟期间进行。
药物组合物
上述纳米粒具有包载单克隆抗体并在加工和储存期间以及直至其最终递送至感兴趣的生物位点对其进行保护的能力。因此，阻止或大大降低了并入不同预期产物(例如药物组合物或化妆品组合物)之后单克隆抗体的失活。实际上，实验测试已经指出，单克隆抗体在白蛋白基质中维持其完整性。
此外，如在角膜新生血管形成动物模型中获得的生物活性数据所指出的，本发明的纳米粒允许持续释放单克隆抗体，该单克隆抗体还可在其整体上维持生物活性，从而构成了对体内应用非常感兴趣的药物递送系统。实际上，进行的体内实验已经表明，当与施用相同的游离形式的单克隆抗体相比，白蛋白与单克隆抗体的纳米粒提供了受角膜血管形成影响的眼表面中的显著降低。
此外，用本发明的纳米粒进行的生物分布测定指出其能够聚集在肿瘤组织中，因此使其成为用于将单克隆抗体释放到那些受影响的癌组织中的非常有前途的纳米粒系统。
因此，在另一个方面中，本发明涉及药物组合物，其包含多种如上所限定的混悬液形式或干粉形式的纳米粒，以及可药用赋形剂、载体或载剂。
纳米粒的特性已经在以上进行限定，并通过引用并入本文。
在一个特定的实施方案中，本发明的药物组合物中包含的纳米粒为干粉形式。
虽然可在本发明的范围内使用施用药物组合物的任何合适的手段，但优选将药物组合物经口、表面或肠胃外施用于人或动物，更优选通过静脉内施用、动脉内施用、肺内施用、眼内施用、肌内施用、经皮或皮下施用、经口施用或吸入。
更优选地，药物组合物包含适合于经口、表面或肠胃外施用的载剂或载体。
基于特定的施用方式，可将药物组合物配制成片剂、丸剂、胶囊剂、小袋剂(sachet)、颗粒剂、散剂、混悬剂、乳剂、无水或含水的表面制剂和溶液剂。
可药用载体或载剂是本领域技术人员众所公知的，并且容易为公众所用。优选地，可药用载体或载剂是对活性制剂及其每种组分具有化学惰性的载体或载剂，以及在使用条件下不具有有害副作用或毒性的载体或载剂。
在一些实施方案中，药物组合物适合作为递送系统，用于将治疗剂经口、表面、肠胃外或静脉内运输到对象的循环系统中。
适合于经口施用的制剂包括溶解在稀释剂(例如水或盐水)中的液体溶液剂，例如有效量的纳米粒或包含其的组合物；胶囊剂、小袋剂、片剂、锭剂，其每个均包含预定量的纳米粒；散剂；适当液体中的混悬剂；和乳剂。
表面制剂包括水性眼用溶液剂或混悬剂、眼用软膏剂、眼植入剂或任何其他能够将纳米粒供应到眼外表面的制剂。优选地，表面制剂是以液滴施加的包含纳米粒的眼用溶液剂或混悬剂。以上提到的制剂中的任何一种都可包含合适的溶剂、防腐剂和其他眼制剂中常见的可药用赋形剂。
肠胃外制剂通常将在溶液中包含0.5重量％至25重量％的纳米粒。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量密封的容器(例如安瓿和小瓶)中，并且可储存在仅需要在使用之前立即添加无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下。
待治疗的疾病
如上所提到的，白蛋白与单克隆抗体的纳米粒已经表明是用于治疗眼疾病和癌症的非常有前途的药物递送系统。
因此，本发明的另一个方面涉及用于治疗眼疾病的如上所限定的纳米粒或组合物。
在该方面的一个特定的实施方案中，纳米粒包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯未涂覆有任何聚合物。更特别地，所述固体芯未涂覆有非离子聚合物。
在该方面的另一个特定的实施方案中，纳米粒包含固体芯，所述固体芯由非交联白蛋白基质和单克隆抗体组成，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯未涂覆有任何聚合物。更特别地，所述固体芯未涂覆有非离子聚合物。
在该方面的另一个特定的实施方案中，纳米粒由固体芯组成，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯未涂覆有任何聚合物。更特别地，所述固体芯未涂覆有非离子聚合物。
在该方面的另一个特定的实施方案中，纳米粒由固体芯组成，所述固体芯由非交联白蛋白基质和单克隆抗体组成，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯未涂覆有任何聚合物。更特别地，所述固体芯未涂覆有非离子聚合物。
在另一个方面中，本发明还涉及用于治疗眼疾病的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的对象施用纳米粒或包含如上所述的纳米粒的组合物。
在另一个方面中，本发明还涉及纳米粒或包含如上所述的纳米粒的组合物用于制备用于治疗眼疾病的药物的用途。
所述组合物可经口、表面或通过眼内注射施用于对象。在一个优选的实施方案中，组合物是表面施用的，例如如通过进入眼黏膜的途径或通过玻璃体内注射。
因此，在一个优选的实施方案中，当施用纳米粒用于治疗眼疾病时，所述纳米粒以表面或可注射的药物组合物(例如以上本文中所述的那些)施用。
在另一个特定的实施方案中，待治疗的眼疾病选自：黄斑变性、角膜新生血管形成或血管生成、虹膜新生血管形成或血管生成、视网膜新生血管形成或血管生成、糖尿病增殖性视网膜病、非糖尿病增殖性视网膜病、青光眼、感染性结膜炎、变应性结膜炎、溃疡性角膜炎、非溃疡性角膜炎、巩膜外层炎、巩膜炎、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎、眼内炎、感染性病症和炎性病症。
本发明的另一个方面涉及用于治疗癌症的如上所限定的纳米粒或组合物。
在该方面的一个特定的实施方案中，纳米粒包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物。
在该方面的另一个特定的实施方案中，纳米粒包含固体芯，所述固体芯由非交联白蛋白基质和单克隆抗体组成，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物。
在该方面的另一个特定的实施方案中，纳米粒由固体芯组成，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物。
在该方面的另一个特定的实施方案中，纳米粒由固体芯组成，所述固体芯由非交联白蛋白基质和单克隆抗体组成，并且其中所述单克隆抗体分布在整个白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物。
在另一个方面中，本发明还涉及用于治疗癌症的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的对象施用纳米粒或包含如上所述的纳米粒的组合物。
在另一个方面中，本发明还涉及纳米粒或包含如上所述的纳米粒的组合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
在一个优选的实施方案中，所述组合物例如通过静脉内、动脉内、肌内或皮下施用来肠胃外施用于个体。
因此，在一个优选的实施方案中，当施用纳米粒用于治疗癌症时，所述纳米粒以肠胃外制剂(例如以上本文中所述的那些)施用。
