CN110964847A

CN110964847A - 实时荧光pcr检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法

Info

Publication number: CN110964847A
Application number: CN202010009713.XA
Authority: CN
Inventors: 顾沛雯; 杜娟; 石华荣; 李文学; 任苗苗
Original assignee: Ningxia University
Current assignee: Ningxia University
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2020-04-07

Abstract

本发明提供一种实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法，本发明依据葡萄白粉病菌ITS基因组序列（1323 bp），设计葡萄白粉病菌的特异性引物，构建了葡萄白粉病菌Real‑time PCR分子检测体系；通过人工接种的方法，建立了潜育期葡萄叶片葡萄白粉病菌菌源量与接种时间的关系。通过本发明，构建了早期、快速、准确、灵敏的定量检测葡萄白粉病菌的Real‑time PCR方法，为葡萄白粉病的早期预防和防治措施的制定提供理论依据。

Description

实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法。

背景技术

葡萄白粉病是由葡萄钩丝壳菌Uncinula necator(Schw.)Burr.引起的一种真菌病害。起源于欧洲，现几乎遍布世界所有葡萄产区。葡萄白粉病的流行会严重影响葡萄树势、产量和品质。在流行年份，一般减产30％左右，严重时减产达50％以上。而国内尚未见有关葡萄白粉病Real-time PCR早期预警检测方面的发明，就目前传统的预测模式，根本检测不到葡萄白粉病菌潜育期的发病情况，从而影响该病的早期防治，错过防治关键期，造成严重的经济损失。因此，建立葡萄白粉病的Real-time PCR体系，为葡萄白粉病菌的早期检测提供理论和技术支撑尤为迫切。

国内外发明中，Chellemi和Marois采用微机处理系统成功的研制出用于预测葡萄白粉菌生长的生长模型，此模型可以预测预报和监控白粉病菌的生长。Diaz等认为通过对空气中传播的病原体进行空气生物学发明可以预测在生产季节病害的潜在风险，从而为葡萄白粉病的适期防治提供科学指导。近年来，随着分子技术的快速发展，尤其是实时荧光定量PCR技术，因其具有定量准确、快速、特异性强、灵敏度高、操作简便等优点而受到人们的青睐，从而使得对植物病害的早期监测成为可能，并逐步开始应用于病害的早期诊断发明。闫佳会等采用Real-time PCR的方法，定量检测对小麦条锈菌进行了检测。陈兆贵等利用Real-time PCR的方法，用特异性引物对马铃薯卷叶病毒进行了定量发明。在白粉病菌的定量发明方面，郑亚明^[14]对小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的Real-time PCR检测技术进行了发明。目前国内外主要开展了葡萄白粉病菌检测、鉴定和分子标记等方面的发明，尚未见有关葡萄白粉病菌Real-time PCR早期定量检测方法的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明依据葡萄白粉病菌ITS基因组序列(1323bp)，设计葡萄白粉病菌的特异性引物，构建了葡萄白粉病菌Real-time PCR分子检测体系；通过人工接种的方法，建立了潜育期葡萄叶片葡萄白粉病菌菌源量与接种时间的关系。通过本发明，构建了早期、快速、准确、灵敏的定量检测葡萄白粉病菌的Real-time PCR方法，为葡萄白粉病的早期预防和防治措施的制定提供理论依据。

进一步地，本发明提供一种实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1：准备样品菌株，包括葡萄白粉病菌、芸薹链格孢、哈茨木霉和辣椒胶胞炭疽菌；

