CN110964661A - 一种微生物岩中有机质早期降解模拟方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例涉及一种微生物岩中有机质早期降解模拟方法，通过实验室培养微生物岩中的蓝藻作为实验中的有机质，培养微生物席中参与有机质降解的各个阶段的细菌，然后分别在有氧、厌氧条件下将细菌加入蓝藻和碳酸盐矿物的互层装置中进行反应，以此实现有机质早期降解过程的模拟，降解产物可以很好的保存在反应装置内，在降解结束后从取样口取样进行液相色谱、红外光谱分析，即可完成有机质降解的各个阶段产物的精确检测。
Description
技术领域
本发明涉及微生物岩中有机质分析技术领域，具体而言，涉及一种微生物岩中有机质早期降解模拟方法，用以定性和定量监测不同有机质降解过程的产物特征。
背景技术
通过对微生物岩有机质早期降解进行的大量研究，可知到其成岩过程经历的有机质降解实际上是复杂的生物化学过程。随着微生物沉积物埋深的增加，有机质将依次进行有氧呼吸阶段、硝酸盐还原阶段、铁-锰的氧化物还原阶段、硫酸盐还原阶段和发酵过程。迄今为止广大学者已经针对现代微生物岩成岩过程开展了大量工作，认识到各个阶段会导致微生物岩内碳酸盐矿物发生溶解或形成，这可能是有机质降解产生有机酸或形成碱性物质所致，但是微生物岩形成在潮坪环境，水体交换较为通畅，降解产物很快进入外部海洋环境，导致野外将样品采回在室内分析有机质降解产物的方法可行性较低。此外，采回的样品深度和有机质降解阶段难以对应，因此检测自然条件下微生物岩有机质降解各个阶段产酸种类及浓度存在一定困难。
发明内容
为了至少克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于提供一种微生物岩中有机质早期降解模拟方法，可以加深对微生物岩中有机质降解各个阶段的了解，同时精确检测其产物的种类及含量，用以定性和定量监测不同有机质降解过程的产物特征。
本发明实施例提供了一种微生物岩中有机质早期降解模拟方法，该方法包括：
将蓝细菌加入室内预先配置的BG11培养基中，并置于恒温培养箱内通过震荡培养的方式进行微生物的培养；
将选定的好氧细菌以及厌氧细菌进行活化培养；所述好养细菌为氨氧化细菌，厌氧细菌包括硝酸盐还原细菌、Fe还原细菌和硫酸盐还原细菌，以上细菌的菌种以冻干粉形式保存；
进行有机质降解过程模拟，并在有机质降解模拟阶段结束后，对降解后的产物中的有机酸种类及含量进行定性、定量检测；其中，所述有机质降解过程包括自然水解过程、有氧降解过程、硝酸盐还原过程、以及铁的氧化物还原过程。
相较于现有技术，本发明实施例所提供的一种微生物岩中有机质早期降解模拟方法，通过模拟微生物岩同生-早成岩期有机质降解的过程，可以加深对微生物岩中有机质降解各个阶段的了解，同时精确检测其产物的种类及含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本实施例提供微生物岩中有机质早期降解模拟方法的流程图。
图2是将蓝细菌加入室内预先配置的BG11培养基的示意图。
图3是好氧细菌、厌氧细菌活化的部分流程示意图。
图4是细菌的增殖培养的部分流程示意图。
图5是模拟自然水解过程的示意图。
图6是用于氨氧化细菌的有氧降解装置的示意图。
图7是用于厌氧细菌的厌氧降解装置的示意图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
为了更好的理解上述技术方案，下面通过附图以及具体实施例对本发明技术方案做详细的说明，应当理解本发明实施例以及实施例中的具体特征是对本发明技术方案的详细的说明，而不是对本发明技术方案的限定，在不冲突的情况下，本发明实施例以及实施例中的技术特征可以相互组合。
为了加深对微生物岩中有机质降解各个阶段的了解，同时精确检测其产物的种类及含量，用以定性和定量监测不同有机质降解过程的产物，本申请实施例提供一种微生物岩中有机质早期降解模拟方法，下面对该方法进行详细的阐述。
