CN110974806B - 一种具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼及其制备方法和应用。本发明所述两亲性纳米笼是由具有两亲性的聚甜菜碱和具有活性氧敏感性的含有缩硫酮键的小分子化合物先形成纳米乳剂,再在引发剂的作用下反应,制备得到;所述两亲性纳米笼具有两亲性,稳定性高,且还具有活性氧敏感性,可在活性氧的作用下解体;其为载体复杂蛋白时,可将蛋白包括在纳米笼内部,提高了蛋白的稳定性,利用蛋白的运输;负载蛋白的纳米颗粒,进入体内后,在活性氧的作用下,外部的纳米笼解体,释放出其内部的蛋白,从而在病灶部位发挥其作用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米医学技术领域,更具体地,涉及一种具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼及其制备方法和应用。
背景技术
随着生物科技尤其是现代免疫技术的迅速发展,蛋白类药物因其生物活性高、特异性强、生物功能明确等临床医用优点,逐渐成为医药领域的重要组成部分。蛋白类药物,从广义上来说是指包括抗体、激素、细胞因子/转运因子、受体分子、蛋白酶、部分蛋白或多肽疫苗等所有化学主体为蛋白质或多肽的产品。与传统小分子药物相比,蛋白类药物具有自身独特的优势,表现出高度特异性、多功能性和良好的生物相容性。而且相对于基因疗法,蛋白质疗法可能更安全,因为不会涉及到基因序列的永久性或随机性改变。
但是蛋白类药物仍存在许多缺点,如:①相对分子质量大、结构复杂;②体内外稳定性差、易受酶解及其他环境因素影响;③存在显著的肝、胃肠首过效应;④大多数蛋白质在中性pH条件下生物膜穿透性差,生物利用度低;⑤存在免疫原性,生物半衰期短。述缺陷很大程度上限制了蛋白类药物的广泛应用。而纳米载体技术的出现有望克服这些缺点,通过对蛋白类药物载体的理化性质调控与化学结构的功能化设计,实现蛋白类药物的高效装载传递和可控释药成为了当下研究的热点。其中,生物安全、可降解性、功能高分子材料具有安全无毒、可降解吸收、结构多样性、易加工与设计、易制备、多功能性及来源广泛等优点,利用其构建的功能化载体能够全方位保护蛋白类药物的生物活性,实现对蛋白类药物的高效传递和可控释放。
在现代药物制剂的应用中,尤其是蛋白类药物的可控传递方面,生物可降解功能高分子载体具有非常重要的应用前景及临床意义。因此,寻找合适的蛋白类药物载体材料,设计理想的蛋白类药物递送系统从而优化药物代谢动力学及释放动力学行为,显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的蛋白的体内外稳定性差、易受酶解及其他环境因素影响等不足,提供一种具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼。本发明所述两亲性纳米笼可以很好的包括蛋白,从而完成蛋白的体内递送。
本发明的另一目的在于提供所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼作为蛋白载体的应用。
本发明的再一目的在于提供所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼负载蛋白的制备方法。
本发明的还一目的在于提供由所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼负载蛋白形成的两亲性纳米颗粒。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的:
一种具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼,由甜菜碱和含有缩硫酮键的小分子水溶液在有机相中,通过表面活性剂的作用,稳定分散,形成纳米乳剂,在惰性气体保护下,通过引发剂与共引发剂的作用,制备得到纳米笼。
聚甜菜碱具有两亲性,可以较好的保证纳米笼的生物稳定性;同时含有缩硫酮键的小分子中的缩硫酮键在ROS存在时发生断裂,从而导致纳米网络断裂,纳米笼解体,释放出相应蛋白。因此,本发明所述两亲性纳米笼负载蛋白药物后,进入人体后,在体内活性氧(ROS)的作用下,纳米笼解体,释放出其负载的蛋白,发挥其蛋白的作用。
优选地,所述惰性气体为氮气。
优选地,所述甜菜碱(CBAA)和含有缩硫酮键的小分子的摩尔比例为10~2:1。
优选地,所述引发剂为过硫酸铵。
优选的,所述共引发剂为四甲基乙二胺(TEMED)。
优选地,所述表面活性剂为双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠(AOT)、聚乙二醇十二烷基醚(Birj30)或司班中的一种或多种。
