CN111019009A - 一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种粗多糖的提取纯化技术，特别涉及一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法。本发明利用蛋白酶K的特异性酶解活性去除杂质蛋白，具体方法为：将海藻粗多糖溶解于Tris‑HCl‑CaCl₂溶液中，震荡溶解，得粗多糖溶液；加入蛋白酶K溶液，得到酶解液；再加入无水乙醇，在0‑5℃下沉淀，分离得到海藻多糖。本发明利用蛋白酶K在特定条件下的酶解活性与冰乙醇对多糖的沉淀能力，最大程度地除去海藻粗多糖中的杂质蛋白，时保证海藻多糖的结构完整，提高了海藻多糖的纯度。该方法简单、高效、安全，不仅能提高海藻的利用率，降低企业生产成本，也为海藻多糖的分离纯化及后续的食品药品开发提供方法学支撑和理论依据。

Description

一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法

技术领域

本发明属于海洋生物综合利用领域，涉及一种粗多糖的提取纯化方法，特别涉及一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法。

背景技术

海藻作为重要的经济型海洋资源，已成为当代开发研究的热点。海藻具有纯绿色，纯天然，且资源丰富等诸多优势。国内外学者对海藻的研究均表明海藻中富含大量的钙、矿物质、膳食纤维、多肽、黄酮等成分，同时多糖和维生素的含量也很丰富具有诸多保健功能。目前以海藻为原料开发上市的食品和保健品已在市场中备受广大消费者的青睐。随着近年来海藻研究的进一步发展，发现多糖也是藻类的重要活性物质之一，具有抗菌功效，可以调节免疫系统，同时具有一定的降脂减肥功效。

石珊瑚叠层藻(Lithothamnion superpositum，石层藻)是南美洲海岸发现的一种红色珊瑚藻，归属于轮藻门珊瑚目石藻属。石层藻广泛分布于热带和亚热带的海岸附近，含有丰富的钙和多种元素，也被称为藻类钙质。它是一种重要的进口型经济海藻，并在化妆品、纺织，特别是食品行业有广泛的应用，已经被制成多种类型的食品和保健品，具有较好的市场开发前景。现有的结果表明，石层藻多糖能减轻血管紧张素Ⅱ诱导的冠状动脉内皮细胞炎症，石层藻中的多糖硫酸酯对α-淀粉酶和α-半乳糖苷酶具有一定的抑制作用，通过对硫酸化半乳聚糖进行化学修饰得到的多糖偶联物能增强5-F基团的抗肿瘤活性。总体而言，多糖已经成为海藻类活性物质先导化合物及开发新食品药品添加剂的重要源泉。

与此同时，海藻多糖的提取、分离纯化等制备工艺也成为了研究热点。目前海藻多糖的提取方法主要有水提法、超声提取法、微波提取法以及酶法等，但这些方法均为非特异性的提取方法。并且提取所得到的通常为海藻粗多糖，其中含有大量的杂质蛋白质。这些蛋白在海藻多糖中含量较高，甚至可高达30％左右，严重影响海藻多糖的纯度，给后续研究增加难度。除去海藻多糖中的杂质，进一步纯化提高多糖纯度，是海藻多糖开发利用急需解决的技术难点。

目前去除海藻粗多糖中杂质蛋白的常用方法主要有三氯乙酸法(TCA法)、酸碱法、Sevage法等。其中TCA法是根据蛋白在有机酸的作用下失活，形成不可逆的沉淀，从而去除粗多糖中的蛋白杂质，但该方法需要重复操作，且使多糖降解，活性减弱，损失较大。酸碱法则是利用粗多糖中酸性蛋白在酸的作用下沉淀、碱性蛋白在碱的作用下沉淀的性质以除去样品中的蛋白，但对于多糖结构有一定的破坏作用。Sevage法是目前较常用的脱蛋白法，其原理是根据蛋白质在氯仿等有机溶液中易变性的性质，操作相对简便，但加入的大量有机溶剂会影响海藻多糖的品质，需要进一步去除残留溶剂，效率较低。

近些年也出现一些去除海藻中杂质的新方法，如吸附法采用的是大孔树脂、活性炭及合成的具有吸附能力的多孔材料，依赖范德华力或氢键等作用力，通过非特异性吸附去除粗多糖中的杂质。但是吸附法存在操作时间长、多糖损失严重等问题。而酶法的特点在于专一性强、可特异性去除杂质蛋白。目前也有报道采用酶法去除多糖中的蛋白杂质，但所用酶的成本相对较高，且存在灭活温度高、易破坏多糖结构和活性等问题，使其应用范围受到限制。