如图1所示，本申请实施例提供的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，主要包括以下步骤：
步骤S01，例如图2所示，将蓝细菌加入室内预先配置的BG11培养基中，并置于恒温培养箱内通过震荡培养的方式进行微生物的培养。
本申请实施例中，所述蓝细菌又称鞘丝藻，是叠层石微生物岩中有机质最主要的来源，其目的是通过人工培养微生物岩中的有机质。详细地，所述恒温培养箱内的温度为20℃-30℃，优选为25℃。另外，光照条件为1500Lux，时间设置为12Hr昼/12Hr夜。
在所述震荡培养的过程中，待铜绿微囊藻生物量明显增多时，可以将培养形成的藻液再次进行转接，例如，以1份藻液与5份BG11培养基的转接比例(1:5)进行转接，直至培养到实验所需用量。然后，将培养的藻液进行浓缩(例如在转速为4000r/min的离心速度下离心20min，对所述藻液进行浓缩)，然后将上清液倒掉，保留底物，即为较纯的铜绿微囊藻，转移至已灭菌的广口瓶中，用纱布封口放入冰箱冷藏备用。
步骤S02，将选定的好氧细菌以及厌氧细菌进行活化培养。
本申请实施例选定的好养细菌为氨氧化细菌(Alcaligenes faecalis)，厌氧细菌包括：硝酸盐还原细菌(Klebsiella sp.)、Fe还原细菌(Shewanella putrefaciens.)和硫酸盐还原细菌(desulfomonile)。以上细菌的菌种以冻干粉形式保存，因此在细菌培养前需要将其活化。
详细地，例如图3所示，活化流程如下：
先按照培养基配方分别配置氨氧化细菌、硝酸盐还原细菌、Fe还原细菌和硫酸盐还原细菌的培养基(加琼脂)，分别装入锥形瓶中，用牛皮纸将瓶口封好后放入高压灭菌锅灭菌，例如，可在121℃的条件下进行21min的灭菌处理；
然后，将灭菌后的培养基取出，并导入1～2个培养皿，自然冷却后即为对应细菌琼脂平板；
其次，将冻干菌粉用0.3-0.5ml无菌水溶解，用滴管吸出打入1～2个琼脂平板并涂布均匀，放在培养箱中倒置培养，防止污染。上述一切操作均在无菌操作台内进行。当培养到第4天时，固体培养基上出现菌落时，表明实验用菌种活化成功。
参照图4所示，细菌的增殖培养流程如下：
1)好氧细菌(氨氧化细菌)的增值培养：按照培养基配方配制液体培养基，然后分装在锥形瓶中，用透气薄膜封口后置入灭菌锅灭菌。将灭菌后的培养基置于已开启紫外灯的超净工作台中冷却。待冷却至室温后，关掉紫外灯，在酒精灯旁用灼烧冷却后的接种环接种细菌，接菌完成后，用透气薄膜封口后置于恒温培养箱中震荡培养。
2)厌氧细菌(硝酸盐还原细菌、Fe还原细菌、硫酸盐还原细菌)的培养：按照培养基配方配制液体培养基，然后分装在磨口锥形瓶中；将磨口锥形瓶用透气薄膜封口，磨口塞装在烧杯中，用纸把烧杯封口后一起放入灭菌锅灭菌；灭菌后将锥形瓶和塞子一同放入已开启紫外灯的超净工作台内冷却；待冷却到室温后，再把培养基和塞子移入厌氧培养箱的取样室；在取样室进行多次(例如，3次)气体置换后，挪入厌氧操作箱；在厌氧操作箱内接种，接种完毕后盖上磨口塞，以在厌氧操作室里的恒温培养箱中进行厌氧细菌的培养。详细地，在所述取样室进行的多次气体置换采用的是无氧气体进行的。例如，可使用氮气对所述取样室进行两次气体置换，然后再使用氮气、氢气和二氧化碳的混合气进行第三次气体置换，实现对所述取样室的三次气体置换。
步骤S03，进行有机质降解过程模拟，并在有机质降解模拟阶段结束后，对降解后的产物中的有机酸种类及含量进行定性、定量检测。如此，实现微生物岩中有机质降解的模拟。
有机质降解过程包括自然水解、有氧降解、硝酸盐还原、铁的氧化物还原等过程的模拟。其中，降解阶段的模拟时间设置自然水解过程7天，有氧降解30天，硝酸盐还原过程28天，Fe的氧化物还原过程30天，硫酸盐还原过程40天。
在模拟叠层石微生物岩有机质降解时称取2.5g制备好的冻干藻均匀平铺在容量为250ml的已灭菌广口瓶底，随后取5g方解石晶粒铺在蓝藻之上，如此铺垫4层蓝藻-方解石互层，向内加入无菌蒸馏水至100ml，按照上述方法准备多个广口瓶。
详细地，
模拟自然水解过程如下：