优选地,所述表面活性剂为双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠(AOT)和聚乙二醇十二烷基醚(Birj30)
优选地,所述AOT和Birj30的质量比为1:8~12。
优选地,所述有机相为正己烷或正己醇。
优选地,所述含有缩硫酮键的小分子由如下过程得到:以巯基乙胺盐酸盐、丙酮为原料,在浓盐酸的催化下得到中间产物;再经氢氧化钠反应后,在0℃、惰性气体保护下,与丙烯酰氯反应,得到含缩硫酮的小分子。
本发明同时还保护所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼作为蛋白载体的应用。
一种具有活性氧敏感性的两亲性纳米颗粒的制备方法,也在本发明的保护范围内,具体过程为:由甜菜碱、含有缩硫酮键的小分子水溶液和蛋白,均加入含有表面活性剂的有机相中,混合,形成纳米乳剂,然后在引发剂的作用下,反应得到包裹蛋白的纳米笼。
本发明还保护由上述制备方法制备得到的具有活性氧敏感性的两亲性纳米颗粒。由本发明所述两亲性纳米笼负载蛋白药物后形成的纳米颗粒的两亲性和稳定性好,可稳定的运输蛋白药物进入体内,且进入体内后,在活性氧的作用下,纳米笼解体,释放出蛋白,发挥其药物作用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明所述两亲性纳米笼是由具有两亲性的聚甜菜碱和具有活性氧敏感性的含有缩硫酮键的小分子化合物先形成纳米乳剂,再在引发剂的作用下反应,制备得到,所述两亲性纳米笼具有两亲性,稳定性高,且还具有活性氧敏感性,可在活性氧的作用下解体。
本发明所述两亲性纳米笼作为载体复杂蛋白时,可将蛋白包括在纳米笼内部,提高了蛋白的稳定性,利用蛋白的运输。负载蛋白的纳米颗粒,进入体内后,在活性氧的作用下,外部的纳米笼解体,释放出其内部的蛋白,从而在病灶部位发挥其作用。尤其是当负载作用于肿瘤部位的药物蛋白时,肿瘤部位的活性氧浓度较高,当纳米颗粒运输至肿瘤部位时,则纳米笼的缩硫酮键打开,聚甜菜碱解体,继而在肿瘤微环境中释放蛋白药物,达到蛋白药物的稳定输送。
附图说明
图1为CBAA单体和含缩硫酮交联小分子TK的合成路线。
图2为CBAA的核磁谱图。
图3为聚合物纳米粒子的粒径分布图。
图4为聚合物纳米粒子TEM图,3%醋酸铀染色1min。
图5为聚合物纳米粒子体外模拟释放图:a纳米粒子加1ml H2O的荧光图谱;b为加1ml 10%H2O2的荧光图谱。
图6为聚合物纳米颗粒的激光共聚焦图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 甜菜碱单体(CBAA)的合成
反应路线如下:
将7.80g 3-(二甲氨基丙基)丙烯酰胺(50mmol)、11.48g溴乙酸甲酯(75mmol)和30ml二氯甲烷加入100ml带有磁力搅拌子的圆底烧瓶中。在氮气保护下,室温下搅拌6小时。收集沉淀物,用500毫升无水丙酮洗涤。真空干燥除去残余的溶剂,得到纯净的产物10.85g,收率,94.8%。
1H NMR(400MHz,D2O)δ6.16(m,2H),5.72(t,1H),4.25(s,2H),3.75(s,3H),3.56(s=t,2H),3.31(t,2H),3.21(s,6H),1.99(m,2H).
实施例2 含缩硫酮交联分子(TK)的合成
反应路线如下:
首先,将5.68g(50mmol)巯基乙胺与7.80g(135mmol)无水丙酮加入100ml茄形瓶中,通入饱和的氯化氢气体,在室温下搅拌反应8h,析出白色固体产物过滤后,用氯仿洗涤两次。然后对粗产品进行3次干燥和重结晶得到产物4.21g,收率86%。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.83(s,4H),2.67(t,J=6.4Hz,4H),1.55(s,6H),1.33(s,4H).
在放有磁力搅拌子的100ml茄形瓶中加1.94g反应物a(10mmol),加入20ml二氯甲烷,在0℃下缓慢滴加1.98g(22mmol)丙烯酰氯与15ml二氯甲烷混合物,反应30min后,恢复至室温后,搅拌4h。TLC检测反应结束后,加入20ml饱和碳酸氢钠溶液,萃取收集有机相,并用无水硫酸镁干燥后,浓缩,经柱色谱纯化(乙酸乙酯/正己烷:1/1)得到纯净的产物1.36g,收率45.6%。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(s,2H),6.31–6.09(m,4H),5.57(d,J=11.2Hz,2H),3.51–3.41(m,4H),2.75(t,J=6.8Hz,4H),1.52(s,6H).
