CN111000984A - 一组蛇神经生长因子及蛇神经生长因子前体在治疗老年痴呆上的应用 - Google Patents
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Abstract
老年性痴呆，也称为阿尔茨海默病，是一种以进行性记忆力障碍、判断推理障碍、运动障碍为主要临床特征的老年性疾病。老年痴呆的病理表现是一种以弥漫性脑萎缩为特征的神经系统的退行性病变并伴有神经元的损伤和死亡，故促进神经元的生长及修复是治疗老年痴呆的一个重要手段。通过Morris水迷宫实验，本发明首次发现了一系列蛇种的神经生长因子能明显缩短治疗后老年痴呆大鼠的逃避潜伏期，提高老年痴呆大鼠的认知能力；并且本发明通过以上试验还首次发现了重组的神经生长因子前体比重组的神经生长因子对老年痴呆大鼠有更好的改善认知功能的疗效。以上发现可能为解决老年痴呆问题提供了一种新的解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及一组具有改善老年痴呆大鼠学习记忆能力的蛇神经生长因子前体及蛇神经生长因子和一种治疗老年痴呆的方法，属于生物制药领域。
背景技术
老年性痴呆，也称为阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，是一种以进行性记忆力障碍、判断推理能力障碍、运动障碍为主要临床特征的老年性疾病。痴呆是一种由于脑功能障碍而产生的获得性和持续性的智能障碍综合征，痴呆的发病率和患病率随年龄增加而上升。随着人口老龄化问题日益严重，AD已经成为人类第4大死亡原因。
老年痴呆的病理表现是一种以弥漫性脑萎缩为特征的神经系统的退行性病变并伴有神经元的损伤和死亡，故促进神经元生长及修复是治疗老年痴呆的一个重要手段。
通过动物试验及临床观察，认为神经生长因子(NGF)对神经系统可能有如下作用：
(1)保护感觉神经元。NGF可以保护神经损伤后的感觉神经元免遭退变死亡，保存了神经纤维再生的物质基础，提高神经恢复率。
(2)促进运动纤维的再生。目前认为，神经生长因子(NGF)不但可以直接作用于运动神经元，而且还能促进神经损伤后鸟氨酸代谢产物多羟胺的合成，从而有促进运动轴突延伸，保护神经元存活的作用。
尽管有用鼠神经生长因子来治疗老年痴呆的报道，但到目前为止还没有发现真正对老年痴呆治疗有效的药物。本发明首次发现了一系列蛇种的神经生长因子能提高老年痴呆大鼠的认知能力，更重要的是本发明通过动物模型试验首次发现了重组的神经生长因子前体比重组的神经生长因子对老年痴呆大鼠有更好的改善其认知功能的作用。
很多原核和真核生物的蛋白在体内是以带有前导肽的前体(preproproteins)形式合成的，前导肽在帮助蛋白质的正确折叠及二硫键的正确配对上起着重要的作用。蛇神经生长因子在体内大约以200～300个氨基酸的形式构成，通常称之为神经生长因子前体(preproNGF)。神经生长因子前体(prepro NGF)是神经生长因子在动物体内的最初形式，它由氨基酸的信号肽(pre-peptide)+氨基酸的前导肽(pro-peptide)+氨基酸的成熟肽组成的一种前体蛋白质(pre-pro-protein)。 Pro-peptide即前导肽，能够催化蛋白质的正确折叠和加工。这种前导肽被称为分子内分子伴侣(intramolecular chaperone IMC)[1]。
1978年Laskey等首先提出了分子伴侣的概念[2]，以后又陆续在原核生物与真核生物中发现有类似功能的蛋白，它们的共同特征是能参与催化和介导其他多肽链或寡聚体蛋自质分子的折叠与装配。
1987年，lkemura在研究中发现，枯草杆菌素(subtilisin)的翻译后折叠需要前导肽(pro-peptide)的帮助才能完成[3]。此后的一些研究表明，除了枯草杆菌素外，还有许多以含前导肽的前体形式合成的蛋白质在其前导肽不存在的情况下均无法正确折叠，如：a-水解蛋白酶(a-Lytic protease，aLP)、羧肽酶等[4， 5]。由此得知前导肽在某些蛋白质折叠过程中扮演了分子内分子伴侣的角色。1993年Shinde等也提出了分子内分子伴侣的概念，将这种具有类似功能，能够辅助蛋白质折叠和加工的前导肽称为分子内分子伴侣(intramolecular chaperone IMC)[1]。
