CN110960567A - 制备抑菌组合物的方法、制得的抑菌组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种制备抑菌组合物的方法，包括如下步骤：(1)将保加利亚乳杆菌培养物与杜仲叶提取物混合，得到混合物；其中，所述混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为4.0×106～7.0×106CFU/mL或1.0×107～7.0×107CFU/mL，所述混合物中的杜仲叶生药浓度为1～9.6mg/mL；(2)将步骤(1)得到的混合物在20℃～38℃下培养20～30小时，得到抑菌组合物。本发明还涉及制得的抑菌组合物。本发明方法制备的抑菌组合物具有显著的抑菌效果。

Description

制备抑菌组合物的方法、制得的抑菌组合物及其应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种制备抑菌组合物的方法，还涉及制得的抑菌组合物及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界中，容易感染动物和人类。目前，国内外主要采用抗生素抑制金黄色葡萄球菌，但是金黄色葡萄球菌易对抗生素产生耐药性。而且，广谱抗生素对肠道菌群的影响明显，容易破坏肠道微生态系统的平衡，引起一系列相关病症，例如胃肠道疾病、炎症性疾病、风湿性关节炎、多发性硬化症、糖尿病、代谢综合征、肥胖等。
基于这种情况，目前需要一种抑菌且不破坏肠道微生态系统平衡的药物。益生菌是对动物及人类有益的细菌，主要以双歧杆菌，乳杆菌，芽孢杆菌为代表。长势良好的益生菌能够抑制致病微生物的生长，同时，益生菌还具有调理肠道菌群、维持肠道微生态平衡的保健作用；此外，益生菌还具有调节免疫的作用，比如，益生菌可通过促进AIDS患者免疫细胞的生成进一步改善其免疫状态。其中，保加利亚乳杆菌是益生菌中应用较广的一种，与人类生活关系密切，它具有调节胃肠道健康、促进消化吸收、增加免疫功能、抗癌抗肿瘤等重要生理功能，因此被认为是可用于保健食品的益生菌之一，在食品发酵、工业乳酸发酵、饲料行业和医疗保健领域均有比较广泛的应用。研究表明，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵物对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。然而，目前仍需研制一种能明显抑制金黄色葡萄球菌的药物。
杜仲(EucommiaμLmoides Oliv.)是杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，传统以干燥树皮入药，是名贵滋补药材，其具有补肝肾、强筋骨、安胎的功效，用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩、妊娠漏血、胎动不安。由于过度砍伐，杜仲药源急剧减少，研究表明杜仲叶也具有药用功能，其具有降压、调节血脂、心血管保护、预防肥胖、增强免疫、延缓衰老、抗疲劳等作用；临床上，杜仲叶主要用于降压等；复方杜仲叶合剂对人体有明显的降压及调节血脂的作用，且对机体健康无不良影响；含有杜仲叶的复方合剂治疗不孕症治愈达90％。
发明内容
本发明提供了一种制备抑菌组合物的方法，所制得的抑菌组合物具有显著的抑菌效果(例如协同抑制金黄色葡萄球菌效果)。相应地，本发明还提供了该抑菌组合物及其医药应用。
本发明第一方面涉及一种制备抑菌组合物的方法，包括如下步骤：
(1)将保加利亚乳杆菌培养物与杜仲叶提取物混合，得到混合物；其中，所述混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为 4.0×106～7.0×106CFU/mL(例如4.2×106CFU/mL、4.5×106CFU/mL、 4.8×106CFU/mL、5.1×106CFU/mL、5.3×106CFU/mL、5.5×106CFU/mL、 5.7×106CFU/mL、5.9×106CFU/mL、6.2×106CFU/mL、6.0×106CFU/mL、 6.4×106CFU/mL、6.6×106CFU/mL、6.8×106CFU/mL)或 1.0×107～7.0×107CFU/mL(例如1.2×107CFU/mL、1.5×107CFU/mL、 1.8×107CFU/mL、2.0×107CFU/mL、2.5×107CFU/mL、2.8×107CFU/mL、 