CN111019900B - 一种微通道内构筑生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微通道内构筑生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的方法。该方法包括：内表面构筑有氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道制备，生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道制备。该方法简单，生产成本低，易于重复，所构筑的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列具有比表面积大、细胞结合位点多及易于修饰抗体的特点，并结合微流控技术，有望成为一种有效的循环肿瘤细胞检测工具，并应用于疾病诊断、食品安全分析等领域。
Description
技术领域
本发明属于循环肿瘤细胞捕获材料的制备方法领域，特别涉及一种微通道内构筑生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的方法。
背景技术
循环肿瘤细胞是从原发肿瘤或转移部位脱落的肿瘤细胞，可作为对早期癌症诊断的实时标志物，并且已被视为转移性癌症(如乳腺癌，肺癌，结肠直肠癌和前列腺癌)的诊断标志物，因其临床应用潜力巨大而引起了广泛的研究。然而，循环肿瘤细胞由于其极低的丰度(血液样本中每109个血细胞中只有几个到几百个)而使检测面临巨大的挑战。开发新的、高效的循环肿瘤细胞捕获和分离方法在临床应用中具有重要价值。
微流控技术因其固有的优点及特性，较好地契合了循环肿瘤细胞捕获的的需求。微流控技术通常是指体积从纳升到微升的微小流体在尺寸为数十到数百微米的微通道内流动的相关科学和技术，其交叉性涉及流体化学、流体物理、微电子器件、医学、生物学和生物医学工程等新兴交叉学科，其中微流控检测技术在生物医学检测方面应用广泛。微流控检测技术一般所需样品较少、耗时较短、操作便捷及体积较小等优点，适用于快速的即时检测。此外，通过流体化学技术在微通道的内表面构筑不同形貌的微纳结构材料，再进行界面的生物功能化，使纳米材料科学与微流控技术得到整合，进而显著提升微流控器件的性能，拓展其在生物医学检测领域的应用。
是美国FDA批准上市的唯一一款用于循环肿瘤细胞捕获的产品，但是捕获效率低及成本高昂限制了其在临床上的广泛应用。纳米结构修饰的平面基底在经过生物功能化之后对循环肿瘤细胞表现出了高的捕获效率(ACS Appl.Mater.Interfaces2018,10,23,19545-19553)。与未修饰的平面基底相比，纳米结构修饰的基底提供了更多与循环肿瘤细胞结合的位点从而能在捕获时提高捕获效率。虽然如此，纳米结构修饰的平面基底并未充分利用与循环肿瘤细胞结合的位点，因为其检测时主要利用重力使细胞沉积在基底上，从而降低了特异性识别抗体与循环肿瘤细胞之间的接触几率。而将纳米结构与微流控技术的结合很好的解决了这个问题，即样本在微通道内流动时，纳米结构上的结合位点将被充分利用从而达到更好的捕获效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种微通道内构筑生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的方法，以克服现有技术中循环肿瘤细胞难以捕获的缺陷。
本发明提供一种微通道内构筑生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的方法，包括：
(1)将玻璃毛细管用高锰酸钾水溶液活化，得到已活化的微通道，将锌盐和氟盐的混合液与六亚甲基四胺溶液以相同的速度同时连续通入已活化的微通道内反应，得到内表面构筑有氟代氢氧化锌纳米线阵列的微通道，处理，再同时连续通入锌盐溶液与六亚甲基四胺溶液继续反应，冲洗，烘干，得到内表面构筑有氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道；
(2)将第一硅烷偶联剂溶液通入步骤(1)中内表面构筑有氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道内，第一次孵育，冲洗，固化，再通入第二硅烷偶联剂溶液，第二次孵育，冲洗，然后通入N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯溶液第三次孵育，冲洗，再通入链霉亲和素溶液第四次孵育，冲洗，通入生物素化抗体第五次孵育，冲洗，得到生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道。
所述步骤(1)中将玻璃毛细管用高锰酸钾溶液活化为：将玻璃毛细管浸入高锰酸钾溶液中，在70～100℃下停留30～90min，其中高锰酸钾水溶液的浓度为0.1～50mM。
所述高锰酸钾水溶液的还原剂为正丁醇。
所述步骤(1)中锌盐包括硝酸锌、硫酸锌或乙酸锌；氟盐包括氟化铵或氟化钠。
