KR102640250B1 - 암 및 안 질환의 치료를 위한 알부민 나노입자들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코어를 포함하며 상기 코어는 비-가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하며, 약제로서 사용하기 위해 비이온성 중합체로 임의로 코팅되는 것을 특징으로 하는 나노입자, 상기 나노 입자를 포함하는 약학 조성물 및 암 및 안 질환 치료에 사용되는 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

암 및 안 질환의 치료를 위한 알부민 나노입자들
본 발명은 나노 크기의 약물 전달 시스템, 보다 구체적으로 암 및 안 질환의 치료에 사용되는 알부민 매트릭스 및 단일 클론 항체를 함유하는 나노 입자에 관한 것이다.
단일 클론 항체는 암, 자가 면역 및 만성 염증성 질환 및 이식 거부의 치료와 같은 다른 치료 영역에서 사용되는 흥미로운 당 단백질 그룹으로 등장했다. 현재 규제 기관 (FDA & EMEA)에서 승인된 대략 30 개의 단일 클론 항체가 있다.
이들 단일 클론 항체 중 하나는 VEGF-A (혈관 내피 성장 인자)를 표적으로 하고 VEGF의 주요 이소형 중 4개를 포함하는 면역글로불린 G (IgG) 인 베바시주 맙(Bevacizumab)이다. 전이성 결장 직장암의 1차 치료에 대하여 2004년 FDA에 의해 승인되었으며, 이후 비-소세포 폐암(non-small-cell lung cancer) 또는 전이성 유방암과 같은 다른 암에 대해서도 승인되었다. 최근, 베바시주맙은 각막 또는 망막 신혈관 형성, 당뇨병성 망막병증 및 연령 관련 황반 변성을 비롯한 안과 질환의 치료에 사용되기 시작했다.
눈 표면에 국소 적용하는 것은 약물 투여를 위한 일반적인 경로이다. 그러나, 보호 메카니즘 (감퇴(slinking), 최루(lachrymation) 및 배수(drainage)은 제제를 신속하게 제거함으로써 약물의 생체 이용률을 감소시킨다. 지난 몇년 동안, 베바시주맙의 안내 주사(intravitreal injection)는 습윤 형태의 연령 관련 황반 변성, 증식성 당뇨병 망막 병증 및 맥락막 신혈관 형성에 매우 효과적인 치료 인 것으로 밝혀졌다. 단기 결과는 유리 체내 베바시주맙이 내약성이 우수하고 대부분의 환자에서 시력 개선, 망막 두께 감소 및 혈관 조영술 누출에서의 감소와 관련이 있음을 제안하였다.
그러나 시력의 개선을 달성하고 유지하기 위해서는 반복적인 주사 및 후속 방문이 필요하다. 이것은 내안구염(endophthalmitis) 뿐만 아니라 바늘을 눈에 삽입하는 것과 관련된 반복적인 통증, 불안 및 고통과 같은 합병증의 높은 위험성을 수반한다. 또한, 주사된 베바시주맙의 유리체내 반감기는 대략 3일이다.
암 치료의 경우, 현재의 치료 전략은 일반적으로 화학 요법을 위한 카테터를 적용하여 수술로 종양을 제거하기 전에 종양을 수축시키는 것을 포함하는 침입 과정(intrusive processes)을 포함한다. 암 치료의 효과를 개선하기 위한 연구 노력으로 환자 생존율이 상당히 개선되었지만, 환자의 독성 부작용 및 삶의 질 저하와 관련된 문제는 여전히 큰 문제이다.
따라서, 암 및 안 질환의 치료를 위하여 베바시주맙 뿐만 아니라 다른 단일클론 항체의 덜 침습적이고 오래 지속되는 전달을 위한 효과적인 약물 전달 방법이 개발될 필요가 있다.
이러한 의미에서, 나노 입자는 약물 투여에 적합한 비히클로서 등장하여 안과 분야 및 암 요법에서 유망한 결과를 얻었다. 이러한 나노 크기 전달 시스템을 제조하는데 사용될 수 있는 다양한 재료가 존재한다. 예를 들어, 단일클론 항체 베바시주맙은 노화 관련 황반 변성의 치료를 위한 PLGA의 나노 입자에 통합되었다.[Hao et al., American Association of Pharmaceutical Scientists (AASP) Annual Meeting and Exposition, Los Angeles, California, November 2009; Li, F. et al., The Open Ophthalmology Journal, 2012, 6, 54-58], as well as for retinal and choroidal neovascularization treatments [Pan CK et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther., 2011, 27(3), 219-224; Varshochian, R. et al., European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 50, 341-352].
그러나, 천연 바이오폴리머가 합성 물질보다 바람직하다. 이와 관련하여, 인간 혈청 알부민은 생체 적합성, 생분해성, 비 독성 및 비 면역원성이기 때문에 약물 전달을위한 나노 입자를 제조하는데 널리 사용되어 왔다. 알부민 나노 입자는 다양한 약물의 높은 결합능 및 심각한 부작용 없이 내약성이 우수하여 상당한 주목을 받았다.
지난 몇년 동안, 열 겔화, 유화 및 탈용매화 (코아세르베이션)를 포함하여 알부민 나노 입자의 제조를 위한 다양한 물리화학적 공정이 제안되어 왔다. 어쨌든, 탈용매화 기초의 절차는 단순성과 반복성으로 인해 가장 인기있는 것으로 보인다. 그러나, 방금 수득된 나노 입자는 불안정하고 수성 환경에서 반감기를 연장하거나/또는 단백질의 거대 응집체의 형성을 방지하기 위해 물리적, 화학적 또는 효소적 안정화의 보충 단계가 수행되어야 한다.
Lohcharoenkal, W. et al. [BioMed Research International, 2014]는 또한 알부민 나노 입자가 가교되지 않은 경우 별도의 상을 형성하기 위해 용해되거나 합체될 때의 알부민 나노입자의 불안정성을 언급한다. Llabot 등. [19th Microencapsulation, 2013 국제 심포지움]은 베바시주맙을 캡슐화하는 Gantrez와 가교 결합된 알부민 나노 입자뿐만 아니라 각막 혈관화에서의 사용을 기술한다.
일반적으로, 알부민의 가교는 알부민 나노 입자의 안정화를 위한 가장 보편적인 전략 중 하나이다. Elzoghby et al. [Journal of Controlled Release, 2012, 157, 168-182]는 알부민 나노입자를 제조하기 위한 다양한 방법과 활성 약물 전달 시스템으로서의 용도를 편집한다. 글루타르알데히드를 당업계에서 사용되는 일반적인 화학 가교제로 인용하면서, 수성 매질에서 나노 입자의 가교가 요구되는 불안정성에 대해 특히 언급된다.
따라서, 가교는 알부민 나노 입자를 안정화시키고 효소적 분해 뿐만 아니라 나노 입자로부터 활성 성분의 전달을 감소시킨다.
그러나, 글루타르알데히드는 나노 입자를 안정화시키는데 매우 효과적이지만, 그 사용은 주로 생체 내 전달을 위한 그의 사용을 방해하는 독성으로 인해 의문의 여지가 있다. 따라서, 가능한 한 완전히 가교제를 제거하는 것이 필수적이다. 또한, 글루 타르알데히드는 거대 분자(예를 들어, 1차 아민 잔기)에 존재하는 작용기와 반응하여 이들의 활성의 중요한 손실을 초래하기 때문에 나노 입자들에서 바이오 거대분자, 더욱 특별하게는 단백질 약물, 항체 및 펩티드의 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
이러한 중요한 결점을 해결하기 위해, 독성 시약을 사용할 필요없이 방금 형성된 알부민 나노 입자를 경화시키거나 안정화시키는 다른 전략이 제안되었다. 그 중에서도, 나노 입자의 안정화는 열 처리, 높은 유체 역학적 압력 또는 제니핀 또는 트랜스글루타미나아제와의 효소적 가교에 의해 수득될 수 있다.
알부민 나노 입자를 안정화시키기 위해 표면 코팅이 또한 사용되었다. 예를 들어, 폴리리신 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 중합체가 그들의 안정성을 향상시키기 위해 소 혈청 알부민 나노 입자를 코팅하는데 사용되었다 [Wang et al., Pharm. Res., 2008, 25 (12), 2896-2909].
WO2013/042125 는 베바시주맙을 포함하는 글루타르알데히드 가교된 소 혈청 알부민 나노 구의 제조 및 이온성 PLGA의 커버에서 상기 나노 구의 후속 캡슐화를 기술한다.
WO2011/053803 은 또한 안 질환을 치료하기 위한 치료제, 예컨대 베바시주 맙을 캡슐화하는 중합체 쉘을 갖는 나노 입자를 언급한다. 상기의 관점에서, 단일 클론 항체의 완전성 및 활성을 보존하고 나노 입자로부터의 방출을 제어하는 적절한 전달 시스템이 요구된다.
본 발명의 저자는 알부민 매트릭스에 베바시주맙과 같은 단일클론 항체의 포획이 수용액에서 높은 안정성을 갖는 나노 입자를 제공한다.
본 발명의 저자는 알부민 매트릭스에 베바시주맙과 같은 단일클론 항체의 포획이 수용액에서 높은 안정성을 갖는 나노 입자를 제공하고, 놀랍게도, 상기 나노 입자는 다른 수단에 의해 가교되거나 안정화될 필요가 없음을 발견하였으며, 이는 3D 구조의 유지 뿐만 아니라 일단 항체가 전달되면 항체의 생물학적 활성을 허용한다. 반대로, 아래의 실험 부분에 나타난 바와 같이, 글루타르알데히드(알부민의 나노 입자를 안정화시키기 위해 종래 기술에서 사용된 가장 일반적인 가교제)의 사용은 항체를 불활성화시켜, 이러한 종류의 활성 성분의 캡슐화를 위한 가교된 나노 입자의 사용을 불가능하게 한다.
저자들은 또한 Eudagrit® S-100 뿐만 아니라 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트 (HPMC-P) 및 폴리에틸렌글리콜 35,000 (PEG35) 뿐만 아니라 Eudagrit® S-100 와 같은 비이온성 폴리머로 장식된(decorated) 비-가교 나노 입자도 테스트했으며 상기 항체의 무결성 또한 유지된다는 것을 관찰하였다.
또한, 이하에 기술된 방법에 따라, 단일클론-로딩된 알부민 나노 입자들은 물 또는 수용액의 간단한 첨가에 의해 분산 및 재구성할 준비가된 건조 분말로서 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 나노 입자는 단일클론 항체의 지속 방출을 허용하고, 각막 신생 혈관화 동물 모델에서 수득된 생물학적 활성 데이터에 의해 지적된 바와 같이 생체 내 적용에 큰 관심을 갖는 약물 전달 시스템을 구성한다.
또한, 생체 분포 분석이 비이온성 중합체로 코팅된 알부민 나노 입자들로 수행되었고, 그들이 종양 조직에 농축될 수 있으며, 따라서 이들을 영향받은 조직 내로 단일 클론 항체를 방출시키기 위한 매우 유망한 나노 미립자 시스템으로 만든다고 지적한다.
실제로, 생체 내 실험은 본 발명의 나노 입자들이 수용액에서 동일한 단일클론 항체의 투여와 비교할 때 더 낮은 농도의 상기 항체가 혈청에 존재하기 때문에 종양 조직에서 단일클론 항체를 방출할 수 있음을 보여주었다. 또한, 종양의 부피가 현저히 감소하였다.
따라서, 본 발명의 제 1 측면은 의약에 사용하기 위한 나노 입자를 말하며, 여기서 상기 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하며, 여기서 상기 단일클론 항체는 상기 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비-이온성 중합체로 선택적으로 코팅된다.
본 발명의 제 2 측면은 하기를 포함하는 약학 조성물을 말한다:
- 복수의 나노 입자들, 상기 나노 입자들는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비-가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 여기서 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 선택적으로 코팅됨; 및
- 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 비히클.
다른 측면에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 본 발명의 상기 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 안 질환의 치료에 사용하기 위한 나노 입자로서, 상기 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비-가교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하며, 여기서 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 선택적으로 비-이온성 중합체로 코팅된다.
본 발명의 추가의 측면은 안 질환의 치료에 사용하기 위한 나노 입자로서, 상기 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비-가교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하며, 여기서 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 선택적으로 비-이온성 중합체로 코팅된다.
본 발명의 다른 측면은 암 치료에 사용하기 위한 나노 입자로서, 상기 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비-가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하며, 여기서 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되어 있으며, 상기 고체 코어는 선택적으로 비-이온성 중합체로 코팅된다.
마지막으로, 본 발명의 또 다른 측면은 고체 코어를 포함하는 나노 입자에 관한 것으로, 상기 고체 코어는 비-가교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 여기서 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비-이온성 중합체로 코팅된다.
본 발명은 알부민 매트릭스에 베바시주맙과 같은 단일클론 항체의 포획이 수용액에서 높은 안정성을 갖는 나노 입자를 제공할 수 있다.
도 1. 생성된 나노 입자들의 탑재량(payload)에 대한 베바시주맙/알부민 비율의 영향. 10 분 동안 단일클론 항체 및 단백질을 배양한 후에 나노 입자를 제조하였다. 데이터는 평균 ±SD로 표현되었다 (n=3).
도 2. 베바시주맙이 로딩된 알부민 나노 입자들(BNP)의 TEM 사진.
도 3. A) 인간 혈청 알부민(HSA), 글루타르알데히드(GLU), HSA와 글루타르 알데히드(HSA-GLU) 간의 물리적 혼합물 및 글루타르알데히드 (NP-GLU)와 가교된 나노 입자의 FT-IR 스펙트럼. B) 인간 혈청 알부민 (HSA), 베바시주맙 (BEVA), HSA와 베바시주맙 사이의 물리적 혼합물 (HSA-BEVA), 및 베바시주맙 로딩된 나노 입자 (B-NP)의 FT-IR 스펙트럼.
도 4. 베바시주맙(BEVA), 베바시주맙 로딩된 나노 입자들(B-NP) 및 인간 혈청 알부민 (HSA)의 X-선 스펙트럼.
도 5. A)천연 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 베바시주맙 (BEVA); B) 인간 혈청 알부민(HSA)과 베바시주맙(BEVA)과 베바시주맙 로딩된-알부민 나노 입자 (B-NP) 사이의 물리적 혼합물 (PM); C) 천연 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 글루타르알데히드 (GLU); D) 인간 혈청 알부민 (HSA)과 글루타르알데히드 (GLU)와 글루타르알데히드 (NP-GLU)와 가교된 알부민 나노 입자 사이의 물리적 혼합물 (PM).
도 6. pH 7.4에서 수용액에 분산시킨 후 글루타르알데히드 (NP-GLU) 및 베바시주맙-로딩된 나노 입자 (B-NP)와 가교된 빈 나노 입자의 평균 크기의 진화. 데이터는 평균 ±SD로 표현됨(n=3).
도 7. PBS (pH 7.4)에서 배양 후 인간 혈청 알부민 나노 입자로부터의 베바시주맙 방출 프로파일. 데이터는 평균 ±SD로 표현됨 (n=3).
도 8. PEG35 (B-NP-PEG35)로 페길화된(pegylated) 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자의 TEM 현미경 사진.