在另一个特定的实施方案中，待治疗的癌症包括但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。待通过施用纳米粒治疗的癌症的实例包括例如：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、前列腺癌、黑素瘤、结肠癌、结直肠癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、肾癌和胃癌、膀胱癌或鳞状细胞癌
在一些实施方案中，可将用于本发明的纳米粒或包含其的组合物与第二治疗化合物和/或第二治疗一起施用，以用于治疗眼疾病或癌症。
在治疗过程中，可调整组合物和第二化合物或第二治疗的给药频率。在一些实施方案中，第一治疗和第二治疗同时、顺序或并行施用。当单独施用时，纳米粒组合物和第二化合物可以以不同的给药频率或间隔施用。
替代地，用于本发明的纳米粒可包含第二单克隆抗体或治疗剂，以为了还提供组合治疗。
所述治疗剂包括例如其他蛋白质(例如降钙素、胰岛素或环孢霉素A)。
第二单克隆抗体可以是以上本文中提到的那些抗体中的任一种，例如贝伐单抗
Figure GDA0003732665210000211
兰尼单抗/>
Figure GDA0003732665210000212
曲妥珠单抗/>
Figure GDA0003732665210000213
西妥昔单抗
Figure GDA0003732665210000214
或利妥昔单抗/>
Figure GDA0003732665210000215
实施例
在以下提供的实施例中，使用以下缩略语：
BEVA：贝伐单抗
B-NP：负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒
HSA：人血清白蛋白
PM：物理混合物
NP-Glu：与戊二醛交联的白蛋白纳米粒
B-NP-GLU：与戊二醛交联的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒
NP-PEG35：涂覆有聚乙二醇35,000的白蛋白纳米粒
B-NP-PEG35：涂覆有聚乙二醇35,000的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒
B-NP-HPMC-P：涂覆有羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒
B-NP-S100：涂覆有Eudagrit S-100的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒
材料
获自Sigma(西班牙，马德里)的人血清白蛋白或HSA(级分V，纯度96％至99％)、聚乙二醇35,000(PEG35)和戊二醛(GLU)25％水溶液。
贝伐单抗
Figure GDA0003732665210000216
购自Roche(西班牙)。羟丙基甲基纤维素K100LV(HPMC；MW164,000)来自Ashland Chemical Hispania(西班牙)。/>
Figure GDA0003732665210000217
提供为用于在单个使用小瓶中输注的溶液的浓缩物，其包含标称量为4mL中100mg的贝伐单抗或16ml中400mg的贝伐单抗(浓度为25mg/mL)。羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMC-P)购自Acros Organic(西班牙)。Micro BCA蛋白测定试剂盒购自Pierce(Thermo Fisher Scientific Inc.(美国，伊利诺斯州)。用于检测贝伐单抗的Shikari Q-beva酶免疫测定购自Matriks Biotech(土耳其)。丙酮购自Prolabo,VWR International Ltd(英国)并且氯化锡二水合物以及无水乙醇购自Panreac Pharma(西班牙)。异氟酮来自Braun，并且安乐死T-69Intervet来自Schering-Plough Animal Health。锝-99m高锝酸盐洗脱液获自/>
Figure GDA0003732665210000221
99Mo-99mTc发生器购自General Electric。
对于物理化学研究，使用了以下设备：Thermo/Nicolet 360FT-IR(E.S.P.ThermoFisher Scientific，美国)、衍射仪Bruker Axs D8 Advance(德国)、用于热重分析(thermogravimetric analysis，TG)和差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)的Mettler Toledo dsc822e和Mettler Toledo TSO 801RO Sample Robot与JulaboFT900冷却器一起使用，用于元素分析的元素分析仪(Elemental Analyzer)来自LECO CHN-900(美国，密歇根州)。
用于放射性标记和生物分布研究，使用了以下设备：Symbia SPECT/CT,SiemensMedical Systems，德国；Activimeter AtomLab 500,Biodex，美国；Gamma counter,LKBPharmacia。
纳米粒的物理化学表征(尺寸、ζ电位和形态)
在Zeta Plus仪器(Brookhaven Inst.Corp.，美国)中确定纳米粒的颗粒尺寸和ζ电位。在超纯水(1/10)中分散之后确定纳米粒的直径，并通过90℃的动态光散射角在25℃下进行测量。如下确定ζ电位：将200μL的样品稀释在2mL的调整至pH 7.4的1mM KCl溶液中。
在Zeiss DSM940数字扫描电子显微镜(Oberkochen，德国)中通过扫描电子显微术(scanning electron microscopy，SEM)研究了纳米粒的形态特征。为了该目的，将样品分散在水中，并在4℃下以27,000×g离心20分钟，以消除冷冻保护剂。然后，将颗粒装在玻璃板上，所述玻璃板用双面胶带黏附在金属桩上并对其进行干燥。使用配备有MTM-20厚度控制器的具有旋转行星倾斜台的Cressington溅射涂层机208HR，将其涂覆有4nm的钯-铂层。使用在1至3kV之间操作的LEO 1530仪器(LEO Electron Microscopy Inc，纽约，桑伍德)以约0.5mA的灯丝电流进行SEM。
产率
通过Micro BCA对形成纳米粒的HAS进行量化，从而确定了转化为纳米粒的HSA的量(产率)。简而言之，称量10mg的纳米粒并分散在10mL的超纯水中，并在4℃下以15,000rpm离心15分钟(Rotor 3336,Biofuge Heraeus,Hanau，德国)。然后，将颗粒用1mL的0.02NNaOH破碎，并将200μL的该溶液转移至96孔微板，并在分光光度计中在562nm处按照特定的micro-BCA蛋白测定试剂盒进行。
通过使用包含其他赋形剂和药物(戊二醛、PEG 35,000、HPMC或贝伐单抗)的对照来确定试剂盒的选择性，以为了检测白蛋白确定中任何可能的干扰。使用以下方程进行数据分析：
