CN110967428B - 一种基于高效液相指纹图谱信息建立评价中药化橘红质量的模式识别方法 - Google Patents

一种基于高效液相指纹图谱信息建立评价中药化橘红质量的模式识别方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于高效液相指纹图谱信息建立评价中药化橘红质量的模式识别方法，所述方法包括以下步骤：收集基源信息准确的中药化橘红样品，包括中药材或饮片，采集样品的HPLC指纹图谱，获取样品的整体化学信息；以获取的共有峰为基础数据，对化橘红样品进行数据归一化处理，利用多元聚类分析和/或因子分析对化橘红样品的归一化数据进行分析，筛选出用于建立判别函数的样品数据；采用逐步判别分析方法，对筛选出的样品数据提取出特征变量，建立判别函数，利用建立的判别函数对化橘红样品进行判别，完成对化橘红样品质量的模式识别。本发明可有效用于解决中药化橘红易混淆品种的鉴别、合格品的等级评价、寻找中药化橘红代用品。

Description

一种基于高效液相指纹图谱信息建立评价中药化橘红质量的 模式识别方法
技术领域
本发明属于中药质量评价领域，涉及一种基于高效液相指纹图谱信息建立评价中药化橘红质量的模式识别方法。
背景技术
中药作为我国的瑰宝，其疗效早已毋庸置疑。但是随着中药现代化步伐的不断深入，中药市场混乱导致了中药质量的参差不齐，中药的安全性和有效性开始受到质疑。中药质量的优劣，是关乎中医临床用药安全、有效的根本，目前现行中药质量控制多采用化学定性鉴别和一种或几种指标成分的含量测定为主，具有一定的片面性，违背了中药作用的整体观。为此，非常有必要建立能反映中药整体质量的中药质量评价新方法，力求中药临床使用安全有效。
CN106404689A公开了一种化橘红成分鉴定方法，所述方法包括：通过至少一个波段对样本集的样本进行扫描，采集样本集的样本的高光谱图像；根据高光谱图像，获取样本集样本的高光谱数据；对样本集样本的高光谱数据进行处理，将样本集的样本划分为建模集样本以及检验集样本，并获取建模集样本的高光谱数据以及检验集样本的高光谱数据；通过连续投影算法在建模集样本的高光谱数据中选择特征波长；将检验集样本的高光谱数据、建模集样本的高光谱数据或特征波长对应的高光谱数据作为判别分析模型的输入变量，获取建模集样本的成分识别结果；但是该方法识别精度较低，存在较大的识别错误率。
因此，在本领域，期望建立新的中药质量评价方法，特别是针对化橘红的质量评价方法，期望能够找到适用于化橘红质量评价，并且可以在保证模型较为简单的情况下获得准确的判别结果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于高效液相指纹图谱信息建立评价中药化橘红质量的模式识别方法。本发明的方法基于HPLC指纹图谱建立，并且依靠逐步判别分析来建立判别模型，得到的判别模型简单，判别准确率可以达到100％。本发明可有效用于解决中药化橘红易混淆品种的鉴别、合格品的等级评价、寻找化橘红代用品等。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种基于高效液相(HPLC)指纹图谱信息建立评价中药化橘红质量的模式识别方法，所述方法包括以下步骤：
(1)收集基源信息准确的中药化橘红样品，包括中药材和饮片，采集化橘红样品的HPLC指纹图谱，获取化橘红样品的整体化学信息；
(2)以步骤(1)的共有峰为基础数据，对化橘红样品进行数据归一化处理，利用多元聚类分析和/或因子分析对化橘红样品的归一化数据进行分析，筛选出用于建立判别函数的样品数据；
(3)采用逐步判别分析方法，对步骤(2)筛选出的样品数据提取出特征变量x7、x8、x20、x21，利用提取出的特征变量建立如下判别函数：
F＝0.926x7+0.606x8-0.549x20+0.873x21
(4)利用步骤(3)建立的判别函数对化橘红样品进行判别，完成对化橘红样品质量的模式识别。
在本发明中，通过基于HPLC指纹图谱，利用逐步判别分析来建立判别模型，得到的判别模型中仅包括4个变量，利用该判别函数就能够快速地得到样品的判别结果，并且结果准确可靠。
优选地，步骤(1)所述采集化橘红样品的HPLC指纹图谱时，选择C18色谱柱，以320nm为检测波长，以甲醇-0.5％冰醋酸为流动相，采用二元梯度洗脱系统，溶剂A(甲醇)—溶剂B(0.5％冰醋酸)，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样量20μL。
优选地，步骤(2)所述数据归一化处理采用中心归一化方法进行。