도 9. PBS (pH 7.4)( ··· ---) (베바시주맙-로딩된 NPs (B-NP)에서 배양한 후 알부민 나노 입자로부터의 베바시주맙 방출 프로파일; (-) PEG35 (B-NP-PEG35)로 코팅된 베바시주맙 로딩된 NPs; ( ··· ) Eudagrit® S-100 (B-NP-S-100)으로 코팅된 베바시주맙 로딩된 NPs; (---) HPMC-P (B-NP-HPMC-P)로 코팅된 베바시주맙이 로딩된 NPs. 데이터는 평균 ±SD로 표현됨(n = 3).
도 10. 나노입자의 미세유체-기반 자동 전기영동 (L: 래더; 1 : PEG35 (NP-PEG35)로 코팅된 빈 나노 입자; 2 : 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자 (B-NP); 3 : PEG35 (B-NP-PEG35)로 코팅된 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자 ; 4 : 인간 혈청 알부민 (HSA); 5 : 베바시주맙).
도 11. 위스터 쥐에 안구 투여 후 99mTc- 표지된 B-NP-PEG35 (아랫줄)와 비교 한 99mTc- 표지된 B-NP (윗줄)의 생체 내 SPECT-CT 이미지. 각 줄의 이미지들은 도면에 표시된 시점에서 연구한 동물과 동일하다. 안구 투여 후 4시간 내지 8시간 동안 활성이 사라지는 반면, B-NP-PEG35에서는 적어도 8시간 동안 눈에 남아 있다.
도 12. 99mTc-B-NP 나노 입자의 안구 투여 후 상이한 영역에서의 방사능 양의 진화에 대한 시간-활성 곡선. 관심대상의 부피(VOIs)는 그래프에 표시된 영역과 각 VOI에서 얻은 평균값 카운트에 대해 그려졌으며, 데이터는 붕괴(decay)에 대해 수정되고 표시되었다.
도 13. Wistar 쥐에 정맥 내 투여 후 99mTc- 표지된 B-NP-PEG35 (아랫줄)과 비교된 99mTc-labelled B-NP (윗줄)의 생체 내 SPECT-CT 이미지. 각 줄의 이미지는 상기 도면에 표시된 시점에서 연구한 동물과 동일하다.
도 14. 0 시간 (0 일)에 발생하는 각막 소작 및 24시간 (1일)에 첫 번째 처리를 나타내는 타임 라인의 개략도.
도 15. (A) 생리학적 혈청 [대조군 (-)]; (B) Avastin ®174; (4 mg / mL 베바시주맙); (C) 베바시주맙 (B-NP)이 로딩된 알부민 나노 입자들; (D) PEG 35,000 (B-NP-PEG35)으로 코팅된 베바시주맙이 로딩된 알부민 나노 입자; (E) : 인간 혈청 알부민 용액 (HSA); (F) : Eylea1® (EYLEA); (G) : 덱사메타손 (DEXA)으로 처리된 동물들의 각막의 사진.
도 16. 병변 면적은 화상에 의해 영향을 받은 각막 면적의 백분율로 표시된다. 다른 그룹의 병변들 사이에서 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았다. 데이터는 평균 ±SD (n=9)로 표시된다.
도 17. 혈관이 존재하는 각막 영역의 일부인, 침습 영역 (IA). 데이터는 평균± SD (n=9)로 나타낸다.
* p <0.01 ANOVA에 이어 대조군 (-)과 크게 다른 Tukey 테스트
** p<0.01 ANOVA 에 이어 BEVA 과 크게 다른 Tukey 테스트
*** p<0.005 ANOVA 에 이어 B-NP 과 크게 다른 Tukey 테스트
도 18. 병변에 의해 정상화된 혈관신생 영역. 데이터는 평균 ± SD (n=9)로 나타낸다.
* p<0.01 ANOVA 에 이어 대조군 (-)과 크게 다른 Tukey 테스트
** p<0.005 ANOVA 에 이어 BEVA 과 크게 다른 Tukey 테스트
도 19. 베바시주맙으로 처리된 정상 및 혈관 신생된(neovascularized) 각막의 각막 섹션의 현미경 사진. (e, 상피층; s, 기질; ac, 전방 챔버; v, 기질 미세 혈관).
A) 온전한 상피(e)를 나타내는 쥐 정상 각막의 현미경 사진, 사이에 편평화 된 각막 세포(keratocytes)를 갖는 규칙적인 평행 콜라겐 라멜라(lamellae)를 함유하는 기질; B) 베바시주맙 (B-NP)이 로딩된 알부민 나노 입자들로 처리된 군으로부터의 쥐 각막의 현미경 사진. 정상 한계 내의 각막의 두께, 온전한 상피 및 기질은 약간 무질서하게 침착되고 매우 신중한 침윤(infiltration)으로 느슨해진다. C) 베바시주맙으로 로딩되고 PEG35 (B-NP-PEG35)로 코팅 된 알부민 나노 입자로 처리된 군으로부터의 쥐 각막의 현미경 사진. 정상 상피, 수많은 간질(stromal) 미세 혈관들 (v). 정상 값 내의 각막 두께; D & E) : 베바시주맙으로 처리된 군으로부터의 쥐 각막의 현미경 사진. 상피는 보간질로부터 분리되어 보존되고 비대성임. 다수의 조직화되지 않은 섬유 모세포, 강렬한 세포 침윤 및 eodema에 의한 간질의 농축 (*); F) 생리 혈청으로 처리된 군으로부터의 쥐 각막의 현미경 사진. 각막 내부의 심각한 변화, 중앙 침식 및 두께 증가. 큰 무질서한 섬유 아세포, 중등도의 염증성 침윤 및 신 혈관 형성을 갖는 강렬한 섬유증(Intense fibrosis) (v). 비정상적인 복구 시도를 나타내는 상피 세포로부터 낭종 (c)의 형성. 스케일 바, 200 μm, H.E. X100.
도 20. PEG35 (NP-PEG35)로 코팅된 알부민 나노 입자로 처리된 동물에서 다리 및 목 종양에 대한 종양 대 비 종양 비율. 값은 방사성 표지된 나노 입자의 정맥 내 (i.v.) 투여 후 1시간 (청색 막대) 및 4시간 (적색 막대)에서 수득된 3개의 동물로부터의 평균값에 상응한다.
도 21. 종양 부피 (mm3). 데이터는 평균 ± SD (n≥ 6)로 표시된다.
* p <0.05 ANOVA에 이어 생리학적 혈청과 현저히 다른 Tukey 시험.
** p <0.01 ANOVA에 이어 생리학적 혈청과 현저하게 다른 Tukey 시험.
도 22. 베바시주맙 혈청 농도 (μg/mL) 대 시간 (일).
전술한 바와 같이, 본 발명의 제 1 측면은 의약에 사용하기 위한 나노 입자를 말하며, 여기서 상기 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비가교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고 여기서 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 선택적으로 코팅된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 나노 입자에 관한 것으로, 여기서 상기 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체로 이루어지고, 여기서 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 임의로 코팅된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 나노 입자에 관한 것으로, 여기서 상기 나노 입자는 고체 코어로 이루어지고, 상기 고체 코어는 비가교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 여기서 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 임의로 코팅된다.
다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 나노 입자에 관한 것으로, 여기서 상기 나노 입자는 고체 코어로 이루어지고, 상기 고체 코어는 비가 교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체로 이루어지고, 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 임의로 비이온성 중합체로 코팅된다.
본원에 사용된 용어 "나노 입자"는 구형 또는 준-구형 형상을 갖고 평균 크기가 1㎛ 미만인 콜로이드 시스템을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 나노 입자는 100 내지 900 nm, 더욱 바람직하게는 150 내지 800 nm, 더욱 더 바람직하게는 200 내지 500 nm, 훨씬 더 바람직하게는 200 내지 400 nm 범위의 평균 크기를 갖는다.
"평균 크기"는 수성 매질에서 함께 이동하는 나노 입자 집단의 평균 직경으로 이해된다. 이들 시스템의 평균 크기는 당업자에게 공지된 표준 방법에 의해 측정될 수 있으며, 예를 들어하기 하기 실험 부분에 기재되어 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 나노 입자는 나노스피어 또는 장식된(decorated)나노스피어를 의미한다.
"나노스피어 (nanosphere)"는 알부민의 고체 비가교된 매트릭스 또는 알부민의 연속 물질로 이해되며, 여기서 단일클론 항체는 상기 매트릭스 전체에 분포되며, 따라서 뚜렷한 코어/쉘 구조를 특징으로 하지 않는다.
"장식된 나노스피어"는 상기 정의된 바와 같은 나노스피어로 이해되어야 하며, 여기서 상기 알부민의 고체 비가교 매트릭스가 비이온성 중합체로 코팅되거나 장식된다.
따라서, 본 발명의 나노 입자는 비이온성 중합체가 아닌 임의의 다른 중합체성 코팅이 없다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 나노 입자는 상기 고체 코어가 코팅될 때 상기 나노입자는 비이온성 중합체가 아닌 임의의 다른 중합체 코팅이 없는 나노 입자이다. 본 발명의 나노 입자는 코팅 중합체를 필요로하지 않지만, 본 발명자들은 나노 입자가 비이온성 중합체가 아닌 임의의 다른 중합체성 코팅이 없을 때, 상기 입자는 이온성 코팅이 사용된 때 동일한 입자에 대해 유리한 효과를 나타내는 것을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명의 나노 입자가 이온성 중합체로 코팅된 때, 상기 입자는 항체의 매우 빠른 방출 프로파일 (burst release)을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 사용된 나노 입자가 비이온성 중합체로 코팅되지 않은 경우, 상기 나노 입자는 상기 정의에 따라 나노스피어로 간주되어야하는 반면, 본 발명에 사용된 나노 입자가 비이온성 중합체로 코팅된 경우 상기 나노 입자는 또한 상기 정의에 따라 장식된 나노스피어로 간주되어야 한다.
상기 알부민 매트릭스가 다른 수단에 의해 가교되거나 안정화되는 종래 기술에서 사용된 나노 입자와 대조적으로, 본 발명에 사용된 나노 입자는 알부민의 비가교된 매트릭스의 고체 코어를 갖는 것을 특징으로 하며, 알부민과 단일클론 항체 사이의 국소적 상호 작용에 기인하는 조직화된 구조 또는 패턴과 같이 이해된다. 따라서, 본 발명의 범위에서, 나노 입자는 고체 매트릭스 시스템을 형성하고 있다.
따라서, 용어 "고체 코어"는 고체 비가교된 매트릭스형 구조를 지칭하며, 여기서 상기 알부민은 단일클론 항체가 전체 매트릭스에 걸쳐 분포되고, 바람직하게는 균질하게 분포되는 연속 구조를 형성한다.
따라서, 본 발명에 사용된 나노 입자의 고체 코어는 외부 및 내부 구조가 분화되지 않았으며 따라서, 단일클론 항체는 알부민의 전체 매트릭스 내에 분포되고,보다 바람직하게는 균질하게 분포되지만, 그 중앙 공동(cavity) 내에 캡슐화되거나 국한(confined)되지는 않는다.
특정 구체 실시양태에서, 본 발명에 사용된 나노 입자는 상기 정의된 바와 같은 나노스피어이다. 보다 구체적으로, 상기 나노 입자에서 고체 코어는 비이온성 중합체로 코팅되지 않는다. 본 명세서 전반에 걸쳐 기술되고, 또한 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 나노 입자는 안정하며 어떠한 캡슐화를 요구하지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "안정한"은 입자의 안정성의 증가를 나타내며, 입자는 물질의 분해없이 입자가 의약에 사용될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 나노 입자는 임의의 코팅 중합체의 존재 또는 부재하에, 안정한 나노 입자이다.
다른 특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용된 나노 입자는 상기 정의된 바와 같은 장식된 나노스피어이며, 즉, 알부민의 고체 매트릭스 또는 알부민의 연속 물질의 고체 코어를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 상기 단일클론 항체는 상기 매트릭스 전체에 분포되며, 여기서 고체 코어는 비이 온성 중합체로 코팅된다.
실제로, 본 발명의 추가의 측면은 고체 코어를 포함하는 나노 입자에 관한 것으로, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 여기서 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 코팅된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 또한 고체 코어를 포함하는 나노 입자에 관한 것으로, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체로 구성되고, 여기서 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 코팅된다,
또한, 특히, 본 발명은 고체 코어로 이루어진 나노입자에 관한 것이며, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하며, 여기서 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 코팅된다.
더욱 더 구체적으로, 본 발명은 또한 고체 코어로 이루어진 나노 입자에 관한 것이며, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체로 이루어지고 여기서 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 폴리머로 코팅된다.
알부민
본원에 사용된 용어 "알부민"은 구형의 음으로 하전된 단백질 패밀리를 지칭하며, 가장 흔한 것은 혈청 알부민이다. 알부민 패밀리의 모든 단백질은 수용성이며, 농축된 염 용액에 적당히 용해되며, 열 변성을 경험한다. 알부민은 일반적으로 혈장에서 발견되며 당화(glycosylated)되지 않는다는 점에서 다른 혈액 단백질과 다르다.
알부민의 일반적인 구조는 상대적으로 정적인 모양을 유지할 수 있도록 몇 개의 긴 α 나선이 특징이며, 이는 혈압을 조절하는데 필수적이다.
특정 실시 양태에서, 상기 알부민은 혈청 알부민이다. 혈청 알부민은 간에서 생산되며 혈장에 용해되며, 포유류에서 가장 풍부한 단백질이다.
보다 바람직하게는, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 소 혈청 알부민 (BSA)이며, 더욱 더 바람직하게는 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민이다.
인간 혈청 알부민은 ALB 유전자에 의해 암호화되는 반면, 소 혈청 알부민과 같은 다른 포유 동물 형태는 화학적으로 유사하다.
인간 혈청 알부민의 분자량은 약 65.000 Da이고 585 개의 아미노산으로 이루어진다. HSA의 아미노산 서열은 총 17 개의 이황화 가교(bridges), 하나의 유리 티올 (Cys34) 및 단일 트립토판 (Trp214)을 함유한다.
단일 클론 항체
본원에 사용된 용어 "단일 클론 항체"(mAb 또는 moAb)는 B- 림프구의 단일 클론 또는 단일 유형의 항체 분자를 분비하는 하이브리도마라 불리는 단일 세포에 의해 생성된 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 단일클론 항체는 당업자에게 공지 된 방법, 예를 들어 항체-생성 세포 및 골수종 또는 다른 자가-침투 세포주의 융합으로부터 하이브리드 항체-형성 세포를 제조함으로써 제조된다.
단일클론 항체들은 동일한 에피토프 (항체에 의해 인식되는 항원의 일부)에 결합한다는 점에서 1가 친화성(monovalent affinity)을 갖는다. 거의 모든 물질이 주어지면 해당 물질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 상기 나노 입자의 알부민 매트릭스에 혼입되는 단일클론 항체는 안구 조직 내 또는 암성 조직 내에서 적어도 하나의 표적에 대해 친 화성을 갖거나, 조직 자체에 친화성을 가져야 한다. 예를 들어, 표적은 눈 장애 또는 암과 관련된 수용체(receptor) 또는 눈 장애 또는 암과 관련된 단백질일 수 있다.