参照图5所示，将上述已灭菌广口瓶的瓶口用纱布封隔好，置于室内让蓝藻在自然条件下水解，实验时间为7天。
模拟有氧降解过程如下：
在图6所示的有氧降解装置内加入氨氧化细菌，持续通入无菌空气，置于30℃恒温培养箱中反应，整个实验过程均在无菌操作台上进行，实验时间为10天。
模拟硝酸盐还原过程如下：
在图7所示的厌氧降解装置内加入硝酸盐还原细菌，持续通入氮气，置于30℃恒温箱中模拟降解。正常海水中硝酸根离子浓度约为4×10-5mol/L，因此往广口瓶中加入1ml浓度为4×10-3mol/L的KNO3溶液，实验时间设置为30天。
模拟Fe的氧化物还原过程如下：
向厌氧降解装置内加入Fe氧化物还原细菌，持续通入氮气，同样放置在30℃恒温箱中反应，向其中加入1ml浓度为5×10-4mol/L的FeCl3溶液以提供Fe3+作有机质降解的电子受体，实验时间设置为30天。
模拟硫酸盐还原过程如下：
往厌氧降解装置加入硫酸盐还原细菌，持续通入氮气保持厌氧，同时置于30℃恒温箱中反应，向其中加入1ml浓度为2.8mol/L的Na2SO4溶液以提供SO42-作有机质降解的电子受体(海水中SO42-浓度为2.8×10-2mol/L，实验时间设置为40天。
降解产物的检测如下：
在模拟自然水解、有氧降解、硝酸盐还原、Fe的氧化物还原、硫酸盐还原过程这5个有机质降解阶段结束后，将装置(有氧降解装置及无氧降解装置)内降解后的产物从取样口放出，用800目纱布过滤，每个装置取10mL滤液，用移液管移入10mL的离心管内，在5000r/min的转速下离心10min，取上清液移入10ml塑料小管；然后，分别将塑料小管内的上清液进行红外光谱分析和液相色谱分析即可对产物中有机酸种类及含量进行定性、定量检测。
通过上述的微生物岩中有机质降解模拟方法，可以加深对微生物岩中有机质降解各个阶段的了解，同时精确检测其产物的种类及含量。
以上仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，该方法包括：
将蓝细菌加入室内预先配置的BG11培养基中，并置于恒温培养箱内通过震荡培养的方式进行微生物的培养；
将选定的好氧细菌以及厌氧细菌进行活化培养；所述好养细菌为氨氧化细菌，所述厌氧细菌包括硝酸盐还原细菌、Fe还原细菌和硫酸盐还原细菌，以上细菌的菌种以冻干粉形式保存；
进行有机质降解过程模拟，并在有机质降解模拟阶段结束后，对降解后的产物中的有机酸种类及含量进行定性、定量检测；其中，所述有机质降解过程包括自然水解过程、有氧降解过程、硝酸盐还原过程、以及铁的氧化物还原过程。
2.根据权利要求1所述的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，将选定的好氧细菌以及厌氧细菌进行活化培养，包括：
先按照培养基配方分别配置所述氨氧化细菌、所述硝酸盐还原细菌、所述Fe还原细菌和所述硫酸盐还原细菌的培养基，分别装入锥形瓶中，用牛皮纸将瓶口封好后放入高压灭菌锅进行灭菌处理；
将灭菌后的培养基取出，并导入1～2个培养皿，自然冷却后即为对应细菌琼脂平板；
将冻干粉用0.3-0.5ml无菌水溶解，用滴管吸出打入1～2个琼脂平板并涂布均匀，放在培养箱中倒置培养。
3.根据权利要求1所述的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，将选定的好氧细菌以及厌氧细菌进行活化培养，还包括好氧细菌的增殖培养以及厌氧细菌的增殖培养，其中：
好氧细菌的增值培养包括：
按照培养基配方配制液体培养基，然后分装在锥形瓶中，用透气薄膜封口后置入灭菌锅灭菌；
将灭菌后的培养基置于已开启紫外灯的超净工作台中冷却，待冷却至室温后，关掉紫外灯，在酒精灯旁用灼烧冷却后的接种环接种细菌，接菌完成后，用透气薄膜封口后置于恒温培养箱中震荡培养；
厌氧细菌的增殖培养包括：
按照培养基配方配制液体培养基，然后分装在磨口锥形瓶中；
将所述磨口锥形瓶用透气薄膜封口，磨口塞装在烧杯中，用纸把所述烧杯封口后一起放入灭菌锅灭菌；