所述步骤(1)中锌盐和氟盐的混合液中锌盐的浓度为0.01-1M，氟盐的浓度为0.01～1M，锌离子与氟离子的摩尔比为2:1～1:3。
所述步骤(1)中六亚甲基四胺溶液浓度为0.005-1M。
所述步骤(1)中锌盐溶液的浓度为0.01-1M。
所述步骤(1)中将锌盐和氟盐的混合液与六亚甲基四胺溶液以相同的速度同时连续通入已活化的微通道内反应为：将锌盐和氟盐的混合液与六亚甲基四胺溶液以相同的速度同时连续通入已活化的微通道内，先在290～350℃下反应1～2min，然后在70～90℃下反应1～2h，或者直接在70～90℃下反应1～2h。
所述步骤(1)中氟代氢氧化锌纳米线阵列的微通道处理温度为150～300℃，处理时间为30～60min。
所述步骤(1)中通入速度均为25～150μL/min；继续反应时间为30～120min。
所述步骤(1)中氟代氢氧化锌纳米线的长度为10～30μm；氧化锌为氧化锌纳米棒，长度为200～1500nm，直径为50～200nm。
所述步骤(2)中第一硅烷偶联剂溶液和第二硅烷偶联剂溶液浓度为1～10％v/v。
所述步骤(2)中第一硅烷偶联剂溶液和第二硅烷偶联剂溶液硅烷偶联剂溶液的溶剂为乙醇。
所述步骤(2)中第一硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷；第二硅烷偶联剂为3-巯基丙基三甲氧基硅烷；
所述步骤(2)中N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯溶液浓度为0.25～1mM。
所述步骤(2)中N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯溶液的溶剂为二甲基亚砜。
所述步骤(2)链霉亲和素溶液浓度为5～20μg/mL，溶剂为pH＝7.4的PBS溶液。
所述步骤(2)中生物素化抗体浓度为2.5～20μg/mL，溶剂为pH＝7.4的PBS溶液。
所述步骤(2)中第一次孵育为：室温孵育1～3h，然后50～60℃孵育0.5～1h。
所述步骤(2)中固化为：100～120℃真空热固化1～3h。
所述步骤(2)中第二次孵育温度为室温，时间为6～10h。
所述步骤(2)中第三次孵育、第四次孵育和第五次孵育温度均为室温，时间均为20～60min。
所述步骤(2)中生物素化抗体包括：抗表皮生长因子受体anti-EGFR、抗上皮细胞粘附分子anti-EpCAM或抗细胞程序性死亡-配体1anti-PD-L1。
所述步骤(2)中第一次孵育后的冲洗是用乙醇冲洗。
所述步骤(2)中第二次孵育后的冲洗是依次用乙醇和二甲基亚砜冲洗。
所述步骤(2)中第三次孵育后的冲洗是用二甲基亚砜和去离子水冲洗。
所述步骤(2)中第四次孵育和第五次孵育后的冲洗是用PBS冲洗。
本发明还提供一种上述方法制备得到的生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道。
本发明还提供一种上述方法制备得到的生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道在制备循环肿瘤细胞检测材料中的应用。检测时，玻璃毛细管的数量大于等于一根。
一般先将抗体修饰到材料基底的表面再进行细胞的捕获，相比于普通的平面基底，本发明微通道内构筑的微纳结构材料可以在三维空间上增加循环肿瘤细胞与材料的接触几率，并结合微流体使抗体抗原在各个维度上进行结合，从而达到增强捕获的作用，该器件具有特异性强、敏感性高、速度快的特点，是癌症诊断的一种有效检测手段。
本发明可通过控制反应液浓度、反应时间及抗体的修饰量，可在微通道内制备得到循环肿瘤细胞捕获性能优良的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列。本发明先采用流体化学法在已被活化的微通道内表面上构筑氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列，再在阵列表面修饰抗体孵育纳米林阵列生物功能，从而通过组装不同数量的微通道达到所需的捕获效率。
本发明因微纳结构氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列具有比表面积大、结合位点多的特性，同时又易于接枝不同特异性识别抗体，通过修饰特异性抗体达到特异性识别的作用，两者结合可有效地提升检测灵敏度和特异性，所以该氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列可以应用在生物、基础医学、疾病诊断及食品安全分析等多个领域。
有益效果
(1)本发明以内表面生长有氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的玻璃毛细管为微流控通道，再对氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列修饰具有特异性识别的抗体，通过结合循环肿瘤细胞表面过表达的蛋白实现捕获的目的，同时利用纳米林阵列在空间位点的优势达到相比于普通一维纳米线阵列增强的效果。本发明以微流控技术为基础，利用可拓展性组装循环肿瘤细胞捕获器件，可实现检测限低、灵敏度高、耗时短的即时检测，在循环肿瘤细胞的捕获及癌症诊断方面具有巨大的应用潜力。