특정 실시양태에서, 단일클론 항체는 새로운 혈관 형성을 자극하는 "혈관 내피 성장 인자"(VEGF) 라 불리는 천연 단백질의 기능을 억제하는 베바시주맙 (Avastin®;); VEGF-A에 강한 결합을 제공하는 라니비주맙(Lucentis®;); 고형 종양에서 과발현된 HER-2 수용체를 인식하는 트라스투주맙(Herceptin®;); EGFR 수용체를 인식하는 세툭시맙(Erbitux®) 및 CD20을 인식하는 리툭시맙(Mabthera®)으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 항 -VEGF 항체 (또는 이의 단편)는 알부민 매트릭스에 포함되도록 선택되어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 자체의 표적화를 허용한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 단일클론 항체는 베바시주맙 및 라니비주맙으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 베바시주맙이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 항 -VEGF R2 항체 (또는 이의 단편)가 알부민 매트릭스에 통합되도록 선택되어, 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF R2)를 발현하는 망막 색소 상피 세포와 같은 세포의 표적화를 허용한다. 항 -VEGF R2 단일클론 항체의 예는 mAb 클론 Avas12a1 및 mAb 2C3을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
망막 색소 상피 세포와 같은 상피 세포에 의한 VEGF 및 VEGFR2 수용체의 과발현은 예를 들어 연령 관련 황반 변성 (AMD)과 관련이 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 단일클론 항체는 안구 표적화제, 즉 안구 장애에 연루된 안구 조직에 의해 생성되거나 이와 관련된 항원에 특이적인 항체이다.
특정 실시양태에서, 단일클론 항체/알부민 중량비는 0.01 내지 0.5, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.2의 범위이다. 단일클론 항체/알부민 중량비가 0.01 미만인 나노 입자는 시간에 따라 안정적이지 않은 것으로 관찰되었다.
비이온성 중합체
본원에 사용된 용어 "비이온성 중합체"는 나노 입자의 제조 조건에서 순전하(net charge)를 나타내지 않는 친수성 중합체를 지칭한다. 또한, 상기 비이온성 중합체는 생분해성이어야 하며, 즉 생체 내 사용 동안 분해될 뿐만 아니라 생체적합성, 즉 이들이 접촉하는 생체 조직 또는 생체 시스템에 실질적으로 비 독성이거나 해로운 영향이 없는 것이어야 한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 비이온성 중합체의 예는 폴리비닐 알코올; 폴리비닐피롤리돈; 폴리알릴알코올; 폴리비닐 메틸에테르; 폴리비닐 아세탈; 폴리알킬렌 알코올; 하나 이상의 알킬기, 히드록시알킬기, 알콕시알킬기, 또는 두 개 이상의 이러한 기의 조합으로 임의로 치환된 다당류; 폴리에스테르; 폴리아미드, 폴리우레탄 및 폴리에테르이다.
바람직한 다당류에는 크산탄 검, 구아 검, 전분, 셀룰로오스, 덱스트란 및 상기 둘 이상의 조합이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
전분은 예를 들어 옥수수 전분 및 하이드록시프로필 전분을 포함한다.
셀룰로오스는 예를 들어 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 및 n-프로필셀룰로오스를 포함하는 C1-C6-알킬 셀룰로오스와 같은 알킬 셀룰로오스; 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시-n-프로필셀룰로오스, 히드록시-n-부틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 및 에틸히드록시에틸셀룰로오스와 같은 히드록시-C1-C6-알킬셀룰로오스 및 히드록시-C1-C6-알킬-C1-C6-알킬셀룰로오스를 포함하는 치환된 알킬셀룰로오스를 포함한다.
특정 실시양태에서, 비이온성 중합체는 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에스테르 및 폴리알킬렌 글리콜로부터 선택된다. 바람직하게는, 비이온성 중합체는 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시-n-프로필셀룰로오스, 히드록시-n-부틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트 및 에틸히드록시에틸셀룰로오스로부터 선택된 수용성 셀룰로오스이고; 녹말; 덱스 트란; 상표명 유다그릿(Eudagrit) 하에서 화합물로부터 선택된 폴리에스테르; 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜이다.
다른 특정 실시양태에서, 비이온성 중합체는 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 전분, 덱스트란 70, Eudagrit® NM; Eudagrit® NE, 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)으로부터 선택된다. 상기 폴리에틸렌 글리콜은 그의 분자량에 따라 PEG-10,000, PEG-20,000 또는 PEG-35,000 인 것이 바람직하다.
바람직하게는 비이온성 중합체는 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시 프로필메틸 셀룰로스 프탈레이트 및 PEG 35,000으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 비이온성 중합체는 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트 및 PEG 35,000으로부터 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 비이온성 중합체는 PEG 35,000이다.
비이온성 중합체는 알부민 나노 입자의 코팅으로서 작용하여, 보다 안정성을 부여하고, 일반적으로 나노 입자 내에 로딩되는 단일클론 항체의 양을 증가시키게한다. 코팅의 존재는 나노 입자의 물리적 특성에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 오직 코팅의 본성(nature)에 따라서 상기 크기 및 제타 전위가 약간 증가하거나 감소할 수 있다.
특정 실시양태에서, 비이온성 중합체/알부민 비는 0.02 내지 5 (w/w), 보다 바람직하게는 0.05 내지 2 (w/w)의 범위이다.
다른 특정적이고 선택적인 실시양태에서, 본 발명에 사용된 나노 입자는 나노입자를 건조하는 공정, 또는 통상적인 방법들, 예를들면, 스프레이 건조, 에 의한 나노입자들을 함유하는 현탁액을 건조하는 공정 동안 알부민 매트릭스를 보호하기 위한 화합물, 이하, "보호제(protecting agent)"추가로 포함한다. 상기 보호제는 나노입자의 고체 매트릭스의 일부를 형성하지 않지만, 그 구조가 유지되도록 효율적인 방식으로 나노 입자의 건조를 촉진하기 위한 증량제(bulking agent)로서 작용한다. 사실상, 이러한 특성을 준수하는 임의의 화합물이 보호제로서 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 보호제는 당류(saccharide)이다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 보호제의 비제한적이고 예시적인 예는 락토오스, 만니톨, 슈크로스, 말토오스, 트레할로스, 말토덱스트린, 글루코오스, 소르비톨 등 뿐만 아니라 프리바이오틱 특성을 갖는 물질, 예를 들어, 올리고프럭 토스, 펙틴, 이눌린, 올리고당 (예를 들어, 갈락토올리고당, 인간 우유 올리고당), 락툴로오스, 식이섬유 등, 및 이들의 임의의 조합과 같은 물질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보호제는 락토스, 만니톨, 슈크로스, 말토오스, 트레할로스, 말토 덱스트린, 글루코스, 소르비톨 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 바람직하게는, 보호제는 수크로오스이다. 본 발명에 사용된 나노입자가 보호제를 포함하는 경우, 알부민 매트릭스 및 보호제의 중량비는 넓은 범위 내에서 변할 수 있으며; 그럼에도 불구하고, 특정 실시 양태에서, 알부민 : 보호제는 중량비로 1:0.1-5, 전형적으로 1:0.5-4, 바람직하게는 약 1:1이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 나노 입자는 치료적 전달 전, 동안 또는 후에 입자 위치가 영상화되도록 함으로써 치료제의 영상-유도된 표적 전달을 허용하는 하나 이상의 이미징제를 포함한다. 형광 이미징제 (인도시아닌 그린, 시아닌 5, 시아닌 7, 시아닌 9, 플루오레세인 및 녹색 형광 단백질과 같은), 방사성 핵종-표지된 이미징제 (요오드-124, 99mTc를 포함하는 물질과 같은) 및 자기 공명 이미징제 (가돌리늄 대조 작용제와 같은)를 포함하며, 이에 제한되지 않는, 다양한 이미징제가 나노 입자의 표면에 커플링하기에 적합하다
본 발명에 사용된 나노입자는 제어 가능한 공정으로 단일클론 항체를 전달할 수 있다. 이러한 조절은 확장된 기간(extended period)에 걸쳐 단일클론 항체의 전달을 허용할 수 있다. 예를 들어, 전달은 1 일 내지 30 일의 기간에 걸쳐 일어날 수 있는 것으로 고려된다. 치료제를 제어 가능한 방식으로 전달하도록 적합화될뿐만 아니라, 상기 나노 입자는 치료제의 전달 전, 동안 및 후에 입자의 검출 및 영상화를 위한 다양한 옵션을 제공하도록 조정될 수 있다.
본 발명에 사용된 나노 입자는 또한 병용 요법을 제공하기 위해 제 2 단일클론 항체 또는 치료제를 임의로 포함할 수 있다.
상기 치료제는 예를 들어 칼시토닌, 인슐린 또는 시클로스포린 A 와 같은 다른 단백질을 포함한다.
제 2 단일클론 항체는 베바시주맙(Avastin®), 라니비주맙(Lucentis®), 트라스투주맙(Herceptin®), 세툭시맙(Erbitux®) 또는 리툭시맙(Mabthera®)과 같은 상기 언급된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
나노 입자의 제조 공정
본 발명에 사용된 나노 입자는 정제 및 건조 전에 수성 환경에서 단백질 (알부민 및 단일클론 항체)의 침전에 의해 제조될 수 있다.
이 프로세스는 다음을 포함한다:
a) 알부민 및 단일클론 항체 수용액을 제조하는 단계;
b) 단계 a)의 수용액을 4 내지 5의 pH로 적정하는 단계;
c) 단계 b)의 수용액에 탈용매화제(desolvating agent)를 첨가하는 단계.
이 방법은 알부민과 단일클론 항체 수용액이 탈용매화제(일반적으로 에탄올, 아세톤 또는 THF와 같은 유기용매)를 일정한 교반, 온도, 및 pH 조건 하에서 적상 추가(dropwise addition) 과 같이 천천히 첨가에 의해 천천히 탈용매화되는 탈용매화 공정에 기초한다.
특정 실시양태에서, 단계 a)의 수용액을 제조하는데 사용되는 알부민은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민이고, 보다 바람직하게는 인간 혈청 알부민이다.
다른 특정 실시양태에서, 단계 a)의 수용액을 제조하는데 사용되는 단일 클론 항체는 베바시주맙(Avastin®), 라니비주맙(Lucentis®), 트라스투주맙 (Herceptin®), 세툭시맙(Erbitux®) 및 리툭시맙(Mabthera®)으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 단일클론 항체는 베바시주맙 또는 라니비주맙이고, 더욱 더 바람직하게는 베바시주맙이다.
알부민 및 단일클론 항체의 용액은 당업자에게 공지된 통상적인 방법, 예를 들어 알부민 및 단일클론 항체를 수용액에 첨가함으로써 제조될 수 있다.
알부민 및 단일클론 항체는 바람직하게는 실온, 즉 18℃ 내지 25℃, 바람직하게는 20℃ 내지 22℃의 온도에서 혼합된다.
수용액에 첨가될 수 있는 알부민의 양은 넓은 범위 내에서 변할 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 특정 실시양태에서, 상기 수용액에 첨가되는 양은 0.1 % 내지 10 % (w/v), 바람직하게는 0.5 % 내지 5 % (w/v), 더욱 더 바람직하게는 1 % 내지 2 % (w/v)로 구성된다.
마찬가지로, 수용액에 첨가될 수 있는 단일클론 항체의 양은 넓은 범위 내에서 변할 수 있지만, 특정 실시양태에서, 상기 수용액에 첨가되는 양은 0.005 % 내지 1 % (w/v), 바람직하게는 0.01 % 내지 0.5 % (w/v), 더욱더 바람직하게는 0.01 % 내지 0.4 % (w/v)이다.
특정 실시양태에서, 알부민 및 단일클론 항체는 단일클론 항체 : 알부민 중량비가 0.01 내지 0.5, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.2의 범위가 되도록 수용액에 첨가된다.
바람직한 실시양태에서, 알부민 및 단일클론 항체의 수용액은 예를 들어 교반에 의해 균질화되어진다.
나노 입자를 제조하는 공정의 단계 b)는 알부민 및 단일클론 항체를 함유하는 수용액의 pH를 약산성 pH로 감소시키는 것을 포함한다. 이는 이 공정의 후속 단계에서 나노 입자의 침전을 허용한다. 이는 HCl 1M과 같은 단계 a)를 수행한 후 수득된 수용액에 산 성분을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 수용액은 실온에서 10 분 이상 동안 배양된다.
나노입자 제조 공정의 단계 c)에서, 탈용매화제가 단계 b)를 수행한 후에 수득된 수용액에 첨가된다.
바람직한 실시양태에서, 단계 b)를 수행한 후에 수득된 수용액에 탈용매화제를 첨가하는 것은 교반하에 이루어진다.
다른 바람직한 실시양태에서, 상기 탈용매화제는 에탄올 및 테트라하이드로 푸란(THF)으로부터 선택된 유기 용매이며, 더욱 바람직하게는 에탄올이다.
탈용매화제는 교반하면서 수용액에 천천히 첨가된다. 더욱 바람직하게는, 탈용매화제는 생성된 혼합물을 교반하면서 알부민 및 단일클론 항체의 수용액에 적가된다(dropwise added).
바람직한 실시양태에서, 상기 첨가는 불활성 분위기, 예컨대 질소 분위기 하에서 수행된다.
상기 조건 하에서, 즉 실온 및 교반 하에서 탈용매화제를 알부민 및 단일클론 항체의 수용액에 첨가 한 후, 본 발명의 나노 입자는 자발적으로 형성된다. 특정 실시양태에서, 상기 나노 입자는 이들이 수득된 배지에서 현탁 상태(suspension)에 있다.
따라서, 본 발명의 공정은 간단한 탈용매화 공정에 의해 나노 입자의 균일 한 분산을 형성할 수 있게 하여, 단일클론 항체가 전체 알부민 매트릭스 내에 분포 된 매트릭스형 구조를 갖는 고체 나노스피어(nanospheres)를 초래한다.
따라서,이 공정에 의해 수득된 나노 입자는 탈용매화제의 첨가시 단일클론 항체와 알부민 간의 국소적 상호작용에 의해 자발적으로 형성되는 자가-조립 나노 입자로 간주될 수 있다.
상기 나노 입자의 제조 방법은 예를 들어 여과 기술, 원심분리 또는 초원심 분리에 의해 추가의 정제 단계를 포함할 수 있다.
마찬가지로, 상기 공정은 분말 형태의 본 발명의 나노 입자를 수득하기 위해 형성된 나노 입자를 건조시키는 추가 단계를 포함할 수 있다. 상기 나노 입자의 이러한 형태의 제시는 이들의 안정성에 기여하며, 특히 약학 제품들에서의 최종 적용에 유용하다.
바람직한 실시양태에서, 단계 c)를 수행한 후 또는 정제된 후에 수득된 나노 입자는 상기 나노 입자를 건조시키기 위해 통상적인 방법, 예를 들어 진공 건조에 의해 또는 유리하게는 분무 건조 또는 동결 건조(lyophilization)에 의해 건조 처리된다.
특정 실시양태에서, 이러한 건조 처리, 특히 분무 건조 또는 동결 건조에 의해 수행되는 경우, 나노 입자가 일단 형성되면 보호제를 첨가하는 단계를 포함한다. 이 보호제는 건조 공정 동안, 예를 들어 당류와 같은 나노 입자를 보호한다.
본 발명의 맥락 내에서 보호제로서 사용될 수 있는 당의 비제한적이고 예시적인 예는 락토오스, 만니톨, 수크로오스, 말토오스, 트레할로스, 말토덱스트린, 글루코오스, 소르비톨 등 뿐만 아니라 프리바이오틱 특성을 갖는 다당류, 예를 들어, 올리고 프럭토오스, 펙틴, 이눌린, 올리고당 (예를 들어, 갈락토-올리고당, 인간 우유 올리고당), 락툴로오스, 식이 섬유 등 및 이들의 혼합물을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 보호제는 락토스, 만니톨, 슈크로오스, 말토오스, 트레할로스, 말토 덱스트린, 글루코오스, 소르비톨 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 상기 나노 입자가 보호제를 포함하는 경우, 이는 적절한 양으로 첨가되고; 나노 입자 매트릭스 및 보호제의 중량비가 넓은 범위 내에서 변할 수 있지만, 특정 실시 양태에서, 알부민 : 보호제 중량비는 1 : 0.1-5, 전형적으로 1 : 0.5-4, 바람직하게는 약 1 : 1 이다.