3×107CFU/mL、3.4×107CFU/mL、3.8×107CFU/mL、4.0×107CFU/mL、 4.3×107CFU/mL、4.6×107CFU/mL、4.8×107CFU/mL、5.0×107CFU/mL、 5.3×107CFU/mL、5.6×107CFU/mL、6.0×107CFU/mL、6.2×107CFU/mL、 6.4×107CFU/mL、6.6×107CFU/mL、6.8×107CFU/mL)，所述混合物中的杜仲叶生药浓度为1～9.6mg/mL(例如2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、 5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、9.4mg/mL)；
(2)将步骤(1)得到的混合物在20℃～38℃(例如22℃、24℃、26℃、27℃、29℃、30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、37℃)下培养20～30 小时(例如21小时、23小时、24小时、26小时、28小时、29小时)，得到抑菌组合物。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，所述混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为4.0×106～6.0×106CFU/mL或 1.0×107～6.2×107CFU/mL。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，所述混合物中的杜仲叶生药浓度为3～8mg/mL。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，所述杜仲叶提取物通过如下的步骤制备：
(a)用水浸提杜仲叶，固液分离，得到提取液；
(b)将步骤(a)得到的提取液与培养基混合，得到杜仲叶提取物。
本发明第一方面的一些实施方式中，所述杜仲叶提取物的制备步骤包括如下i)至ix)中的一项或多项：
i)步骤(a)中，在回流条件下浸提；
优选地，回流温度为70℃～160℃，例如80℃、85℃、90℃、95℃、 100℃、105℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃；
ii)步骤(a)中，浸提时间为0.5～5小时，例如1小时、1.5小时、 2小时、2.5小时、3小时、4小时、4.5小时；
iii)步骤(a)中，浸提的料液重量比为1:(1～13)，例如1:2、1:3、 1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12；
iv)步骤(a)中，在浸提之前，将杜仲叶破碎(例如剪碎)；
v)步骤(a)中，浸提次数为一次或多次(例如两次)；
vi)步骤(a)中，固液分离的方式为过滤(例如通过滤纸过滤)；
vii)在步骤(a)和(b)之间，还包括步骤(a’)：将提取液进行干燥，得到干燥物；将干燥物与水混合，得到的混合物用于与步骤(b) 中的培养基混合；
优选地，步骤(b)中，步骤(a’)得到的混合物与培养基的体积比为1:(4～15)，例如1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:13、1:14；
viii)步骤(b)中，步骤(a)得到的提取液与培养基的体积比为1:(4～15)，例如1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:13、1:14；
ix)所述杜仲叶提取物为杜仲叶提取液。
本发明第一方面的一些实施方式中，所述杜仲叶提取物的制备步骤中，步骤(b)中，所述培养基为MRS培养基。
本发明第一方面的一些实施方式中，包括如下A至H中的一项或多项：
A.步骤(1)中，所述保加利亚乳杆菌培养物中的活菌数为5×107 CFU/mL～9×107CFU/mL，优选为6×107CFU/mL～8×107CFU/mL，例如 5.3×107CFU/mL、5.5×107CFU/mL、5.7×107CFU/mL、5.9×107CFU/mL、 6.1×107CFU/mL、6.3×107CFU/mL、6.5×107CFU/mL、6.7×107CFU/mL、 6.9×107CFU/mL、7.2×107CFU/mL、7.4×107CFU/mL、7.6×107CFU/mL、 7.8×107CFU/mL、7.9×107CFU/mL、8.3×107CFU/mL、8.5×107CFU/mL、 8.7×107CFU/mL；
