CN110999791A - 一种提高藏红花素含量的藏红花培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物培养技术领域，具体领域为一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，以MS培养基为基础培养基，在MS培养基中添加BA、IAA、蔗糖、琼脂、稀土元素，MS培养基中的硝酸盐和铵的含量较高，更加有利于藏红花球茎愈伤组织的诱导，配以固定浓度的细胞生长素BA和植物激素IAA，固定浓度的细胞生长素BA和植物激素IAA具有协同作用，能够较好的诱导藏红花愈伤组织，提高诱导生物细胞量，稀土元素三氧化镧的加入对藏红花愈伤组织细胞的生长进一步起到促进作用，固定浓度的细胞生长素BA、植物激素IAA和固定浓度的稀土元素三氧化镧在MS基质中协同使得藏红花素的合成量得到有效提升。

Description

一种提高藏红花素含量的藏红花培养基

技术领域

本发明涉及植物培养技术领域，具体领域为一种提高藏红花素含量的藏红花培养基。

背景技术

藏红花，属于鸢尾科番红花属多年生草本植物，藏红花原产于西班牙、希腊、南欧各国以及伊朗等地，后经印度传到中国，如今在江浙和华北都有种植，藏红花属于中药材的一种，在治疗精神类疾病、神经退行性疾病、学习记忆障碍、心血管方面显示出潜在的药用价值，由于藏红花只能依靠球茎无性繁殖，并且在种植过程中随着繁殖代数的增加球茎越来越小，小球茎开花少且小，甚至不开花，从而失去药用价值。藏红花仅仅是柱头入药，但因适合其种植的地域有效且种植条件苛刻等因素，以致其产量极低，来源有限，价格昂贵。而应用植物组织细胞培养的方法能够很好的解决藏红花种球病毒积累、品质退化、繁殖系数低，甚至失去药用价值等问题，以藏红花的半个子房为外植体，将其培养在添加植物激素6-BA和NAA的MS植物培养基上，可以获得花柱-柱头状物的再生，而在生的柱头可以产生藏红花素类物质，但是上述方式在应用过程中，存在藏红花素含量低的问题。

藏红花素是藏红花中起到主要药用价值的物质，藏红花素含量低的问题有待解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，以MS培养基为基础培养基，在MS培养基中添加BA、IAA、蔗糖、琼脂、稀土元素。

优选的，所述BA的浓度为0.4mg/L，所述IAA浓度为4mg/L，所述蔗糖浓度为30g/L，所述琼脂浓度为9g/L，所述稀土元素浓度为150mg/L。

优选的，其PH值为5.7～5.8。

优选的，所述稀土元素为三氧化镧。

优选的，一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，其使用方法为：

将藏红花愈伤组织接种到藏红花培养基中，在温度为25℃，黑暗条件下，在摇床上培养14天。

本发明的有益效果是：一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，以MS为基础培养基，MS培养基中的硝酸盐和铵的含量较高，更加有利于藏红花球茎愈伤组织的诱导，配以固定浓度的细胞生长素BA和植物激素IAA，固定浓度的细胞生长素BA和植物激素IAA具有协同作用，能够较好的诱导藏红花愈伤组织，提高诱导生物细胞量，稀土元素三氧化镧的加入对藏红花愈伤组织细胞的生长进一步起到促进作用，固定浓度的细胞生长素BA、植物激素IAA和固定浓度的稀土元素三氧化镧在MS基质中协同使得藏红花素的合成量得到有效提升；

将藏红花愈伤组织接种到藏红花培养基中，在温度为25℃，黑暗条件下，在摇床上培养14天，黑暗条件下更加适合于藏红花愈伤组织的诱导，使其诱导效率高。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