步骤2：对菌株进行样品DNA提取；

步骤3：设计并合成引物；

步骤4：对引物进行特异性检查；

步骤5：优化Real-time PCR反应退火温度；

步骤6：制备质粒标准品；

步骤7：绘制Real-time PCR标准曲线并进行有效性检验；

步骤8：通过Real-time PCR定量检测接种后叶片中病原菌含量；

进一步地，所述步骤2中样品DNA提取包括以下步骤：

步骤2.1：取1.5mL离心管加入400μL LE Buffer；取葡萄霜霉菌丝0.5g放入液氮中充分研磨后加入离心管中混匀；

步骤2.2：于65℃环境中温浴15～30min；加入130μL DA Buffer混匀后冰浴5min，14,000r离心3min；

步骤2.3：将上清液转移到新的1.5mL离心管，加滤液体积1.5倍的E BindingBuffer混匀然后转移至过滤柱，6,000r离心1min，弃废液；

步骤2.4：向柱子中加入500μL的G Binding Buffer，10000r离心30s，弃废液；

步骤2.5：过滤柱中加入600μL的Wash Buffer，10000r离心30s，弃废液；

步骤2.6：重复上一步骤一次；再次将柱子10000r离心1min后转移至新的1.5mL离心管；加入150μL Elution Buffer，并于室温温育1min；12000r离心1min，弃去过滤柱；

步骤2.7：分装DNA，标记，-20℃保存备用.；

进一步地，所述步骤3具体为：利用葡萄白粉病菌ITS序列(1323bp)设计特异性引物UNF2/UNR2，目的片段大小为157bp；

所述UNF2：5’-CCTCAAGCTGCCCTTGTG-3’；

所述UNR2：5-’TCCGGATGACCGGACAA-3’；

进一步地，所述步骤4具体为：将步骤2中提取的样品DNA以ddH₂O为空白对照，用步骤3中引物UNF2/UNR2进行常规PCR和Real-time PCR扩增，检测引物特异性；

进一步地，所述Real-time PCR扩增及检测引物特异性具体为：94℃预变性30s；94℃变性5s；58℃退火15s；72℃延伸30s；40个循环；使用荧光定量PCR仪进行扩增，并对扩增加结果进行数据分析，获取Real-time PCR对引物UNF2/UNR2溶解曲线；分析温度设定为60～95℃之间，每0.5℃收集荧光信号30s，溶解曲线分析中有单一特异的峰为判断引物特异性的标准；

进一步地，所述步骤5具体为设计退火温度区间56～59℃，优化退火温度按Real-time PCR反应体系及条件，对扩增曲线和溶解曲线中荧光值△Rn最高和Ct值最小且在溶解曲线分析中有单一吸收峰为标准，进行最佳退火温度的优化，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历等的循环数；

进一步地，所述步骤6具体包括以下步骤：

步骤6.1：将扩增的PCR产物与pEASY-T1Simple Cloning Vector25℃连接后，转至Trans1-T1感受态细胞中，37℃过夜培养；

步骤6.2：挑取白色单克隆，转到含有Amp的LB液体培养基中，振荡培养12h；

步骤6.3：:利用试剂盒提取重组质粒，使用PCR验证和测序的方法，检测插入的片段是否正确；

步骤6.4：微量分光光度计计算质粒DNA的浓度和纯度，根据摩尔定律，计算单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度；

质粒拷贝数＝[质粒浓度(ng·μL^-1)×质粒体积(μL)×6.02×10²³]/[(载体长度bp+片段长度bp)×660g·mol^-1]；

进一步地，所述步骤7具体为：用优化后的Real-time PCR体系和反应条件，对重组的质粒进行拷贝数10倍梯度稀释作为标准品，用引物UNF2/UNR2进行Real-time PCR检测，构建Real-time PCR标准曲线；

进一步地，所述步骤8具体为：提取的葡萄叶片中的植物DNA，用引物UNF2/UNR2进行Real-time PCR扩增，应用步骤6中的标准曲线计算白粉病菌的带菌量，建立接种叶片内葡萄白粉病菌DNA量随时间变化的定量关系；

进一步地，所述提取的葡萄叶片中的植物DNA方法为：

取1.5mL离心管加入600μL Buffer CPL；取葡萄叶片0.5g放入液氮中充分研磨后加入离心管中混匀；于65℃环境中温浴15～30min；加入600μL氯仿震荡混匀20s，室温下12000r离心10min；吸取300μL上清液至新的1.5mL离心管中,加入10μL RNase A，室温放置10-20min；加入150μL Buffer CXD和300μL乙醇，混匀；将包括沉淀的整个样本转移至过滤柱中，10000r离心1min，弃废液和2mL收集管；将过滤柱转至新的离心管中，加入650μL SPWWash Buffer,10000r离心1min，弃废液；重复上一步骤，将过滤柱移入空的收集管中，空柱10000r离心2min；将Elution Buffer放入65℃水浴锅中温浴3min；将过滤柱放入新的1.5mL离心管；加入已温浴的Elution Buffer 50μL；10000r离心1min，重复上一步骤；分装DNA，标记，-20℃保存备用；