各种理化性质显示神经生长因子前体是一个二聚体结构，由两条完全相同的肽链组成，每条肽链有多个半胱氨酸残基，之间形成二硫键，这些二硫键对维持NGF 的生物学活性至关重要，一旦破坏则活性丧失。
在生物体内，神经生长因子前体(prepro NGF)是以带前导肽(pro-peptide)的形式存在于内质网中，折叠成天然二聚体结构，然后被转移至高尔基体中；其前导肽可被弗林蛋白酶和相应前体蛋白转化酶限制性的水解，形成成熟的NGF二聚体(单体含有120个氨基酸左右)，然后被转运至细胞外，同时也有部分未经切割的pro NGF前体分泌至细胞外。现代研究表明前导肽(pro-peptide)对神经生长因子功能性肽链的折叠即空间结构的形成具有重要作用[6]，故重组时带有前导肽(pro-peptide)的神经生长因子前体(prepro NGF)的结构可能比只带有神经生长因子成熟肽这一部分肽链更接近天然神经生长因子二聚体的空间结构。蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，多肽链在体内合成后，通过折叠加工成特定的三维结构，并最终形成有生物活性的蛋白质。
随着发现越来越多的蛋白质折叠体系必须依赖前导肽的存在[7，8，9，10]，说明这是一种普遍存在的蛋白质折叠机制。从原核生物到真核生物都存在这种现象，其中包括各类蛋白酶，如丝氨酸、蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋自酶等，也包括其他的非蛋白酶类，如脂酶，某些毒素蛋白等。前导肽的存在降低了折叠反应的活化能，使得折叠过程变得容易进行[11]，除了辅助蛋白质正确折叠，某些蛋白质的Pro肽还可以帮助二硫键的正确配对[12]。前导肽作为分子内分子伴侣(IMC)有辅助蛋白质折叠的作用，这对于以后使通过基因工程表达的重组蛋白能拥有更高的生物活性具有重要意义[13]。
发明内容
神经生长因子(NGF)存在于多种物种中，在雄性小鼠颌下腺、牛精浆、蛇毒、豚鼠前列腺和人胎盘组织中含量丰富。其中蛇神经生长因子(NGF)不仅与人和鼠神经生长因子(NGF)氨基酸序列有较高的同源性，而且在恢复受损神经元方面有其独到的疗效。本发明首次发现南美响尾蛇亚种(Crotalus durissus terrificus)、日本原矛头蝮(Protobothropsflavoviridis)、日本冲绳烙铁头(Ovophis okinavensis)、烙铁头(Protobothropsmucrosquamatus)、琉球原矛头蝮(Protobothrops elegans)、亚洲蝮属(Gloydiusintermedius)、钝鼻蝰(Macrovipera lebetina turanica)、澳洲虎蛇(Notechisscutatus)、眼镜王蛇(Ophiophagus Hannah)、澳洲棕蛇 (Pseudonaja textilis)、铜头蝮(Agkistrodon contortrix contortrix)、三色矛头蝮(Bothrops asper)、巨蝮属(Lachesis stenophry)、菜花原矛头蝮(Sistrurus catenatus edwardsi)、等这些蛇种的神经生长因子前体和神经生长因子对改善老年痴呆大鼠的认知水平都有一定的疗效；同时进一步的研究发现，尽管重组的神经生长因子(NGF) 和神经生长因子前体(preproNGF)都能在水迷宫试验中缩短老年痴呆大鼠逃避潜伏期，但本发明首次发现含有前导肽的神经生长因子前体(preproNGF)的治疗效果要比神经生长因子(NGF)更好。重组的神经生长因子前体和重组的神经生长因子的差别可能在于前导肽对神经生长因子功能性肽链的折叠即空间结构的形成有重要作用，而蛋白质的活性主要取决于它的三维结构。
本发明所述的神经生长因子前体(preproNGF)，其特征在于，它是具有带有信号肽(pre-peptide)、前导肽(pro-peptide)及成熟肽的神经生长因子蛋白质；本发明所述的神经生长因子(NGF)，其特征在于，它是只带有成熟肽的神经生长因子多肽，本发明所述的各蛇种的神经生长因子前体(preproNGF)和神经生长因子(NGF)的氨基酸序列如下：
南美响尾蛇亚种(Crotalus durissus terrificus)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.1)为：.