综上所述，虽然近年来在海藻多糖的提取、纯化技术研究方面取得了一定进展，但现有的纯化除杂方法仍以非特异性方法为主，且各有利弊，普遍存在操作繁琐、试剂浪费、除杂效率低等诸多问题。

发明内容

针对现有技术所存在的缺陷，本发明旨在提供一种高效的特异性去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，提高了海藻多糖的纯度。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实施：一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，包括如下步骤：

将海藻粗多糖溶解于缓冲体系，震荡溶解，得粗多糖溶液；

在粗多糖溶液中加入蛋白酶K溶液，得到酶解液；

在酶解液中加入无水乙醇，在0-5℃下沉淀，分离得到海藻多糖。

蛋白酶K(Proteinase K)归属于枯草杆菌蛋白酶类，是一种来源于酵母菌的高活性丝氨酸蛋白酶，切割活性广泛，可通过切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，达到特异性降解蛋白的目的。海藻粗多糖中的杂质蛋白酶解为小分子肽段后，在后期加入有机溶剂时就不会被沉淀。蛋白酶K可最大程度的去除海藻粗多糖中的杂质蛋白，同时保证海藻多糖的结构不被破坏，实现高效的分离纯化。

优选地，本发明所用缓冲体系为50mM的Tris-HCl缓冲液和10mM的CaCl₂溶液混合得到的Tris-HCl-CaCl₂溶液。

蛋白酶K的pH适用范围广，反应条件温和，活性高，价格低廉，安全性较高。蛋白酶K有两个Ca²⁺结合位点，且该位点离酶的活性中心有一定距离，而在Ca²⁺存在的条件下可以有效的保护proteinase K不自溶，同时增加其热稳定性，因此本发明溶解粗多糖的缓冲液中加入了适量CaCl₂，CaCl₂溶液中的Ca²⁺还有助于提高酶的活力。

优选地，上述Tris-HCl-CaCl₂溶液中Tris-HCl缓冲液的pH值为6.5-7.2。

进一步优选，上述Tris-HCl-CaCl₂溶液中Tris-HCl缓冲液的pH值为6.8。

优选地，本发明所用蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL。

优选地，本发明所用蛋白酶K溶液为将蛋白酶K溶解于50mM的Tris-HCl缓冲液制得，Tris-HCl缓冲液的pH值为6.5-7.2。

进一步优选，本发明中溶解蛋白酶K的Tris-HCl缓冲液的pH值为6.8。

蛋白酶K在4-12.5的pH范围内均有活性，常规的Tris-HCl缓冲液为中性至碱性，而本发明在试验中发现缓冲液的pH值对粗多糖中杂质蛋白的去除率有一定影响，当Tris-HCl缓冲液为中性偏微酸性时，蛋白酶K的酶解和乙醇沉淀除杂的效果最好。

优选地，本发明在酶解液中加入无水乙醇之前，先将酶解液在55-65℃下孵育1-3小时，再冷却至0-5℃。

蛋白酶K的理想孵育温度为55-60℃，理想孵育时间为2-2.5小时，而当温度超过65℃时就会迅速变性。在上述孵育温度和孵育时间内，蛋白酶K可使海藻粗多糖中的蛋白充分酶解，再利用乙醇在低温下对多糖的沉淀能力，进一步分离得到纯化的海藻多糖。