实施例3 CBAA-TK纳米笼(两亲性纳米笼)的制备
以实施例1制备的CBAA和实施例2制备的TK为原料,经如下步骤制备得到:
(1)在30mL放有磁力搅拌子血清瓶中,分别加入480mg双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠(AOT),和920mg聚乙二醇十二烷基醚(brij30),加入15ml正己烷,剧烈搅拌至完全溶解,并通入氮气15min。
(2)在上述溶液中加入100mg CBAA单体和10mg TK单体;
(3)在水相中通入氮气3min,然后水相缓慢滴加到有机连续相中;经过超声处理,形成稳定的微乳液;然后在水相中加入10uL 20%(w/v)的过硫酸铵溶液;5min后,加入6uL四甲基乙二胺(TEMED)引发聚合反应,并在4℃下快速磁搅拌;反应2h后,用冰丙酮沉淀纳米粒子,用丙酮洗涤3次,真空干燥30min。在Pbs缓冲液中复溶纳米颗粒,并用100kda超滤管进行纯化,去除游离得GFP,得到CBAA-TK纳米笼。
当CBAA-TK纳米笼作为载体,负载蛋白时,其制备过程同上,不同之处在于步骤(2)中,在加入CBAA单体和TK单体时,加入蛋白,这里以绿色荧光蛋白(GFP)为例,制备负载蛋白的纳米颗粒,其中绿色荧光蛋白(GFP)采用pH8.0的Tris缓冲液进行配制。
实施例4 纳米颗粒的形貌表征
用Zeta电位及粒度测定仪(DLS)检测纳米颗粒的粒径,测得结果如图3,入射激光波长λ=532nm,入射角θ=175°,温度为25℃;粒径值取三次测量值的平均值。用透射电镜(TEM)观察纳米颗粒的形貌如图4,从图4中可以看出整个纳米粒子粒径大约在50nm。简要操作如下:取2μL样品(0.2mg/mL)滴在纯碳膜铜网上,在室温下晾干,用3%的醋酸铀染色1min。用透射电镜在120kV下观察(所述操作采用本领域常规技术进行检测)。
实施例5 纳米粒子活性氧敏感释放定性研究
以实施例3中制备的负载了GFP蛋白的纳米颗粒为测试对象,测试其活性氧敏感性。实验分为两组,具体分组为纳米颗粒(PCB-GFP)+H2O、纳米颗粒(PCB-GFP)+H2O2。
以纳米颗粒+H2O2为例,具体实验步骤如下:
3mL 10.0mg纳米颗粒溶液中加入1.0mL H2O2装入10mL离心管中,放置于37℃摇床。24h后,取出测试样品荧光。
测试结果如图5所示,荧光结果显示,加入H2O2后,GFP荧光信号大幅增加,说明纳米颗粒可以在活性氧条件下响应释放负载的蛋白。
实施例6 纳米粒子的细胞摄取
采用反向乳液聚合法制备包裹有GFP蛋白的纳米颗粒(PCB-GFP),用CLSM观测肿瘤细胞摄取纳米粒子的情况。
具体步骤如下:首先,按照1×103个细胞/孔将HT-1080细胞接种于共聚焦培养皿中,加入1mL DMEM(含10%FBS)培养基,在培养箱中(37℃和5%CO2)培养过夜。向培养过夜后的HT-1080细胞激光共聚焦皿中加入PCB-GFP,其中纳米颗粒的浓度为100ng/mL,共孵育6h,然后,弃去细胞培养基。PBS洗涤培养皿3次,加Hoechst 33342(1μg/mL PBS溶液)染色细胞核5~10min,弃去Hoechst 33342染色液,PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定5min,PBS洗涤3次。使用CLSM观察并拍照。
通过流式细胞术定量检测细胞摄取纳米颗粒的效率。按照上述的方法培养细胞和处理PCB-GFP,当细胞与纳米粒子共孵育6h后,弃去细胞培养基,PBS洗涤3次,加入0.25%胰酶,将细胞转移到15mL离心管中,1000rpm/min离心5min,弃去上清液,加入5mL PBS,震荡,1000rpm/min离心5min,弃去上清液。如此重复用PBS再洗涤一次,将细胞悬浮于0.5mL PBS中。最后,用Gallios流式细胞仪(Beckman)的FL通道(荧光接收波长509nm)检测GFP的荧光。未与纳米粒子共孵育的细胞作为空白组,用于校正背景。
如图6所示,HT-1080cells与PCB-GFP孵育后,GFP组细胞内有明显的绿色荧光(图片为灰黑色图,丢掉了原本的颜色,图中白色部分为原本绿色荧光),表明该纳米颗粒可以被细胞摄取,通过流式细胞术定量检测细胞摄取纳米颗粒的效率表明该纳米粒子可直接用于相关的蛋白药物的输送。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,对于本领域的普通技术人员来说,在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
2.根据权利要求 1 所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼,其特征在于,所述甜菜碱单体和含有缩硫酮键的小分子的摩尔比例为10~2:1。
3.根据权利要求 1 所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼,其特征在于,所述引发剂为过硫酸铵;所述共引发剂为四甲基乙二胺。
4.根据权利要求 1 所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼,其特征在于,所述表面活性剂为双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠、聚乙二醇十二烷基醚或司班中的一种或多种。
5.根据权利要求 4 所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼,其特征在于,所述表面活性剂为质量比为1:8~12的双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠和聚乙二醇十二烷基醚。
6.根据权利要求1所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼,其特征在于,所述有机相为正己烷或正己醇。
7.根据权利要求 1 所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼,其特征在于,所述含有缩硫酮键的小分子由如下过程得到:以巯基乙胺盐酸盐、丙酮为原料,在浓盐酸的催化下得到中间产物;再经氢氧化钠反应后,在0℃、惰性气体保护下,与丙烯酰氯反应,得到含缩硫酮的小分子。
8.权利要求1至7任一所述具有活性氧敏感性的两亲性纳米笼在制备蛋白载体中的应用。
10.一种具有活性氧敏感性的两亲性纳米颗粒,其特征在于,由权利要求 9 所述方法制备得到。
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