CN111018893A - 一种含硫氨基醇席夫碱铜配合物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含硫氨基醇席夫碱铜配合物及其制备方法和应用,所述铜配合物的结构式为[Cu4(C12H14N2O4S)4],其中(C12H14N2O4S)2‑是含硫氨基醇席夫碱阴离子配体,即 L‑2‑[(5‑硝基‑2‑羟基氧‑苯亚甲基)‑氨基]‑4‑甲硫基‑1‑正丁醇阴离子。制备是将L‑蛋氨醇用无水甲醇溶解后,放入反应釜中,加入5‑硝基水杨醛,再加入氢氧化钾‑无水甲醇混合溶液,室温磁力搅拌溶液1‑2 h后,再加入可溶性铜盐的甲醇溶液,磁力搅拌0.5‑1.5 h后,停止搅拌,取出搅拌子后,将反应釜盖子拧紧置于鼓风恒温干燥箱中恒温干燥,得到针状和柱状绿色单晶,即为含硫氨基醇席夫碱铜配合物 [Cu4(C12H14N2O4S)4] 单晶。本发明铜配合物既是抗肿瘤药物的候选,又是肿瘤血管生成抑制剂。
Description
技术领域
本发明涉及铜配合物及其制备技术领域,具体涉及一种含硫氨基醇席夫碱铜配合物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤治疗一直面临着严峻的挑战。顺铂已经在临床上用于治疗肿瘤,但顺铂的毒副作用显著,并表现出显著的耐药现象。肿瘤的生长、恶化、浸润和转移与肿瘤血管生成密切相关。恶性肿瘤可以衍生自身的脉管系统而获得营养,肿瘤细胞获得营养后,又促进肿瘤血管的生成,这意味着肿瘤血管生成和恶性肿瘤细胞的发展之间有一个相互促进的作用。于是,研发低毒的、且既能抑制肿瘤血管生成又能诱导肿瘤细胞凋亡双重功能的抗肿瘤药物有重要意义。
铜是生命金属元素,据报道铜基活性配合物是传统铂类抗肿瘤药物的替代。此外,铜元素对血管生成有着密切的关系,血管内皮细胞对铜有着特殊的敏感性,因为螯合作用而使铜水平降低,有效地降低肿瘤血管的密度。而我们的研究发现,活性铜基配合物既能作为肿瘤血管生成的抑制剂,又是肿瘤细胞凋亡和损伤的诱导剂,通过对与肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖、生存与转移密切相关的重要信号分子进行了研究,阐述了活性铜基配合物抑制肿瘤血管生成以及诱导肿瘤细胞凋亡的分子机理。据报道含硫氨基酸席夫碱金属基配合物具有较强的生物活性,但具有抗肿瘤以及抑制肿瘤血管生成的含硫氨基醇类的多核铜基配合物未见有报道。在此,我们研发了一个比顺铂低毒的纳米级含硫氨基醇席夫碱四核铜基配合物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,提供一种比顺铂低毒的,且既可作为抗肿瘤药物,又可作为肿瘤血管生成抑制剂的纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物及其制备方法。
本发明所要解决的技术问题,通过以下技术方案予以实现:
一种含硫氨基醇席夫碱铜配合物,其结构式为[Cu4(C12H14N2O4S)4],是一个电中性的配位单元,(C12H14N2O4S)2-是含硫氨基醇席夫碱阴离子配体,即L-2-[(5-硝基-2-羟基氧-苯亚甲基)-氨基]-4-甲硫基-1-正丁醇阴离子。
所述的含硫氨基醇席夫碱铜配合物的制备方法,包含如下步骤:
S1将L-蛋氨醇(又名L-2-氨基-4-甲硫基-1-正丁醇,分子式是C5H14NOS)用无水甲醇溶解后,放入反应釜中,加入5-硝基水杨醛,再加入氢氧化钾-无水甲醇混合溶液,室温磁力搅拌溶液1-2h后,再加入可溶性铜盐的甲醇溶液,磁力搅拌0.5-1.5h后,停止搅拌,取出搅拌子后,将反应釜盖子拧紧置于鼓风恒温干燥箱中,设置鼓风干燥箱恒温为100℃,反应4天,之后温度降至60℃,反应1天,之后温度降至30℃,继续反应1天,然后关掉干燥箱电源,4h后从鼓风干燥箱中取出,开盖,得到针状和柱状绿色单晶,即为含硫氨基醇席夫碱铜配合物[Cu4(C12H14N2O4S)4]单晶,是四核铜配合物;
S2将[Cu4(C12H14N2O4S)4]单晶先用DMSO溶解,然后加入乙醇,形成以DMSO-乙醇作为混合溶剂的溶液,用透射电镜检测,观测到分散性好、平均粒径为80~90nm的 [Cu4(C12H14N2O4S)4]球状纳米粒子,即为纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物。