本发明的有益效果如下：

1)本发明建立的Real-time PCR体系最低可检测到1.11×10⁵copies·μL^-1的病原菌DNA含量；

2)本发明对潜伏侵染6h的病原菌侵染量进行了检测，证明该体系可用于潜育期葡萄白粉病菌的检测；

3)本发明最终建立的葡萄白粉病菌Real-time PCR检测体系的，特异性强，其Ct值与模板浓度呈较好线性关系，可用于定量检测葡萄叶片中葡萄白粉病菌的潜育期侵染量，为葡萄白粉病的早期预防和防治措施的制定提供理论依据。

附图说明

图1为本发明葡萄白粉病菌普通PCR引物特异性检测图；

图2为本发明Real-time PCR检验葡萄白粉病菌引物UNF2/UNR2的特异性；

图3为本发明Real-time PCR反应Tm值的优化图；

图4为本发明葡萄白粉病菌质粒转化图；

图5为本发明葡萄白粉病菌Real-time PCR标准曲线图；

图6为本发明葡萄白粉病菌叶部潜育期的检测及其动态模拟图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。下面为本发明的举出最佳实施例：

本发明提供了一种实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法，所述方法具体如下：

1.1准备实验材料

葡萄白粉病菌U.necator、芸薹链格孢Alternaria brassicae(Berk.)Sace、哈茨木霉Trichoderma harzianum、辣椒胶胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Pena，所有菌株均由宁夏大学农学院植物病理实验室提供。

1.2试剂和仪器

植物DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.HP Plant DNAMini Kit，OMEGA公司，美国)、真菌DNA提取试剂盒(Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit，BioFlux公司，日本)、胶纯化试剂盒(Universal DNA Purification Kit，TIANGEN公司，德国)、质粒DNA小样试剂盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，CORNING公司，美国)、2×EcoTaqPCR SuperMix(+dye)(全式金公司)、RansStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金公司)。

qTOWER2.2荧光定量PCR仪(Jena公司，德国)、Azure c200凝胶成像仪(AzureBiosystems)、RQX-250智能人工气候箱(上海跃进医疗器械有限公司)、THZ-92B气浴恒温振荡器(上海)、SimpliNano微量分光光度计(GE公司，美国)

1.3.1样品DNA的提取

真菌DNA提取试剂盒：用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(BioFlux公司)按照说明书提取真菌菌丝体DNA，具体操作步骤如下：取1.5mL离心管加入400μL LEBuffer；取葡萄霜霉菌丝0.5g放入液氮中充分研磨后加入离心管中混匀；于65℃环境中温浴15～30min；加入130μL DA Buffer混匀后冰浴5min，14,000r离心3min；将上清液转移到新的1.5mL离心管，加滤液体积1.5倍的E Binding Buffer混匀然后转移至过滤柱，6,000r离心1min，弃废液；向柱子中加入500μL的G Binding Buffer，10000r离心30s，弃废液；过滤柱中加入600μL的Wash Buffer，10000r离心30s，弃废液；重复上一步骤一次；再次将柱子10000r离心1min后转移至新的1.5mL离心管；加入150μL Elution Buffer，并于室温温育1min；12000r离心1min，弃去过滤柱。分装DNA，标记，-20℃保存备用。