B.步骤(1)中，所述保加利亚乳杆菌培养物通过如下的步骤制备：
将保加利亚乳杆菌接种于培养基中，培养10～20小时(例如12小时、14小时、16小时、18小时、19小时)，得到保加利亚乳杆菌培养物；
优选地，所述培养基为液体培养基，例如MRS液体培养基；
优选地，培养温度为20℃～38℃，例如22℃、24℃、26℃、27℃、 29℃、30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、37℃；
优选地，所述保加利亚乳杆菌已活化；
C.步骤(1)中，所述保加利亚乳杆菌培养物为液态；
D.步骤(1)中，所述杜仲叶提取物的生药浓度为10～100mg/mL，例如30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、90mg/mL；
E.步骤(1)中，所述保加利亚乳杆菌培养物与杜仲叶提取物的体积比为(1～30):3，例如2:3、4:3、5:3、7:3、10:3、13:3、16:3、17:3、 19:3、20:3、22:3、25:3：26:3、28:3；
F.步骤(1)中，采用移液器搅拌进行混合。
本发明第一方面的一些实施方式中，所述保加利亚乳杆菌培养物包括保加利亚乳杆菌、可选的用于培养保加利亚乳杆菌的成分以及可选的辅料和/或赋形剂；例如，所述保加利亚乳杆菌培养物为分离的保加利亚乳杆菌、保加利亚乳杆菌和培养基(比如MRS液体培养基)的组合物、保加利亚乳杆菌制剂(比如液态制剂)。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，将培养基、保加利亚乳杆菌培养物和杜仲叶提取物混合。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，所述培养基与杜仲叶提取物的体积比为(1～30):3，优选为(1～28):3，例如2:3、5:3、 7:3、10:3、11:3、13:3、16:3、17:3、20:3、22:3、23:3、25:3、26:3。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，所述培养基为液体培养基，例如MRS液体培养基。
本发明第二方面涉及一种抑菌组合物，其由本发明第一方面所述方法制备得到。
本发明第二方面的一些实施方式中，所述抑菌组合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为6×107～8×107CFU/mL，例如6.3×107CFU/mL、6.5 ×107CFU/mL、6.7×107CFU/mL、7.0×107CFU/mL、7.2×107CFU/mL、 7.1×107CFU/mL、7.5×107CFU/mL、7.7×107CFU/mL、7.9×107CFU/mL。
本发明第二方面的一些实施方式中，所述抑菌组合物为用于体外或体内的抑菌组合物。
本发明第二方面的一些实施方式中，所述抑菌组合物为用于抑制金黄色葡萄球菌的组合物。
本发明第三方面涉及一种用于制备抑菌组合物的原料组合，其包含保加利亚乳杆菌培养物和杜仲叶提取物；其中，所述原料组合中的保加利亚乳杆菌活菌数为4.0×106～7.0×106CFU/mL(例如4.2×106CFU/mL、4.5×106CFU/mL、4.8×106CFU/mL、5.1×106CFU/mL、5.3×106CFU/mL、 5.5×106CFU/mL、5.7×106CFU/mL、5.9×106CFU/mL、6.2×106CFU/mL、6.0×106CFU/mL、6.4×106CFU/mL、6.6×106CFU/mL、6.8×106CFU/mL) 或1.0×107～7.0×107CFU/mL(例如1.2×107CFU/mL、1.5×107CFU/mL、 1.8×107CFU/mL、2.0×107CFU/mL、2.5×107CFU/mL、2.8×107CFU/mL、 3×107CFU/mL、3.4×107CFU/mL、3.8×107CFU/mL、4.0×107CFU/mL、 4.3×107CFU/mL、4.6×107CFU/mL、4.8×107CFU/mL、5.0×107CFU/mL、 5.3×107CFU/mL、5.6×107CFU/mL、6.0×107CFU/mL、6.2×107CFU/mL、 6.4×107CFU/mL、6.6×107CFU/mL、6.8×107CFU/mL)，所述原料组合中的杜仲叶生药浓度为1～9.6mg/mL(例如2mg/mL、3mg/mL、4 mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、9.4mg/mL)。