优选地，步骤(2)所述聚类分析采用SPSS 17.0统计分析软件进行。
优选地，步骤(2)所述聚类分析采用ward法作为样品的聚类方法，采用欧氏距离作为距离测度。
优选地，步骤(2)所述因子分析采用SPSS 17.0统计分析软件进行，得出对应因子，根据相关矩阵和因子得分计算出变量系数，以变量系数为中心做图，得到数据分布情况。
优选地，步骤(2)所述利用多元聚类分析和/或因子分析对化橘红样品的归一化数据进行分析时，包括剔除离群点样品。
优选地，步骤(3)所述逐步判别分析方法，利用SPSS 17.0统计分析软件，用Wilks'Lambda作为评价指标，采用相同概率在0.05以内选择为主要峰，保留该峰，相同概率大于0.1以上为无差异峰，剔除该峰，以提取出特征变量。
优选地，步骤(3)建立的判别函数，F＞0时，表示样品为第一类毛橘红；F＜0时，表示样品为第二类光橘红。
优选地，利用已知类别的化橘红样品对步骤(3)建立的判别函数进行验证，以验证判别函数的判别准确性。
作为本发明的优选技术方案，所述基于高效液相指纹图谱信息建立评价中药化橘红质量的模式识别方法，具体包括以下步骤：
(1)选择C18色谱柱，以320nm为检测波长，以甲醇-0.5％冰醋酸为流动相，采用二元梯度洗脱系统，溶剂A甲醇—溶剂B 0.5％冰醋酸，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样量20μL，采集化橘红样品的HPLC指纹图谱，获取化橘红样品的整体化学信息；
(2)以步骤(1)的共有峰为基础数据，采用中心归一化方法对化橘红样品进行数据归一化处理，利用多元聚类分析和/或因子分析对化橘红样品的归一化数据进行分析，筛选出用于建立判别函数的样品数据；
(3)采用逐步判别分析方法，对步骤(2)筛选出的样品数据提取出特征变量x7、x8、x20、x21，利用提取出的特征变量建立如下判别函数：
F＝0.926x7+0.606x8-0.549x20+0.873x21；
F＞0时，表示样品为第一类毛橘红；F＜0时，表示样品为第二类光橘红。
(4)利用步骤(3)建立的判别函数对化橘红及其伪品样品进行判别，完成对化橘红样品质量的模式识别，利用已知类别的化橘红样品对步骤(3)建立的判别函数进行验证，以验证判别函数的判别准确性。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明基于HPLC指纹图谱，依靠逐步判别分析来建立判别模型，得到的判别模型简单，判别准确率可以达到100％。进一步完善了化橘红药材的质量评价方法，也为中国药典对中药化橘红标准的提高提供了依据。
附图说明
图1A为本发明实施例1中利用高效液相采集的空白溶剂的色谱图；
图1B为本发明实施例1中利用高效液相采集的化橘红样品的色谱图。
图2A为本发明实施例1采集得到的毛橘红的HPLC指纹图谱。
图2B为本发明实施例1采集得到的光橘红的HPLC指纹图谱。
图3为本发明实施例1中对毛橘红样品的HPLC数据进行多元聚类分析的结果图。
图4为本发明实施例1中对毛橘红样品的HPLC数据进行因子分子的结果图。
图5为本发明实施例1中对光橘红样品的HPLC数据进行多元聚类分析的结果图。
图6为本发明实施例1中对光橘红样品的HPLC数据进行因子分子的结果图。
图7为本发明实施例1中将31个批次的化橘红样品代入判别函数方程进行判别分析所得结果图。
图8为对比例1中利用偏最小二乘判别分析方法进行判别分析的得分结果图；
图9为对比例1中利用置换检验来判定模型的稳定性和预测能力的结果图；
图10为对比例1中利用提取的6个特征峰再次建立PLS-DA模型而得到的PLS-DA得分图；
图11为对比例1中利用置换检验来判定利用提取的6个特征峰再次建立PLS-DA模型的稳定性和预测能力的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，使用的仪器、试剂与软件如下表1所示：
表1
Figure GDA0003266243850000051
Figure GDA0003266243850000061
在本实施例中，采用的样品如下表2和表3所示：
表2
Figure GDA0003266243850000062
Figure GDA0003266243850000071
表3
样品编号 来源 拉丁名 特征
34 化州，广东 Citrus grandis‘Tomentosa’ 药材
35 化州，广东 Citrus grandis‘Tomentosa’ 药材
36 化州，广东 Citrus grandis‘Tomentosa’ 药材
37 化州，广东 Citrus grandis‘Tomentosa’ 药材