植物DNA提取试剂盒：取1.5mL离心管加入600μL Buffer CPL；取葡萄叶片0.5g放入液氮中充分研磨后加入离心管中混匀；于65℃环境中温浴15～30min；加入600μL氯仿(24:1)震荡混匀20s，室温下12000r离心10min；吸取300μL上清液至新的1.5mL离心管中,加入10μL RNase A，室温放置10-20min(目的是移除RNA)；加入150μL Buffer CXD和300μL乙醇，混匀；将整个样本(包括沉淀)转移至过滤柱中；10000r离心1min；弃废液和2mL收集管；将过滤柱转至新的离心管中；加入650μL SPW Wash Buffer(用乙醇稀释过),10000r离心1min，弃废液；重复上一步骤；将过滤柱移入空的收集管中，空柱10000r离心2min；将Elution Buffer放入65℃水浴锅中温浴3min；将过滤柱放入新的1.5mL离心管；加入已温浴的Elution Buffer 50μL；10000r离心1min，重复上一步骤。分装DNA，标记，-20℃保存备用。

1.3.2引物的设计与合成

本发明在设计引物时，根据葡萄白粉病菌的ITS序列(1323bp)，设计出以下两对引物：

UNF1:GGTAGTCGTGTGCTGG

UNR1:CGAAGCCGGTGGGCG

UNF2:CCTCAAGCTGCCCTTGTG

UNR2:TCCGGATGACCGGACAA

经过特异性检测后，选择特异性引物：

UNF2(5’-CCTCAAGCTGCCCTTGTG-3’)/UNR2(5-’TCCGGATGACCGGACAA-3’)；目的片段大小为157bp。引物由生工生物(上海)有限公司合成。

所述葡萄白粉菌的ITS序列：LC028995：

CAGAGCGAGAGGCTCAGCCATGACGGTAGTCGTGTGCTGGGTCGACCCTCCCACCCGTGTCGATATGTATTTTGTTGCTTTGGCGGGCCGGGTTTGCGCCCCGTTCGGCGTCCGCTGTGGCGCTGGGGGAGCCGCCCACCGGCTTCGGCTGGAGCGTGCCCGCCAGAGACCTCATCCAAACTCACGTTGTCATGTAGTCTAAGCTTTATTAAGTAATTGATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGCATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATAACACCCCCCTCAAGCTGCCCTTGTGGTGGCTTCGGTGTTGGGGCTCGTCGCAGTTTTGCGGTGGCCCTTAAAGACAGTGGCGGTCCCCGCGTGGGCTCTACGCGTAGTAACTTGTTCCTCGCGACAGAGTGACGCTCGTGATCAGCCAGAACCACCCACCTTTGTCCGGTCATCCGGATTGACAGGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACTGGGATTACCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGTAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCCTTCGGAGTCCGAGTTGTAATTTGTAGAAGATGCTTTGGGCTGTAGGTTCGGCCTAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTATGCGGCCGAGGCTTGCGCCCATGTAAAGCTCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATATTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTGAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCAACCAGACTTGGGCGCTGCGGATCACCTCGGGTTTTTCGAGGGCACTCGGTAGCGCACAGGCCAGCATCGGTTCGGGTGGCTGGAGAAAGGCCGTTGGAACGTAGCTCCCCTCGGGGAGTGTTATAGCCAACGGTGCCATGCAGCCCAGCCGGACCGAGGACCGCGCCTTCGGGCTAGGATGCTGGCGTAATGGTTGTAAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATCTATGCGAGTGTTTGGGCGTGAAAACCCACACGCGGAATGAAAGTGAACGTAGGTGAGAACCCTTCTGGGGCGCATCATCGACCGATCCT。

1.3.3引物特异性检查

分别取上述葡萄白粉病菌U.necator、芸薹链格孢A.brassicae、哈茨木霉T.harzianum、辣椒胶胞炭疽菌C.gloeosporioides Pena的DNA，以ddH₂O为空白对照，用引物UNF2/UNR2进行常规PCR和Real-time PCR扩增，检测引物特异性。

常规PCR反应体系(见表1)，反应程序为：94℃预变性10min；94℃1min；58℃30s；72℃1min 30s；共35个循环；72℃延伸10min；4℃∞。PCR产物经3％的琼脂糖凝胶电泳(30min)后，用Azurec200凝胶成像系统成像分析结果。

表1常规PCR优化后的反应体系

Table.1Reaction system optimizadby conventional PCR

Real-time PCR反应体系(见表2)，反应程序：94℃预变性30s；94℃变性5s；58℃退火15s；72℃延伸30s；40个循环。使用qTOWER2.2荧光定量PCR仪(Jena公司，德国)进行扩增，并用该仪器上的分析软件进行数据分析。