神经生长因子成熟肽的氨基酸序列(SEQ ID No.2)为：
日本原矛头蝮(Protobothrops flavoviridis)
神经生长因子前体A(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.3)为：
神经生长因子成熟肽的氨基酸序列(SEQ ID No.4)为：
日本原矛头蝮(Protobothrops flavoviridis)
神经生长因子前体B(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.5)为：
神经生长因子成熟肽的氨基酸序列(SEQ ID No.6)为：
冲绳烙铁头(Ovophis okinavensis)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.7)为：
神经生长因子成熟肽的氨基酸序列(SEQ ID No.8)为：
烙铁头(Protobothrops mucrosquamatus)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.9)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.10)为：
亚洲蝮属Gloydius intermedius)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.11)为：
神经生长因子熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.12)为：
巴西矛头蝮(Bothrops jararacussu)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.13)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.14)为：
琉球原矛头蝮(Protobothrops elegans)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.15)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.16)为：
眼镜王蛇(Ophiophagus Hannah)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.17)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.18)为：
澳洲棕蛇(Pseudonaja textilis)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.19)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.20)为：
铜头蝮(Agkistrodon contortrix contortrix)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.21)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.22)为：
三色矛头蝮(Bothrops asper)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列9SEQ ID No.23)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.24)为：
巨蝮属(Lachesis stenophry)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.25)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.26)为：
菜花原矛头蝮(Sistrurus catenatus edwardsi)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.27)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.28)为：
钝鼻蝰(Macrovipera lebetina)
神经生长因子前体(prepro NGF)的氨基酸序列(SEQ ID No.29)为：
神经生长因子成熟肽氨基酸序列(SEQ ID No.30)为：
本发明首次给出了每一种对改善老年认知障碍(老年痴呆)大鼠有促进作用的蛇神经生长因子前体(prepro NGF)和神经生长因子(NGF)的氨基酸序列，这不仅避免了混淆，比如日本原矛头蝮(Protobothrops flavoviridis)就有 2种以上的神经生长因子前体(prepro NGF)和神经生长因子(NGF)，同时也保证了生产过程中的质量和纯度的控制；最重要的是明确的氨基酸序列能使它们以重组或合成的方法获得，这对蛇神经生长因子前体(prepro NGF)和神经生长因子(NGF)这种难以获取的生物制品有极其重要的意义。
以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但以下方法并非对本发明的限定，而只是用本发明的实施方法之一来举例说明实施的具体过程，其他实施方法也可能达到同样效果；同时凡依照本发明公开内容所进行的本领域等同替换，均属于本发明保护范围。