(2)本发明以微流控技术为基础，具有操作简单，生产成本低，易于重复的特点。
附图说明
图1是实施例1中可拓展微流控和器件数码照片及其内部氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列示意图；
图2是实施例1中毛细管内修饰氟代氢氧化锌纳米线阵列的SEM图；
图3是实施例1中毛细管内修饰氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的SEM图；
图4是实施例1中毛细管内修饰氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列捕获循环肿瘤细胞的SEM图；
图5是实施例1中毛细管内修饰氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列对三种循环肿瘤细胞的捕获效率。
图6是实施例2中毛细管内修饰氟代氢氧化锌纳米线阵列的SEM图；
图7是实施例2中毛细管内修饰氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的SEM图；
图8是实施例2中毛细管内修饰氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列对三种循环肿瘤细胞的捕获效率。
图9是实施例3中毛细管内修饰氟代氢氧化锌菱形纳米柱阵列的SEM图；
图10是实施例3中毛细管内修饰氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的SEM图；
图11是实施例3中毛细管内修饰氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列对三种循环肿瘤细胞的捕获效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)微流控器件的制备
选用10mM高锰酸钾水溶液，将玻璃毛细管(内径为900μm，外径为1000μm，长度为10cm)浸入高锰酸钾溶液中，85℃下处理45min，处理后的玻璃毛细管作为微流控通道，选用聚四氟乙烯管(内径为300μm，外径为350μm)作为进样口和出样口材料，使用环氧树脂将聚四氟乙烯管与玻璃毛细管进行粘合，由此完成微流控器件的制备。
(2)微流控器件的功能化修饰
微流控器件四氟乙烯管中同时通入A液(硝酸锌(0.05M)、氟化铵(0.05M)混合液)，B液(六亚甲基四胺溶液(0.05M))，流速为42.45μL/min，300℃下同时通入A液、B液，反应时间为2min；反应完成后在90℃下同时通入A液、B液，反应时间为1h(此时冲洗烘干将毛细管的内管壁用扫描电子显微镜拍摄的图片见图2)；随后150℃处理1h，再同时通入(42.45μL/min)C液(硝酸锌(0.05M))、D液(六亚甲基四胺溶液(0.1M)))，反应时间1h，随后冲洗、烘干，将毛细管的内管壁用扫描电子显微镜拍摄(见图3)，上述反应液所用溶剂均为蒸馏水。
将上述烘干后的毛细管中浸入体积为15mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液(5％(v/v))，室温孵育2h，60℃孵育40min，用乙醇冲洗，110℃真空热固化2h。随后浸入10mL5％3-巯基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液孵育6h；冲洗是依次用乙醇和二甲基亚砜冲洗；再浸入10mL 0.5mM N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯二甲基亚砜溶液中孵育30min；二甲基亚砜和去离子水冲洗后注满10μg/mL链霉亲和素溶液(溶剂为pH＝7.4的PBS溶液)孵育30min，pH＝7.4的PBS溶液冲洗，最后注满10μg/mL的anti-EpCAM溶液(溶剂为pH＝7.4的PBS溶液)，pH＝7.4的PBS冲洗即得。
(3)检测阶段
先将5根功能化的玻璃毛细管组装成微流控器件，然后将含有循环肿瘤细胞的样本以1mL/h通入毛细管1h，PBS清洗，细胞脱水处理后在扫描电子显微镜下观察。
图2和图3表明：氟代氢氧化锌纳米线被成功合成，而后氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列被成功合成。
图4表明：循环肿瘤细胞在微通道内流动时可以被有效地被生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列捕获。