Real-time PCR对引物UNF2/UNR2溶解曲线，分析温度设定为60～95℃之间，每0.5℃收集荧光信号30s，获得溶解曲线，溶解曲线分析中有单一特异的峰为判断引物特异性的标准。

表2 Real-time PCR优化后的反应体系

1.3.4优化Real-time PCR反应退火温度

为提升Real-time PCR反应扩增特异性，设计退火温度区间56～59℃，优化退火温度(Annealing Temperature，Tm)。按1.3.3Real-time PCR反应体系及条件，对扩增曲线和溶解曲线荧光值(△Rn)最高、Ct(Cycle threshold)值(每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历等的循环数)最小且在溶解曲线分析中有单一吸收峰为标准，进行最佳退火温度的优化。

1.3.5质粒标准品的制备

PCR产物与pEASY-T1 Simple Cloning Vector 25℃连接后，转至Trans1-T1感受态细胞中，37℃过夜培养，第2d在超净工作台中进行蓝白斑挑选，挑取平板上的白色单克隆，转到含有Amp的LB液体培养基中，利用THZ-92B气浴恒温振荡器设置37℃，200r/min振荡培养12h。利用试剂盒提取重组质粒，使用PCR验证和测序(生工生物有限公司合成)的方法，检测插入的片段是否正确。微量分光光度计计算质粒DNA的浓度和纯度，根据摩尔定律，计算单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度。

质粒拷贝数＝[质粒浓度(ng·μL^-1)×质粒体积(μL)×6.02×10²³]/[(载体长度bp+片段长度bp)×660g·mol^-1]

1.3.6Real-time PCR标准曲线的绘制及方法有效性检验

用优化后的20μL的定量Real-time PCR体系和反应条件，对定量的质粒进行拷贝数10倍梯度稀释作为标准品。用引物UNF2/UNR2进行Real-time PCR检测，选择荧光值稳定且线性良好的浓度范围，以拷贝数为x轴，Ct为y轴，构建Real-time PCR标准曲线(利用定量软件Real-time PCR soft 3.2生成)。

1.3.7Real-time PCR定量检测接种后叶片中病原菌含量

从田间选取葡萄白粉病霉层密集的叶片，用1.5cm打孔器打取病斑叶盘，将叶盘霉层直接与无菌组培苗叶背拓贴接菌，一叶一盘。在气候培养箱中25℃、相对湿度48％的黑暗条件下保湿培养6h，去掉叶盘，共接种葡萄叶片35片，以空白无菌组培苗叶片为对照；在气候培养箱中培养6、12、24、48、72、96、120h(接种72h后叶片出现霉层)收集接种叶片，每处理重复3次。将葡萄叶片无菌水清洗，剪碎，混匀，称取0.5g，按照1.3.1的方法提取葡萄叶片DNA。用引物UNF2/UNR2进行Real-time PCR扩增，应用已构建的标准曲线计算潜育期葡萄叶片中白粉病菌的带菌量(反应体系和条件同1.3.3)，建立接种叶片内葡萄白粉病菌DNA量随时间变化的定量关系。

1.4数据处理

荧光定量软件Real-time PCR soft 3.2构建Real-time PCR标准曲线；统计软件IBM SPSS Statistics 19.0的Regression-Curve Estimation程序进行曲线模拟。

通过上述方法，本发明对该方法的结果进行分析：

2.1引物特异性验证

应用引物UNF2/UNR2对葡萄白粉病菌U.necator、芸薹链格孢A.brassicae、哈茨木霉T.harzianum、辣椒胶胞炭疽菌C.gloeosporioides Pena的DNA进行常规PCR扩增。结果显示，仅葡萄白粉病DNA扩增出157bp的目标条带，而其它供试菌DNA和清水对照等均未扩增出条带，如图1所示，图中M：Marker；1～3：葡萄白粉病菌；4：芸薹链格孢；5：哈茨木霉；6：胶胞炭疽；ck：清水对照。应用引物扩增，结果表明，该引物UNF2/UNR2对葡萄白粉病菌有唯一的产物吸收峰，如图2所示。