优选地，本发明用于酶解液沉淀的无水乙醇为预先冷却的食用级乙醇，所述酶解液与加入的无水乙醇的体积比为1:6-8。

优选地，本发明在酶解液中加入无水乙醇后，静置沉淀4-10小时。

进一步优选，本发明中加入乙醇后的沉淀温度为4℃，沉淀时间为5小时。

优选地，本发明所述的海藻粗多糖通过水提醇沉法制得，具体包括如下步骤：

将海藻粉碎，烘干，得到海藻粉末；

称取海藻粉末置于圆底烧瓶中，加入15-30倍质量的蒸馏水，水浴提取得到提取液；

提取液浓缩后得到浓缩液，加入6-8倍体积的无水乙醇，静置沉淀，离心；

将离心后的沉淀用无水乙醇洗涤2-5次，干燥，得到海藻粗多糖。

优选地，本发明采用水浴法提取海藻中的粗多糖类物质，具体为在80-85℃的恒温条件下水浴90-120min。

优选地，本发明制备粗多糖的醇沉条件为在0-5℃下静置沉淀4-8h。

优选地，本发明在醇沉后进行离心，具体条件为以2000-4000r/min的转速离心10-30min。

优选地，本发明所用海藻为红藻门或褐藻门的藻类。

其中红藻门的藻类可以列举为石珊瑚层藻、紫菜、石花菜、海萝、鹧鸪菜、海人草、蜈蚣藻等，但不仅限于此；褐藻门的藻类可以列举为海带、巨藻、泡叶藻、墨角藻等，但不仅限于此。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明将水提醇沉得到的海藻粗多糖充分溶解后，加入微量蛋白酶K溶液，在其活性范围内实现杂质蛋白的特异性酶解，使其降解为肽链分子，最大程度地去除海藻粗多糖中的杂质蛋白，同时保证海藻多糖的结构完整。

2、本发明利用蛋白酶K在特定条件下的酶解活性与冰乙醇对多糖的沉淀能力，有效去除了海藻粗多糖中的杂质蛋白，制得高纯度的海藻多糖，该纯化方法无需使用大量化学试剂，具有简单、高效、安全、经济、环保的特征。

3、本发明的纯化方法不仅可以显著提高海藻多糖的蛋白去除率和多糖纯度，还可进一步增强海藻多糖的抗氧化性能。

附图说明

图1为去除海藻粗多糖中杂质蛋白的工艺流程图。

图2为实施例1中制得的海藻多糖的红外光谱图。

图3为实施例1与对比例1中制得的海藻多糖对羟基自由基的清除能力对比图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，结合附图对本发明的技术方案作进一步描述说明。下列实施例将有助于本领域技术人员对本发明技术方案的理解，但本发明并不限于这些实施例。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。

实施例1

本实施例以石珊瑚层藻为原料，去除石珊瑚层藻粗多糖中的杂质蛋白的方法具体包括如下步骤：

(1)将石珊瑚层藻万能高速粉碎机粉碎，粉碎时间50s，于40℃下烘干至恒重，得到石珊瑚层藻粉末；

(2)称取10.50g石珊瑚层藻粉末，置于圆底烧瓶中，加入200mL蒸馏水，在85℃水浴中搅拌提取100min，过滤得到提取液；

(3)将提取液用旋转蒸发仪在60℃下浓缩至含水率为15％，冷却至室温后，加入200mL预冷的食用级乙醇，在4℃下沉淀5h，以3000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀用食用级乙醇洗涤3次，在40℃烘箱中干燥3h，得到石珊瑚层藻粗多糖；

(4)将50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝6.8)和10mM的CaCl₂溶液混合得到Tris-HCl-CaCl₂溶液，取100.17mg石珊瑚层藻粗多糖粉末，加入5mL的Tris-HCl-CaCl₂溶液，充分震荡溶解，得到粗多糖溶液；

(5)在粗多糖溶液中加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，于55℃恒温箱中孵育2h，得到酶解液；

(6)在酶解液中加入20mL预冷的食用级乙醇，在4℃下沉淀5h，以3000r/min离心15min，弃去上清液，将沉淀置于40℃烘箱中干燥至恒重，得到纯化的石珊瑚层藻多糖。

制得的石珊瑚层藻多糖的红外光谱图如图2所示，其中3455cm^-1处的吸收峰为-OH的伸缩振动吸收峰，2967cm^-1处的吸收峰为糖类C-H不对称伸缩振动引起的，2368cm^-1为R-N＝C＝O的特征吸收峰，1720cm^-1处为羰基吸收峰，1162cm^-1处的吸收峰为环上碳-氧(C-O)峰，1023cm^-1为醇羟基的变角振动吸收峰，948cm^-1为D-吡喃葡萄糖环的振动吸收峰。

实施例2

本实施例以石珊瑚层藻为原料，去除石珊瑚层藻粗多糖中的杂质蛋白的方法具体包括如下步骤：

(1)将石珊瑚层藻万能高速粉碎机粉碎，粉碎时间50s，于40℃下烘干至恒重，得到石珊瑚层藻粉末；

(2)称取10.63g石珊瑚层藻粉末，置于圆底烧瓶中，加入300mL蒸馏水，在80℃水浴中搅拌提取100min，过滤得到提取液；

(3)将提取液用旋转蒸发仪在60℃下浓缩至含水率为15％，冷却至室温后，加入200mL预冷的食用级乙醇，在0℃下沉淀5h，以3000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀用食用级乙醇洗涤3次，在40℃烘箱中干燥3h，得到石珊瑚层藻粗多糖；