图5表明：循环肿瘤细胞在微通道内流动时可以被有效地被氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列捕获；对于不同细胞系，将1000个癌细胞分散于1mL培养基中，乳腺癌细胞MCF7的捕获效率达到92.4％，前列腺癌细胞PC-3的捕获效率达到91.3％，乳腺癌细胞MDA-MB-231的捕获效率达到90.4％，整个捕获过程仅为1h，实现了循环肿瘤细胞快速、灵敏的捕获。
实施例2
(1)微流控器件的制备
选用5mM高锰酸钾水溶液，将玻璃毛细管(内径为300μm，外径为400μm，长度为10cm)浸入高锰酸钾溶液中，在90℃下处理45min，处理后的玻璃毛细管作为微流控通道，选用聚四氟乙烯管(内径为300μm，外径为350μm)作为进样口和出样口材料，使用环氧树脂将聚四氟乙烯管与玻璃毛细管进行粘合，由此完成微流控器件的制备。
(2)微流控器件的功能化修饰
微流控器件四氟乙烯管中同时通入A液(硝酸锌(0.1M)、氟化铵(0.15M)混合液)，B液(六亚甲基四胺溶液(0.1M))，流速为25μL/min，在90℃下同时通入A液、B液，反应时间为1h(此时冲洗烘干将毛细管的内管壁用扫描电子显微镜拍摄的图片见图6)；随后150℃处理1h，再同时通入(50μL/min)C液(硝酸锌(0.05M))、D液(六亚甲基四胺溶液(0.05M))，反应时间1h，随后冲洗、烘干，将毛细管的内管壁用扫描电子显微镜拍摄(见图7)，上述反应液所用溶剂均为蒸馏水。
将上述烘干后的毛细管中浸入体积为15mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液(5％(v/v))，室温孵育2h，55℃孵育40min，用乙醇冲洗，110℃真空热固化2h。随后浸入10mL5％3-巯基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液孵育10h；冲洗是依次用乙醇和二甲基亚砜冲洗；再浸入10mL 0.3mM N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯二甲基亚砜溶液中孵育45min；二甲基亚砜溶和去离子水冲洗后注满5μg/mL链霉亲和素溶液(溶剂为pH＝7.4的PBS溶液)孵育45min，pH＝7.4的PBS冲洗，最后注满10μg/mL的生物素化anti-EpCAM溶液(溶剂为pH＝7.4的PBS溶液)，pH＝7.4的PBS冲洗即得。
(3)检测阶段
先将5根功能化的玻璃毛细管组装成微流控器件，然后将含有循环肿瘤细胞的样本以1mL/h通入毛细管1h，PBS清洗，收集未捕获的细胞并在荧光显微镜下观察计数，计算捕获效率。
图6和图7表明：氟代氢氧化锌纳米线被成功合成，而后氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列被成功合成。
图8表明：循环肿瘤细胞在微通道内流动时可以被有效地被氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列捕获；对于不同细胞系，将1000个癌细胞分散于1mL培养基中，乳腺癌细胞MCF7的捕获效率达到89.2％，前列腺癌细胞PC-3的捕获效率达到90.3％，乳腺癌细胞MDA-MB-231的捕获效率达到88.3％，整个捕获过程仅为1h，实现了循环肿瘤细胞快速、灵敏的捕获。
实施例3
(1)微流控器件的制备
选用5mM高锰酸钾水溶液，将玻璃毛细管(内径为500μm，外径为600μm，长度为10cm)浸入高锰酸钾溶液中，在90℃下处理30min，处理后的玻璃毛细管作为微流控通道，选用聚四氟乙烯管(内径为300μm，外径为350μm)作为进样口和出样口材料，使用环氧树脂将聚四氟乙烯管与玻璃毛细管进行粘合，由此完成微流控器件的制备。
(2)微流控器件的功能化修饰
微流控器件四氟乙烯管中同时通入A液(硝酸锌(0.1M)、氟化铵(0.1M)混合液)，B液(六亚甲基四胺溶液(0.1M))，流速为45μL/min，在90℃下同时通入A液、B液，反应时间为1h(此时冲洗烘干将毛细管的内管壁用扫描电子显微镜拍摄的图片见图9)；随后150℃处理1h，再同时通入(25μL/min)C液(硝酸锌(0.05M))、D液(六亚甲基四胺溶液(0.1M))，反应时间1h，随后冲洗、烘干，将毛细管的内管壁用扫描电子显微镜拍摄(见图10)，上述反应液所用溶剂均为蒸馏水。
将上述烘干后的毛细管中浸入体积为15mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液(4％(v/v))，室温孵育2h，50℃孵育40min，用乙醇冲洗，110℃真空热固化2h。随后浸入10mL4％3-巯基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液孵育8h；冲洗是依次用乙醇和二甲基亚砜冲洗；再浸入10mL 0.25mM N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯二甲基亚砜溶液中孵育45min；二甲基亚砜溶和去离子水冲洗后注满5μg/mL链霉亲和素溶液(溶剂为pH＝7.4的PBS溶液)孵育45min，pH＝7.4的PBS冲洗，最后注满5μg/mL的生物素化anti-EpCAM溶液(溶剂为pH＝7.4的PBS溶液)，pH＝7.4的PBS冲洗即得。