2.2Real-time PCR反应退火温度的优化

优化Real-time PCR反应退火温度(Tm)，提升反应扩增特异性。以引物对UNF2/UNR2常规PCR最优Tm值58℃为基础，采用线性±1℃筛选最优Tm值如图3中的a部分内容。结果表明引物对UNF2/UNR2在58℃时获得最小Ct值，如图3中的b部分内容，本实验选择58℃作为葡萄白粉病菌Real-time PCR反应的Tm值。

2.3Real-time PCR标准曲线的建立及方法有效性检验

2.3.1重组质粒的制备

成功将目的片段插入到

-T1Simple克隆载体，用引物UNF2/UNR2对基因组DNA，白色单克隆，和重组质粒进行普通PCR检测，如图4所示，图4中M：Marker；1～2：基因组DNA的常规PCR结果；3～4：白色单克隆的常规PCR结果5～6：质粒DNA的常规PCR结果；CK：清水对照。检测结果与测序结果一致，长度为157bp片段。提取的重组质粒浓度和纯度(A₂₆₀/A₂₈₀＝1.896)都较高，重组质粒的制备符合实验要求。

2.3.2标准曲线的建立及方法有效性检验

设置浓度梯度为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001ng/μL的质粒浓度作为标准品。在荧光定量PCR仪上结束扩增后，以模板浓度的对数为x轴，以Ct值为y轴做标准曲线，获得检测葡萄白粉病菌的标准曲线，如图5所示，图5中；a:10ng/μl,b:1ng/μl,c:0.1ng/μl,d:0.01ng/μl,e:0.001ng/μl,f:0.0001ng/μl。线性方程为y＝46.4009-3.3295x(r²＝0.9963)，线性范围达6个数量级(2.29×10⁴～2.29×10⁹copies·μL^-1)。

2.4潜伏侵染叶片中病原菌的Real-time PCR定量测定

利用以建立好的葡萄白粉病菌real-time PCR体系，对已接种6、12、24、48、72、96、120h的葡萄白粉病菌的叶片，进行葡萄白粉病潜育阶段的病原体数量的测定，分别得出潜育期葡萄白粉病原菌Ct平均值和拷贝数的方差检测表，如表3所示，表3中拷贝数方差后小写字母是0.05水平的差异显著性，大写字母是0.01水平的差异显著性，由接种时间与潜育期葡萄白粉病菌之间的数量关系,分析出了葡萄白粉病菌叶部潜育期的检测及其动态模拟，如图6所示。该病菌的DNA量处在潜育期的葡萄叶片内呈指数增长趋势，用如下方程表示：y＝98927.07e^0.0238x(r²＝0.8635，P＝0.000,F＝120.179)，其中y为葡萄白粉病菌DNA的拷贝数，x为接种小时数。接种72h后，病原菌拷贝数可达375371.6837。

表3潜育期葡萄白粉病原菌Ct平均值和拷贝数的方差检测表

本发明设计筛选的引物UNF2/UNR2大小为157bp，对白粉病菌的特异性好，优化后的体系，在58℃时为最优退火温度，不易形成二聚体，特异性高，扩增效率好。此外，本发明构建了Real-time PCR循环阈值(Ct)与模板浓度的线性关系，相关系数r²＝0.9963，线性范围达6个数量级，在2.29×10⁴～2.29×10⁹copies·μL^-1之间呈现良好的线性关系。对人工接种葡萄白粉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行Real-time PCR检测，叶片内病原菌潜育侵染量随接种时间的变化呈指数关系增长，相关系数r²＝0.8635。该体系最低可定量检测叶片内葡萄白粉病菌潜育侵染量为1.11×10⁵copies·μL^-1的病原菌DNA。能检测到病原菌侵入叶片6h后的低侵染量，这为葡萄白粉病的田间潜育侵染量与病害早期诊断与预测提供了技术支持。

本发明建立的Real-time PCR体系最低可检测到1.11×10⁵copies·μL^-1的病原菌DNA含量。并对潜伏侵染6h的病原菌侵染量进行了检测，证明该体系可用于潜育期葡萄白粉病菌的检测。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤2：对菌株进行样品DNA提取；