38 化州，广东 Citrus grandis‘Tomentosa’ 药材
39 广西 Citrus grandis(L.)Osbeck 饮片
40 广东 Citrus grandis(L.)Osbeck 饮片
41 广东 Citrus grandis(L.)Osbeck 饮片
42 广东 Citrus grandis(L.)Osbeck 饮片
43 广东 Citrus grandis(L.)Osbeck 饮片
基于HPLC指纹图谱的化橘红质量评价方法如下：
采集化橘红样品的HPLC指纹图谱
色谱系统
色谱柱的选择
分别考察了3个不同厂家生产的色谱柱：(1)Shiseido Capcell Pak C18(250mm×4.6mm，5μm)、(2)WATERS SunFire C18(250mm×4.6mm，5μm)和(3)Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，在相同色谱条件下进样分析，结果表明Shiseido Capcell Pak C18色谱柱能够对样品中各活性成分实现良好的分离，峰形尖锐，色谱图的基线平稳，提供的色谱信息较多，能够满足指纹图谱的分析要求，所以最终选择了Shiseido Capcell Pak C18色谱柱。
检测波长的选择
采用PDA检测器，比较不同波长下的色谱峰(210、254、283、320、325nm)，选择基线平稳时的检测波长，并结合化橘红中的主要成分选择色谱峰峰数适中的检测波长。结果表明，在320nm波长处检测，可同时兼顾到样品中的黄酮类和香豆素类成分，且基线平稳、图谱清晰、特征性强，因此选择320nm为指纹图谱的检测波长。
流动相的选择
分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-冰醋酸、乙腈-冰醋酸四个梯度洗脱系统，在相同色谱条件下，进样分析，记录色谱图。结果表明，用甲醇代替乙腈能获得更多的色谱信息，且得到较好的分离效果。考虑到化橘红中黄酮类组分，在流动相中加入一些酸抑制酚羟基离子化，结果表明分离效果明显得到改善，因此选择甲醇-冰醋酸系统为指纹图谱的流动相。
色谱条件
色谱柱：Shiseido Capcell Pak C18(250mm×4.6mm，5μm，资生堂公司)流动相：甲醇-0.5％冰醋酸梯度洗脱
洗脱梯度：采用二元梯度洗脱系统，溶剂A(甲醇)—溶剂B(0.5％冰醋酸)
梯度程序如下表4所示：
表4
Figure GDA0003266243850000081
Figure GDA0003266243850000091
检测波长：320nm，流速：1.0mL·min-1，柱温：30℃，进样量：20μL
在此条件下，柚皮苷峰与相邻色谱峰的分离度大于1.5，重复性好，拖尾因子在0.95～1.05之间，色谱图如图1所示，证明系统适用性良好。
因此，在采集化橘红样品的HPLC指纹图谱时，选择C18色谱柱，以320nm为检测波长，以甲醇-0.5％冰醋酸为流动相，采用二元梯度洗脱系统，洗脱溶剂为溶剂A(甲醇)—溶剂B(0.5％冰醋酸)，洗脱程序如表4所示，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样量20μL。
采集得到毛橘红与光橘红的HPLC指纹图谱，如图2A和图2B(两个图中最右侧数列的数字表示样品的编号)所示。选取毛橘红与光橘红的HPLC指纹图谱中共有的13个共有峰。
化橘红数据的基础分析
数据归一化处理
由于数据的个体间差异较大，甚至出现了不在同一数量级的问题，严重影响统计分析，因此有必要进行数据归一化，使数值进行无量纲化，同时建立统一分析标准。采用中心归一化方法对编号为1-33的毛橘红样品的13个共有峰数据进行归一化，得到结果如表5和表6所示。
表5
Figure GDA0003266243850000092
Figure GDA0003266243850000101
表6
Figure GDA0003266243850000102
Figure GDA0003266243850000111
样品1-16的多元聚类分析
应用“SPSS 17.0”统计分析软件对样品1-16的归一化数据进行多元聚类分析，采用ward法作为样品的聚类方法，采用欧氏(Euclidean)距离作为样品的测度，判别异常值个体，防止个体的差异过大影响整体数据的分析。聚类分析谱系图如图3所示，通过谱系图可以看出，样本6是显著离群点，应将其剔除后再进行分析。
样品1-16的因子分析
