CN110987553B - 一种红细胞处理试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红细胞处理试剂及其应用，所述红细胞处理试剂包括洗涤液、固定液、封闭液和保存液，所述固定液中含有单宁酸和戊二醛，能够用于红细胞模拟物的制备。使用含有单宁酸的固定液，能够使多个体红细胞的MCV分布在处理后变窄，使处理后的RDW值更接近正常人的RDW。该红细胞处理试剂配制简单、使用方便，能够控制红细胞分布宽度和稳定红细胞平均体积，从而提高检测的灵敏度和准确性。

Description

一种红细胞处理试剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种红细胞处理试剂及其应用。
背景技术
血细胞分析仪经过校准后，为了监控测定结果在长期运行过程中测定结果是否发生漂移，需要开展质量控制。质量控制在临床血常规测定中一直被认为是一种必要的操作程序，各项目的分析结果的准确性在一定程度上取决于：1.选取合适的质控品；2.使用合适的质控规则。过去通常使用新鲜人血作为血细胞分析仪的质控品/校准品，新鲜人血经过参考方法赋值后，在血细胞分析仪进行测定，通过比较靶值与测定值的差异来判断仪器是否需要进行校准。但是，使用参考方法进行赋值过程繁琐，需要耗费大量的人力及时间；同时，目前只有WBC、 RBC、HGB、HCT(PCT)、PLT这5个参数具有国际血液标准化委员会(International Committee for the Standardization of Hematology，ICSH)推荐的参考测量方法，无法监控仪器其他参数的漂移；此外，新鲜血液的参数只能在4个小时内认为是稳定的，如果需要进行日间质控，只能每日重新使用参考方法对新鲜血赋值。随着血常规分析的普及，大多数用户需要同时监控多台血细胞分析仪器的运行状况，甚至需要进行室间比对，不再适合使用新鲜血液作为质量控制物。因此，人们开始研发可以模拟新鲜血液成分的血细胞分析用质控品/校准品。
血细胞分析用质控品/校准品的常规制备思路是：1.将血液中的血浆成分去除；2.使用固定剂处理细胞膜，提高细胞的形态稳定性；3.加入封闭剂(也称为猝灭剂)停止固定反应； 4.加入保存液(也称为人造血清或悬浮介质)，通过调节保存液的加入量来控制各细胞组分的最终浓度。其中，步骤1和4是关键的，而固定及封闭的工艺在部分公开的专利中未使用也能达到目标效果。保存液配方设计的主要目的是避免血细胞由于重力沉降而发生不可逆的聚集，以及避免微生物的生长导致细胞被破坏或干扰测定。此外，为了避免红细胞对白细胞计数的干扰，需要保持红细胞与溶血剂的反应能力，因此，固定剂的用量及处理时间需要严格控制，必要时，对红细胞和白细胞分别处理。
此前公开的专利中，通常通过调节渗透压来改变细胞的大小，然后再使用固定剂使其体积保持稳定。但对于非人红细胞，当细胞体积收缩或膨胀超过30％-50％时，细胞将会过度聚集或者发生溶血。美国专利US 4704364、US 632003、US 3541137、US 4179398等报道了血细胞分析仪用质控品中白细胞、血小板模拟物的制备方法，其中，粒细胞可以使用铰口鲨红细胞进行模拟，单核细胞可以使用火鸡红细胞模拟，淋巴细胞可以使用禽类红细胞模拟，血小板可以使用山羊红细胞进行模拟。美国专利US 3873467通过保存液内的特殊成分使细胞趋向于球形化，而不改变细胞的MCV测定值，抑制了细胞在储存过程中的降解。此外，该保存液提供一种抑制细胞生物活性的液体环境。美国专利US 4777139报道了通过使用少量的二醛类化合物，如甲醛、戊二醛、多聚甲醛等，来固定悬浮的红细胞的形状和大小。但该方法的不足是，所制备的质控品MCV的日间变化需要经过一定的稳定期(平衡时间)后才能到达最小值，该稳定期的长短取决于制备样本的浓度水平。尽管经过该平衡时间后，质控品的红细胞平均体积(MCV)可以在90天内变化范围小于1fL，但不同的平衡时间将使得该方法难以实现生产转化。此外，由于醛类物质会降低红细胞的代谢活性，将降低保存液对细胞的稳定效应。