(4)将50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝6.8)和10mM的CaCl₂溶液混合得到Tris-HCl-CaCl₂溶液，取99.12mg石珊瑚层藻粗多糖粉末，加入5mL的Tris-HCl-CaCl₂溶液，充分震荡溶解，得到粗多糖溶液；

(5)在粗多糖溶液中加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，于55℃恒温箱中孵育2h，得到酶解液；

(6)在酶解液中加入20mL预冷的食用级乙醇，在0℃下沉淀5h，以3000r/min离心15min，弃去上清液，将沉淀置于40℃烘箱中干燥至恒重，得到纯化的石珊瑚层藻多糖。

实施例3

本实施例以石珊瑚层藻为原料，去除石珊瑚层藻粗多糖中的杂质蛋白的方法具体包括如下步骤：

(1)将石珊瑚层藻万能高速粉碎机粉碎，粉碎时间50s，于40℃下烘干至恒重，得到石珊瑚层藻粉末；

(2)称取10.28g石珊瑚层藻粉末，置于圆底烧瓶中，加入300mL蒸馏水，在80℃水浴中搅拌提取120min，过滤得到提取液；

(3)将提取液用旋转蒸发仪在55℃下浓缩至含水率为15％，冷却至室温后，加入200mL预冷的食用级乙醇，在2℃下沉淀8h，以3000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀用食用级乙醇洗涤2次，在40℃烘箱中干燥3h，得到石珊瑚层藻粗多糖；

(4)将50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝6.8)和10mM的CaCl₂溶液混合得到Tris-HCl-CaCl₂溶液，取100.63mg石珊瑚层藻粗多糖粉末，加入5mL的Tris-HCl-CaCl₂溶液，充分震荡溶解，得到粗多糖溶液；

(5)在粗多糖溶液中加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，于55℃恒温箱中孵育2h，得到酶解液；

(6)在酶解液中加入20mL预冷的食用级乙醇，在2℃下沉淀8h，以3000r/min离心15min，弃去上清液，将沉淀置于40℃烘箱中干燥至恒重，得到纯化的石珊瑚层藻多糖。

实施例4

本实施例以石珊瑚层藻为原料，去除石珊瑚层藻粗多糖中的杂质蛋白的方法具体包括如下步骤：

(1)将石珊瑚层藻万能高速粉碎机粉碎，粉碎时间60s，于40℃下烘干至恒重，得到石珊瑚层藻粉末；

(2)称取9.76g石珊瑚层藻粉末，置于圆底烧瓶中，加入150mL蒸馏水，在85℃水浴中搅拌提取90min，过滤得到提取液；

(3)将提取液用旋转蒸发仪在55℃下浓缩至含水率为15％，冷却至室温后，加入200mL预冷的食用级乙醇，在5℃下沉淀4h，以3000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀用食用级乙醇洗涤4次，在40℃烘箱中干燥3h，得到石珊瑚层藻粗多糖；

(4)将50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝6.8)和10mM的CaCl₂溶液混合得到Tris-HCl-CaCl₂溶液，取100.63mg石珊瑚层藻粗多糖粉末，加入5mL的Tris-HCl-CaCl₂溶液，充分震荡溶解，得到粗多糖溶液；

(5)在粗多糖溶液中加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，于55℃恒温箱中孵育2h，得到酶解液；

(6)在酶解液中加入20mL预冷的食用级乙醇，在5℃下沉淀6h，以3000r/min离心15min，弃去上清液，将沉淀置于40℃烘箱中干燥至恒重，得到纯化的石珊瑚层藻多糖。