步骤3：设计并合成引物；

步骤4：对引物进行特异性检查；

步骤5：优化Real-time PCR反应退火温度；

步骤6：制备质粒标准品；

步骤7：绘制Real-time PCR标准曲线并进行有效性检验；

步骤8：通过Real-time PCR定量检测接种后叶片中病原菌含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中样品DNA提取包括以下步骤：

步骤2.1：取1.5mL离心管加入400μL LE Buffer；取葡萄白粉病菌丝0.5g放入液氮中充分研磨后加入离心管中混匀；

步骤2.3：将上清液转移到新的1.5mL离心管，加滤液体积1.5倍的E Binding Buffer混匀然后转移至过滤柱，6,000r离心1min，弃废液；

步骤2.7：分装DNA，标记，-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3具体为：利用葡萄白粉病菌ITS序列设计特异性引物UNF2/UNR2，目的片段大小为157bp,葡萄白粉病菌ITS序列全长1323bp；

所述UNF2：5’-CCTCAAGCTGCCCTTGTG-3’；

所述UNR2：5-’TCCGGATGACCGGACAA-3’。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4具体为：将步骤2中提取的样品DNA以ddH₂O为空白对照，用步骤3中引物UNF2/UNR2进行常规PCR和Real-time PCR扩增，检测引物特异性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Real-time PCR扩增及检测引物特异性具体为：94℃预变性30s；94℃变性5s；58℃退火15s；72℃延伸30s；40个循环；使用荧光定量PCR仪进行扩增，并对扩增加结果进行数据分析，获取Real-time PCR对引物UNF2/UNR2溶解曲线；分析温度设定为60～95℃之间，每0.5℃收集荧光信号30s，溶解曲线分析中有单一特异的峰为判断引物特异性的标准。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤5具体为设计退火温度区间56～59℃，优化退火温度按Real-time PCR反应体系及条件，对扩增曲线和溶解曲线中荧光值△Rn最高和Ct值最小且在溶解曲线分析中有单一吸收峰为标准，进行最佳退火温度的优化，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历等的循环数。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤6具体包括以下步骤：

步骤6.1：将扩增的PCR产物与

-T1 Simple Cloning Vector 25℃连接后，转至Trans1-T1感受态细胞中，37℃过夜培养；

质粒拷贝数＝[质粒浓度(ng·μL^-1)×质粒体积(μL)×6.02×10²³]/[(载体长度bp+片段长度bp)×660g·mol^-1]。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤7具体为：用优化后的Real-timePCR体系和反应条件，对重组的质粒进行拷贝数10倍梯度稀释作为标准品，用引物UNF2/UNR2进行Real-time PCR检测，构建Real-time PCR标准曲线。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤8具体为：提取的葡萄叶片中的植物DNA，用引物UNF2/UNR2进行Real-time PCR扩增，应用步骤6中的标准曲线计算白粉病菌的带菌量，建立接种叶片内葡萄白粉病菌DNA量随时间变化的定量关系。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述提取的葡萄叶片中的植物DNA方法为：

取1.5mL离心管加入600μL Buffer CPL；取葡萄叶片0.5g放入液氮中充分研磨后加入离心管中混匀；于65℃环境中温浴15～30min；加入600μL氯仿震荡混匀20s，室温下12000r离心10min；吸取300μL上清液至新的1.5mL离心管中,加入10μL Rnase A，室温放置10-20min；加入150μL Buffer CXD和300μL乙醇，混匀；将包括沉淀的整个样本转移至过滤柱中，10000r离心1min，弃废液和2mL收集管；将过滤柱转至新的离心管中，加入650μL SPWWash Buffer,10000r离心1min，弃废液；重复上一步骤，将过滤柱移入空的收集管中，空柱10000r离心2min；将Elution Buffer放入65℃水浴锅中温浴3min；将过滤柱放入新的1.5mL离心管；加入已温浴的Elution Buffer 50μL；10000r离心1min，重复上一步骤；分装DNA，标记，-20℃保存备用。