现有技术的另一个缺陷是，当原料来源于多个个体时，由于不同个体的MCV差异，将有可能导致制备物的红细胞分布宽度(RDW)高于参考范围，或者导致批间质控品RDW值差异较大。为了解决该问题，目前通常在制备前对原料进行初步筛选，选择MCV值接近的原料进行制备。但该过程需要耗费较长时间，且需要损耗部分的原料。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种红细胞处理试剂，能够控制红细胞分布宽度和稳定红细胞平均体积，从而提高检测的灵敏度和准确性。
本发明还提出一种上述红细胞处理试剂的应用。
根据本发明的第一方面实施例的一种红细胞处理试剂，包括洗涤液、固定液、封闭液和保存液；所述固定液中含有单宁酸和戊二醛。
根据本发明实施例的一种红细胞处理试剂，至少具有如下有益效果：该红细胞处理试剂配制简单、使用方便，能够控制红细胞分布宽度和稳定红细胞平均体积，从而提高检测的灵敏度和准确性。使用含有单宁酸的固定液，能够使多个体红细胞的MCV分布在处理后变窄，使处理后的RDW值更接近正常人的RDW。通过细胞单位体积的计数值来计算试剂的用量可以严格控制反应过程。
根据本发明的一些实施例，所述红细胞处理试剂包括：
所述洗涤液中含有磷酸缓冲盐、柠檬酸缓冲盐、叠氮化钠、葡萄糖和氯化钠；
所述固定液中含有：戊二醛和单宁酸；
所述封闭液中含有：牛血清蛋白；
所述保存液中含有：柠檬酸缓冲盐、氯化钠、磷酸缓冲盐、腺嘌呤、牛血清蛋白、乳糖、胆固醇、肌苷、脱氧胆酸和生物抑菌剂。
根据本发明的一些实施例，所述洗涤液的pH值在7.20～7.40之间，洗涤液中含有：
KH2PO4 0.1～0.5g/L；
Na2HPO4·12H2O 1～2g/L；
二水合柠檬酸钠三钠2～3g/L；
柠檬酸0.4～0.6g/L；
葡萄糖4～6g/L；
NaN3 0.5～1g/L；
用于调节渗透压至310～320mOsm/kg的碱金属氯化物。
根据本发明的一些实施例，每升所述固定液中含有：
25％戊二醛(0.2～1)mL；
单宁酸质量大于0g且不大于30g；
所述固定液为通过向每升所述洗涤液中加入以上组分配制而得的固定液。
根据本发明的一些实施例，所述封闭液中含有：
牛血清蛋白(5～10)g/L；
所述封闭液为通过所述洗涤液中加入以上组分配制而得的封闭液。
根据本发明的一些实施例，所述保存液的pH值在6.90～7.00之间，所述保存液中含有：
NaCl 3g/L；
柠檬酸0.4～0.6g/L；
二水合柠檬酸钠三钠2～3g/L；
Na2HPO4·12H2O 1～2g/L；
腺嘌呤0.5～1g/L；
牛血清蛋白25g/L；
乳糖10～20g/L；
胆固醇0.5g/L；
肌苷2g/L；
脱氧胆酸0.2～0.5g/L；
青霉素G钠2×106单位；
ProClin 300 0.3～1g/L。
根据本发明的一些实施例，所述洗涤液配制完成后需要使用滤膜过滤；所述固定液、封闭液和保存液需要现配现用。
根据本发明的第二方面实施例的应用，将上述红细胞处理试剂用于血细胞模拟物的制备。
根据本发明的一些实施例，一种红细胞模拟物的制备方法，包括以下步骤：使用上述红细胞处理试剂对红细胞进行洗涤、固定、封闭和保存操作制备红细胞模拟物。
根据本发明的一些实施例，所述红细胞模拟物的制备方法，步骤具体为：
S1、洗涤：取全血离心，去除上层血浆；加入所述洗涤液，重新悬浮红细胞；再次离心去除上层清液后，重新加入所述洗涤液并重悬红细胞；
S2、固定：加入所述固定液并重悬红细胞，并在(18～35)℃下静置(3.5～4.5)小时后离心除去上层清液；
S3、封闭：加入所述封闭液并重悬红细胞，重悬后混合(3.5～4.5)小时后离心除去上层清液；