实施例5

本实施例以石珊瑚层藻为原料，去除石珊瑚层藻粗多糖中的杂质蛋白的方法具体包括如下步骤：

(1)将石珊瑚层藻万能高速粉碎机粉碎，粉碎时间50s，于40℃下烘干至恒重，得到石珊瑚层藻粉末；

(2)称取10.14g石珊瑚层藻粉末，置于圆底烧瓶中，加入200mL蒸馏水，在85℃水浴中搅拌提取90min，过滤得到提取液；

(3)将提取液用旋转蒸发仪在60℃下浓缩至含水率为15％，冷却至室温后，加入200mL预冷的食用级乙醇，在4℃下沉淀5h，以2000r/min离心20min，弃去上清液，沉淀用食用级乙醇洗涤3次，在40℃烘箱中干燥3h，得到石珊瑚层藻粗多糖；

(4)将50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝6.8)和10mM的CaCl₂溶液混合得到Tris-HCl-CaCl₂溶液，取100.59mg石珊瑚层藻粗多糖粉末，加入5mL的Tris-HCl-CaCl₂溶液，充分震荡溶解，得到粗多糖溶液；

(5)在粗多糖溶液中加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，于60℃恒温箱中孵育1.5h，得到酶解液；

(6)在酶解液中加入20mL预冷的食用级乙醇，在4℃下沉淀5h，以2000r/min离心20min，弃去上清液，将沉淀置于40℃烘箱中干燥至恒重，得到纯化的石珊瑚层藻多糖。

实施例6

本实施例以石珊瑚层藻为原料，去除石珊瑚层藻粗多糖中的杂质蛋白的方法具体包括如下步骤：

(1)将石珊瑚层藻万能高速粉碎机粉碎，粉碎时间50s，于40℃下烘干至恒重，得到石珊瑚层藻粉末；

(2)称取10.23g石珊瑚层藻粉末，置于圆底烧瓶中，加入200mL蒸馏水，在85℃水浴中搅拌提取90min，过滤得到提取液；

(3)将提取液用旋转蒸发仪在60℃下浓缩至含水率为15％，冷却至室温后，加入200mL预冷的食用级乙醇，在4℃下沉淀5h，以4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用食用级乙醇洗涤3次，在40℃烘箱中干燥3h，得到石珊瑚层藻粗多糖；

(4)将50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)和10mM的CaCl₂溶液混合得到Tris-HCl-CaCl₂溶液，取100.89mg石珊瑚层藻粗多糖粉末，加入5mL的Tris-HCl-CaCl₂溶液，充分震荡溶解，得到粗多糖溶液；

(5)在粗多糖溶液中加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，于58℃恒温箱中孵育1.5h，得到酶解液；

(6)在酶解液中加入20mL预冷的食用级乙醇，在4℃下沉淀5h，以4000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀置于40℃烘箱中干燥至恒重，得到纯化的石珊瑚层藻多糖。

对比例1：Sevage法

用Sevage法去除石珊瑚层藻粗多糖中的杂质蛋白，具体包括如下步骤：

(1)取实施例1中得到的石珊瑚层藻粗多糖粉末99.76mg，加入5mL蒸馏水，充分震荡溶解，得到粗多糖溶液；

(2)将氯仿和正丁醇按体积比4:1混合，配置成Sevage试剂，取粗多糖溶液5mL与Sevage试剂1mL混合，充分振荡30min，以5000r/min离心1min，将水相与有机相分开；

(3)取离心后的上层粗多糖溶液，继续按体积比5:1加入Sevage试剂，振荡离心，共计重复操作5次；

(4)加入20mL食用级乙醇，室温下沉淀5h，过滤，并用乙醇洗涤3次，将沉淀置于40℃烘箱中干燥至恒重，得到纯化的石珊瑚层藻多糖。

对比例2：三氯乙酸法

用三氯乙酸法去除石珊瑚层藻粗多糖中的杂质蛋白，具体包括如下步骤：

(1)取实施例1中得到的石珊瑚层藻粗多糖粉末100.26mg，加入5mL蒸馏水，充分震荡溶解，得到粗多糖溶液；

(2)在粗多糖溶液中一边振荡一边滴加10％的三氯乙酸溶液，直至溶液澄清；

(3)在5℃下放置过夜，以4000r/min离心10min，弃去下层沉淀，上清液用NaOH溶液中和，用蒸馏水透析，冷冻干燥，即得纯化的石珊瑚层藻多糖。

对比例3：盐酸法

(1)将石珊瑚层藻万能高速粉碎机粉碎，粉碎时间50s，于40℃下烘干至恒重，得到石珊瑚层藻粉末；

(2)称取10.31g石珊瑚层藻粉末，置于圆底烧瓶中，加入200mL蒸馏水，在85℃水浴中搅拌提取100min，过滤得到提取液；

(3)将提取液用旋转蒸发仪在60℃下进行减压浓缩，得到粗多糖浓缩液；

(4)取50mL粗多糖浓缩液，加入2mol/L盐酸调节其pH值至3，放置过夜，以4000r/min离心10min，上清液用NaOH溶液中和，用蒸馏水透析，冷冻干燥，即得纯化的石珊瑚层藻多糖。