S1中所述的L-蛋氨醇、5-硝基水杨醛、氢氧化钾和可溶性铜盐的摩尔比为1~2:1~2:1~2: 2~3;优选地,L-蛋氨醇、5-硝基水杨醛、氢氧化钾和可溶性铜盐的摩尔比为1:1:2:2.5。
S1中所述的可溶性铜盐为硫酸铜、硝酸铜、氯化铜;优选硝酸铜。
S2中所述的DMSO-乙醇混合溶剂的体积比为1:0~1;优选体积比为1:1。
本发明另一目的是:制备的纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物在制备抗肿瘤药物中的应用,还作为制备肿瘤血管生成抑制剂的应用,以及作为制备抗肿瘤药物和肿瘤血管生成抑制剂的应用。
本发明制备的纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物与顺铂相比,对人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有相近的细胞毒性,显著诱导MDA-MB-231细胞凋亡,而对非癌的正常细胞的细胞毒性比顺铂小,诱导HUVECs细胞凋亡弱。实验表明,在体外,浓度分别为15μM 和20μM的纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物与人乳腺癌细胞MDA-MB-231共孵育48h,能诱导MDA-MB-231总凋亡率分别为43.2%和70.1%;相同条件下,对人脐静脉内皮细胞 HUVECs的总凋亡率分别为11.8%和22.9%。制备的纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物通过下调MDA-MB-231细胞中VEGR2信号转导通路中的重要蛋白VEGR2、FAK、AKT、Erk1/2 以及磷酸化蛋白p-VEGR2、p-FAK、p-AKT的表达显著诱导细胞凋亡和转移;其次,制备的纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物通过下调HUVECs中VEGR2信号转导通路中的重要蛋白 VEGR2、FAK、AKT、Erk1/2以及磷酸化蛋白p-VEGR2、p-FAK、p-AKT的表达诱导血管内皮细胞凋亡、阻碍肿瘤血管生成,从而抑制肿瘤转移。研究发现,制备的纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物与顺铂对Erk1/2信号转导通路有不同的作用机制,在肿瘤细胞MDA-MB-231 中,纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物显著地抑制Erk1/2蛋白的表达,对p-Erk1/2蛋白的表达没有显著影响,而顺铂没有抑制Erk1/2蛋白的表达,对p-Erk1/2蛋白的表达略有上调,可能是MDA-MB-231对顺铂产生了一定的耐药。实验表明,本发明制备的纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物是抑制肿瘤生长以及抑制肿瘤血管生成的双重功能抗肿瘤药物的候选。此外,直接用单晶溶解制备纳米粒子,操作简单,不带其他杂质,产品纯度高。
附图说明
图1为本发明[Cu4(C12H14N2O4S)4]的晶体结构图。
图2为本发明[Cu4(C12H14N2O4S)4]的纳米粒子N(TNCu-1)的形貌图。
图中TNCu-1指[Cu4(C12H14N2O4S)4]单晶;
N(TNCu-1)指[Cu4(C12H14N2O4S)4]的纳米粒子。
图3为实施例4流式细胞分析仪测定N(TNCu-1)体外诱导细胞凋亡与损伤实验结果图;
其中,图3(a)为N(TNCu-1)与乳腺癌细胞(MDA-MB-231)共孵育48h,诱导MDA-MB-231 细胞凋亡的实验结果图;
图3(b)为N(TNCu-1)与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)孵育48h,诱导HUVECs细胞凋亡的实验结果图。
图4为实施例5蛋白免疫印迹(Western blot)实验结果图;