분무 건조에 의해 나노 입자를 건조시킬 수도 있다. 이를 위해, 나노 입자 및 보호제를 함유하는 현탁액을 분무 건조기에 도입하고 처리 조건 (공기 유입 온도, 공기 배출 온도, 기압, 샘플 펌핑 속도, 흡입 및 기류)이 제어된다. 당업자는 각 경우에 가장 적합한 처리 조건을 설정할 수 있다.
이 방법은 건조 분말 형태의 나노 입자를 얻을 수 있게 하며, 이는 제어된 또는 환경적 조건 하에서 장기간 저장 기간 동안 그의 안정성에 기여하며, 상이한 의도된 고체 및 액체 생성물에 용이하게 혼입될 수 있다.
나노 입자는 보호제의 첨가에 앞서 미리 형성되기 때문에, 이것은 알부민 매트릭스와의 접합체 또는 복합체를 형성하지 않는다.
다른 특정 실시 양태에서, 본 발명에 사용되는 나노 입자가 비이온성 중합체로 코팅 될 때, 상기 코팅된 나노 입자는 상기 정의된 공정의 단계 a) 내지 c)에 따라 이미 형성된 알부민-단일클론 나노 입자를 비이온성 중합체와 함께 배양함으로써 수득될 수 있다.
특정 실시양태에서, 비이온성 중합체는 상기 기재된 것들 중 임의의 것일 수있다. 바람직하게는, 상기 비이온성 중합체는 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 전분, 덱스트란 70, Eudagrit® NM, Eudagrit® NE, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 비이온성 중합체는 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트 및 PEG 35,000으로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 비이온성 중합체/알부민 비는 0.02 내지 5, 보다 바람직하게는 0.05 내지 2의 범위이다.
다른 특정 실시양태에서, 비이온성 중합체에서 나노 입자의 배양은 1 시간 미만, 보다 바람직하게는 45분 미만 동안 수행된다.
약학 조성물
상기 기재된 나노 입자는 단일클론 항체를 포획하고 가공 및 저장 동안뿐만 아니라 관심있는 생물학적 부위로 최종 전달될 때까지 이들을 보호하는 능력을 갖는다. 상이한 의도된 생성물(예를 들어, 약학 조성물 또는 미용 조성물)에 혼입 된 후 단일클론 항체의 불활성화는 따라서 방지되거나 실질적으로 감소된다. 실제로, 실험 시험은 단일 클론 항체가 알부민 매트릭스에서 그의 완전성을 유지한다는 것을 지적하였다.
또한, 본 발명의 나노 입자는 또한 그의 전체에서 생물학적 활성을 유지하는 단일클론 항체의 지속 방출을 허용하여, 각막 혈관 신생 동물 모델에서 수득된 생물학적 활성 데이터에 의해 지적된 바와 같이 생체 내 적용에 큰 관심을 갖는 약물 전달 시스템을 구성한다. 실제, 수행된 생체 내 실험에서 알부민 및 단일클론 항체의 나노 입자는 유리 형태의 동일한 단일클론 항체의 투여와 비교할 때 각막 혈관 신생(corneal vascularization)에 의해 영향을 받는 눈 표면의 현저한 감소를 제공하는 것으로 나타났다.
더욱이, 본 발명의 나노 입자로 수행된 생체 분포 분석은 그들이 종양 조직에 농축될 수 있으며, 따라서 그들을 단일 클론 항체를 영향을 받는 암 조직 내로 방출하기 위한 매우 유망한 나노 미립자 시스템으로 만든다는 것을 지적한다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 현탁액 형태 또는 건조 분말 형태의 상기 정의된 바와 같은 복수의 나노 입자 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
나노 입자의 특성은 이미 위에서 정의되었으며 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 약학 조성물에 함유된 나노 입자는 건조 분말 형태이다.
약학 조성물을 투여하는 임의의 적합한 수단이 본 발명의 맥락 내에서 사용될 수 있지만, 바람직하게는 상기 약학 조성물은 인간 또는 동물에게 경구, 국소 또는 비경구, 보다 바람직하게는 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 폐내 투여, 안구 내 투여, 근육 내 투여, 경피 또는 피하 투여, 경구 투여 또는 흡입을 통하여 투여된다.
더욱 바람직하게는, 상기 약학 조성물은 경구, 국소 또는 비경구 투여에 적합한 비히클 또는 담체를 포함한다.
특정 투여 방식에 기초하여, 약학 조성물은 정제, 환제, 캡슐제, 향낭, 과립제, 분말, 현탁액, 에멀젼, 무수의 또는 함수성 국소 제제 및 용액으로 제제화될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클은 당업자에게 널리 공지되어 있고 대중에게 쉽게 이용 가능하다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클은 활성 제제 및 그의 각 성분에 화학적으로 불활성이고, 사용 조건 하에서 유해한 부작용 또는 독성을 갖지 않는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 상기 치료제를 대상체의 순환계 내부로 경구의, 국소의, 비경구의 또는 정맥 내로 운반하기 위한 전달 시스템으로서 적합화된다.
경구 투여에 적합한 제제는 액체 용액, 예컨대 물 또는 식염수와 같은 희석제에 용해된 유효량의 나노 입자, 또는 이를 포함하는 조성물; 각각 미리 결정된 양의 나노입자들을 함유하는 캡슐, 향낭, 정제, 로젠지스(lozenges); 분말; 적절한 액체 중의 현탁액; 및 에멀젼을 포함한다.
국소 제형은 안과용 수용액 또는 현탁액, 안 연고, 안구 삽입물 또는 나노 입자를 외부 눈 표면에 공급할 수 있는 임의의 다른 제형을 포함한다. 바람직하게는, 국소 제제는 액체 방울로서의 적용을 위해 나노 입자를 함유하는 안과용 용액 또는 현탁액이다.
상기 언급된 임의의 제제는 안구 제제에서 일반적으로 발견되는 적합한 용매, 보존제 및 다른 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
비경구 제제는 전형적으로 용액 중에 0.5 내지 25 중량%의 나노 입자를 함유할 것이다. 상기 제형은 앰플 및 바이알과 같은 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용 물의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조된(lyophilized) 조건에서 저장될 수 있다 .
치료될 질병
전술한 바와 같이, 알부민 및 단일클론 항체의 나노 입자는 안 질환 및 암의 치료를 위한 매우 유망한 약물 전달 시스템인 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 안 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 정의 된 바와 같은 나노 입자 또는 조성물에 관한 것이다.
이러한 측면의 특정 실시양태에서, 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 임의의 중합체로 코팅되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 코팅되지 않는다.
이러한 측면의 다른 특정 실시양태에서, 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체로 구성되며, 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 어떠한 중합체로 코팅되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 코팅되지 않는다.
이러한 측면의 또 다른 특정 실시양태에서, 나노 입자는 고체 코어로 이루어지고, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 여기서 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 어떠한 폴리머로 코팅되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 코팅되지 않는다.
이러한 측면의 다른 특정 실시양태에서, 나노 입자는 고체 코어로 이루어지고, 상기 고체 코어는 비가 교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체로 이루어지고, 여기서 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 어떤 폴리머로도 코팅되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 코팅되지 않는다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 안 질환의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로하는 대상에게 상기 기재된 바와 같은 나노 입자 또는 나노 입자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 안 질환 치료 용 의약의 제조를 위한 상기 기재된 바와 같은 나노 입자 또는 나노 입자를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
상기 조성물은 경구, 국소 또는 안구 내 주사를 통해 대상체에게 투여될 수있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 예를 들어 안구 점막에 대한 접근 경로 또는 유리체내 주사에 의해 국소적으로 투여된다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 안구 질환의 치료를 위해 나노 입자가 투여 될 때, 상기 나노 입자는 상기에 기재된 것과 같은 국소 또는 주사용 약학 조성물로 투여된다.
다른 특정 실시 양태에서, 치료될 안 질환은 황반 변성, 각막 혈관 신생 또는 혈관 형성, 홍채 혈관 신생 또는 혈관 형성, 망막 혈관 신생 또는 혈관 형성, 당뇨병성 증식성 망막 병증, 비 당뇨병성 증식성 망막 병증, 녹내장, 감염성 결막염, 알레르기성 결막염, 궤양성 각막염, 비궤양성 각막염, 상공막염, 공막염, 당뇨망막병증, 포도막염, 내안구염, 감염성 상태 및 염증성 상태로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면은 암 치료에 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 나노 입자 또는 조성물에 관한 것이다.
이러한 측면의 특정 실시양태에서, 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 여기서 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 중합체로 코팅된다.
이러한 측면의 다른 특정 실시양태에서, 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체로 구성되며, 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 코팅된다 비이온성 폴리머로 코팅된다.
이러한 측면의 다른 특정 실시 양태에서, 나노 입자는 고체 코어로 이루어지고, 상기 고체 코어는 비가교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 폴리머로 코팅된다.
이러한 측면의 다른 특정 실시양태에서, 나노 입자는 고체 코어로 이루어지고, 상기 고체 코어는 비가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체로 구성되며, 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어는 비이온성 폴리머로 코팅된다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 암 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 치료를 필요로하는 대상에게 상기 기재된 바와 같은 나노 입자 또는 나노 입자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 암 치료용 의약의 제조를 위한 나노입자 또는 상기 기재된 바와 같은 나노입자를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 예를 들어 정맥 내, 동맥 내, 근육 내 또는 피하 투여에 의해 개체에게 비경구 투여된다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 나노 입자가 암 치료를 위해 투여될 때, 상기 나노 입자는 상기에 기재된 것과 같이 비경구 제제로 투여된다.
다른 특정 실시양태에서, 치료될 암은 암종, 림프종, 블라스토마, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 나노 입자의 투여에 의해 치료될 암의 예는 예를 들어 유방암, 폐암, 췌장암, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 전립선 암, 흑색종, 결장암, 결장 직장암, 신장 암, 자궁 경부암, 난소암, 간, 신장 및 위암, 방광암 또는 편평 세포 암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용된 나노 입자, 또는 이를 함유하는 조성물은 안 질환 또는 암의 치료를 위해, 제 2 치료 화합물 및/또는 제 2 치료법과 함께 투여될 수 있다.
상기 조성물 및 제 2 화합물 또는 제 2 치료법의 투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 조정될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제 1 및 제 2 치료법은 동시에, 순차적으로 또는 동시에(concurrently) 투여된다. 별개로 투여되는 경우, 나노 입자 조성물 및 제 2 화합물은 상이한 투여 빈도 또는 간격으로 투여될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 사용된 나노 입자는 병용 요법을 제공하기 위해 제 2 단일클론 항체 또는 치료제를 포함할 수 있다.
상기 치료제는 예를 들어 칼시토닌, 인슐린 또는 시클로스포린 A와 같은 다른 단백질을 포함한다.
제 2 단일클론 항체는 베바시주맙(Avastin®), 라니비주맙(Lucentis®), 트라스투주맙(Herceptin®), 세툭시맙(Erbitux®) 또는 리툭시맙(Mabthera®)과 같은 상기 언급된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
실시예
아래 제공된 실시예에서는 다음 약어가 사용된다:
BEVA: 베바시주맙
B-NP: 베바시주맙-로딩된 알부민 나노입자
HSA: 인간 혈청 알부민
PM: 물리적 혼합물
NP-Glu: 글루타르알데히드와 가교된 알부민 나노 입자
B-NP-GLU: 글루타르알데히드와 가교된 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자
NP-PEG35: 폴리에틸렌 글리콜 35,000으로 코팅된 알부민 나노입자
B-NP-PEG35: 폴리에틸렌 글리콜 35,000로 코팅된 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자
B-NP-HPMC-P: 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트로 코팅된 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자
B-NP-S100: Eudagrit S-100으로 코팅된 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자
재료
인간 혈청 알부민 또는 HSA(분획 V, 순도 96-99 %), 폴리에틸렌 글리콜 35,000 (PEG35) 및 글루타르알데히드(GLU) 25 % 수용액은 Sigma (Madrid, Spain)에서 얻었다. 베바시주맙(Avastin®)은 Roche(스페인)에서 구입하였다. Ashland Chemical Hispania (스페인)로부터 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 K100 LV (HPMC; MW 164,000). Avastin®은 일회용 바이알에 주입하기 위한 농축액으로서 제공되며, 이는 nominal amount의 4mL 내의 베바시주맙 100 mg 또는 16 ml 내의 베바시주맙 400 mg 을 포함한다.(25mg / mL의 농도) 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트 (HPMC-P)는 Acros Organic (스페인)에서 구입하였다. 마이크로 BCA 단백질 분석 키트는 Pierce (Thermo Fisher Scientific Inc. (미국 일리노이)로부터 구입하였다. 베바시주맙의 검출에 사용된 시카리 Q-베바 효소 면역분석은 Matriks Biotech (터키)로부터 구입하였다. 아세톤은 Prolabo, VWR International Ltd (영국) 및 틴 클로라이드 디히드레이트로부터 구입하였고, 절대 에탄올은 Panreac Pharma (스페인)에서 구입하였다. 이소플루오론은 브라운으로부터, euthanasic T-69 Intervet은 Schering-Plough Animal Health로부터였다. Technetium-99m pertechnetate 용출액은 General Electric에서 구입한 Drytec® 99Mo-99mTc 발전기에서 얻었다.
물리화학적 연구를 위해 다음 장치가 사용되었다 : Thermo / Nicolet 360FT-IR (ESPThermo Fisher Scientific, USA), diffractometer Bruker Axs D8 Advance (독일), 열 중량 분석 (TG) 및 시차 주사 열량 측정 (DSC)을 위해 Mettler Toledo dsc822e는 Mettler Toledo TSO 801RO 샘플 로봇 및 Julabo FT900 쿨러와 함께 사용되었으며, 원소 분석을 위해 LECO CHN-900 (Michigan USA)로부터 원소 분석기가 사용되었다.
방사성 표지 및 생체 분포 연구를 위해 다음 장치가 사용되었다 : Symbia SPECT/CT, Siemens Medical Systems, Germany, Activimeter AtomLab 500, Biodex, USA, Gamma counter, LKB Pharmacia.
나노 입자의 물리 화학적 특성 (크기, 제타 포텐셜 및 형태)
나노 입자의 입자 크기 및 제타 포텐셜은 Zeta Plus 장치 (Brookhaven Inst. Corp., USA)에서 측정되었다. 초순수(1/10)에 분산시킨 후 나노 입자의 직경을 측정하고 동적 광 산란 각도 90°로 25℃ 에서 측정하였다. 제타 포텐셜은 다음과 같이 결정되었다 : 200 μL의 샘플은 pH 7.4로 조정된 1 mM KCl 용액 2 mL 내에 희석되었다.