产率(％)＝(Wlyop/Winitial)×100 [方程1]
其中Wlyop是转化为纳米粒的HSA，Winitial是用于制备纳米粒的HSA量。
纳米粒中药物有效负载的量化
通过酶免疫测定(Shikari Q-BEVA)评估了白蛋白纳米粒中负载的抗体量。为了该目的，称量10mg的纳米粒并分散在1mL水中。将混悬液以10,000rpm离心10分钟(Rotor3336，Biofuge Heraeus，Hanau，德国)。去除上清液。然后将纳米粒用1ml的0.02N NaOH破碎。将200μL的所得溶液转移至涂覆有人血管内皮生长因子(VEGF)的96孔微板，然后进行贝伐单抗的特异性ELISA(Q-Beva测试程序，Shikari Q-Beva，Matriks Biotek)。
每个样品一式三份进行测定，并使用0.1至100μg/mL的标准曲线进行计算(r2>0.993)。检出限和定量限分别为0.1μg/mL和100μg/mL(r2>0.993)。
根据以下方程计算贝伐单抗负载量(loading，DL)及其包封效率(encapsulationefficiency，EE)：
DL＝[Wencap/Wnp] [方程2]
EE＝[Wencap/Wtotal]×100 [方程3]
其中，Wencap是包封的贝伐单抗的量，Wtotal是所用药物的总量，Wnp是纳米粒的重量。
FT-IR确定
通过FTIR谱研究了HSA纳米粒的分子结构。在NICOLET FTIR谱仪(Thermo/Nicolet360FT-IR E.S.P.Thermo Fisher Scientific，美国)中记录在KBr圆盘中以1％的样品分散的样品的红外谱。从4000至400cm-1扫描样品。记录条件如下：分辨率为8.0，样品扫描为40。使用OMNIC软件(Thermo Fisher Scientific，美国)分析数据。
X射线研究
进行X射线研究以为了研究不同纳米粒样品中聚合物基体的结晶平面分布和结晶度变异性。为了该目的，将样品以粉末形式放置在衍射仪(Bruker Axs D8 Advance，德国)中的金属板上-并在室温下进行360次以上的测量。使用程序Diffrac.Suite分析衍射图。
热分析
通过热分析((热重分析(thermogravimetric analysis，TGA)与差热分析(differential thermal analysis，DTA)耦合)研究了不同纳米粒对温度变化的响应。分析了当HAS的官能团反应以形成纳米粒时HAS官能团的热行为的变化。用同时存在的TGA/sDTA851e Mettler Toledo热分析仪进行热研究。通过以10℃/分钟的扫描速率从25至250℃在穿孔的铝坩埚中加热约5至10mg的样品来获得热分析图。在静态空气气氛下以及将N2(20mLmin-1)作为吹扫气体的情况下进行热分析。一式三份进行测量。
元素分析
进行纳米粒的元素分析(C、H、O和N)，以为了确定来自LECO CHN-900(美国密歇根州)的HSA纳米粒元素分析仪中不同稳定剂的缔合。简而言之，将1mg的每个样品一式三份进行测试，并且结果表示为百分比(％w/w)SD±0.4。该技术显示当与其他组分(戊二醛、PEG35、HPMC-P或贝伐单抗)缔合时，白蛋白(HSA)的氧、氢或氮组成中的变化。
体外释放研究
在PBS(pH 7.4)中进行负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒的体外释放研究。将包含10mg的每种纳米粒制剂的Eppendorf管分散在总体积为1mL的PBS中，将其分配在eppendorf管中，并放置于37℃下的振荡浴中，以60次/分钟的恒定速度搅拌(Unitronic 320OR，Selecta，西班牙，马德里)。在不同的时间间隔时，取eppendorf管，并以10,000rpm离心10分钟(Rotor3336，Biofuge Heraeus，Hanau，德国)。用特异性ELISA测试(Shikari Q-Beva，Matriks Biotek)分析上清液的贝伐单抗含量。释放曲线以累积释放百分比表示，并与时间绘图。
此外，根据释放曲线，通过Korsmeyer-Peppas方程指数模型(方程4)研究动力学：
Q＝Ktn [方程4]
其中，Q是在时间t时释放的药物百分比，并且K是并入研究下的设备的结构和几何特征的常数，并且“n”是扩散指数，其通常用作剂型中药物运输机制的指标。
n≤0.43的值指示药物释放受Fickian扩散控制，而n≥0.85的值表明药物释放受侵蚀机制支配。对于0.43<n<0.85的值，释放被描述为异常，这意味着扩散和侵蚀的组合有助于控制药物释放[Gao Y.,et al.,In Vitro Release Kinetics of AntituberculosisDrugs from Nanoparticles Assessed Using a Modified DissolutionApparatus.Biomed Research International2013]。
实施例1.负载贝伐单抗的人血清白蛋白纳米粒的制备。贝伐单抗/HSA比对所得纳米粒理化特性的影响
负载贝伐单抗的纳米粒通过这样的过程制备，其中在纯化和干燥之前，通过在水环境中沉淀蛋白质来获得纳米粒。
为了该目的，将100mg HSA和可变量的贝伐单抗(BEVA)(1至20mg)溶解在5至10mL的注射用水中，并且然后用1M HCL将溶液滴定至pH 4.1至4.4。将混合物在室温下孵育10分钟。通过在室温下连续搅拌(500rpm)下连续添加16mL用作去溶剂的乙醇来获得纳米粒。通过两种不同的方法纯化所得的纳米粒：超速离心和超滤。在前者中，通过在4℃下以21,000×g离心20分钟(Sigma 3K30，Osterodeam Harz，德国)将纳米粒纯化两次，然后将颗粒重新分散在原始体积的水中。在后者中，通过经由50kDa孔尺寸的聚砜膜滤筒(Medica SPA，意大利)的超滤纯化纳米粒。最后，将纳米粒重新分散或添加5％的蔗糖水溶液之后，在Genesis12EL设备(Virtis，美国，纽约)中冷冻干燥。这些制剂是负载贝伐单抗的人血清白蛋白纳米粒，其没有任何进一步的稳定作用，以下被称为B-NP制剂。
为了将单克隆抗体包封在纳米粒中，确定了两个关键参数：贝伐单抗/白蛋白比以及两种化合物在纳米粒形成之前的孵育时间。表1总结了通过改变单克隆抗体/蛋白质比所得的纳米粒的主要理化特性。当贝伐单抗/白蛋白比低(例如0.01)时，纳米粒随时间不稳定。对于大于0.01的比，所得纳米粒是稳定的，平均尺寸接近300nm，并且负表面电荷为约-15mV。
同样，该方法的产率经计算为约80％。图1显示了贝伐单抗/白蛋白比对单克隆抗体负载量的影响。
根据这些结果，纳米粒中负载的贝伐单抗的量随BEVA/HSA比的提高而提高。所有这些实验都是在单克隆抗体和蛋白质之间孵育10分钟之后进行的。有趣的是，通过提高该参数在纳米粒的理化特性上没有观察到显著差异。
表1.贝伐单抗/白蛋白比对所得纳米粒理化特性的影响。贝伐单抗和白蛋白之间的孵育时间：10分钟。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