其中,图4(a)、4(b)分别为实施例纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物[Cu4(C12H14N2O4S)4] 与HUVECs共孵育40h,用蛋白免疫印迹法分析细胞中重要蛋白FAK、AKT、Erk1/2以及磷酸化蛋白p-FAK、p-AKT和p-Erk1/2的表达结果,其中DDP为顺铂,做阳性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明,但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1[Cu4(C12H14N2O4S)4]单晶的制备
用无水甲醇溶解L-蛋氨醇,配成浓度为0.1mmol/mL的L-蛋氨醇无水甲醇溶液;用无水甲醇溶解KOH固体,配制成浓度为0.05mmol/mL的KOH无水甲醇溶液。于25mL的反应釜中,加入L-蛋氨醇无水甲醇溶液2mL(0.2mmol),5-硝基水杨醛0.0334g(0.2mmol),KOH 无水甲醇溶液6mL(0.3mmol)以及无水甲醇8mL,在室温下磁力搅拌溶液搅拌成旋涡状,溶液呈蛋黄色。搅拌1h后,于溶液中加入Cu(NO3)2·3H2O(0.1216g,0.5mmol)和6mL 无水甲醇,继续搅拌1h,得到绿色伴有少量浑浊液。停止搅拌后,将反应釜盖子拧紧置于鼓风恒温干燥箱中,反应釜在鼓风干燥箱中保持平衡,设置干燥箱温度为100℃,反应4天,之后温度降至60℃,反应1天,之后温度降至30℃,再反应1天,然后关掉鼓风干燥箱电源, 4h后从干燥箱中取出,开盖,观察到釜壁有针状和柱状晶体,晶体即为含硫氨基醇席夫碱四核铜基配合物[Cu4(C12H14N2O4S)4]单晶,结构如图1所示,图中没有标注的原子是C原子;为了清楚,C原子上的氢原子被删除,对称操作为:-x,1-y,-z.
实施例2[Cu4(C12H14N2O4S)4]纳米粒子的制备
将[Cu4(C12H14N2O4S)4]单晶先用DMSO溶解,然后加入缓慢加入乙醇,形成以DMSO-乙醇(体积比1:1)混合溶剂的溶液,终浓度为2.0mmol.L-1,用透射电镜检测,观测到分散性好、平均粒径为80~90nm的[Cu4(C12H14N2O4S)4]球状纳米粒子N(TNCu-1),如图2 所示。
实施例3[Cu4(C12H14N2O4S)4]纳米粒子体外细胞毒性实验
MTT法:取处于对数生长期的肿瘤细胞,调整活细胞浓度为5×104/mL加于96孔培养板,每孔100μL,在培养箱中培养18h后,再分别加入用无血清培养稀释的不同浓度受试样品100 μL,加样组每个浓度设6个复孔,同时做阴性对照,置于37℃,5%CO2培养48h,然后加入MTT(5mg/mL)20μL/孔,4h后用微量注射器轻轻吸出清夜,加入二甲基亚砜(DMSO) 150μL/孔,振荡10min左右,用酶标仪在490nm波长下测定OD值。计算细胞存活抑制率,通过软件计算其半数抑制浓度IC50。
抑制率=(OD阴性组平均值-OD测试组平均值)/(OD阴性组平均值-OD培养基对照)×100%
用MTT方法研究N(TNCu-1)对人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)和人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)的细胞毒性。实验结果表明,N(TNCu-1)与细胞孵育48h,5、10、15和20μM 的N(TNCu-1)对MDA-MB-231的生存抑制率分别为(6.66±0.10)%,(29.77±0.68)%, (62.50±0.07)%和(79.45±0.30)%,同样浓度的N(TNCu-1)对HUVECs的生存抑制率分别为(3.37±0.54)%、(19.58±0.23)%、(56.44±0.95)%和(73.48±0.25)%;N(TNCu-1) 对MDA-MB-231和HUVECs的IC50值分别为(12.83±0.06)μM和(14.47±0.08)μM,相同条件下,顺铂对MDA-MB-231细胞的IC50值为(10.47±0.18)μM,N(TNCu-1)与之相近,表明N(TNCu-1)对乳腺癌具有抑制作用;顺铂对HUVECs的IC50值为(7.23±0.08)μM,比 N(TNCu-1)的IC50值低,表明N(TNCu-1)比顺铂低毒。因此,本实施例的N(TNCu-1)具有显著地抑制所测肿瘤细胞增殖的能力,以及对血管内皮细胞也具有很强的抑制增殖作用。
表1.N(TNCu-1)与受试细胞孵育48h的IC50值.