나노 입자의 형태학적 특성은 Zeiss DSM940 디지털 주사 전자 현미경 (Oberkochen, Germany)에서 주사 전자 현미경사진 (SEM)에 의해 연구되었다. 이를 위해, 동결 방지기를 제거하기 위해 샘플을 물에 분산시키고 4℃에서 20 분 동안 27,000 × g에서 원심분리 하였다. 이어서, 상기 펠릿을 양면 접착 테이프로 접착된 유리판에 장착하고 금속 스터브 상에 장착하고 건조시켰다. 이들은 MTM-20 두께 제어기가 장착된 회전-평판-기울기 단계를 갖는 Cressington sputter-coater 208HR을 사용하여 4 nm의 팔라듐-백금 층으로 코팅되었다. SEM은 약 0.5 mA의 필라멘트 전류로 1 내지 3 kV에서 작동하는 LEO 1530 장치 (LEO Electron Microscopy Inc, Thornwood, NY)를 사용하여 수행되었다.
수율
나노 입자로 변환된 HSA의 양(수율)은 마이크로 BCA에 의해 나노 입자를 형성하는 HSA의 정량화를 통해 결정되었다. 간단히 말하면, 10 mg의 나노 입자를 칭량하고 10 mL의 초순수에 분산시키고 4℃에서 15분 동안 15,000 rpm에서 원심분리 하였다(Rotor 3336, Biofuge Heraeus, Hanau, Germany). 그리고나서, 1mL의 NaOH 0.02N으로 펠렛을 부수고 이 용액 200μL를 96 웰 마이크로 플레이트로 옮기고 562nm에서 분광 광도계에서 특정 마이크로-BCA 단백질 분석 키트를 따르도록 진행하였다.
키트의 선택성은 알부민 측정에서 가능한 간섭을 검출하기 위해 다른 부형제 및 약물 (글루타르알데히드, PEG 35,000, HPMC 또는 베바시주맙)을 함유하는 대조군을 사용하여 결정되었다. 다음 방정식을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
수율(%) = (Wlyop /Winitial) x 100 [식 1]
Wlyop은 나노 입자로 변형된 HSA이고, Winitial은 나노 입자를 준비하는 데 사용된 HSA의 양이다.
나노 입자에서 약물 탑재량의 정량
알부민 나노 입자에 로딩된 항체의 양은 효소 면역검정 (Shikari Q-BEVA)에 의해 추정되었다. 이를 위해, 10 mg의 나노 입자를 칭량하고 1 mL 물에 분산시켰다. 현탁액을 10,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리 하였다 (Rotor 3336, Biofuge Heraeus, Hanau, Germany). 상청액을 제거했다. 이어서, 나노 입자를 1 ml의 NaOH 0.02N으로 파괴하였다. 생성된 용액 200 μL를 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)로 코팅된 96- 웰 마이크로 플레이트로 옮기고 베바시주맙에 대한 특정 ELISA를 따랐다 (Q-Beva 테스트 절차, Shikari Q-Beva, Matriks Biotek).
각 샘플을 3회 분석하고, 0.1 내지 100 μg / mL (r2> 0.993) 범위의 표준 곡선을 사용하여 계산을 수행하였다. 검출 및 정량 한계는 각각 0.1 μg / mL 및 100 μg / mL였다 (r2> 0.993).
베바시주맙 로딩(DL) 및 이의 캡슐화 효율 (EE)은 다음 방정식에 따라 계산되었다 :
DL = [Wencap / Wnp] [식. 2]
EE = [Wencap / Wtotal] x100 [식. 3]
여기서 Wencap은 캡슐화된 베바시주맙의 양이고, Wtotal은 사용된 약물의 총량이고 Wnp는 나노입자 중량이었다.
FT-IR 결정
HSA 나노 입자의 분자 구조는 FTIR 분광법에 의해 조사되었다. KBr 디스크에서 샘플의 1 %로 분산된 샘플의 적외선 스펙트럼을 NICOLET FTIR 분광계 (Thermo/ Nicolet 360FT-IR E.S.P. Thermo Fisher Scientific, USA)에 기록하였다. 샘플을 4000 내지 400 cm-1로 스캔하였다. 기록 조건은 8.0의 해상도 및 40의 샘플 스캔이었다. OMNIC 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
X-ray 연구
상이한 나노 입자 샘플에서 중합체 매트릭스의 결정학적 평면의 분포 및 결정성 변동성을 연구하기 위해 X- 선 연구를 수행하였다. 이를 위해, 샘플을 회절 계(Bruker Axs D8 Advance)의 금속 플레이트 상에 분말 형태로 배치하고, 360 이상 측정을 실온에서 수행하였다. 회절 분석은 프로그램 Diffrac.Suite를 사용하여 분석되었다.
열 분석
온도 변화에 대한 상이한 나노 입자의 반응은 열 분석 (차동 열 분석 DTA 에 결합된 열 중량 분석 TGA)에 의해 연구되었다. 이것이 반응하여 나노 입자를 형성할 때, HSA의 작용기의 열 거동의 변화를 분석하였다. 열 연구는 TGA/sDTA 851e Mettler Toledo 열 분석기와 동시에 수행되었다. 써모그램은 25 내지 250 ℃에서 10℃/분의 스캔 속도로 피어싱된 알루미늄 도가니에서 약 5 - 10mg의 샘플을 가열함으로써 수득되었다. 퍼지 가스로서 정적 대기 분위기 및 N2 (20 mL min-1) 하에서 열 분석을 수행하였다. 측정은 3회 수행되었다.
원소 분석
상이한 안정화제의 연관성을 확인하기 위해 나노 입자의 원소분석(C, H, O 및 N)을 LECO CHN-900, Michigan USA 로부터의 HSA 나노 입자 원소 분석기에서 수행하였다. 간략하게, 각각의 샘플 1mg을 3회 시험하고 결과를 백분율 (% w/w) SD ±0.4로 나타내었다. 이 기술은 다른 성분들 (글루타르알데히드, PEG35, HPMC-P 또는 베바시주맙)과 관련된 때에 알부민(HSA)의 산소, 수소 또는 질소의 조성에 있어서의 변화를 보여준다.
체외 방출 연구
베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자의 시험관내 방출 연구를 PBS (pH 7.4)에서 수행하였다. 각각의 나노 입자 제형 10mg을 함유하는 에펜도르프 튜브를 총 부피 1mL PBS에 분산시키고, 에펜도르프 튜브에 분배하고, 60 스트로크/분의 일정한 교반으로 37℃의 진탕조에 넣었다(Unitronic 320 OR, Selecta, Madrid, Spain). 상이한 시간 간격으로, 에펜도르프 튜브를 취하여 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다 (Rotor 3336, Biofuge Heraeus, Hanau, Germany). 특정 ELISA 테스트 (Shikari Q-Beva, Matriks Biotek)로 베바시주맙 함량에 대해 상청액을 분석하였다. 방출 프로파일은 백분율로 누적 방출의 관점에서 표현되었고, 시간 대 플롯되었다.
또한, 방출 프로파일에 기초하여, 상기 동역학은 Korsmeyer-Peppas 방정식 지수 모델 (식 4)에 의해 조사되었다 :
Q=Ktn [식 4]
여기서 Q는 시간 t에서 방출된 약물의 백분율이고, K는 조사중인 장치의 구조적 및 기하학적 특성을 포함하는 상수이고, "n"은 확산 지수이며, 이는 일반적으로 투여 형태로부터 약물 전달의 메커니즘의 지표로 사용된다.
n≤0.43의 값은 약물 방출이 Fickian 확산에 의해 제어됨을 나타내고, n≤ 0.85의 값은 약물 방출이 침식 메커니즘에 의해 지배됨을 시사한다. 값이 0.43<n <0.85 인 경우, 방출은 이례적인 것으로 설명되며, 확산과 침식의 조합이 약물 방출의 제어에 기여한다는 것을 암시한다.[Gao Y., et al., In Vitro Release Kinetics of Antituberculosis Drugs from Nanoparticles Assessed Using a Modified Dissolution Apparatus. Biomed Research International 2013].
실시예 1. 베바시주맙-로딩된 인간 혈청 알부민 나노 입자의 제조. 생성된 나노 입자의 물리 화학적 특성에 대한 베바시주맙 / HSA 비의 영향
베바시주맙이 로딩된 나노 입자는 정제 및 건조 전에 수성 환경에서 단백질을 침전시켜 나노 입자를 얻는 절차에 의해 제조되었다.
이러한 목적을 위해, 100 mg HSA 및 다양한 양의 베바시주맙 (BEVA) (1-20 mg)을 주사를 위해 5-10 mL의 물에 용해시킨 후, 용액을 HCL 1 M 로 pH 4.1-4.4로 적정하였다. 상기 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양 하였다. 실온에서 연속 교반 (500 rpm) 하에 탈용매화제로서 사용된 16 mL의 에탄올을 연속적으로 첨가하여 나노 입자를 수득하였다. 생성된 나노 입자를 2가지 상이한 절차: 초원심분리 및 한외여과에 의해 정제하였다. 전자에서, 나노 입자는 4 ℃ (Sigma 3K30, Osterodeam Harz, Germany)에서 20분 동안 21,000 x g에서 원심 분리 및 물에서 원래 부피로 펠렛의 재분산에 의해 두 번 정제되었다. 후자에서, 나노 입자를 50 kDa 기공 크기의 폴리설폰 막 카트리지(Medica SPA, Italy)를 통한 한외 여과에 의해 정제하였다. 마지막으로, 재분산 또는 수크로오스 5 % 수용액 첨가 후, 제네시스 12EL 장치 (Virtis, NewYork, USA)에서 나노 입자를 동결 건조시켰다. 이들 제제는 베바 시주맙-로딩된 인간 혈청 알부민 나노 입자이며, 추가의 안정화없이, 이하 B-NP 제제이다.
나노 입자에서의 단일클론 항체의 캡슐화를 위해, 2개의 주요 파라미터, 즉 베바시주맙/알부민 비 및 나노 입자 형성 전에 두 화합물 사이의 배양 시간이 확인되었다. 표 1은 단일 클론 항체 / 단백질 비율을 변화시킴으로써 생성된 나노 입자의 주요 물리 화학적 특성을 요약한다. 베바시주맙/알부민 비가 낮을 때 (예를 들어, 0.01), 나노 입자는 시간에 따라 안정적이지 않았다. 0.01 보다 높은 비율의 경우, 생성된 나노 입자는 평균 크기가 300 nm에 가까우며 음의 표면 전하가 약 -15 mV 인 것으로 안정적이었다.
유사하게, 상기 공정의 수율은 약 80% 인 것으로 계산되었다. 도 1은 단일클론 항체 로딩에 대한 베바시주맙/알부민 비의 효과를 보여준다.
이들 결과에 따르면, BEVA/HSA 비를 증가시킴으로써 나노 입자에 로딩된 베바시주맙의 양이 증가하였다. 이러한 모든 실험은 단일 클론 항체와 단백질 사이에서 10 분 동안 배양한 후에 수행되었다. 흥미롭게도,이 파라미터를 증가시킴으로써 나노 입자의 물리 화학적 특성에 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
표 1. 베바시주맙/알부민 비율이 생성된 나노 입자의 물리화학적 특성에 미치는 영향. 베바시주맙과 알부민 사이의 배양 시간: 10분. 데이터는 평균±SD (n=3)로 표현됨.
BEVA / HSA ratio 평균 크기(㎚) PDI Zeta 포텐셜 (mV) 수율(%)
0.01 240 ± 3 0.27 ± 0.01 -18.9 ± 0.9 75
0.03 326 ± 7 0.21 ± 0.03 14.1 ± 0.3 78
0.05 353 ± 6 0.26 ± 0.01 -11.7 ± 0.2 78
0.08 304 ± 4 0.16 ± 0.03 -15.5 ± 0.3 80
0.15 306 ± 4 0.22 ± 0.01 -16.1 ± 0.3 85
실시예 2. 베바시주맙 로딩된 나노 입자와 글루타르알데히드와 가교가 그들의 물리-화학적 특성에 미치는 영향
베바시주맙이 없는 인간 혈청 알부민 나노 입자가 안정하지 않고 형성 직후에 사라졌기 때문에, 콘트롤 베바시주맙 로딩된 나노 입자는 에탄올 (300 μl) 중 12.5 μg 글루타르알데히드와 가교된 후에(이하, B-NP- GLU 제제) 수득되었다. 이를 위해, 방금 형성된 베바시주맙 로딩된 나노 입자는 정제 및 동결 건조 전에 글루타르알데히드로 5분간 배양되었다.
표 2는 "네이키드(naked)" HSA 나노 입자의 주요 물리화학적 특성 (추가 안정화 절차없이) 및 글루타르알데히드와의 가교 후 수득 된 대조물을 요약한 것이다. 알부민 나노 입자에서 베바시주맙의 캡슐화는 높은 항체 함량을 갖는 안정한 나노 입자를 생성하였다. 흥미롭게도, 나노 입자에 로딩된 활성 단일클론 항체로서 계산된 캡슐화 효율은 약 13 %의 베바시주맙 로딩으로 90%에 가까웠다. 베바시주 맙이 로딩된 나노 입자가 글루타르알데히드와 가교될 때, 생성된 나노 입자는 화학 가교제없이 생성된 것보다 약간 작았다. 그러나, 글루타르알데히드로 나노 입자의 처리는 단일클론 항체를 활성화시켰으며, 매우 낮은 수준의 항체는 ELISA 분석에 의해 정량화되었다.
표 2. 비 처리 및 글루타르알데히드 가교된 알부민 나노 입자의 물리 화학적 특성. 나노 입자는 나노 입자의 형성 전에 0.15 의 베바시주맙/알부민 비 에서 10분의 배양으로 제조되었다. 데이터는 평균 +/- SD (n = 3)로 표시된다.
PDI : 다분산 지수; BEVA : 베바시주맙; EE : 캡슐화 효율; NP : 나노 입자; GLU : 글루타르알데히드.
크기(nm) PDI Zeta 포텐셜 (mV) 수율(%) BEVA 로딩
(μg/mg NP)		 EE (%)
NP NA NA NA NA - -
B-NP 310±3 0.14±0.02 -14 ± 1 85±3 132±5 89±0
NP-GLU 163±2 0.17±0.01 -36 ± 0 66±5 - -
B-NP-GLU 270±3 0.11±0.03 -39 ± 1 68±2 0.1±0.3 0.1±1.3
실시예 3: 베바시주맙이 로딩된 나노 입자의 특성
TEM
도 2는 구형(spherical) 및 불규칙한 표면을 갖는 베바시주맙이 로딩된 나노 입자 (B-NP)의 형태를 보여준다.
FT-IR 결정
IR은 단백질의 2차 구조에서 형태 변화의 발생을 평가하도록 허용한다. 도 3은 단일클론 항체 단독 및 단백질, 그리고 그들의 물리적 혼합물의 것들과 비교한 베바시주맙 로딩된 나노 입자의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다.
단백질의 적외선 스펙트럼은 펩티드 모이어티(moieties)의 상이한 진동을 나타내는 다수의 아미드 밴드를 나타낸다. 1600 ~ 1700 cm-1 범위의 아미드 I 밴드 (주로 C=O 스트레치)와 1550 cm-1 범위의 아미드 II 밴드 (NH 굽힘 모드와 결합된 C-N 스트레치)과 같은 신호는 이 화학 결합의 존재의 증거로서 사용되었고 그들은 직접적으로 상기 단백질의 2차 구조와 관련된다.
그러나, 아미드 I 밴드는 아미드 II보다 단백질 2차 구조의 변화에 더 민감하다. 이러한 방식으로, 이들 신호의 빈도 및 강도의 변화는 단백질과의 상호 작용의 증거이다.
이 경우에, 나노 입자는 2 개의 상이한 단백질 (알부민 및 베바시주맙)에 의해 형성된다는 사실로 인해, 아미드 I 피크에 상응하는 신호의 주파수의 작은 변동이 관찰되었다 (HSA의 경우 2164 및 B-NP의 경우 1645cm-1).