S4、保存：加入所述保存液，调节至目标HCT值或红细胞计数值后混匀分装，密闭保存于(2～8)℃温度下。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为使用本发明实施例1中的固定液(S1)处理样本过程前(a)、处理后(b)及使用对照例1中固定液处理(c)的红细胞直方图；
图2为本发明实施例2中经过处理后的红细胞MCV值随时间的变化；
图3为本发明实施例3中实验完成后血小板模拟物的直方图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明的实施例一为：一种红细胞处理试剂：
试剂的配方及配制：
1、洗涤液(W1)：
Figure BDA0002274342930000051
2、固定液(S1)：
Figure BDA0002274342930000052
3、封闭液(Q1)：
Figure BDA0002274342930000061
4、保存液(P1)：
Figure BDA0002274342930000062
上述洗涤液配制完成后可于2～8℃下保存备用，固定液、封闭液、保存液需要现配现用。
本发明的对照例一为：一种红细胞处理试剂：其与实施例一的区别仅在于：固定液中不含单宁酸。
本发明的实施例二为：一种红细胞模拟物的制备方法：
使用本发明实施例1或对照例1的试剂进行如下操作：
1、洗涤：
1)取EDTA抗凝人类或哺乳动物(如豚鼠、兔等)全血于血袋中，3000转/min下离心20分钟使血浆与血细胞分离，缓慢挤出上层血浆；
2)往细胞层加入洗涤液，重新悬浮红细胞，使混匀后的细胞计数值为5×1012/L；
3)在3000转/min下离心20分钟，吸去上层清液后，重新加入洗涤液并重悬红细胞，使混匀后的细胞计数值为5×1012/L；
4)重复以上洗涤步骤3次。
2、固定：
往洗涤后的红细胞层加入固定液(S1)，并立即重悬红细胞，使混匀后的红细胞计数值为 1×1012/L，并在25℃下静置4小时后3000转/min下离心10min并除去上层清液。
3、封闭：
加入封闭液并重悬红细胞，使混匀后的红细胞计数值为4×1012/L，在水平摇床上混匀4 小时，3000转/min下离心10min并除去上层清液。
4、保存：
根据所需要的红细胞浓度，调节保存液的加入量，调节至目标HCT值或红细胞计数值后，在水平摇床上混匀1小时后分装于样品管中。4℃下密闭保存。
5、方法评价：
将上述处理产品在4℃下密闭保存15天后，对产品进行检验及赋值。图1为使用本发明实施例1中的固定液(S1)处理样本过程前(a)及处理后(b)及使用对照例1中固定液处理后(c) 的红细胞直方图。从图1中可以看出，在使用本发明实施例方案的固定液处理后，RDW值从处理前的22.3％减少至12.0％，红细胞分布宽度显著降低，从而增加了测定的灵敏度和准确性，而使用对照例1中不含单宁酸的固定液处理后的红细胞，尽管RDW略有减少，但MCV 分布宽度反而增加。
图2为本发明实施例2中经过处理后的红细胞MCV值随时间的变化，结果表明，红细胞平均体积在120天内变化范围小，说明该试剂有利于红细胞的稳定。
本发明的实施例三为：一种血细胞模拟物的制备方法，该血细胞包括红细胞、白细胞和血小板，其中，红细胞和白细胞模拟物的制备流程参照实施例2，白细胞模拟物的制备流程，血小板模拟物的制备流程如下：
使用山羊红细胞(由于山羊红细胞体积较小(大约9fL)，因此，在血细胞分析仪中会被计算成血小板，可实现模拟血小板的目的。)作为原料，洗涤液、封闭液、保存液配方参照实施例1不变，固定液(S2)的配方如下：
Figure BDA0002274342930000081
洗涤、固定及封闭步骤中，使血小板稀释10倍后的测定值为200×109/L、50×109/L、 100×109/L，在保存步骤中调节保存液的用量，使血小板计数值达到目标浓度。
实验完成后，测定血小板模拟物的直方图，如图3所示。从图3中可以看出，该直方图近似为正态分布，体积与人血小板接近，表明本发明实施例方案实现了血小板的模拟。