Figure GDA0003732665210000261
实施例2.负载贝伐单抗的纳米粒与茂二醛的交联对其理化特性的影响
由于在不存在贝伐单抗的情况下人血清白蛋白纳米粒不稳定并在形成之后即消失的事实，因此与乙醇(300μl)中的12.5μg戊二醛交联之后，获得了对照负载贝伐单抗的纳米粒(以下被称为B-NP-GLU制剂)。为了该目的，将刚形成的负载贝伐单抗的纳米粒与戊二醛孵育5分钟，然后纯化和冻干。
表2总结了“裸”HSA纳米粒(没有任何进一步的稳定过程)以及与戊二醛交联之后获得的对照HSA纳米粒的主要理化特性。贝伐单抗在白蛋白纳米粒中的包封产生了具有高抗体含量的稳定的纳米粒。有趣的是，以纳米粒中负载的活性单克隆抗体计算的包封效率接近90％，贝伐单抗负载量为约13％。当负载贝伐单抗的纳米粒与戊二醛交联时，所得纳米粒略微小于那些在没有化学交联剂的情况下产生的纳米粒。然而，用戊二醛处理的纳米粒使单克隆抗体失活，并且通过ELISA分析对非常低水平的抗体进行量化。
表2.未经处理的白蛋白纳米粒和戊二醛交联白蛋白纳米粒的理化特性。在纳米粒形成之前，以0.15的贝伐单抗/白蛋白比并孵育10分钟来制备纳米粒。数据表示为平均值+/-SD(n＝3)。PDI：多分散性指数；BEVA：贝伐单抗；EE：包封效率；NP：纳米粒；GLU：戊二醛。
Figure GDA0003732665210000271
实施例3：负载贝伐单抗的纳米粒的表征
TEM
图2显示了负载贝伐单抗的纳米粒(B-NP)的形态，其具有球形形状和不规则表面。
FT-IR确定
IR允许评价蛋白质二级结构中构象变化的出现。图3显示了与单独的单克隆抗体和蛋白质及其物理混合物的FT-IR谱相比，负载贝伐单抗的纳米粒的FT-IR谱。
蛋白质的红外谱显示出许多酰胺带，其代表肽部分的不同振动。这样的信号，1600至1700cm-1的酰胺I带(主要为C＝O拉伸)和1550cm-1处的酰胺II带(CN拉伸与NH弯曲模式耦合)为已被用作存在该化学结合的证据，并且其与蛋白质的二级结构直接有关。然而，酰胺I带对蛋白质二级结构的变化比酰胺II更敏感。以这种方式，这些信号的频率和强度中的变化是与蛋白质相互作用的证据。
在这种情况下，并且由于这样的事实，纳米粒由两种不同的蛋白质(白蛋白和贝伐单抗)形成，因此观察到与酰胺I峰相对应的信号频率的微小变化(HSA为1642，并且B-NP为1645cm-1)。
作为对照，还研究了与戊二醛交联的纳米粒。在这种情况下，由于戊二醛与白蛋白之间的相互作用，也发现了酰胺I频率的轻微位移(1642至1645cm-1)。
X射线研究
图4显示了人血清白蛋白、贝伐单抗和负载贝伐单抗的纳米粒的X射线谱。在所有情况下，这些谱均显示出非晶态结构。
热分析
进行热分析，以确定HSA和贝伐单抗的官能团之间的反应。图5显示了天然白蛋白(HSA)和贝伐单抗(BEVA)(A)、贝伐单抗纳米粒(B-NP)以及白蛋白和贝伐单抗的物理混合物(P.M.)(B)、天然白蛋白(HSA)和戊二醛(GLU)(C)、戊二醛交联纳米粒(NP-GLU)以及白蛋白和戊二醛的物理混合物(P.M.)(D)的热分析图。
热分析图显示，天然白蛋白在30℃附近呈现放热效应，其相当于可逆的转变，和由于约下的吸热玻璃化转变产生的第二热效应。
在NPs中不存在对应于白蛋白的放热信号可归因于白蛋白与蛋白质(BEVA)和交联剂(戊二醛)二者的组合。因此，贝伐单抗和白蛋白将形成复合物。
元素分析
表3显示了人血清白蛋白、贝伐单抗、与戊二醛交联的白蛋白纳米粒和负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒的元素分析。贝伐单抗展示出比人血清白蛋白显著更低的碳和氮含量。相反，单克隆抗体中的氧含量比白蛋白中的氧含量高约2倍。以类似的方式，负载贝伐单抗的纳米粒(B-NP)与天然白蛋白相比呈现出较低百分比的氮和较高含量的氧。
表3.人血清白蛋白(HSA)、贝伐单抗(BEVA)、与戊二醛交联的白蛋白纳米粒(NP-GLU)和负载贝伐单抗的纳米粒(B-NP)的元素分析。
％C ％H ％N ％O
HSA 48.34 6.96 17.80 26.91
BEVA 36.70 6.64 4.25 52.41
NP-GLU 48.09 6.87 15.19 29.85
B-NP 48.77 6.86 14.90 29.48
实施例4：负载贝伐单抗的纳米粒的稳定性
在超纯水中评价了纳米粒的稳定性。将样品分散在纯化水中，并在室温下储存3天。在不同的时间间隔时，通过测量纳米粒的尺寸、多分散性指数和ζ电位来评估稳定性。
分散在水(pH调整至7.4)中之后，将负载贝伐单抗的纳米粒稳定至少24小时(图6)。其行为与观察到的与戊二醛交联的空纳米粒的行为类似(图6)。以类似的方式，在实验期间B-NP的多分散性指数(polydispersity index，PDI)不受影响。因此，在t＝0时，PDI为0.19±0.01，并且在24小时之后，该参数计算为0.16±0.03(数据未显示)。
实施例5：贝伐单抗从纳米粒的体外释放
图7显示了在PBS中贝伐单抗从白蛋白纳米粒的体外释放曲线。该曲线的特征在于在前5分钟期间初始爆发效应为负载抗体的约23％，随后在之后的24小时期间缓慢控制释放。实验结束时，释放了约40％的负载贝伐单抗。爆发释放可能与吸附在纳米粒表面上的抗体有关。
实施例6.负载贝伐单抗的经涂覆的 白蛋白纳米粒的制备和表征。
贝伐单抗在用不同化合物装饰的人血清白蛋白纳米粒中的包封是通过涉及四个步骤的过程制备的。特别是，选择非离子HPMC-P和PEG35来探索其装饰负载贝伐单抗的纳米粒的能力。还使用了离子涂层Eudragit S-100。
第一步致力于在水环境中产生纳米粒。然后通过在水环境中简单孵育来装饰纳米粒的表面。第三步骤用于纯化最终干燥的所得纳米粒。
第一步。将100mg HSA和可变量的贝伐单抗(1至20mg)溶解在5至10mL的注射用水中，并且然后用1M HCl将溶液滴定至pH 4.1至4.4。恒温10分钟。将混合物在室温下孵育10分钟。通过在室温下在连续搅拌(500rpm)下连续添加16mL用作去溶剂的乙醇来获得纳米粒。
第二步。对于刚形成的负载贝伐单抗纳米粒的涂层，添加了以下化合物之一：PEG35,000、羟甲基丙基纤维素邻苯二甲酸酯或Eudragit S-100。
作为对照，如上所述，通过与乙醇(300μL)中12.5μg戊二醛交联5分钟来稳定负载贝伐单抗的纳米粒。
第三步。纯化所得纳米粒。使用了两种不同的过程：超速离心和超滤。在前者中，通过在4℃下以21,000×g离心20分钟(Sigma 3K30，Osterodeam Harz，德国)将纳米粒纯化两次，然后将颗粒重新分散在原始体积的水中。在后者中，通过经由50kDa孔尺寸的聚砜膜滤筒(Medica SPA，意大利)的超滤纯化纳米粒。
第四步。最后，将纳米粒在Genesis 12EL设备(Virtis，美国，纽约)中冻干。当使用超速离心作为纯化方法时，将来自最后一次离心的颗粒分散在5％蔗糖水溶液中。当使用超滤时，在冷冻干燥之前，也将颗粒重新分散在5％蔗糖水溶液中。