实施方法
A：神经生长因子前体(prepro NGF)和神经生长因子(NGF)的获得
I：南美响尾蛇亚种(Crotalus durissus terrificus)神经生长因子前体(prepro NGF)由重组获得，具体如下：
1.重组表达载体的克隆
根据Genbank上提供的的南美响尾蛇(Crotalus durissus terrificus)的神经生长因子前体(preproNGF)的基因合成神经生长因子前体的DNA序列设计并使用引物Sequence(5’-＞3’)
Forward primer TGGGTCAGCAGCAAACATCA
Reverse primer AGGATGCCTGATTGCCTTCC
对目的DNA序列进行PCR扩增，在上游引物的5’端引入编码肠激酶识别位点的序列和Nde I酶切位点，在下游引物的5’端引入终止密码子和BamHI酶切位点。用PCR的方法扩增出含前导肽(preproNGF)的基因并克隆到pBS-T载体，对所构建的重组子pBS-T-preproNGF进行分析鉴定。
2.基因表达
把重组质粒转化到大肠杆菌表达载体pET15b中，构建重组表达质粒 pET15b-preproNGF，将分析鉴定正确的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS。将单克隆接种至5mLLB培养基中，37℃培养过夜，次日按1∶100的比例接种至 50mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD600nm＝0.4～0.6。
3.表达产物的收集分析
用1mmol/L IPTG继续培养3小时，诱导转化的大肠杆菌BL21(DE3)。表达菌经超声破碎后离心，包涵体溶于缓冲液，离心收集后上清和沉淀分别进行SDS.PAGE 电泳检测，目的蛋白以包涵体的形式存在。
4.表达产品的亲和和纯化
超声破菌后的包涵体溶于缓冲液(6mol/L盐酸胍、20mmol/L Tris-HCL pH8.0、0.5mol/L NaCI、5mmol/L咪唑)中；通过镍-NTA柱亲合层析纯化，具体为上柱前用上述缓冲液平衡，上样后用含20mmol/L咪唑的上述缓冲液洗至基线，最后用含300mol/L咪唑的上述缓冲液洗脱。肠激酶切割得到了preproNGF蛋白。
5.表达产物的复性
用6mol/l盐酸胍、0.1mol/L Tris-HCL pH8.0、0.01mol/LEDTA、0.1mmol/L PMSF、10mmol/L DTT缓冲液透析上述洗脱蛋白，缓冲液中的DTT和盐酸胍浓度递减，然后再用10倍体积的0.1mol/L Tris-HCL pH8.0、5μmol/L CuSo4、 20％甘油的缓冲液透析。RP-HPLC法对复性结果进行检测，通过与标样保留时间的对比确定已复性的成份，复性产物冷藏保存。
II：南美响尾蛇亚种(Crotalus durissus terrificus)神经生长因子(NGF) 由重组获得，具体如下：
1.重组表达载体的克隆
根据Genbank上提供的的南美响尾蛇(Crotalus durissus terrificus)的神经生长因子(NGF)成熟肽的基因合成神经生长因子DNA序列
设计并使用引物Sequence(5’-＞3’)
Sequence(5′-＞3′)
Forward primer ATATCCGGGCCAAACGTGAA
Reverse primer TGATGTCCGTTGCTGTGGTT
对目的DNA序列进行PCR扩增，在上游引物的5’端引入编码肠激酶识别位点的序列和Nde I酶切位点，在下游引物的5’端引入终止密码子和BamHI酶切位点。用PCR的方法扩增出(NGF)基因并克隆到pBS-T载体，对所构建的重组子 pBS-T-NGF进行分析鉴定。
2.基因表达
把重组质粒转化到大肠杆菌表达载体pET15b中，构建重组表达质粒pET15b-NGF，将分析鉴定正确的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。将单克隆接种至5mL LB培养基中，37℃培养过夜，次日按1∶100的比例接种至50mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD600nm＝0.4～0.6。
3.表达产物的收集分析
用1mmol/L IPTG继续培养3小时，诱导转化的大肠杆菌BL21(DE3)。表达菌经超声破碎后离心，包涵体溶于缓冲液，离心收集后上清和沉淀分别进行SDS.PAGE 电泳检测，目的蛋白以包涵体的形式存在。
4.表达产品的亲和和纯化
超声破菌后的包涵体溶于缓冲液(6mol/L盐酸胍、20mmol/L Tris-HCL pH8.0、0.5mol/L NaCI、5mmol/L咪唑)中；通过镍-NTA柱亲合层析纯化，具体为上柱前用上述缓冲液平衡，上样后用含20mmol/L咪唑的上述缓冲液洗至基线，最后用含300mol/L咪唑的上述缓冲液洗脱。肠激酶切割得到了NGF蛋白。
5.表达产物的复性
用6mol/l盐酸胍、0.1mol/L Tris-HCL pH8.0、0.01mol/LEDTA、0.1mmol/L PMSF、10mmol/L DTT缓冲液透析上述洗脱蛋白，缓冲液中的DTT和盐酸胍浓度递减，然后再用10倍体积的0.1mol/L Tris-HCL pH8.0、5μmol/L CuSo4、 20％甘油的缓冲液透析。RP-HPLC法对复性结果进行检测，通过与标样保留时间的对比确定已复性的成份，复性产物冷藏保存。