灭菌后将所述磨口锥形瓶和塞子一同放入已开启紫外灯的超净工作台内冷却；待冷却到室温后，再把培养基和塞子移入厌氧培养箱的取样室；
在所述取样室进行多次气体置换后，挪入厌氧操作箱；
在所述厌氧操作箱内接种，接种完毕后盖上磨口塞，以在厌氧操作室里的恒温培养箱中进行厌氧细菌的培养。
4.根据权利要求1所述的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，所述进行有机质降解过程模拟在模拟，包括：称取2.5g制备好的冻干藻均匀平铺在容量为250ml的已灭菌广口瓶底，随后取5g方解石晶粒铺在蓝藻之上，铺垫4层蓝藻-方解石互层，向内加入无菌蒸馏水至100ml，按照上述方法准备多个广口瓶。
5.根据权利要求4所述的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，
所述自然水解过程包括：将上述已灭菌广口瓶的瓶口用纱布封隔好，置于室内让蓝藻在自然条件下水解7天；
所述有氧降解过程包括：在有氧降解装置内加入所述氨氧化细菌，持续通入无菌空气，置于30℃恒温培养箱中反应，持续10天；
所述硝酸盐还原过程包括：在厌氧降解装置内加入所述硝酸盐还原细菌，持续通入氮气，置于30℃恒温箱中模拟降解，并在广口瓶中加入1ml浓度为4×10-3mol/L的KNO3溶液，实验30天；
所述Fe的氧化物还原过程包括：向厌氧降解装置内加入所述Fe氧化物还原细菌，持续通入氮气，放置在30℃恒温箱中反应，向其中加入1ml浓度为5×10-4mol/L的FeCl3溶液以提供Fe3+作有机质降解的电子受体，实验30天；
所述硫酸盐还原过程包括：往厌氧降解装置加入所述硫酸盐还原细菌，持续通入氮气保持厌氧，同时置于30℃恒温箱中反应，向其中加入1ml浓度为2.8mol/L的Na2SO4溶液以提供SO4 2-作有机质降解的电子受体(海水中SO42-浓度为2.8×10-2mol/L，实验40天。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，对降解后的产物中的有机酸种类及含量进行定性、定量检测，包括：
在模拟自然水解、有氧降解、硝酸盐还原、Fe的氧化物还原、硫酸盐还原过程这5个有机质降解阶段结束后，将降解后的产物取出，用800目纱布过滤，其中，每个降解阶段的产物中取10mL滤液，用移液管移入10mL的离心管内，在5000r/min的转速下离心10min，取上清液移入10ml塑料小管；
分别将塑料小管内的上清液进行红外光谱分析和液相色谱分析，对产物中有机酸种类及含量进行定性、定量检测。
7.根据权利要求1所述的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，在所述恒温培养箱内通过震荡培养的方式进行微生物的培养时，所述恒温培养箱内的温度范围为20℃-30℃，光照条件为1500Lux，时间设置为12Hr昼/12Hr夜。
8.根据权利要求1或7所述的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，将蓝细菌加入室内预先配置的BG11培养基中，并置于恒温培养箱内通过震荡培养的方式进行微生物的培养，还包括：
在所述震荡培养的过程中，待铜绿微囊藻生物量明显增多时，将培养形成的藻液再次进行转接，直至培养到实验所需用量；
将培养的藻液进行浓缩，然后将上清液倒掉，保留底物，即为较纯的铜绿微囊藻，转移至已灭菌的广口瓶中，用纱布封口放入冰箱冷藏备用。
9.根据权利要求8所述的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，
在将培养形成的藻液再次进行转接时，以1份藻液与5份BG11培养基的转接比例进行转接。
10.根据权利要求8所述的微生物岩中有机质早期降解模拟方法，其特征在于，将培养的藻液进行浓缩具体为：在转速为4000r/min的条件下离心20min，对所述藻液进行浓缩。
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