表4总结了这些纳米粒的主要理化特性。总体而言，负载贝伐单抗的量总是相似的并接近14％。然而，将负载贝伐单抗的纳米粒与不同的赋形剂一起孵育用于涂覆目的，产生了具有改良的理化特性的纳米粒。因此，包封贝伐单抗的经PEG35涂覆的纳米粒(B-NP-PEG35)展示出与负载裸贝伐单抗的纳米粒(B-NP)类似的平均尺寸和负ζ电位。相反，当将B-NP与HPMC-P孵育时，所得纳米粒的平均尺寸与B-NP相比显著提高。当用离子
Figure GDA0003732665210000301
S-100进行孵育时，所得纳米粒与B-NP相比展示出降低的尺寸和提高的负ζ电位。通过SEM，白蛋白纳米粒展示出球形形状和光滑的表面。
表4.包封在经涂覆的白蛋白纳米粒中的贝伐单抗的理化特性。数据表示为平均值±SD(n＝3)。PDI：多分散性指数。涂层剂：S-100(离子
Figure GDA0003732665210000302
S100)、HPMC-P(羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)、PEG35(聚乙二醇35,0000)。CA/蛋白质比：涂层剂/白蛋白比。B-NP-GLU：与戊二醛交联的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒。B-NP：负载贝伐单抗至“裸”白蛋白纳米粒中。
Figure GDA0003732665210000311
涂覆有PEG35的负载贝伐单抗的纳米粒(B-NP-PEG35)的形态研究(图8)显示，其是球形的，具有不规则的表面和均匀的分散。
实施例7：贝伐单抗从经涂覆的纳米粒的体外释放
图9显示了在pH 7.4的PBS中贝伐单抗从涂覆有两种非离子聚合物(PEG35和HPMC-P)以及具有离子
Figure GDA0003732665210000312
E100的白蛋白纳米粒的体外释放曲线。对于经PEG35涂覆的纳米粒(B-NP-PEG35)，其曲线与观察到的裸纳米粒(B-NP)的曲线类似，不同之处在于，在实验结束时，释放的贝伐单抗的量高于B-NP。在任何情况下，这些聚乙二醇化的纳米粒提供了双相释放模式，其特征在于在前5分钟中初始爆发效应为约22％，随后在至少24小时期间具有更持续和缓慢的释放速率。爆发释放接近22％，并且可能与吸附在纳米粒表面上的抗体有关。使用Korsmeyer-Peppas方程将双相部分，忽略爆发释放的前5分钟，调整为扩散曲线(n＝0.54；R2＝0.994)。在扩散阶段期间，贝伐单抗的释放高至48％以在前两小时之后达到平台。
同样，对于涂覆有HPMC-P的纳米粒(B-NP-HPMC-P)，在前60分钟期间释放的贝伐单抗的量为约40％。然后，观察到剩余抗体的连续释放速率。然而，在这种情况下，贝伐单抗的释放速率比B-NP或B-NP-PEG35的释放速率更快。因此，孵育8小时之后，从涂覆有HPMC-P的纳米粒中释放出接近100％的贝伐单抗含量。
与涂覆有非离子聚合物的纳米粒相反，涂覆有离子
Figure GDA0003732665210000313
S-100(B-NP-S-100)的纳米粒显示出立即释放特征。
实施例8.在将贝伐单抗包封在白蛋白纳米粒中之后贝伐单抗的完整性
为了证实用于量化在白蛋白纳米粒中负载的贝伐单抗的量的ELISA试剂盒获得的结果，通过使用ExperionTM自动电泳系统的基于微流控的自动电泳(Bio Rad，美国)分析了包封在不同纳米粒中的抗体(贝伐单抗)的完整性。使用2-巯基乙醇在非还原条件和还原条件中对样品进行评价。使用软件Experion System处理获得的数据。
称量纳米粒并将其用1mL0.005N NaOH破碎。不同溶液的浓度为约400ng蛋白/μL(测试的线性动态范围为5至2,000ng/μL)。使用游离蛋白(白蛋白和贝伐单抗)样品作为对照。所有这些样品均以获得的或在用β-巯基乙醇和加热处理之后进行评价。然后，按照Experion System Pro260分析试剂盒(Bio-Rad实验室，美国)的方案处理样品。一旦将样品和对照加载到芯片中，通过ExperionTM自动电泳系统(Bio Rad，美国)对其进行分析。
结果获得为在虚拟凝胶中的光密度带。每个带对应于不同的样品。Experion软件识别出不同尺寸的峰，并将其在系统控制带中以千道尔顿(“kDa”)表示。
研究结果示于图10中。在泳道5中，贝伐单抗在150kDa左右显示为强带。在泳道2(B-NP)和3(B-NP-PEG35)中观察到类似的带。类似地，与白蛋白(泳道4)相对应的带也清楚地显示在泳道1至3中。
实施例9.在Wistar大鼠中眼施用的纳米粒的生物分布研究
在Wistar大鼠中进行NP放射性标记和生物分布研究以进行体内SPECT-CT成像
按照其他地方描述的方法，通过用氯化锡还原99mTc-高锝酸盐，用99mTc对纳米粒进行放射性标记。简而言之，将20μl注射用水中的氯化锡二水合物溶液并且最终锡浓度为0.02mg/ml添加至9mg的冷冻干燥的纳米粒，然后将60μL的99mTcO4-洗脱液添加至预先还原的锡。将4μL的经放射性标记的纳米粒混悬液(5MBq)与0.6mg的未标记的纳米粒制剂混合，并在经异氟烷麻醉的Wistar大鼠的右眼上小心地施用这样的混合物。
对Wistar大鼠进行眼施用以进行体内SPECT-CT成像
将动物麻醉一小时，以避免主动从眼去除混悬液，然后在施用纳米粒之后5至17小时30分钟之间的六个不同时间点唤醒并获得SPECT-CT图像。
对于成像研究动物，在临到用异氟烷进行每次研究之前进行麻醉，并以俯卧位放置在Symbia T2 Truepoint SPECT-CT系统(Siemens)中。使用128×128矩阵获得图像，7幅图像/秒；CT设置为110mA和130Kv，130幅3毫米厚的图像。使用Syngo MI ApplicationsTrueD软件完成图像融合。使用内置软件系统对图像进行处理和量化。通过在选定区域的三个平面上自动绘制等高线以获得感兴趣的体积(Volumes of Interest，VOI)，从中获取计数的平均值，从而获得定量值。
图11和图12显示了以滴眼剂眼施用之后，B-NP和B-NP-PEG35的生物分布。在B-NP的情况下，与纳米粒相关的放射性在眼中保留至少4小时，并且在B-NP-PEG35的情况下，则保留8小时，尽管其会从施用点缓慢消失并进入胃肠道。在图11的最左上方图像中可看到经放射性标记的纳米粒通过动物咽部的运输。图11中SPECT图像的强度已重新调节为每个单独图像中的最高强度点，以能够更好地欣赏动物体内放射性的位置。
B-NP的放射性半定量衰变校正的时间过程演变绘制于图12中。B-NP-PEG35的结果非常类似，然而，由于所述纳米粒保留更多的时间进入眼，因此其需要更长的时间才能排泄
实施例10.向雄性Wistar大鼠静脉内施用之后纳米粒的生物分布
对于在Wistar大鼠中进行的体内生物分布成像实验，施用99mTc标记的负载贝伐单抗的HSA纳米粒(B-NP)和涂覆有PEG35的负载贝伐单抗的HSA纳米粒(B-NP-PEG35)。静脉内施用单剂量5mg的贝伐单抗/kg体重，并在施用之后两小时至至多十小时拍照。
静脉内施用之后一小时，在肝和肾中观察到与注射B-NP和B-NP-PEG35相关的放射性，如可在图13中看到的。另外，值得注意的是，B-NP-PEG35的肝摄取较少。B-NP和B-NP-PEG35不会在任何器官中积累。