III：其他蛇神经生长因子前体(preproNGF)和神经生长因子(NGF) (SEQ IDNo.3-SEQ ID No.30)的获得
根据Genbank上提供的以上神经生长因子前体(preproNGF)及神经生长因子(NGF)成熟肽的基因，按上述方式I或II重组其他目标产物，我们可得到本发明所述的一系列蛇种的神经生长因子前体和神经生长因子的重组产物，冷藏保存，用于老年认知障碍(老年痴呆)大鼠动物模型的测试。
B：动物模型选择
本发明采用了自然衰老认知障碍(老年痴呆)动物模型，通过动物本身的自然衰老来获得老年痴呆的动物模型，包括老龄大鼠、小鼠及猴等。这类模型的认知障碍等神经系统改变是自然发生的，更贴近AD的真实病理生理改变。Cummings等报道老龄犬脑中有Aβ沉淀斑块，同时有相应的选择性的行为能力损害；Higgins 等报道老龄鼠可出现Aβ沉积于前脑基底区，并有记忆缺损。本发明选择了老年认知障碍(老年痴呆)大鼠动物模型
C：试验动物与分组
1.对100个月龄在21～22的大鼠适应性饲养10天，动物自由摄水，室温控制在22-25度，湿度为50％-70％，光照12小时，黑12小时。
2.通过Morris水迷宫定位实验训练来筛选认知障碍的大鼠(老年痴呆大鼠)。Morris水迷宫实验是一种强迫动物游泳，寻找水下平台的实验，主要用于评价动物空间学习记忆能力，提供的实验指标敏感可靠，操作简便，是测试和评价大鼠老年痴呆指标的经典实验。
3.水迷宫水深50cm，水温控制在22-25度，水池中央设平台。水池中放入奶粉，充分混匀至水呈乳白色，使大鼠无法通过视觉辨认平台位置。正式试验前训练日将大鼠面向池壁放入水中，训练其寻找逃避平台，若大鼠找到并站在平台上3秒后不再滑落，可中止此次训练，记录其抵达平台所用时间及所游距离，并让其在平台上停留10秒，由此让大鼠学习记忆。不能找到者持续记录120s后将其引至平台并放置30秒，培训其学习记忆。每天4次训练，间隔15～30秒进行下一次训练，从4个不同方向入水，连续4天。第5天正式试验测试，实时图像系统自动记录大鼠的活动情况，并计算大鼠首次穿越平台(中心区域)的平均时间，评价动物的学习记忆情况。以青年(4月龄)大鼠平均逃避潜伏期99％正常值范围上限值为标准，将逃避潜伏期大于99％上限值的老年大鼠定为知障碍老年大鼠。标签每个大鼠，以便在完成最后试验后能计算出每组大鼠用药前平均逃避潜伏期。
4.筛选出认知障碍大鼠后随机分为3组：即老年痴呆大鼠对照组(不给药，灌胃等体积的生理盐水)、神经生长因子治疗组和神经生长因子前体治疗组(神经生长因子和神经生长因子前体按40μg/Kg配成液态，连续濯胃给药，每天2次，连续8周)；同时设青年大鼠对照组(不给药，灌胃等体积的生理盐水)。在实验过程中，保持每组10个大鼠。多余的出组。
D：行为学(学习记忆能力)测试
给药8周后，再次连续训练5天，记录每天各组动物在水中寻找平台的平均时间，第6天直接进行Morris水迷宫测试。测定各组动物在水中寻找平台的时间。在训练过程中仍继续给药。
E：实验结果
以下，以4种蛇的神经生长因子和神经生长因子前体为例，对老年痴呆大鼠对照组、神经生长因子组、神经生长因子前体组、青年大鼠对照组的平均逃避潜伏期进行比较，以说明蛇生长因子和神经生长因子前体对改善老年痴呆大鼠认知能力的疗效，结果如表1-4：
表1南美响尾蛇亚种(Crotalus durissus terrificus)神经生长因子前体(prepro NGF)和神经生长因子(NGF)
图1是表1实验数据的折线图
表2琉球原矛头蝮(Protobothrops elegans)神经生长因子前体(prepro NGF) 和神经生长因子(NGF)
图2是表2实验数据的折线图
表3烙铁头(Protobothrops mucrosquamatus)神经生长因子前体(prepro NGF)和神经生长因子(NGF)
图3是表3实验数据的折线图
表4亚洲蝮属Gloydius intermedius)神经生长因子前体(prepro NGF) 和神经生长因子(NGF)
图4是表4实验数据的折线图
以上实验数据显示，给药前，老年认痴呆大鼠对照组和神经生长因子组及神经生长因子前体组之间无显著性差异；但它们与青年大鼠对照组存在显著性差异，### 表示P＜0.001。
给药8周后，再次进行Morris水迷宫定位实验训练，从第一天到第六天，老年痴呆大鼠对照组和和神经生长因子组及神经生长因子前体组之间的差异用*表示，*表示P＜0.05、**表示P＜0.01；***表示P＜0.001；神经生长因子组与神经生长因子前体组之间的差异用@号表示，@表示P＜0.05、@@表示P＜0.01、@@@ 表示P＜0.001。
从第一到第六天，以上3组(老年认痴呆大鼠对照组和神经生长因子组及神经生长因子前体组)与青年大鼠对照组存在显著性差异，###表示P＜0.001。
以上的数据显示：神经生长因子前体治疗组及神经生长因子治疗组能缩短老年痴呆大鼠组的平均逃避潜伏期，改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力；同时神经生长因子前体组比神经生长因子组具有更好的疗效。