用苯酚-硫酸法分别对实施例1中石珊瑚层藻粗多糖、纯化的石珊瑚层藻多糖以及对比例1-3中石珊瑚层藻多糖进行含量测定。采用BCA试剂盒测定实施例1和对比例1-3样品中蛋白质含量，并计算蛋白质去除率(％)。多糖及蛋白质测定结果如表1所示。

表1实施例1和对比例1-3中石珊瑚层藻多糖中蛋白及多糖含量(n＝3)

名称	蛋白含量mg/g	蛋白去除率％	多糖含量％
				实施例1粗多糖	25.36±0.2	—	65.2±0.2
实施例1	0.15±0.05	99.4±0.04	91.4±0.1
				对比例1	5.89±0.11	76.8±0.06	84.1±0.1
对比例2	6.02±0.13	76.3±0.05	82.3±0.3
				对比例3	4.76±0.21	81.2±0.03	85.9±0.2

根据表1结果可知，实施例1中用蛋白酶K对海藻多糖中杂质蛋白的去除率高达99.4％，相较于Sevage法、三氯乙酸法和盐酸法，蛋白去除率分别提高了22.6％、23.1％、18.2％。实施例1中的石珊瑚层藻多糖的含量均高于实施例1-3，可知采用本发明的方法可基本除去海藻粗多糖中的蛋白杂质，多糖含量提高了7.3％。，同时较同浓度Sevage法、三氯乙酸法和盐酸法得到的海藻多糖对羟基自由基的去除效率更高。

采用酶标法测试实施例1及对比例1中石珊瑚层藻多糖对羟基自由基的清除能力，结果如图3所示，可知在不同浓度下，采用本发明方法纯化得到的海藻多糖对羟基自由基的抑制率均高于Sevage法制得的多糖，且在低浓度下，本发明纯化得到的海藻多糖对羟基自由基的清除能力接近于维生素C的清除能力。相比于常规方法，用蛋白酶K去除海藻粗多糖中的杂质蛋白不仅可以提高多糖含量和蛋白去除率，还可显著增加海藻多糖的抗氧化作用。

本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内，并且本发明方案所有涉及的参数间如无特别说明，则相互之间不存在不可替换的唯一组合。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，并不用于限定本发明的保护范围。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (10)

1.一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将海藻粗多糖溶解于缓冲体系，震荡溶解，得粗多糖溶液；

在粗多糖溶液中加入蛋白酶K溶液，得到酶解液；

在酶解液中加入无水乙醇，在0-5℃下沉淀，分离得到海藻多糖。

2.根据权利要求1所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述缓冲体系为50mM的Tris-HCl缓冲液和10mM的CaCl₂溶液混合得到的Tris-HCl-CaCl₂溶液。

3.根据权利要求2所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述Tris-HCl-CaCl₂溶液中Tris-HCl缓冲液的pH值为6.5-7.2。

4.根据权利要求1所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL。

5.根据权利要求4所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液为将蛋白酶K溶解于50mM的Tris-HCl缓冲液制得，Tris-HCl缓冲液的pH值为6.5-7.2。

6.根据权利要求1所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述酶解液与加入的无水乙醇的体积比为1:6-8，沉淀时间为4-10h。

7.根据权利要求1所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述海藻粗多糖通过以下步骤提取制得：

将海藻粉碎，烘干，得到海藻粉末；

称取海藻粉末置于圆底烧瓶中，加入15-30倍质量的蒸馏水，水浴提取得到提取液；

提取液浓缩后得到浓缩液，加入6-8倍体积的无水乙醇，静置沉淀，离心；

将离心后的沉淀用无水乙醇洗涤2-5次，干燥，得到海藻粗多糖。

8.根据权利要求7所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述水浴为在80-85℃的恒温条件下水浴90-120min。

9.根据权利要求7所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述静置沉淀为在0-5℃下沉淀4-8h。

10.根据权利要求7所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述海藻为红藻门或褐藻门的藻类。

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