实施例4流式细胞分析仪测定N(TNCu-1)体外诱导细胞凋亡与损伤实验(如图3所示)
凋亡分析试剂盒Annexin V/PI购买于美国BD公司(BD Bioscience)。MDA-MB-231细胞(1.5×105/孔)被种在12-孔板(康宁)培养20h,HUVECs(1.5×105/孔)被种在12-孔板(康宁)培养18h,然后用N(TNCu-1)分别与细胞孵育48h,终浓度分别为5、10、15和20μM。为检测早期和晚期凋亡,悬浮的和贴壁的细胞全部收集,用1×PBS洗涤两次,以1000r/min 转速离心5分钟,除去上清夜。细胞用100μl Binding Buffer重悬。随后,先用5μL Annexin-V染细胞,轻轻重悬细胞后,再用5μL PI染细胞。将细胞轻轻重悬,在37℃避光孵育15分钟。然后加Binding Buffer重悬细胞调整细胞密度,滤膜过滤后,用流式细胞分析仪(FACSCalibur,BD Bioscience)检测。
实验结果如图3(a)、3(b)所示,N(TNCu-1)对细胞的损伤非常弱,但是诱导细胞凋亡呈剂量依赖关系,15μM N(TNCu-1)诱导MDA-MB-231细胞的总凋亡率为43.2%,诱导HUVECs的总凋亡率为11.8%,20μM的N(TNCu-1)大大地提高了肿瘤细胞MDA-MB-231 的凋亡率,达70.1%,而它诱导HUVECs的总凋亡率为22.9%,表明N(TNCu-1)能显著诱导肿瘤细胞凋亡,但对正常细胞诱导凋亡的程度相对较弱。
实施例5蛋白免疫印迹(Western blot)实验(如图4所示)
VEGF/VEGFR2信号转导通路在肿瘤细胞的增殖、存亡以及转移方面扮演了重要角色。 VEGFR2、FAK、Akt和Erk1/2蛋白及其磷酸化蛋白p-VEGFR2、p-FAK、p-Akt和p-Erk1/2 是该通路中关键的信号分子,调控了肿瘤血管生成以及肿瘤的存亡和恶性转移。为了进一步研究TNCu-1对这些蛋白表达的影响,肿瘤细胞MDA-MB-231和HUVECs被进行WesternBlotting分析。顺铂作为阳性对照。如图4(a)所示。N(TNCu-1)明显地下调了MDA-MB-231 细胞中的VEGFR2/p-VEGFR2、FAK/p-FAK,Akt/p-Akt以及Erk1/2蛋白的表达。但没有明显地改变p-Erk1/2蛋白的表达。与顺铂相比,对MDA-MB-231细胞中FAK/p-FAK,Akt/p-Akt 有相同的调控机制,但顺铂没有明显改变MDA-MB-231细胞中Erk1/2蛋白的表达,而且 p-Erk1/2蛋白的表达却有所上调,这可能是细胞对顺铂产生了耐药,而N(TNCu-1)在5~20μM 的浓度范围,显著地下调了Erk1/2蛋白的表达,而对p-Erk1/2蛋白表达没有影响,表明细胞没有对N(TNCu-1)产生耐药。实验结果表明,N(TNCu-1)与顺铂对MDA-MB-231细胞有不完全相同的分子机制;N(TNCu-1)能通过下调MDA-MB-231细胞中Erk1/2、Akt/p-Akt、 FAK/p-FAK以及VEGFR2/p-VEGFR2蛋白的表达,抑制肿瘤的增殖、存亡以及恶性转移,阻碍了肿瘤的发展。肿瘤血管的发生与发展,对肿瘤的恶化起到重要作用。抑制肿瘤血管生成,可以抑制肿瘤的发展。