应用“SPSS 17.0”统计分析软件对样品1-16的归一化数据进行因子分析，得到对应3个因子，根据相关矩阵和因子得分计算出变量系数，以变量系数为中心做图，如图4所示，可以看出，个体6显然与其他数值离群，可以剔除。
运用多元聚类分析和因子分析两种方法，均表明6号样本为离群个体，进行后续判别分析时需将其剔除，用剩余15批样本的数据进行分析。
样品17-33的多元聚类分析
应用“SPSS 17.0”统计分析软件对样品17-33的归一化数据进行多元聚类分析，采用ward法作为样品的聚类方法，采用欧氏(Euclidean)距离作为样品的测度，判别异常值个体，防止个体的差异过大影响整体数据的分析。聚类谱系图见图5，通过谱系图可以看出，样本19是显著离群点，应将其剔除后再进行分析。
样品17-33的因子分析
应用“SPSS 17.0”统计分析软件对样品17-33的归一化数据进行因子分析，得到对应3个因子，根据相关矩阵和因子得分计算出变量系数，以变量系数为中心做图，如图6所示，可以看出，个体19显然与其他数值离群，可以剔除。
运用多元聚类分析和因子分析两种方法，均表明19号样本为离群个体，进行后续判别分析时需将其剔除，用剩余16批样本的数据进行分析。
判别分析
判别函数的建立
应用“SPSS 17.0”统计分析软件，对已筛选出来的15批毛橘红和16批光橘红进行判别分析，建立判别函数。
采用逐步判别分析方法，用Wilks'Lambda作为评价指标，采用相同概率在0.05以内选择为主要峰，保留该峰，相同概率大于0.1以上为无差异峰，剔除该峰，判别化橘红的分类。应用先验概率(bayes)方法进行分析，综合了Fisher方法进行判别函数选取，得到结果如下：
由表7可以确定，判别函数的相关准确率为95.9％，判别有效，可以接受统计结果。
表7特征值
Figure GDA0003266243850000131
a.前1个典型区别函数用于分析.
通过前面的逐步判别分析输出的Wilks’Lambda检验结果如表8所示，sig值代表显著性值，由表8可知，显著性的数值小于0.05，检查有显著性差异，说明两组中存在显著性差异。
表8 Wilks’Lambda检验结果
Figure GDA0003266243850000132
运行判别分析时的协方差矩阵检验结果如表9所示，通过表9可以看到，Box's M检验sig值＝0.124＞0.05，证明这两组偏差是相等的，判别函数有效。
表9 Box’s M检验结果
Figure GDA0003266243850000133
运行判别分析时建立的标准化函数，里面显示的入选的峰及其系数如表表10所示。
表10标准化函数
Figure GDA0003266243850000141
由表10可知，以提取出的特征变量x7、x8、x20、x21，建立如下判别函数：
F＝0.926*x7+0.606*x8-0.549*x20+0.873*x21
其中x7：峰值7，x8：峰值8，x20：峰值20，x21：峰值21。
当F＞0时，表示为第一类毛橘红；F＜0时，表示为第二类光橘红。
将31个批次的化橘红样品代入判别函数方程进行判别分析，所得结果如图7所示，该图进一步说明两组可以进行很好的分类，且没有误判情况。本研究根据现有的13个共有峰，通过聚类分析、剔除异常值个体、因子分析、判别分析最终得到只需要4个峰值建立判别函数，下面对所建判别函数进行验证。
判别函数的验证
采集已知类别的10批化橘红样品(样品编号34-43)的HPLC指纹图谱，数据经过标准化后，得到四个有效峰x7、x8、x20、x21的标准化数值，应用判别函数进行判别，可得到判别值和分类情况，结果见表11。
表11
Figure GDA0003266243850000142
Figure GDA0003266243850000151
可见，判别函数对判定已知类别的化橘红具有很好的判别效果，准确率为100％。
对比例1
与实施例1不同的是，在本对比例中判别分析时采用偏最小二乘判别分析方法(PLS-DA)，具体为：
采用SIMCA 14.1软件，对已筛选出来的15批毛橘红和16批光橘红进行偏最小二乘判别分析，得分图见图8，前两个主成分解释了61.8％的方差(R2X＝0.618)，模型区分参数90.0％(R2 Y＝0.900)，模型预测度85.5％(Q2＝0.855)。R2Y是指变量能解释模型分类的方差值，其数值大小反映了模型的解释能力，Q2是指变量能解释预测分类能力的方差值，其数值大小可以表征模型的预测能力，二者越接近于1，模型的拟合能力和预测能力越好。结果表明，本模型拟合度很好，并具有可靠的预测能力，PLS-DA模型有效的将化橘红的中毛橘红和光橘红分开。通过置换检验(置换次数：200)来判定模型的稳定性和预测能力，右侧的R2或Q2均高于左侧的所有点(图9)，R2<0.4，Q2<0.05，表明该模型具有很好的可预测性和拟合优度。