本发明对日本原矛头蝮(Protobothrops flavoviridis)、日本冲绳烙铁头(Ovophis okinavensis)、钝鼻蝰(Macrovipera lebetina turanica)、澳洲虎蛇(Notechisscutatus)、眼镜王蛇(Ophiophagus Hannah)、澳洲棕蛇(Pseudonaja textilis)、铜头蝮(Agkistrodon contortrix contortrix)、三色矛头蝮(Bothrops asper)、巨蝮属(Lachesis stenophry)、菜花原矛头蝮(Sistrurus catenatus edwardsi)、钝鼻蝰(Macrovipera lebetina turanica)等这些蛇种的神经生长因子前体 (preproNGF)和神经生长因子(NGF)也进行了以上水迷宫实验，得到了类似的实验结果，由此证明了它们对改善老年痴呆大鼠的认知水平都有一定的效果，且神经生长因子前体组比神经生长因子组具有更好的疗效，在此不再一一赘述。
上述实例只为说明本发明的实施思路和技术特点，其目的在于让熟悉此技术的人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此而限制本发明的实施方法和保护范围。凡根据本发明精神实质所做的任何等效改变或修饰，都应涵盖在本发明的实施方法和保护范围之内。
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Claims (7)
1.一种治疗病人老年痴呆的方法，通过使用该方法含有的治疗有效量的蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体的药物可接受载体的组合物来逆转，减轻或治疗老年痴呆症状。
2.根据权利要求(1)所述的蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体，其特征在于，它是具SEQ ID No.1至SEQ ID No.30所示的氨基酸序列中任何一个蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体；或分别与SEQ ID No.1至SEQ ID No.30中的蛇神经生长因子或神经生长因子前体具有70％或以上同源性的蛋白/多肽，该蛋白/多肽的功能与SEQ ID No.1至SEQ IDNo.30所示的氨基酸序列的蛇神经生长因子或神经生长因子前体的功能相同或相似。
3.权利要求(1-2)以上所述的蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体，其特征在于，它们可来自于从天然蛇毒中分离提取，或化学多肽合成，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
4.根据权利要求(1-3)以上所述的重组生产的蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体，根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体蛋白/多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的；可以是包含二硫键的，或可以是不包含二硫键的。本发明中所述的蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体蛋白/多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
5.权利要求(1-4)以上所述蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体蛋白/多肽，其特征还在于本发明中所述的蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体蛋白/多肽可包括上述各种蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体经过水解或酶解后的片段、用物理和化学方法处理后的衍生物和类似物，他们是基本保持着与上述蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体蛋白/多肽相同的生物学功能或活性的蛋白/多肽。本发明中所述的片段、衍生物或类似物可以是一个或多个氨基酸残基被取代的多肽或蛋白，或在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽或蛋白，或与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇、脂肪链)融合所形成的多肽或蛋白，或附加的氨基酸序列融合到此多肽或蛋白序列而形成的多肽或蛋白。根据本文的描述，这些片段、衍生物和类似物都属于本领域熟练技术人员公知的范围。
6.权利要求(1)的方法包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、口服、舌下、鼻腔、直肠、真皮内、腹膜内或鞘內给药或经皮给药。
7.权利要求(1)的方法的蛇神经生长因子或蛇神经生长因子前体剂量包括从1μg/Kg到500μg/kg每次，给药频率从每天一次到每天多次；或一年多次。
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