实施例11.负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒对角膜新生血管形成的影响
从Harlan获得了约200g的雄性Wistar大鼠，以为了测试负载贝伐单抗的纳米粒在大鼠角膜新生血管形成模型中的效力。研究由机构动物实验伦理委员会(协议编号172-14)根据欧洲动物实验立法批准。
腹膜内施用100μl的5mg/kg xylacine溶液(Xilagesic，Caler Laboratory)和200μl的40mg/kg氯胺酮溶液(IMALGENE，Merial)之后，使动物维持镇静状态。然后，向大鼠的每只眼施用一滴睫状肌麻痹剂洗眼剂(Coliricusi Tropicamida，10mg/ml，Alcon)。5分钟之后，通过将硝酸银棒(Argepenal，Braun)施加在眼表面上5秒钟来烧伤大鼠角膜。最后，用0.9％p/v的NaCl无菌溶液洗涤眼。
12小时之后，将动物用异氟烷麻醉(西班牙，Isovet)并分成不同的组。将以下治疗以滴眼剂施加在动物眼中：(i)在7天期间每12小时施用10μl的4mg/ml贝伐单抗
Figure GDA0003732665210000341
水溶液，(ii)在7天期间每12小时施用10μl的4mg/ml aflibercept
Figure GDA0003732665210000342
水溶液，(iii)在7天期间每12小时施用10μl的0.1％的磷酸地塞米松(Coliriculi/>
Figure GDA0003732665210000343
)水溶液(iv)一周期间每天施用负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP；10μl包含40μg贝伐单抗的混悬液)；以及(v)一周期间每天施用涂覆有PEG35的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP-PEG35；10μL包含40μg贝伐单抗的混悬液)。作为对照，一组动物接受生理血清(physiological serum，PBS)并且另一组动物接受溶解在PBS中的人血清白蛋白(HSA)，其量与用B-NP-PEG35施用的量类似。
图14对应于显示在0小时(第0天)发生的角膜烧灼和在24小时(第1天)的第一次治疗的示意图时间轴。
为了进行计算，使用ImageJ软件(公共域，http://rsb.info.nih.gov/ij/)拍摄并分析了角膜的数字图像。以二进制模式分析图像，将图像转换为黑白格式。从这些图像中，确定了角膜的总面积以及被用硝酸银烧伤所占据的角膜表面(病变)，并通过像素计数计算了受新血管生成(角膜新生血管形成)影响的面积。从这些参数，如下确定侵袭面积(invasive area，IA)和CNV(由病变表面归一化的角膜新生血管形成，cornealneovascularization normalized by the lesion surface)：
IA＝[(受新血管形成影响的区域)/(角膜总面积)]×100
CNV＝IA/(受烧伤影响的眼表面)
表5总结了不同的贝伐单抗治疗的效力，这是由于由通过病变诱导的新生血管形成影响的眼表面降低(图15)。在所有情况下，在动物眼中诱导的病变类似，并且在四组之间的病变区域上未发现统计学差异(p>0.05；图16)。
用贝伐单抗(BEVA)溶液治疗的动物组比接受PBS的动物(阴性对照)显示出更低的受新生血管形成影响的眼表面。在另一个方面，在用负载贝伐单抗的纳米粒(B-NP)治疗的动物中，发现受角膜新生血管形成影响的眼表面比用
Figure GDA0003732665210000344
(BEVA)治疗的动物低2.7倍(图17和18)。当用负载贝伐单抗的在聚乙二醇化的纳米粒中治疗动物时，受新生血管形成影响的表面中的降低比用/>
Figure GDA0003732665210000345
治疗的动物低约1.4倍。重要的是要强调，用纳米粒治疗的动物接受了比向用/>
Figure GDA0003732665210000352
治疗的动物施用的贝伐单抗少50％的贝伐单抗。另一个重要的观察是，在我们的实验条件下，地塞米松和/>
Figure GDA0003732665210000353
均未显示出对新生血管形成的积极作用(表5，图15)。
表5.贝伐单抗制剂对由用硝酸银棒烧伤诱导的角膜新生血管形成的影响。BEVA：贝伐单抗溶液(
Figure GDA0003732665210000354
4mg/mL，7天期间每天两个剂量)；B-NP：负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(4mg/mL，7天期间每天一个剂量)；B-NP-PEG35：涂覆有PEG35的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(4mg/mL，7天期间每天一个剂量)；HSA：人血清白蛋白溶液；地塞米松：7天期间每天两次0.1％溶液；Eylea：Aflibercept溶液(/>
Figure GDA0003732665210000355
4mg/mL，7天期间每天两个剂量)；对照：PBS。IA：侵袭面积。CNV：由病变表面归一化的角膜新生血管形成。数据表示为n＝9的平均值+/-SD。
Figure GDA0003732665210000351
b p<0.05ANOVA，随后进行Tukey检验，与对照(-)显著不同
c p<0.01ANOVA，随后进行Tukey检验，与对照(-)显著不同
d p<0.005ANOVA，随后进行Tukey检验，与对照(-)显著不同
e p<0.001ANOVA，随后进行Tukey检验，与对照(-)显著不同
组织学
为了对具有角膜新生血管形成的眼进行组织学研究，在治疗结束时，将每组的两只眼摘除。用盐水洗涤眼表并将前极与后极分开。将角膜平装，用4％多聚甲醛固定24小时，并且然后用PBS对每个样品进行数次洗涤。将角膜保存在70％甲醇中以进行后切和分析。
为了分析角膜，将其包含在石蜡中，并从角膜中心和新生血管形成区域切成4微米的切片。然后将其用苏木精-伊红染色并使用光学显微镜进行分析。切片的评价包含新生血管形成的强度；炎症、纤维化、水肿的强度和角膜的平均厚度。研究由对治疗组不知情的检查员进行。图像是用配备有数字照相机Nikon DS-Ri 1的Nikon Eclipse Ci显微镜拍摄的。使用校准的数字图像Nikon的NIS元素分析系统分析图像。
为了评价新生血管形成的强度，使用了以下评分：0＝不存在新生血管形成；1＝极小或接近负血管形成；2＝轻度血管形成；3＝上皮下和前间质区域的有限或局灶性血管形成(中度新生血管形成)；4＝非常频繁或强烈；5＝弥漫性和强烈的血管生成。以类似的方式，对炎症的强度评分如下：0＝不存在炎症；1＝极小或接近阴性炎症；2＝局灶性、少量的混合炎性细胞类型(例如淋巴细胞、中性粒细胞白细胞和嗜酸性粒细胞白细胞)；3＝中度炎症；4＝非常频繁或强烈；5＝强烈的、弥散性、混合的炎性细胞类型。成纤维细胞活性的标度系统为：0＝不存在成纤维细胞活性；1＝极小或接近阴性成纤维细胞活性；2＝局灶性成纤维细胞活性；3＝中度成纤维细胞活性；4＝非常频繁；5＝弥漫性和强烈的成纤维细胞活性。最后，用以下评分对水肿进行分类：0＝不存在水肿；1＝极低或接近阴性水肿；2＝轻度水肿；3＝中度水肿；4＝非常频繁或强烈；5＝弥漫性和强烈的水肿。