대조군으로서, 글루타르알데히드와 가교된 나노 입자도 또한 연구되었다. 이 경우에, 글루타르알데히드와 알부민 사이의 상호 작용의 결과로서 아미드 I (1642 내지 1645 cm-1)의 주파수의 약간의 변위가 또한 발견되었다.
X-선 연구
도 4는 인간 혈청 알부민, 베바시주맙 및 베바시주맙이 로딩된 나노 입자의 X-선 스펙트럼을 나타낸다. 모든 경우에, 이들 스펙트럼은 비정질 구조를 나타낸다.
열 분석
HSA와 베바시주맙의 작용기 사이의 반응을 결정하기 위해 열 분석을 수행하였다. 도 5는 천연 알부민 (HSA) 및 베바시주맙 (BEVA) (A), 베바시주맙 나노 입자 (B-NP) 및 알부민 및 베바시주맙의 물리적 혼합물 (PM) (B), 천연 알부민 (HSA) 및 글루타르알데히드 (GLU) (C), 글루타르알데히드 가교된 나노 입자 (NP-GLU) 및 알부민 및 글루타르알데히드의 물리적 혼합물 (PM) (D) 의 서모그램(thermograms)을 나타낸다.
서모그램은 천연 알부민이 약 30℃의 발열 효과를 나타내며, 이는 가역적 전이와 흡열 유리 전이로 인한 두 번째 열 효과에 해당함을 보여준다.
NPs에서 알부민에 상응하는 발열 신호의 부재는 알부민과 단백질 (BEVA) 및 가교제(글루타르알데히드)의 조합에 기인할 수 있다. 따라서, 베바시주맙 및 알부민은 복합체를 형성할 것이다.
원소 분석
표 3은 인간 혈청 알부민, 베바시주맙, 글루타르알데히드 가교된 알부민 나노입자, 및 베바시주맙- 로딩된 알부민 나노입자의 원소 분석을 나타낸다.
베바시주맙은 인간 혈청 알부민 보다 현저히 낮은 탄소 및 질소 함량을 나타낸다. 반대로, 단일클론 항체에서 산소 함량은 알부민에서보다 약 2배 더 높다. 유사한 방식으로, 베바시주맙-로딩된 나노 입자(B-NP)는 천연 알부민보다 더 낮은 질소 백분율과 더 높은 산소 함량을 보인다.
표 3. 인간 혈청 알부민 (HSA), 베바시주맙 (BEVA), 글루타르알데히드로 가교된 알부민 나노입자 (NP-GLU) 및 베바시주맙-로딩된 나노입자(B-NP)의 원소 분석.
% C % H % N % O
HSA 48.34 6.96 17.80 26.91
BEVA 36.70 6.64 4.25 52.41
NP-GLU 48.09 6.87 15.19 29.85
B-NP 48.77 6.86 14.90 29.48
실시예 4 : 베바시주맙이 로딩된 나노입자의 안정성
나노 입자의 안정성은 초순수에서 평가되었다. 샘플을 정제수에 분산시키고 실온에서 3일 동안 저장하였다. 상이한 시간 간격에서, 안정성은 나노 입자의 크기, 다분산 지수 및 제타 포텐셜을 측정함으로써 평가되었다.
물에 분산시킨 후 (pH 7.4로 조정), 베바시주맙이 로딩된 나노 입자는 24 시간 이상 동안 안정하였다 (도 6). 그들의 거동은 글루타르알데히드와 가교된 빈 나노 입자에 대해 관찰된 것과 유사하였다 (도 6). 유사한 방식으로, B-NP의 다분산 지수 (PDI)는 실험 동안 영향을 받지 않았다. 따라서, t=0에서, PDI는 0.19±0.01이고, 24 시간 후에,이 파라미터는 0.16±0.03 으로 계산되었다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예 5 : 나노 입자로부터 베바시주맙의 시험관내 방출
도 7은 PBS에서 알부민 나노 입자로부터 베바시주맙의 시험관내 방출 프로파일을 보여준다. 이 프로파일은 처음 5분 동안 로딩된 항체의 약 23 %의 초기 버스트 효과에 이어 다음 24 시간 동안 느리게 제어된 방출을 특징으로 하였다. 실험의 끝에서, 로딩된 베바시주맙의 약 40%가 방출되었다. 버스트 방출은 나노 입자의 표면에 흡착된 항체와 관련될 수 있다.
실시예 6. 베바시주맙-로딩된 코팅된 알부민 나노 입자의 제조 및 특성.
상이한 화합물로 장식된 인간 혈청 알부민 나노 입자에서 베바시주맙의 캡슐화는 4단계를 포함하는 절차에 의해 제조되었다. 특히, 비이온성 HPMC-P 및 PEG35를 선택하여 베바시주맙-로딩된 나노 입자를 장식하는 그들의 능력을 탐구하였다. 이온 코팅 Eudragit S-100도 사용되었다.
첫 번째 단계는 수성 환경에서 나노 입자의 생산에 전념했다. 그리고나서 수성 환경에서 간단한 배양으로 나노 입자의 표면을 장식하였다. 세번째 단계는 생성되는 나노입자를 정제하기 위하여 사용되었고, 최종적으로 건조되었다.
첫 번째 단계. 주사를 위해 100mg HSA 및 다양한 양의 베바시주맙 (1-20mg)을 5-10mL의 물에 용해시킨 후, HCl 1M을 사용하여 용액을 pH 4.1 ~ 4.4로 적정하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양 하였다. 실온에서 연속 교반 (500 rpm)하에 탈용매화제로서 사용된 16 mL의 에탄올을 연속적으로 첨가하여 나노 입자를 수득하였다.
두번째 단계. 방금 형성된 베바시주맙 로딩된 나노 입자의 코팅을 위해, 다음의 화합물들 중 하나가 첨가되었다:PEG 35,000, 하이드록시메틸프로필 셀룰로오스 프탈레이트 또는 Eudragit S-100.
대조군으로서, 베바시주맙이 로딩된 나노 입자를 상기 기재된 바와 같이 5 분 동안 에탄올 (300 μL) 중 12.5 μg 글루타르알데히드와의 가교에 의해 안정화시켰다.
세번째 단계. 생성된 나노 입자를 정제하였다. 초원심 분리 및 한외 여과의 두 가지 절차가 사용되었다. 전자에서, 나노 입자를 4℃ (Sigma 3K30, Osterodeam Harz, Germany)에서 20분 동안 21,000 x g 에서 원심 분리하고 물에서 원래 부피로 펠렛의 재분산에 의해 2회 정제하였다. 후자에서, 나노 입자를 50 kDa 기공 크기의 폴리설폰 막 카트리지를 통한 한외 여과에 의해 정제하였다.(Medica SPA, Italy)
네번째 단계. 마지막으로, 나노 입자는 Genesis 12EL 장치(Virtis, NewYork, USA)에서 동결 건조되었다. 초원심 분리를 정제 방법으로 사용하는 경우, 마지막 원심 분리로부터의 펠렛을 수크로오스 5% 수용액에 분산시켰다. 한외 여과를 사용하는 경우, 펠렛을 또한 동결 건조 전에 수크로오스 5 % 수용액에 재분산시켰다.
표 4는 이들 나노 입자의 주요 물리 화학적 특성을 요약한 것이다. 전반적으로, 로딩된 베바시주맙의 양은 항상 유사하고 14%에 가까웠다. 그럼에도 불구하고, 코팅 목적을 위해 상이한 부형제와 베바시주맙이 로딩된 나노 입자의 배양은 변형된 물리 화학적 특성을 갖는 나노 입자를 생성하였다. 따라서, 베바시주맙을 캡슐화하는 PEG35- 코팅된 나노 입자(B-NP-PEG35)는 naked 베바시주맙-로딩된 나노 입자(B-NP)와 유사한 평균 크기 및 음의 제타 포텐셜을 나타냈다. 반대로, B-NP를 HPMC-P와 함께 배양했을 때, 생성된 나노 입자의 평균 크기는 B-NP와 비교하여 상당히 증가하였다. 배양을 이온성 Eudragit® S-100과 함께 수행한 경우, 생성된 나노 입자는 B-NP와 비교하여 감소된 크기 및 증가된 음의 제타 포텐셜을 나타내D었다. SEM에 의해, 알부민 나노 입자는 구형 및 매끄러운 표면을 나타냈다.
표 4. 코팅된 알부민 나노 입자로 캡슐화된 베바시주맙의 물리 화학적 특성. 데이터는 평균±SD (n=3)로 표현됨. PDI : 다분산 지수. 코팅제 : S-100 (이온성 Eudragit® S100), HPMC-P (하이드록시 프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트), PEG35 (폴리에틸렌 글리콜 35,0000). CA/단백질 비율 : 코팅제/알부민 비율. B-NP-GLU : 글루타르알데히드와 가교 결합된 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자. B-NP : "네이키드(naked)" 알부민 나노 입자 내로 로딩된 베바시주맙.
CA/단백질 비; 시간
배양 		크기
(nm) 		PDI Zeta
포텐셜(mV) 		수율
(%) 		BEVA 로딩
(μg/mg NP)
B-NP-GLU - 180 ± 3 0.11±0.01 -36 ± 1 75 ± 2 0.1 ± 1
B-NP - 310 ± 3 0.14±0.02 -14 ± 1 85 ± 3 132 ± 5
B-NP-HPMC-P 0.1;10 분 369 ± 1 0.15±0.01 -13 ± 1 76 ± 4 142 ± 4
B-NP-PEG35 0.5;35 분 301 ± 2 0.13±0.03 -17 ± 1 63 ± 7 145 ± 6
B-NP-S100 0.25;10 분 252 ± 4 0.07±0.01 -27 ± 1 86 ± 3 148 ± 5
PEG35 (B-NP-PEG35)로 코팅된 베바시주맙-로딩된 나노 입자의 형태학적 연구 (도 8)는 이들이 불규칙한 표면 및 균일한 분산을 갖는 구형인 것을 보여준다.
실시예 7 : 코팅된 나노 입자로부터 베바시주맙의 시험관내 방출
도 9는 pH 7.4에서 PBS 중의 2 개의 비이온성 중합체 (PEG35 및 HPMC-P) 및 이온성 Eudragit® S100 으로 코팅된 알부민 나노 입자로부터의 베바시주맙의 시험 관내 방출 프로파일을 보여준다. PEG35-코팅된 나노 입자 (B-NP-PEG35)의 경우, 프로파일은 실험 종료시 방출된 베바시주맙의 양이 B-NP 에 대한 것보다 더 큰 차이를 제외하고는 네이키드 나노 입자 (B-NP)에 대해 관찰된 것과 유사하였다.
어쨌든, 이러한 페길화된(pegylated) 나노 입자는 처음 5분 동안 약 22%의 초기 파열(burst) 효과를 특징으로 하는 byphasic 방출 패턴을 제공한 후, 적어도 24 시간 동안보다 더욱 지속되고 느린 방출 속도를 나타냈다. 파열(burst) 방출은 거의 22% 였으며 나노 입자의 표면에 흡착된 항체와 관련이 있을 수 있다. 처음 5 분의 파열(burst) 방출을 무시하면서, byphasic 섹션은 Korsmeyer-Peppas 방정식을 사용하여 확산 프로파일 (n = 0.54; R2 = 0.994)로 조정되었다. 확산 단계 동안 베바시주맙의 방출은 처음 2시간 후에 정체기(plateau) 에 도달하기 위해 최대 48%였다.
HPMC-P (B-NP-HPMC-P)로 코팅된 나노 입자의 경우, 다시 처음 60 분 동안 방출된 베바시주맙의 양은 약 40% 였다. 이어서, 남은 항체의 연속 방출 속도가 관찰되었다. 그러나, 이 경우, 베바시주맙의 방출 속도는 B-NP 또는 B-NP-PEG35보다 더 빠르다. 따라서, 8시간의 배양 후, 베바시주맙 함량의 100%에 가까이가 HPMC-P로 코팅된 나노 입자로부터 방출되었다.
비이온성 중합체로 코팅된 나노 입자와 반대로, 이온성 Eudragit® S-100 (B-NP-S-100)으로 코팅된 나노 입자는 즉시 방출 프로파일을 나타냈다.
실시예 8. 알부민 나노 입자 내에 캡슐화 후 베바시주맙의 완전성
알부민 나노 입자에 로딩된 베바시주맙의 양을 정량화하는데 사용된 ELISA 키트로 얻은 결과를 입증하기 위해, 상이한 나노 입자에 캡슐화된 항체 (베바시주 맙)의 완전성을 Experion ™ 자동 전기 영동 시스템(Bio Rad, US)을 사용하여 미세유체-기반 자동 전기 영동에 의해 분석하였다. 2- 메르캅토에탄올을 사용하여 비 환원 조건 및 환원 조건에서 샘플을 평가하였다. 얻어진 데이터는 소프트웨어 Experion System을 사용하여 처리되었다.
나노 입자의 무게를 측정하고 1 mL NaOH 0,005 N으로 파쇄하였다. 상이한 용액의 농도는 약 400 ng 단백질/μL였다 (시험의 선형 동적 범위는 5-2,000 ng / μL 임). 유리 단백질 (알부민 및 베바시주맙)의 샘플을 대조군으로 사용하였다. 이들 샘플 모두는 수득된대로 또는 β- 메르캅토에탄올 및 열로 처리한 후에 평가되었다. 그런 다음, Experion System Pro260 분석 키트 (Bio-Rad Lab., USA)의 프로토콜에 따라 샘플을 처리하였다. 일단 샘플 및 대조군이 칩에 로딩되면, 이들은 Experion ™ 자동 전기 영동 시스템 (Bio Rad, US)에 의해 분석되었다.
결과는 가상 겔에서 밀도계 밴드로서 수득되었다. 각 밴드는 다른 샘플에 해당한다. Experion 소프트웨어는 다른 크기의 피크들을 식별하고 시스템 제어 밴드에서 킬로달톤 ("kDa")으로 표시된다,
연구 결과는 도 10에 도시되어 있다. 레인 5에서, 베바시주맙은 약 150 kDa의 강한 밴드로 나타난다. 레인 2 (B-NP) 및 3 (B-NP-PEG35)에서 유사한 밴드가 관찰되었다. 마찬가지로 알부민 (레인 4)에 해당하는 밴드 또한 레인 1-3에 명확하게 나타난다.
실시예 9. 위스타 쥐에 안구로 투여된 나노 입자의 생체 분포 연구
생체 내 SPECT-CT 이미징을 위한 위스타 쥐에서의 NP 방사성 표지 및 생체 분포 연구
나노 입자의 방사성 표지는 다른 곳에 기술된 방법에 따라 틴 클로라이드로 99mTc- 퍼테크네테이트(pertechnetate)의 환원에 의해 99mTc로 수행되었다. 간단히, 주사용 수 중의 틴 클로라이드 디하이드레이트(tin chloride dihidrate) 용액 20 μl 및 0.02 mg/ml의 최종 주석 농도가 동결 건조된 나노 입자 9 mg에 첨가된 후, 60 μl의 99mTcO4- 용출액을 예비 환원된 주석에 첨가하였다. 0.6 mg의 비표지된 나노 입자 제제와 혼합된 나노 입자의 방사성 표지된 현탁액 (4 MBq) 4 μL, 및 이러한 혼합물은 이소플루오란-마취된 위스타 쥐의 오른쪽 눈에 조심스럽게 투여되었다.