制备藏红花培养基：

在MS培养基中添加浓度为0.4mg/L的BA，浓度为4mg/L的IAA，浓度为30g/L的蔗糖，浓度为9g/L的琼脂，浓度为150mg/L三氧化镧。

藏红花愈伤组织准备：

以藏红花球茎(已经在4℃冰箱中休眠8周)为外植体，在流水冲洗下去掉球茎表面的泥土和皮膜，剔除清洗不净的病斑，将萌发的芽连同球茎一起切下，在流水下冲洗过夜，在已通过紫外除菌洁净的工作台上将藏红花球茎和侧芽转入到75％乙醇灭菌1min，再转入0.5％次氯酸钠中，消毒15min，然后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸去多余水分，备用；

在无菌操作台上将已经消毒完毕的球茎侧芽切成1cm的小段，即为准备完毕的藏红花愈伤组织。

藏红花愈伤组织培养：

将藏红花愈伤组织接种到藏红花培养基中，在温度为25℃，黑暗条件下，PH值为5.7，在摇床上培养14天。

选择现有培养基及按现有培养基的使用方式对作藏红花愈伤组织进行培养作为对比例。

培养完毕后，收获细胞经冷冻干燥后称取干质量，计算其生长倍数，测定培养液中营养物质的消耗情况并分析藏红花素的含量，

培养液中营养物质浓度测定：收集培养液，用3.5-硝基水杨酸显色法测定培养液中的总糖和还原糖含量，用定靛酚蓝比色法测定培养液中的氨态氮含量，用磷钼蓝比色法分析培养液中的磷含量。

藏红花素含量分析：收获藏红花细胞经冷冻干燥后磨碎，用50％的乙醇按(干细胞质量：乙醇体积＝0.02g/ml的比例)，在25℃，100r/min,摇床萃取24h，萃取液经高速离心取上清液，并经0.22μm的膜过滤后，用HPLC分析其藏红花素的含量，所用HPLC为岛津10Avp高效液相色谱仪，岛津反相C18色谱柱(粒度5μm，6mm×150mm)，流动相为甲醇-水，甲醇0～100％线性梯度洗脱60min，温柱40℃，检测波长250nm，流速为1.0ml/min。标准品为分离纯化的藏红花色素，经过质谱和核磁鉴定纯度为99％。

结果如下：

在实施例中，前4天的细胞生物量比对比例增加了约21％，直到第10天为止，细胞生物量比对比例增加了约64％，继而实施例和对比例的细胞生物量均有所下降。

在实施例中，前6天藏红花素含量变化趋势基本相同，第6天后，细胞开始变红，表明进入藏红花素的快速合成阶段，在第12天时，藏红花素含量达到最高约为41.2mg/g，此时实施例中藏红花素含量是对比例中藏红花素含量的3倍

在实施例中，碳源的消耗从第2天到第8天消耗速度快，占添加总糖量的65％，随后趋于平衡，在此过程中，实施例中的的碳源消耗量持续高于对比例中的碳源消耗量。

在实施例中，细胞增殖较快的前4天，培养液中的氮浓度下降较快，表明细胞增殖需要较多的氮源，此后，细胞停止生长的阶段，培养液中的铵态氮含量有所回升，第6天，细胞开始合成藏红花素，培养液中的铵态氮含量下降，第6天至第12天之间，实施例中的氮消耗量持续高于对比例中的氮消耗量。

在实施例中，培养液中磷的浓度在前2天快速降低，此后磷的消耗趋于缓和，即使在藏红花素合成阶段也没有发生快速吸收现象，表明组织细胞可以贮藏磷以备后期生长和生物合成使用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，以MS培养基为基础培养基，其特征在于：在MS培养基中添加BA、IAA、蔗糖、琼脂、稀土元素。

2.根据权利要求1所述的一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，其特征在于：所述BA的浓度为0.4mg/L，所述IAA浓度为4mg/L，所述蔗糖浓度为30g/L，所述琼脂浓度为9g/L，所述稀土元素浓度为150mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，其特征在于：其PH值为5.7～5.8。

4.根据权利要求2所述的一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，其特征在于：所述稀土元素为三氧化镧。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的一种提高藏红花素含量的藏红花培养基，其特征在于：其使用方法为：

将藏红花愈伤组织接种到藏红花培养基中，在温度为25℃，黑暗条件下，在摇床上培养14天。