图19显示了参与研究的动物眼的组织学研究。用B-NP(图19B)和B-NP-PEG35(图19C)治疗的角膜上的病变处于恢复阶段，并且尽管之前其暂时影响视力，但现在不是。因此，损害是可逆的。相反，用生理血清治疗的角膜上的病变非常严重，其影响视力，并且似乎是不可逆的(图19F)。
表6.从动物眼获得的样品的组织病理学评价。对照-：用生理血清治疗的动物；BEVA：用
Figure GDA0003732665210000361
治疗的动物；B-NP：用负载贝伐单抗的纳米粒治疗的动物；B-NP-PEG35：用负载贝伐单抗的聚乙二醇化的纳米粒治疗的动物。
样品 纤维化 炎症 平均厚度(μm) 血管形成 水肿
对照 4 4 774.7 4 3
BEVA 1 4 570.5 2 1
B-NP 1 2 287.7 1 0
B-NP-PEG35 1 2 430.9 4 1
表6总结了不同组中的组织病理学评价。用血清治疗的角膜显示出比用贝伐单抗治疗的角膜高1.4倍的厚度以及比用B-NP治疗的角膜高2.7倍的厚度。在另一个方面，用
Figure GDA0003732665210000371
(BEVA)治疗的角膜呈现出比用B-NP治疗的角膜高2倍的厚度以及大于用B-NP-PEG35治疗的角膜1.3倍的厚度。以类似的方式，用B-NP治疗的角膜展示出最好的症状，即纤维化程度低、血管形成低并且不存在水肿。
实施例12.向荷瘤裸鼠静脉内施用之后纳米粒的生物分布
为了在小鼠中进行肿瘤成像实验，在标准条件下培养人肝癌细胞(HepG2)，平板接种之后一周收获，并混悬在PBS中。在两个不同位置(右肢和背部上部)皮下注射5×105HepG2细胞之后，在裸鼠中诱导肿瘤。跟踪肿瘤生长12至15天，直到清晰可见，并且然后在静脉内注射涂覆有PEG35的99mTc标记的HSA纳米粒(NP-PEG35)之后，将动物用于SPECT-CT体内成像实验。i.v.施用之后一至4小时，对动物实施安乐死，并切除来自对侧腿(无肿瘤)的肿瘤和一部分肌肉。在校准为99mTc的伽玛计数器中对样品进行计数、校正样品重量和衰变以及使用来自对侧腿的肌肉作为背景计算的肿瘤/非肿瘤比。
在荷瘤小鼠中，与静脉内注射NP-PEG35相关的放射活性聚集在肿瘤中(如果与正常组织相比)，如可在图20中看到的。这样的现象似乎是时间依赖性的，因为在施用纳米粒之后4小时，存在于肿瘤中的量降低，尽管其已经保持高值(肿瘤/非肿瘤比＞6)。
实施例13.负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒对小鼠结直肠癌模型的影响
研究由机构动物实验伦理委员会(协议编号107-16)根据欧洲动物实验立法批准。对于实验，从Harlan Sprague Dawley,Inc购买了约20克和3周龄的42只雄性athimic裸鼠。根据机构指南，将小鼠保持在受控环境中。随意提供食物和水。
在标准条件下培养人结肠癌细胞(HT-29)，平板接种之后一周收获并混悬在PBS中。对于肿瘤诱导，通过吸入异氟烷麻醉小鼠，并在每只动物的右侧胁中皮下注射100uL包含2×106至3×106的HT-29肿瘤细胞(贝伐单抗敏感的人结肠癌细胞系)。跟踪肿瘤生长12至15天，直到清晰可见(直径0.4至0.6cm)，并且然后开始治疗。
将小鼠随机分为6组，每组7只动物：(i)贝伐单抗(Avastin)水溶液，(ii)负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP)，(iii)涂覆有PEG35,000的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒(B-NP-PEG35)，(iv)生理血清(PBS)，(v)涂覆有PEG35,000的空纳米粒(NP-PEG35)，其量与用B-NP-PEG35施用的量类似，以及(vi)HSA水溶液，其包含与接受B-NP的组类似的量的白蛋白。在所有情况下，两次/周静脉内施用150至200μl包含5mg贝伐单抗/kg体重的制剂。对照组在相同时间点接受0.9％盐水的静脉注射。
在第一次施用之后第0天(第一次施用之前)、第15天、第22天和第26天采集血液样品。通过特异性酶免疫测定(Shikari Q-Beva)测量贝伐单抗血清浓度。
1至2次/周记录肿瘤体积和重量。用卡尺在两个尺寸(宽度(W)和长度(L))上测量肿瘤(V)，并使用以下方程(方程5)进行计算：V(mm3)＝长度×(宽度)2×0.5[方程5]
图21显示了肿瘤体积与时间的关系。每个组中生长具有相同体积的肿瘤，并且在实验开始时六个组之间的肿瘤体积没有发现统计学差异(p>0.05)。
在第12天，接受B-NP-PEG35的组显示肿瘤体积显著低于其余组(p<0.05)。到第14天，接受BEVA和B-NP-PEG35的组呈现出肿瘤体积显著低于其余组(p<0.05)。在第22天，未接受任何治疗的组显示比用负载贝伐单抗的纳米粒(B-NP)、贝伐单抗(BEVA)和用负载贝伐单抗的聚乙二醇化的纳米粒(B-NP-PEG35)治疗的动物更高的肿瘤体积。值得一提的是，到实验结束时，未接受贝伐单抗治疗的组中的一半动物在肿瘤中形成溃疡。
图22显示了血清中的贝伐单抗水平。在以下天数采集样品：第一次施用之后第0天(施用之前)、第15天、第22天和第26天。值得注意的是，在第22天(相当于每周施用的第二天)血清贝伐单抗水平提高。可在图22中看出，接受游离药物的那些小鼠中贝伐单抗的血清水平比接受纳米粒(B-NP和B-NP-PEG35)的小鼠高高至6倍。
施用包封在纳米粒中的贝伐单抗的益处在于降低了贝伐单抗的血清水平。静脉内施用游离贝伐单抗之后，血液中药物浓度高，其可能引起副作用。该浓度缓慢降低至达到平台。但是，在施用新剂量之后，血液中贝伐单抗浓度提高(参见图22)，从而提高了副作用的可能性。
在另一个方面，静脉内施用贝伐单抗纳米粒之后，药物的血清水平缓慢提高至达到平台。该浓度比用游离贝伐单抗获得的浓度低六倍，其保持恒定。此外，每次施用新剂量，血液中贝伐单抗的峰浓度要低得多。这降低了副作用的可能性。
此外，聚乙二醇为纳米粒的表面赋予了空间屏障，防止了调理作用，这是i.v.注射之后几小时内损失注射剂量(injected dose，ID)的主要机制。
Pet成像