(3)检测阶段
先将7根功能化的玻璃毛细管组装成微流控器件，然后将含有循环肿瘤细胞的样本以1mL/h通入毛细管1h，PBS清洗，收集未捕获的细胞并在荧光显微镜下观察计数，计算捕获效率。
图9和图10表明：氟代氢氧化锌菱形纳米柱被成功合成，而后氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列被成功合成。
图11表明：循环肿瘤细胞在微通道内流动时可以被有效地被氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列捕获；对于不同细胞系，将1000个癌细胞分散于1mL培养基中，乳腺癌细胞MCF7的捕获效率达到90.5％，前列腺癌细胞PC-3的捕获效率达到91.3％，乳腺癌细胞MDA-MB-231的捕获效率达到89.3％，整个捕获过程仅为1h，实现了循环肿瘤细胞快速、灵敏的捕获。
本发明与现有技术的比较如表1(用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构阵列)所示：
表1.用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构阵列
由表1可知，与参考文献相比，本发明对材料制备的设备要求较低，制备简单，易于重复。此外，捕获过程中对MCF7的捕获效率高达92.4％，PC-3的捕获效率高达91.3％，均优于上述对比文献，且捕获时间仅为1h。
本发明表1中涉及的参考文献如下：
[1]F.Zhang,Y.Jiang,X.Liu,J.Meng,P.Zhang,H.Liu,G.Yang,G.Li,L.Jiang,L.J.Wan,J.S.Hu,S.Wang,Hierarchical Nanowire Arrays as Three-DimensionalFractal Nanobiointerfaces for High Efficient Capture of Cancer Cells,NanoLett.16(2016)766–772.
[2]Y.Song,Y.Shi,M.Huang,W.Wang,Y.Wang,J.Cheng,Z.Lei,Z.Zhu,C.J.Yang,Bioinspired Engineering of Multivalent Aptamer-Functionalized Nanointerfaceto Enhance Capture and Release of Circulating Tumor Cells,Angew.Chemie.131(2018)ange.201809337.
[3]S.Li,Y.Gao,X.Chen,L.Qin,B.Cheng,S.Wang,S.Wang,G.Zhao,K.Liu,N.Zhang,Highly efficient isolation and release of circulating tumor cellsbased on size-dependent filtration and degradable ZnO nanorods substrate in awedge-shaped microfluidic chip,Biomed.Microdevices.19(2017).
[4]R.Li,F.F.Chen,H.Q.Liu,Z.X.Wang,Z.T.Zhang,Y.Wang,H.Cui,W.Liu,X.Z.Zhao,Z.J.Sun,S.S.Guo,Efficient Capture and High Activity Release ofCirculating Tumor Cells by UsingTiO 2 Nanorod Arrays Coated with Soluble MnO2 Nanoparticles,ACS Appl.Mater.Interfaces.10(2018)16327–16334.
[5]H.Cui,B.Wang,W.Wang,Y.Hao,C.Liu,K.Song,S.Zhang,S.Wang,FrostedSlidesDecorated with Silica Nanowires for Detecting Circulating Tumor Cellsfrom Prostate CancerPatients,ACS Appl.Mater.Interfaces.10(2018)19545–19553.
[6]G.He,C.Yang,J.Feng,J.Wu,L.Zhou,R.Wen,S.Huang,Q.Wu,F.Liu,H.Chen,T.Hang,X.Xie,Hierarchical Spiky Microstraws-Integrated Microfluidic Devicefor Efficient Capture and InSitu Manipulation of Cancer Cells,Adv.Funct.Mater.29(2019)1806484.