从上述描述可知，本发明红细胞处理试剂配制简单、使用方便，能够控制红细胞分布宽度和稳定红细胞平均体积，从而提高检测的灵敏度和准确性。使用含有单宁酸的固定液，能够使多个体红细胞的MCV分布在处理后变窄，使处理后的RDW值更接近正常人的RDW。通过细胞单位体积的计数值来计算试剂的用量可以严格控制反应过程。本发明方案的模拟物在用于制备多细胞组分(红细胞、白细胞和血小板)时，可将红细胞模拟物调节其浓度为目标浓度的3～5倍，血小板模拟物浓度调节为目标浓度的10～20倍，各白细胞亚群的浓度为目标浓度的30～40倍，根据各组分的目标浓度来计算各组分的比例。混合所有组分后，加入保存液调节红细胞计数值至目标浓度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种红细胞处理试剂，包括洗涤液、固定液、封闭液和保存液；所述固定液中含有戊二醛，其特征在于：所述固定液中还含有单宁酸；
每升所述固定液中含有：
25％戊二醛0.2mL；
单宁酸质量为15g；
所述固定液为通过向每升所述洗涤液中加入以上组分配制而得的固定液。
2.如权利要求1所述的一种红细胞处理试剂，其特征在于：
所述洗涤液中含有磷酸缓冲盐、柠檬酸缓冲盐、叠氮化钠、葡萄糖和氯化钠；
所述固定液中含有：戊二醛和单宁酸；
所述封闭液中含有：牛血清蛋白；
所述保存液中含有：柠檬酸缓冲盐、氯化钠、磷酸缓冲盐、腺嘌呤、牛血清蛋白、乳糖、胆固醇、肌苷、脱氧胆酸和生物抑菌剂。
3.如权利要求1所述的一种红细胞处理试剂，其特征在于：所述洗涤液的pH值在7.20～7.40之间，洗涤液中含有：
KH2PO4 0.1～0.5g/L；
Na2HPO4·12H2O 1～2g/L；
二水合柠檬酸钠三钠2～3g/L；
柠檬酸0.4～0.6g/L；
葡萄糖4～6g/L；
NaN3 0.5～1g/L；
用于调节渗透压至310～320mOsm/kg的碱金属氯化物。
4.如权利要求1所述的一种红细胞处理试剂，其特征在于：所述封闭液中含有：
牛血清蛋白5～10g/L；
所述封闭液为通过所述洗涤液中加入以上组分配制而得的封闭液。
5.如权利要求1所述的一种红细胞处理试剂，其特征在于：所述保存液的pH值在6.90～7.00之间，保存液中含有：
NaCl 3g/L；
柠檬酸0.4～0.6g/L；
二水合柠檬酸钠三钠2～3g/L；
Na2HPO4·12H2O 1～2g/L；
腺嘌呤0.5～1g/L；
牛血清蛋白25g/L；
乳糖10～20g/L；
胆固醇0.5g/L；
肌苷2g/L；
脱氧胆酸0.2～0.5g/L；
青霉素G钠2×106单位；
ProClin 300 0.3～1g/L。
6.如权利要求1所述的红细胞处理试剂，其特征在于：所述洗涤液配制完成后需要使用滤膜过滤；所述固定液、封闭液和保存液需要现配现用。
7.一种红细胞处理试剂的应用，其特征在于：将如权利要求1至6任一项所述的红细胞处理试剂用于血细胞模拟物的制备。
8.一种红细胞模拟物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：使用如权利要求1至6任一项所述的红细胞处理试剂对红细胞进行洗涤、固定、封闭和保存操作，制备红细胞模拟物。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤具体为：
S1、洗涤：取全血离心，去除上层血浆；加入所述洗涤液，重新悬浮红细胞；再次离心去除上层清液后，重新加入所述洗涤液并重悬红细胞；
S2、固定：加入所述固定液并重悬红细胞，并在18～35℃下静置3.5～4.5小时，离心除去上层清液；
S3、封闭：加入所述封闭液并重悬红细胞，重悬后混合3.5～4.5小时，离心除去上层清液；
S4、保存：加入所述保存液，混匀分装后密闭保存于2～8℃温度下。
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