在实验结束时，选择3个用贝伐单抗和负载贝伐单抗的聚乙二醇化的纳米粒进行治疗以及用生理血清治疗的小鼠进行18F-FDG-PET成像。为此，将小鼠禁食过夜，但允许随意喝水。次日，将小鼠用100％O2气体中的2％异氟烷麻醉，并在18F-FDG PET期间保持静止。扫描之前四十分钟，通过尾静脉注射18F-FDG(80至100μL中的10MBq±2)。在专用的小动物Philips Mosaic断层成像(Cleveland,OH)中进行PET成像，分辨率为2mm，轴向视野(fieldof view，FOV)为11.9cm并且经轴FOV为12.8cm。将麻醉的小鼠水平放置在PET扫描仪床上以进行15分钟的静态采集(正弦图)。使用3D Ramla算法(真实的3D重建)将图像经过2次迭代重建，并将0.024的松弛参数转换为128×128矩阵(体素尺寸为1mm)，其应用死时间、衰变、随机和散射校正。为了评估肿瘤18F-FDG摄取，所有研究均使用PMOD软件(PMODTechnologies Ltd.，瑞士，阿德利斯维尔)进行输出和分析。在包含整个肿瘤的连续切片上，在冠状1mm厚的小动物PET图像上绘制感兴趣区域(Regions of interest，ROI)。最后，使用以下公式计算每个肿瘤的最大归一化摄取值(standardized uptake value，SUV)：SUV＝[组织活性浓度(Bq/cm3)/注射剂量(Bq)]×体重(g)
表7总结了不同组中的PET成像结果。关于SUVmax(最大肿瘤摄取，maximum tumoruptake)，最低值对应于用B-NP-PEG35治疗的组，而最高值对应于接受生理血清的组。
就体积而言，最低值属于用B-NP-PEG35和HAS治疗的组。然而，选择HSA组的动物不具有代表性，因为其是唯一不出现溃疡的动物。最高值再次属于未接受任何治疗的组(生理血清)。B-NP-PEG35组呈现出比生理血清组小3倍的体积并且比BEVA组小1.5倍的体积。
最后，TLG(总病变糖酵解)显示，用B-NP-PEG35治疗的组的最小值，其比用BEVA治疗的组低1.5倍，并且比接受生理血清的组低高至3.5倍。
表7.PET成像结果。P.S.：用生理血清治疗的动物；B-NP-PEG35：用负载贝伐单抗的聚乙二醇化的纳米粒治疗的动物；BEVA：用
Figure GDA0003732665210000401
治疗的动物。
SUVmax 体积 TLG
P.S. 1,35 0,91 0,77
B-NP-PEG35 0,97 0,33 0,22
BEVA 1,15 0,48 0,34
实施例14.负载兰尼单抗的人血清白蛋白纳米粒的制备
按照与实施例1中描述的负载贝伐单抗的白蛋白纳米粒相同的过程制备负载兰尼单抗的HSA纳米粒。
对于负载兰尼单抗的纳米粒，最佳抗体/白蛋白比为0.15。兰尼单抗纳米粒展示约210nm的颗粒尺寸，PDI低于0.3并且ζ电位为-15mV。

Claims (15)

1.纳米粒用于制备用于治疗眼疾病之药物的用途，其中所述纳米粒包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个所述白蛋白基质中；其中当所述固体芯被涂覆时，其涂覆有非离子聚合物，并且其中所述单克隆抗体为贝伐单抗，并且所述非离子聚合物选自羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和聚乙二醇35,000，其中所述贝伐单抗/白蛋白重量比为0.01至0.5。
2.纳米粒用于制备用于治疗癌症之药物的用途，其中所述纳米粒包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个所述白蛋白基质中；其中当所述固体芯被涂覆时，其涂覆有非离子聚合物，并且其中所述单克隆抗体为贝伐单抗，并且所述非离子聚合物选自羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和聚乙二醇35,000，其中所述贝伐单抗/白蛋白重量比为0.01至0.5。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述非离子聚合物/白蛋白比为0.02至5 w/w。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述白蛋白是人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述纳米粒能够通过以下方法获得，所述方法包括：
a）制备白蛋白与所述单克隆抗体的水溶液；
b）将步骤a）的水溶液滴定至pH为4至5；
c）向步骤b）的水溶液添加去溶剂化剂以形成白蛋白-单克隆抗体纳米粒；
d）任选地，将步骤c）中形成的所述白蛋白-单克隆抗体纳米粒与所述非离子聚合物一起孵育；以及任选地
e）通过真空干燥、喷雾干燥或通过冷冻干燥来干燥所述纳米粒。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述眼疾病选自：黄斑变性、角膜新生血管形成或血管生成、虹膜新生血管形成或血管生成、视网膜新生血管形成或血管生成、糖尿病增生性视网膜病变、非糖尿病增生性视网膜病变、青光眼、感染性结膜炎、变应性结膜炎、溃疡性角膜炎、非溃疡性角膜炎、巩膜外层炎、巩膜炎、糖尿病视网膜病变和葡萄膜炎。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述眼疾病是眼内炎。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述眼疾病是感染性病症。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述眼疾病是炎性病症。
10.根据权利要求2所述的用途，其中癌症是乳腺癌、肺癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、黑素瘤、结肠癌、结直肠癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、膀胱癌或鳞状细胞癌。
11.纳米粒，其包含固体芯，所述固体芯包含非交联白蛋白基质和单克隆抗体，并且其中所述单克隆抗体分布在整个所述白蛋白基质中，所述固体芯涂覆有非离子聚合物，并且其中所述单克隆抗体为贝伐单抗，并且所述非离子聚合物选自羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和聚乙二醇35,000，其中所述贝伐单抗/白蛋白重量比为0.01至0.5。
12.药物组合物，其包含：
-多个纳米粒，所述纳米粒包含含有非交联白蛋白基质和单克隆抗体的固体芯，并且其中所述单克隆抗体分布在整个所述白蛋白基质中；和
-可药用赋形剂、载体或载剂；
其中当所述固体芯被涂覆时，其涂覆有非离子聚合物，并且其中所述单克隆抗体为贝伐单抗，并且所述非离子聚合物选自羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和聚乙二醇35,000，其中所述贝伐单抗/白蛋白重量比为0.01至0.5。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述纳米粒为干粉形式。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述可药用赋形剂、载体或载剂适合于经口或肠胃外施用。
15.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述可药用赋形剂、载体或载剂适合于表面施用。
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