Claims (7)
1.一种微通道内构筑生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的方法，包括：
(1)将玻璃毛细管用高锰酸钾溶液活化，得到已活化的微通道，将锌盐和氟盐的混合液与六亚甲基四胺溶液以相同的速度同时连续通入已活化的微通道内反应，处理，再同时连续通入锌盐溶液与六亚甲基四胺溶液继续反应，冲洗，烘干，得到内表面构筑有氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道；其中将锌盐和氟盐的混合液与六亚甲基四胺溶液以相同的速度同时连续通入已活化的微通道内反应为：将锌盐和氟盐的混合液与六亚甲基四胺溶液以相同的速度同时连续通入已活化的微通道内，先在290～350℃下反应1～2min，然后在70～90℃下反应1～2h，或者直接在70～90℃下反应1～2h；处理温度为150～300℃，处理时间为30～60min；
(2)将第一硅烷偶联剂溶液通入步骤(1)中内表面构筑有氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道内，第一次孵育，冲洗，固化，再通入第二硅烷偶联剂溶液，第二次孵育，冲洗，然后通入N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯溶液第三次孵育，冲洗，再通入链霉亲和素溶液第四次孵育，冲洗，通入生物素化抗体第五次孵育，冲洗，得到生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道；其中第一硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷；第二硅烷偶联剂为3-巯基丙基三甲氧基硅烷；其中所述步骤(2)中第一次孵育为：室温孵育1～3h，然后50～60℃孵育0.5～1h；第二次孵育温度为室温，时间为6～10h；第三次孵育、第四次孵育和第五次孵育温度均为室温，时间均为20～60min；生物素化抗体包括：抗表皮生长因子受体anti-EGFR、抗上皮细胞粘附分子anti-EpCAM或抗细胞程序性死亡-配体1anti-PD-L1。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中将玻璃毛细管用高锰酸钾溶液活化为：将玻璃毛细管浸入高锰酸钾溶液中，在70～100℃下停留30～90min，其中高锰酸钾溶液的浓度为0.1～50mM。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中锌盐包括硝酸锌、硫酸锌或乙酸锌；氟盐包括氟化铵或氟化钠；锌盐和氟盐的混合液中锌盐的浓度为0.01-1M，氟盐的浓度为0.01～1M，锌离子与氟离子的摩尔比为2:1～1:3；六亚甲基四胺溶液浓度为0.005-1M。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中通入速度均为25～150μL/min；继续反应时间为30～120min。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中第一硅烷偶联剂溶液和第二硅烷偶联剂溶液浓度为1～10％v/v；N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯溶液浓度为0.25～1mM；链霉亲和素溶液浓度为5～20μg/mL；生物素化抗体浓度为2.5～20μg/mL。
6.一种如权利要求1所述方法制备得到的生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道。
7.一种如权利要求1所述方法制备得到的生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的微通道在制备循环肿瘤细胞检测材料中的应用。
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| CN201911258802.1A Active CN111019900B (zh) | 2019-12-10 | 2019-12-10 | 一种微通道内构筑生物功能化的氟代氢氧化锌/氧化锌复合纳米林阵列的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111019900B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103406133A (zh) * | 2013-08-07 | 2013-11-27 | 东华大学 | 一种微通道内三维连通Pd网络结构的制备方法 |
| CN107653179A (zh) * | 2016-07-26 | 2018-02-02 | 北京纳米能源与系统研究所 | 一种微孔道装置及应用其的循环肿瘤细胞捕捉方法 |
| CN108489942A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-09-04 | 东华大学 | 一种微通道内氧化锌-聚丙烯酸钠复合纳米棒阵列的制备方法 |
| CN109748317A (zh) * | 2019-03-08 | 2019-05-14 | 淮北师范大学 | 一种氟化氢氧化锌纳米材料的可控合成方法 |
-
2019
- 2019-12-10 CN CN201911258802.1A patent/CN111019900B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103406133A (zh) * | 2013-08-07 | 2013-11-27 | 东华大学 | 一种微通道内三维连通Pd网络结构的制备方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 基于微纳结构分离材料的微流控器件的构建及其在蛋白质分离中的应用;赵德;《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20170215;第4.2.2.1节 * |
| 生物材料表面微结构对循环肿瘤细胞粘附、增殖及捕获率的影响;吴兴达等;《广东医科大学学报》;20190729;第37卷(第4期);第1.2.2节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111019900A (zh) | 2020-04-17 |
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