생체 내 SPECT-CT 이미징을 위해 위스타 쥐에 안과적 투여
눈으로부터 현탁액의 활성 제거를 피하기 위해 동물을 1 시간 동안 마취시킨 후, 나노 입자의 투여 30 분 후 5 시간 내지 17 시간 사이에 6 개의 상이한 시점에서 각성 및 SPECT-CT 이미지들을 수득하였다.
영상 연구를 위하여 동물은 이소플루오란으로 각각의 연구 직전에 마취되고 Symbia T2 Truepoint SPECT-CT 시스템 (Siemens)에서 위치하기 쉬운 위치에 위치되었다. 128x128 매트릭스, 7개 이미지/초를 사용하여 획득한 이미지; CT는 110 mAs 및 130 Kv, 3 mm 두께 130 이미지로 설정되었다. 이미지 융합은 Syngo MI Applications TrueD 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 내장 소프트웨어 시스템을 사용하여 이미지를 처리하고 정량화했다. 수량의 평균값을 구한 관심있는 볼륨 (VOI)을 얻기 위해 선택한 영역에 대해 3 개의 평면에 등고선을 자동으로 그려 양적 값을 얻었습니다. 관심있는 볼륨 (VOI)을 얻기 위해 선택한 영역에 대해 3 개의 평면에 등고선을 자동으로 그려 정량적 값들을 얻었고 그로부터 카운트들의 평균값들을 취하였다.
도 11 및 12는 점안제로서 안구 투여 후 B-NP 및 B-NP-PEG35 의 생체 분포를 보여준다. 나노 입자와 관련된 방사능은 B-NP의 경우 4 시간 이상, B-NP-PEG35의 경우 8 시간 동안 눈에 남아 있지만, 그럼에도 불구하고 투여 지점에서 서서히 사라지고 위장관으로 들어간다. 동물의 인두를 통한 방사성 표지된 나노 입자의 수송은 도 11에서 가장 왼쪽 위 이미지에서 볼 수 있다. 도 11의 SPECT 이미지의 강도는 동물의 몸에서 방사능의 위치를 더 잘 이해할 수 있기 위하여 각 개별 이미지에서 가장 높은 강도로 조정되었다.
방사능의 반정량적 붕괴-보정된 시간-경과 진화는 도 12에서 B-NP 에 대해 도시되어 있다. B-NP-PEG35 와의 결과는 매우 유사하지만, 상기 나노 입자는 눈에 더 많은 시간이 남아 있기 때문에 분비하는데 시간이 더 오래 걸린다.
실시예 10. 수컷 위스타 쥐에 정맥내 투여 후 나노 입자의 생체 분포
위스타 쥐 에서의 생체 내 생체 분포 영상화 실험을 위해, 99mTc 표지된 베바시주맙-로딩된 HSA 나노입자 (B-NP) 및 PEG35 (B-NP-PEG35)로 코팅된 베바시주맙-로딩된 HSA 나노입자가 투여되었다. 5mg의 베바시주맙/체중의 kg 인 단일 용량을 정맥 내로 투여하고, 투여 후 10시간까지 2시간마다 사진을 찍었다.
정맥내 투여 후 1 시간 후에는 B-NP 및 B-NP-PEG35의 주사와 관련된 방사능이 도 13에서 보는 바와 같이 간 및 신장에서 관찰된다. 또한 B-NP-PEG35 의 간 흡수가 적다는 것을 주목할 가치가 있다. B-NP 및 B-NP-PEG35는 어떤 기관에도 축적되지 않는다.
실시예 11. 각막 혈관 신생에 대한 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자의 효과
약 200g의 수컷 위스타 쥐를 각막 혈관 신생의 래트 모델에서 베바시주맙-로딩된 나노 입자의 효능을 시험하기 위해 Harlan 으로부터 수득하였다. 동물 실험에 관한 유럽의 법률에 따라 기관의 동물 실험을 위한 윤리위원회 (프로토콜 번호 172-14)에 의해 연구가 승인되었다.
100 ㎕의 5 mg/kg 자일라신 용액 (Xilagesic, Calier Laboratory) 및 200 ㎕의 40 mg/kg 케타민 용액 (IMALGENE, Merial)을 복강 내 투여한 후 동물을 진정시켜 유지시켰다. 그 후, 한 방울의 안근마비 점안제(cycloplegic collyrium )(Coliricusi Tropicamida, 10 mg / ml, Alcon)를 쥐의 각 눈에 투여하였다. 5분 후, 눈의 표면에 질산은 스틱 (Argepenal, Braun)을 5초 동안 도포하여 쥐의 각막을 태웠다. 마지막으로, 눈을 NaCl 0.9 % p/v의 멸균 용액으로 세척하였다.
12시간 후, 동물들을 이소플루오란(Isovet, Spain)으로 마취시키고 다른 그룹들로 나누었다. 동물들의 눈에 점안제로서 다음과 같은 처리를 적용하였다 : (i) 7일 동안 12시간마다 4 mg/ml 베바시주맙 (Avastin®) 수용액 10 μl , (ii) 7일 동안 12시간마다 4 mg/mL aflibercept (Eylea®) 수용액 10 μl, (iii) 7일 동안 12시간마다 10μl의 0.1 % 덱사메타손 포스페이트(Coliriculi dexametasona®) 수용액 10 μl (iv) 1 주일 동안 매일 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자 (B- NP;40 μg 베바시주맙을 함유하는 10 μL 현탁액), 및 (v) 1 주일 동안 매일 PEG35 (B-NP-PEG35; 40 μg 베바시주맙을 함유하는 10 μL 현탁액)로 코팅된 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자. 대조군으로서, B-NP-PEG35로 투여된 것과 유사한 양으로 한 동물 그룹은 생리학적 혈청(PBS)을 제공받았고, 또 다른 그룹의 동물은 PBS (HSA)에 용해된 인간 혈청 알부민을 제공받았다.
도 14는 0 시간 (0 일)에 발생하는 각막의 소작(cauterization) 및 24 시간 (1 일)에 첫 번째 처리를 나타내는 개략적인 타임 라인에 해당한다.
계산을 위해 각막의 디지털 이미지들을 ImageJ 소프트웨어 (public domain, http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 촬영하고 분석하였다. 이들 이미지들로부터, 질산은(병변)으로 화상에 의해 점유된 각막의 표면뿐만 아니라 각막의 총 면적이 결정되었고, 새로운 혈관의 생성(각막 혈관 신생)에 의해 영향을 받는 면적은 픽셀 계수에 의해 계산되었다.
이들 파라미터들로부터, 침습 영역 (IA) 및 CNV (병변 표면에 의해 정규화 된 각막 혈관 신생)를 다음과 같이 결정하였다 :
IA= [(새로운 혈관의 생성에 의해 영향을 받은 영역)/(총 각막 영역)] x 100
CNV = IA / (화상에 의해 영향을 받은 눈의 표면)
표 5는 병변에 의해 유도된 혈관 신생에 의해 영향을 받는 눈 표면의 감소 결과로서 상이한 베바시주맙 치료의 효능을 요약한다 (도 15). 모든 경우에, 동물의 눈에 유도된 병변은 유사하였고, 4 개의 그룹 사이의 병변 영역들에서 통계적 차이가 발견되지 않았다 (p> 0.05;도 16).
베바시주맙 용액(BEVA)으로 처리된 동물 그룹은 PBS (음성 대조군)를 받는 동물보다 혈관 신생에 의해 영향을 받는 눈의 하부 표면을 나타냈다. 한편, 베바시주맙- 로딩된 나노 입자(B-NP)로 처리된 동물에서, 각막 혈관신생에 의해 영향을 받는 눈의 표면은 Avastin® 로 처리된 동물(BEVA)에 대해서보다 2.7배 더 낮은 것으로 밝혀졌다.(도 17 및 18) 베바시주맙-로딩된 페길화된 나노 입자로 동물을 치료했을 때, 신생 혈관 형성에 의해 영향을 받는 표면에서의 감소는 Avastin®으로 처리된 동물에서보다 약 1.4 배 더 낮았다. 나노 입자로 처리된 동물은 Avastin®으로 처리된 동물에 투여된 베바시주맙의 50 % 적은 양을 받았다는 것을 강조하는 것이 중요하다. 또 다른 중요한 관찰은 실험 조건 하에서 덱사메타손(dexamethasone)이나 Eylea® 모두가 혈관 신생에 긍정적인 영향을 나타내지 않았다는 것이다 (표 9, 도 15).
표 5. 질산은 스틱으로 화상에 의해 유도된 각막 혈관 신생에 대한 베바시주맙 제제의 효과.
BEVA: 베바시주맙 용액 (Avastin®, 4 mg/mL, 7일 동안 하루에 2회 투여); B-NP: 베바시주맙-로딩된 알부민 나노입자(7일 동안 하루에 1회 투여); B-NP-PEG35: PEG35으로 코팅된 베바시주맙-로딩된 알부민 나노입자 (7일 동안 하루에 1회 투여); HSA: 인간 혈청 알부민 용액; 덱사메타손: 0.1% 용액 7일 동안 하루에 2회; Eylea: Aflibercept 용액 (Eylea®, 4 mg/mL, 7일 동안 하루에 2회 투여); 대조군: PBS. IA: 침습 영역. CNV: 병변 표면에 의해 정상화된 각막 혈관 신생. 데이터는 평균 n=9의 +/- SD 로 표현됨.
병변에 의해 영향을 받은 눈의 표면 (%) IA
(%) 		CNV
대조군(-) 17.3 ± 4.0a 31.3 ± 4.6a 1.89 ± 0.49a
BEVA 15.1 ± 2.6a 24.4 ± 4.7c 1.69 ± 0.53a
B-NP 15.1 ± 2.9a 9.4 ± 1.6e 0.74 ± 0.24d
B-NP-PEG35 16.0 ± 4.1a 17.7 ± 2.9d 1.18 ± 0.38b
HSA 15.7 ± 3.9a 36.0 ± 5.9a 2.41 ± 0.60a
덱사메타손 17.7 ± 1.1a 34.4 ± 6.7a 1.94 ± 0.35a
Eylea 15.5 ± 2.2a 34.1 ± 6.5a 2.27 ± 0.68a
b p<0.05 ANOVA 에 이어 대조군(-)과 크게 다른 Tukey 테스트
c p<0.01 ANOVA 에 이어 대조군(-)과 크게 다른 Tukey 테스트
d p<0.005 ANOVA 에 이어 대조군(-)과 크게 다른 Tukey 테스트
e p<0.001 ANOVA 에 이어 대조군(-)과 크게 다른 Tukey 테스트
조직학
각막 혈관 신생을 가진 눈의 조직학적 연구를 위해, 치료 종료시, 각 그룹의 2 개의 눈이 적출되었다(enucleated). 안구 표면을 식염수로 세척하고 전방 극을 후방으로부터 분리하였다. 각막을 평평하게 장착하고, 4 % 파라포름알데히드로 24시간 동안 고정시킨 후, PBS로 각 샘플에 대해 여러 차례 세척을 수행하였다. 상기 각막은 후방 절단 및 분석을 위해 메탄올 70 %로 유지되었다.
각막의 분석을 위해, 이들을 파라핀에 포함시켰고, 각막의 중심 및 혈관 신생 영역으로부터 4 마이크로미터 섹션을 슬라이스하였다. 이어서 이들을 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 광 현미경을 사용하여 분석하였다. 섹션의 평가는 혈관 신생의 강도, 염증 강도, 섬유증, 부종 및 각막의 평균 두께를 포함하였다. 연구는 치료 그룹에 대해 맹검관에 의해 수행되었다. 디지털 카메라 Nikon DS-Ri 1이 장착된 Nikon Eclipse Ci 현미경으로 이미지를 촬영하였다. 상기 이미지는 디지털 이미지 Nikon의 NIS-요소에 대하여 보정된 분석 시스템을 사용하여 분석되었다.
혈관 신생 강도의 평가를 위해, 다음 점수가 사용되었다 : 0 = 혈관 신생의 부재; 1 = 최소 또는 음성 혈관형성에 근접함; 2 = 약한 혈관형성; 3 = 상피하 및 기질간 영역에서의 제한적 또는 국소적 혈관 형성 (보통의 혈관 신생); 4 = 매우 빈번하거나 강함; 5 = 확산 및 강한 혈관형성. 유사한 방식으로, 염증 강도를 다음과 같이 점수를 매겼다 : 0 = 염증 부재; 1 = 최소 또는 음성 염증에 근접함; 2 = 림프구, 호중성 백혈구 및 호산 백혈구와 같은 중심의(focal), 적은 수의 혼합된 염증성 세포 유형; 3 = 중등도의 염증; 4 = 매우 빈번하거나 강함; 5 = 강하고, 확산, 및 혼합된 염증성 세포 유형.
섬유아세포 활성에 대한 스케일링 시스템은 다음과 같다 : 0 = 섬유 아세포 활성의 부재; 1 = 최소 또는 음성 섬유 아세포 활성에 근접함; 2 = 중심의 섬유 아세포 활성; 3 = 중간의 섬유 아세포 활성; 4 = 매우 자주; 5 = 확산 및 강한 섬유아세포 활성. 마지막으로, 부종은 다음 점수로 분류되었다 : 0 = 부종의 부재; 1 = 최소 또는 음성 부종에 근접함; 2 = 경증 부종; 3 = 중등도 부종; 4 = 매우 빈번하거나 강함; 5 = 확산 및 강렬한 부종.
도 19는 이 연구에 관련된 동물의 눈에 대한 조직학적 연구를 보여준다. B-NP (도 19B)와 B-NP-PEG35 (도 19C)로 치료된 각막의 병변은 회복 단계에 있으며 이전에는 시력에 일시적으로 영향을 미쳤지만 지금은 그렇지 않다. 따라서 피해는 가역적이다. 반대로, 생리학적 혈청으로 치료된 각막의 병변은 시력에 매우 심각한 영향을 미치며 돌이킬 수 없는 것처럼 보인다 (도 19F).
표 6. 동물의 눈으로부터 얻은 샘플의 조직병리학적 평가. 대조군 -: 생리 학적 혈청으로 처리된 동물; BEVA : Avastin®으로 처리된 동물; B-NP : 베바시주 맙- 로딩된 나노 입자로 처리된 동물; B-NP-PEG35 : 베바시주맙- 로딩된 페 길화 된 나노 입자로 처리된 동물
샘플 섬유종
(Fibrosis) 		염증 평균 두께
(μm) 		혈관형성 부종
대조군 4 4 774.7 4 3
BEVA 1 4 570.5 2 1
B-NP 1 2 287.7 1 0
B-NP-PEG35 1 2 430.9 4 1
표 6은 여러 그룹의 병리학적 평가를 요약하였다. 혈청으로 처리된 각막은 베바시주맙으로 처리된 것보다 두께가 1.4 배 더 높고 B-NP로 처리된 것보다 2.7 배 더 높다. 한편, Avastin® (BEVA)으로 처리된 각막은 두께가 B-NP로 처리된 각막보다 2 배 더 높고 B-NP-PEG35로 처리된 것보다 1.3 배 더 두꺼운 것을 나타냈다. 비슷한 방식으로, B-NP로 치료된 각막은 섬유증이 적고 혈관형성이 작으며 부종이 없는 가장 좋은 증상을 나타내었다.