如图4(b)所示,在5~20μM的浓度范围,N(TNCu-1)下调了内皮细胞VEGFR2/p-VEGFR2、FAK/p-FAK,Akt/p-Akt,p-Erk1/2蛋白的表达,没有显著下调 Erk1/2蛋白的表达,表明了N(TNCu-1)可以激活血管内皮细胞中的p-Erk1/2、Akt/p-Akt、 FAK/p-FAK和VEGFR2/p-VEGFR2信号分子,抑制内皮细胞增殖和迁移、诱导内皮细胞凋亡,从而抑制了血管生成。但与相同浓度的顺铂相比,N(TNCu-1)对抑制这些蛋白的表达比顺铂弱,表明N(TNCu-1)对正常细胞的毒性比顺铂低。此外,顺铂对MDA-MB-231细胞和 HUVECs的Erk1/2蛋白没有显著影响,但对p-Erk1/2蛋白略微上调,这与N(TNCu-1)对它们的调控作用不一致,证明了本申请铜基活性配合物与顺铂有不完全相同的分子机制。
Claims (9)
1.一种含硫氨基醇席夫碱铜配合物,其特征在于:其结构式为 [Cu4(C12H14N2O4S)4], 是一个电中性的配位单元,其中(C12H14N2O4S)2-是含硫氨基醇席夫碱阴离子配体,即L-2-[(5-硝基-2-羟基氧-苯亚甲基)-氨基]-4-甲硫基-1-正丁醇阴离子。
2.权利要求1所述的含硫氨基醇席夫碱铜配合物的制备方法,其特征在于,包含如下步骤:
S1. 将L-蛋氨醇用无水甲醇溶解后,放入反应釜中,加入5-硝基水杨醛,再加入氢氧化钾-无水甲醇混合溶液,室温磁力搅拌溶液1-2 h后,再加入可溶性铜盐的甲醇溶液,继续室温磁力搅拌0.5-1.5 h后,停止搅拌,取出搅拌子后,将反应釜置于鼓风恒温干燥箱中,干燥箱温度为100℃,反应4天,之后温度降至60℃,反应4天,之后温度降至30℃,继续反应4天,关掉干燥箱电源,4 h后从干燥箱中取出,得到针状和柱状绿色单晶,即为含硫氨基醇席夫碱铜配合物 [Cu4(C12H14N2O4S)4] 单晶;
S2. 将 [Cu4(C12H14N2O4S)4] 单晶先用DMSO溶解,然后加入乙醇,形成以DMSO-乙醇作为混合溶剂的分散系,用透射电镜检测,得到 [Cu4(C12H14N2O4S)4] 球状纳米粒子,即为纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:S1中所述的L-蛋氨醇、5-硝基水杨醛、氢氧化钾和可溶性铜盐的摩尔比为1~2:1~2:1~2: 2~3。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:S1中所述的 L-蛋氨醇、5-硝基水杨醛、氢氧化钾和可溶性铜盐的摩尔比为1:1:2:2.5。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:S1中所述的可溶性铜盐为硫酸铜,硝酸铜,氯化铜。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:S1中所述的可溶性铜盐为硝酸铜。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:S2中所述的DMSO-乙醇混合溶剂的体积比为1: 0~1。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于:S2中所述的DMSO-乙醇混合溶剂的体积比为1: 1。
9.权利要求2制备的纳米级含硫氨基醇席夫碱铜配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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