特征提取可以提高模型的可预测性并降低其复杂性。本对比例中选用变量重要性投影值(variable importance in project，VIP)>1.0来评价变量的贡献大小，VIP值越大，表明变量对分类的贡献度越大。筛选VIP值>1.0的变量，并对其进行组间t检验，剔除不显著变量，最终得到具有非常显著差异(P值<0.01)的6个峰作为特征峰，按照其对分类影响由大到小的顺序，分别为峰7(VIP＝1.4411)、峰20(VIP＝1.34192)、峰8(VIP＝1.32911)、峰1(VIP＝1.30457)、峰19(VIP＝1.2491)、峰11(VIP＝1.02147)。这6个峰对毛橘红和光橘红样品分类具有显著的影响，他们是区分橘红不同样本的标志物。用6个特征峰再次建立PLS-DA模型，累计方差贡献率87.1％(R2X＝0.871)，模型区分参数86.8％(R2Y＝0.868)模型预测度84.7％(Q2＝0.47)，该模型可以表征大部分信息化学成分，具有很好的拟合能力和可靠的预测能力，PLS-DA得分图见图10。置换检验(置换次数：200)右侧的R2或Q2均高于左侧的所有点(图11)，R2＝0.0153<0.4，Q2＝-0.258<0.05，表明该模型具有很好的可预测性和拟合优度。表明该模型具有很好的可预测性和拟合优度，没有过度拟合。
可见，与本发明使用逐步判别分析结果相比，PLS-DA选出的特征峰为6个，而逐步判别分析选出特征峰仅有4个，可见逐步判别分析比PLS-DA判别模型更简便，能以最少的特征变量实现对毛橘红和光橘红的准确区分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (5)

1.一种基于高效液相指纹图谱信息建立评价中药化橘红质量的模式识别方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)收集基源信息准确的中药化橘红样品，包括中药材和饮片，采集样品的HPLC指纹图谱，获取样品的整体化学信息；
(2)以步骤(1)的共有峰为基础数据，对化橘红样品进行数据归一化处理，利用多元聚类分析和/或因子分析对化橘红样品的归一化数据进行分析，筛选出用于建立判别函数的样品数据；
(3)采用逐步判别分析方法，对步骤(2)筛选出的样品数据提取出特征变量x7、x8、x20、x21，利用提取出的特征变量建立如下判别函数：
F＝0.926x7+0.606x8-0.549x20+0.873x21；
(4)利用步骤(3)建立的判别函数对化橘红样品进行判别，完成对化橘红样品质量的模式识别；
步骤(2)所述数据归一化处理采用中心归一化方法进行；步骤(2)所述多元聚类分析采用ward法作为样品的聚类方法，采用欧氏距离作为距离测度；步骤(2)所述因子分析采用SPSS 17.0统计分析软件进行，得出对应因子，根据相关矩阵和因子得分计算出变量系数，以变量系数为中心做图，得到数据分布情况；
步骤(3)建立的判别函数，F＞0时，表示样品为第一类毛橘红；F＜0时，表示样品为第二类光橘红；
步骤(1)所述采集样品的HPLC指纹图谱时，选择C18色谱柱，以320nm为检测波长，流动相A为甲醇，流动相B为0.5％冰醋酸，采用二元梯度洗脱系统，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样量20μL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述多元聚类分析采用SPSS 17.0统计分析软件进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述利用多元聚类分析和/或因子分析对化橘红样品的归一化数据进行分析时，包括剔除离群点样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述逐步判别分析方法，利用SPSS17.0统计分析软件，用Wilks'Lambda作为评价指标，采用相同概率在0.05以内选择为主要峰，保留该峰，相同概率在0.1以上为无差异峰，剔除该峰，以提取出特征变量。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用已知类别的化橘红样品对步骤(3)建立的判别函数进行验证，以验证判别函数的判别准确性。
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