실시예 12. 종양 보유 누드 마우스에 정맥내 투여 후 나노 입자들의 생체분포
마우스에서의 종양 이미징 실험을 위해, 인간 간암종 세포(HepG2)를 표준 조건에서 배양하고, 플레이팅 후 1주일에 수확하고 PBS에 현탁시켰다. 누드 마우스에서 두 가지 다른 위치, 오른쪽 팔다리와 등의 상부에 5x105 HepG2 세포의 피하 주사 후 종양을 유도하였다.
종양 성장을 명확하게 볼 때까지 12-15 일 동안 추적한 다음, PEG35 로 코팅된 99mTc 표지 HSA 나노 입자(NP-PEG35)의 정맥 주사 후 동물을 SPECT-CT 생체 내 이미징 실험에 사용하였다. i.v. 투여 후 1 시간 및 4 시간에, 동물을 안락사시키고, 종양들 및 종양이 없는 반대쪽 다리로부터의 근육의 일부를 절제하였다. 샘플을 99mTc에 대해 보정된 감마 계수기에서 계수하고, 샘플 중량 및 부패를 보정하고, 반대쪽 다리로부터의 근육을 배경으로 사용하여 종양/비종양 비를 계산하였다.
종양 보유 마우스에서, 정맥내 주사된 NP-PEG35와 관련된 방사능은 도 20에서 볼 수 있는 바와 같이 종양에 농축된다(정상 조직과 비교되는 경우). 이러한 현상은 나노 입자의 투여 후 4 시간과 같이 시간-의존적인 것으로 보이며 종양에 존재하는 양은 이미 높은 값을 유지하지만 감소한다.(비율 종양/비 종양 > 6)
실시예 13. 뮤린 결장직장암 모델에 대한 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자의 효과
동물 실험에 관한 유럽의 법규에 따라 기관의 동물 실험 실험위원회 (프로토콜 번호 107-16)에 의해 연구가 승인되었다. 실험을 위해 Harlan Sprague Dawley, Inc.에서 약 20 그램 및 3 주령의 42 마리의 수컷 athimic 누드 마우스를 구입하였다. 마우스는 기관 지침에 따라 제어된 환경에서 유지시켰다. 음식과 물은 임의로 공급되었다.
인간 결장암 세포 (HT-29)를 표준 조건에서 배양하고, 플레이팅 후 1 주일에 수확하고 PBS에 현탁시켰다. 종양 유도 마우스를 흡입에 의해 이소플루란으로 마취시키고, 2-3 x 106의 HT-29 종양 세포 (베바시주맙-민감성 인간 결장암 세포주)를 함유하는 100 uL을 각 동물의 우측 옆쪽 측면에 피하 주사 하였다. 명확하게 볼 수있을 때까지 12-15 일 동안 종양 성장(직경 0.4-0.6 cm)을 추적한 다음 치료를 시작하였다.
마우스를 각각 7 마리 동물의 6개 그룹으로 무작위화 하였다 : (i) 베바시주맙 수용액 (Avastin), (ii) 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자 (B-NP), (iii) PEG35,000으로 코팅된 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자 (B-NP-PEG35), (iv) 생리적 혈청 (PBS), (v) B-NP-PEG35로 투여된 것과 유사한 양으로 PEG35,000 으로 코팅된 빈 나노 입자 (NP-PEG35) 및 (vi) B-NP를 투여받은 군과 유사한 양의 알부민을 함유하는 HSA 수용액. 모든 경우에, 5 mg의 베바시주맙/kg 체중을 함유하는 제제 150-200 ㎕를 정맥 내로 주당 2회 투여하였다. 대조군 그룹은 동일한 시점들에0.9 % 식염수로 정맥내 주사를 받았다.
0 일 (제 1 투여 전), 제 1 투여 후 15 일, 22 일 및 26 일에 에 혈액 샘플을 채취하였다. 베바시주맙 혈청 농도는 특정 효소 면역 검정 (Shikari Q-Beva)에 의해 측정되었다.
종양 부피 및 중량은 주당 1-2 회 기록되었다. 캘리퍼를 사용하여 종양 (V)을 폭 (W) 및 길이 (L)의 2차원으로 측정하고 하기 식 (식 5)을 사용하여 계산하였다 :
V (mm3) = 길이 x (폭)2 x 0.5 [식 5]
도 21은 종양 부피 대 시간을 보여준다. 동일한 부피를 갖는 종양을 각 그룹에서 성장시켰고 실험의 시작시 6개의 그룹 사이의 종양 부피에서 통계적 차이가 발견되지 않았다 (p> 0.05)
12일째에, B-NP-PEG35를 투여받은 그룹은 나머지 그룹보다 종양 부피가 유의하게 더 낮았다 (p <0.05). 14일까지, BEVA 및 B-NP-PEG35를 투여받은 그룹은 나머지 그룹보다 종양 부피가 상당히 낮았다 (p <0.05). 22일째, 어떠한 치료도 받지 않은 그룹은 베바시주맙-로딩된 나노 입자 (B-NP), 베바시주맙 (BEVA)으로 처리되고, 베바시주맙-로딩된 페길화된 나노 입자에서 (B-NP-PEG35)로 처리된 동물보다 더 높은 종양 부피를 나타냈다. 실험이 끝에 의해, 베바시주맙을 제공받지 않은 그룹의 동물 중 절반은 종양에 궤양이 생겼음을 언급할 가치가 있다.
도 22는 혈청에서 베바시주맙 수준을 나타낸다. 제 1 투여 후 0 (투여 전), 15, 22 및 26 일에 샘플을 채취하였다. 주간 투여 중 하나에 해당하는 22일째에 베바시주맙 수준의 증가가 있다는 것을 주목할 가치가 있다. 도 22에서, 자유 약물을 투여받은 마우스에서 베바시주맙의 혈청 수준은 나노 입자 (B-NP 및 B-NP-PEG35)를 투여받은 마우스보다 6 배 더 높다는 것을 알 수 있다.
나노 입자내로 캡슐화된 베바시주맙의 투여의 이점은 더 낮은 베바시주맙의 혈청 수준에 있다. 유리 베바시주맙의 정맥내 투여 후, 혈류에 고농도의 약물이 존재하며 이는 부작용을 일으킬 수 있다. 이 농도는 천천히 감소하여 정체기(plateau)에 도달한다. 그러나 새로운 용량을 투여한 후 혈류의 베바시주맙 농도가 증가하여 (도 22 참조) 부작용 가능성이 높아진다.
한편, 베바시주맙 나노 입자의 정맥 내 투여 후 약물의 혈청 수준은 천천히 증가하여 정체기에 도달한다. 이 농도는 유리 베바시주맙으로 얻은 것보다 6 배 낮으며, 이는 일정하게 유지된다. 또한, 새로운 용량이 투여될 때마다 혈액에서 베바시주맙의 최고 농도는 훨씬 낮다. 이는 부작용들의 가능성을 감소시킨다.
또한 폴리에틸렌글리콜은 나노 입자의 표면에 입체 장벽을 부여하여 옵소닌화(opsonization)를 방지하는데, 즉 정맥 주사후 수 시간 내에 주입된 용량(ID) 의 손실에 대한 주요 메커니즘이다.
Pet 이미징
실험 종료시, 페길화된 나노 입자 처리에서 베바시주맙 및 베바시주맙-로딩된 마우스 3 마리 및 생리학적 혈청을 18F-FDG-PET 이미징을 수행하도록 선택하였다. 이를 위해, 마우스를 밤새 금식시켰지만 임의로 물을 마실 수 있게 하였다. 그 다음날, 100 % O2 가스 중 이소플루란 2 %로 마우스를 마취시키고 18F-FDG PET 동안 여전히 유지시켰다. 스캐닝하기 40분 전에, 18F-FDG (80-100 μL에서 10 MBq ± 2)를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. PET 이미징은 2mm 해상도, 11.9cm 축 시야 (axial field of view, FOV) 및 12.8cm 축 방향 FOV를 갖는 전용의 소형 동물 필립스 모자이크 단층 촬영기 (Cleveland, OH)에서 수행되었다.
마취된 마우스를 PET 스캐너 베드에 수평으로 배치하여 15분의 정적 획득(sinogram)을 수행하였다. 데드 타임, 디케이, 랜덤 및 산란 보정을 적용하여 1mm 복셀 크기의 128x128 매트릭스에 2회 반복 및 0.024의 이완 파라미터를 갖는 3D Ramla 알고리즘 (실제 3D 재구성)을 사용하여 이미지를 재구성하였다.
종양 18F-FDG 흡수의 평가를 위해, 모든 연구는 PMOD 소프트웨어(PMOD Technologies Ltd., Adliswil, Switzerland)를 사용하여 수출 및 분석되었다.
관심 영역 (ROI)이 전체 종양을 포함하는 연속 슬라이스상에서 관상 1mm 두께의 작은 동물 PET 이미지 상에 그려졌다. 마지막으로, 다음 공식을 사용하여 각 종양에 대해 최대 표준화된 섭취 값 (SUV)을 계산하였다.
SUV = [조직 활성 농도(Bq/cm3)/주입된 용량(Bq)] Х 체중 (g)
표 7은 다른 그룹에서의 PET 이미징 결과를 요약한 것이다. SUVmax (최대 종양 흡수)와 관련하여, 가장 낮은 값은 B-NP-PEG35로 처리된 그룹에 해당하는 반면, 가장 높은 값은 생리학적 혈청을 받은 그룹에 해당하였다.
부피 측면에서, 가장 낮은 값은 B-NP-PEG35 및 HSA로 처리된 그룹에 속했다. 그러나 HSA 그룹에서 선택한 동물은 궤양이 없는 유일한 동물이기 때문에 대표적이지 않았다. 가장 높은 값은 치료를 받지 않은 그룹 (생리적 혈청)에 다시 속한다. B-NP-PEG35 그룹은 생리적 혈청 그룹보다 3 배 작고 BEVA 그룹보다 1.5 배 작다.
마지막으로, TLG (total lesion glycolysis)는 B-NP-PEG35로 치료한 그룹에 대해 가장 작은 값을 보였으며, 이는 BEVA로 치료한 그룹보다 1.5 배 낮고 생리학적 혈청을 받는 그룹보다 최대 3.5 배 낮았다.
표 7. PET 이미징 결과. P.S.: 생리 혈청으로 처리된 동물; B-NP-PEG35: 베바시주맙이 로딩된 페길화된 나노 입자로 처리된 동물; BEVA : Avastin®으로 처리된 동물.
SUV max 부피 TLG
P.S. 1,35 0,91 0,77
B-NP-PEG35 0,97 0,33 0,22
BEVA 1,15 0,48 0,34
실시예 14. 라니비주맙-로딩된 인간 혈청 알부민 나노 입자의 제조
라니비주맙-로딩된 HSA 나노 입자는 베바시주맙-로딩된 알부민 나노 입자에 대해 실시예 1에 기재된 것과 동일한 절차에 따라 제조하였다.
라니비주맙-로딩된 나노 입자의 경우, 최적의 항체/알부민 비는 0.15였다. 라니비주맙-나노 입자는 0.3 미만의 PDI 및 -15mV의 제타 포텐셜을 갖는 대략 210 nm의 입자 크기를 나타내었다.

Claims (24)

  1. 나노입자들을 포함하는, 안 질환 치료를 위한 약학조성물로서, 상기 나노 입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비-가교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하며, 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어가 코팅된때, 비-이온성 중합체로 코팅되고, 상기 안 질환은 황반 변성, 각막 혈관 신생 또는 혈관 형성, 홍채 혈관 신생 또는 혈관 형성, 망막 혈관 신생 또는 혈관 형성, 당뇨병성 증식성 망막 병증, 비 당뇨병성 증식성 망막 병증, 녹내장, 감염성 결막염, 알레르기성 결막염, 궤양성 각막염, 비궤양성 각막염, 상공막염, 공막염, 당뇨망막병증, 포도막염, 내안구염, 감염성 상태 및 염증성 상태로부터 선택되는 약학 조성물.
  2. 나노입자들을 포함하는, 암 치료를 위한 약학조성물로서, 상기 나노입자는 고체 코어를 포함하고, 상기 고체 코어는 비-가교 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되며, 상기 고체 코어가 코팅된때, 비-이온성 중합체로 코팅되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일클론 항체/알부민 중량비가 0.01 내지 0.5 인 약학 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비-이온성 중합체/알부민 비는0.02 내지 5 (w/w)인 약학 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민인 약학 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 베바시주맙, 라니비주맙, 트라스투주맙, 세툭시맙 및 리툭시맙으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비-이온성 중합체는 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시-n-프로필셀룰로오스, 히드록시-n-부틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 및 에틸히드록시에틸셀룰로오스로 이루어지는 군으로부터 선택된 수용성 셀룰로오스; 녹말; 덱스트란; 폴리비닐피롤리돈, 폴리에스테르; 및 폴리알킬렌 글리콜인 약학 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 나노 입자는 하기를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 약학 조성물:
    a) 알부민 및 단일클론 항체의 수용액을 제조하는 단계:
    b) 단계 a)의 수용액을 pH 4 내지 5로 적정하는 단계:
    c) 단계 b)의 수용액에 탈용매제를 첨가하여 알부민-단일클론 항체 나노 입자를 형성하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 나노입자는 단계(d) 및 (e)를 추가로 포함하는 방법에 의해 수득가능한 약학 조성물:
    d) 단계 c)에서 형성된 알부민-단일클론 항체 나노 입자를 비-이온성 중합체와 함께 배양하는 단계:및
    e) 진공 건조, 분무 건조 또는 동결 건조에 의해 나노 입자를 건조시키는 단계.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제2항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 췌장암, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 전립선 암, 흑색종, 결장암, 결장 직장암, 신장암, 자궁 경부암, 난소암, 간, 신장 및 위암, 방광암 또는 편평 세포 암인 약학 조성물.
  13. 고체 코어를 포함하는 나노 입자로서, 상기 고체 코어는 비-가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하고, 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되고, 상기 고체 코어는 비-이온성 중합체로 코팅된 나노 입자.
  14. 하기를 포함하는 약학 조성물.
    - 복수의 나노 입자, 상기 나노입자는 비-가교된 알부민 매트릭스 및 단일클론 항체를 포함하는 고체 코어를 포함하고, 상기 단일클론 항체는 알부민 매트릭스 전체에 분포되고, 상기 고체 코어는 코팅된 때, 비-이온성 중합체로 코팅됨; 및
    - 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 비히클.
  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서, 상기 나노 입자들은 건조 분말 형태인 약학 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 비히클은 경구, 국소 또는 비경구 투여에 적합한 약학 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민인 약학 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 베바시주맙, 라니비주맙, 트라스투주맙, 세툭시맙 및 리툭시맙으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  20. 제14항에 있어서, 상기 비-이온성 중합체는 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시-n-프로필셀룰로오스, 히드록시-n-부틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 및 에틸히드록시에틸셀룰로오스로 이루어지는 군으로부터 선택된 수용성 셀룰로오스; 녹말; 덱스트란; 폴리비닐피롤리돈, 폴리에스테르; 및 폴리알킬렌 글리콜인 약학 조성물.
  21. 제1항, 제2항, 또는 제14항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 베바시주맙 또는 트라스투주맙인 약학 조성물.
  22. 제1항, 제2항, 또는 제14항에 있어서, 상기 비-이온성 중합체는 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되는 약학 조성물.
  23. 제1항, 제2항, 또는 제14항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 베바시주맙 또는 트라스투주맙이고, 상기 비-이온성 중합체는 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되는 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 베바시주맙이고, 상기 비-이온성 중합체는 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트 및 폴리에틸렌 글리콜 35,000 으로부터 선택되는 약학 조성물.
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