本发明第三方面的一些实施方式中，所述保加利亚乳杆菌培养物包括保加利亚乳杆菌、可选的用于培养保加利亚乳杆菌的成分以及可选的辅料和/或赋形剂；例如，所述保加利亚乳杆菌培养物为分离的保加利亚乳杆菌、保加利亚乳杆菌和培养基(比如MRS液体培养基)的组合物、保加利亚乳杆菌制剂(比如液态制剂)。
本发明第三方面的一些实施方式中，所述杜仲叶提取物通过如下的步骤制备：
(a)用水浸提杜仲叶，固液分离，得到提取液；
(b)将步骤(a)得到的提取液与培养基混合，得到杜仲叶提取物。
本发明第三方面的一些实施方式中，所述杜仲叶提取物的制备步骤包括如下i)至ix)中的一项或多项：
i)步骤(a)中，在回流条件下浸提；
优选地，回流温度为70℃～160℃，例如80℃、85℃、90℃、95℃、 100℃、105℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃；
ii)步骤(a)中，浸提时间为0.5～5小时，例如1小时、1.5小时、 2小时、2.5小时、3小时、4小时、4.5小时；
iii)步骤(a)中，浸提的料液重量比为1:(1～13)，例如1:2、1:3、 1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12；
iv)步骤(a)中，在浸提之前，将杜仲叶破碎(例如剪碎)；
v)步骤(a)中，浸提次数为一次或多次(例如两次)；
vi)步骤(a)中，固液分离的方式为过滤(例如通过滤纸过滤)；
vii)在步骤(a)和(b)之间，还包括步骤(a’)：将提取液进行干燥，得到干燥物；将干燥物与水混合，得到的混合物用于与步骤(b) 中的培养基混合；
优选地，步骤(b)中，步骤(a’)得到的混合物与培养基的体积比为1:(4～15)，例如1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:13、 1:14；
viii)步骤(b)中，步骤(a)得到的提取液与培养基的体积比为 1:(4～15)，例如1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:13、1:14；
ix)所述杜仲叶提取物为杜仲叶提取液。
本发明第三方面的一些实施方式中，所述保加利亚乳杆菌培养物中的活菌数为5×107CFU/mL～9×107CFU/mL，优选为6×107 CFU/mL～8×107CFU/mL，例如5.3×107CFU/mL、5.5×107CFU/mL、 5.7×107CFU/mL、5.9×107CFU/mL、6.1×107CFU/mL、6.3×107CFU/mL、6.5×107CFU/mL、6.7×107CFU/mL、6.9×107CFU/mL、7.2×107CFU/mL、 7.4×107CFU/mL、7.6×107CFU/mL、7.8×107CFU/mL、7.9×107CFU/mL、8.3×107CFU/mL、8.5×107CFU/mL、8.7×107CFU/mL。
本发明第三方面的一些实施方式中，所述保加利亚乳杆菌培养物通过如下的步骤制备：
将保加利亚乳杆菌接种于培养基中，培养10～20小时(例如12小时、14小时、16小时、18小时、19小时)，得到保加利亚乳杆菌培养物；
优选地，所述培养基为液体培养基，例如MRS液体培养基；
优选地，培养温度为20℃～38℃，例如22℃、24℃、26℃、27℃、 29℃、30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、37℃；
优选地，所述保加利亚乳杆菌已活化。
本发明第三方面的一些实施方式中，所述保加利亚乳杆菌培养物为液态。
本发明第三方面的一些实施方式中，所述杜仲叶提取物的生药浓度为10～100mg/mL，例如30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、 70mg/mL、90mg/mL。
本发明第三方面的一些实施方式中，所述原料组合中，保加利亚乳杆菌培养物与杜仲叶提取物的体积比为(1～30):3，例如2:3、4:3、5:3、 7:3、10:3、13:3、16:3、17:3、19:3、20:3、22:3、25:3：26:3、28:3。
本发明第三方面的一些实施方式中，所述原料组合还包含培养基；
优选地，所述原料组合中，培养基与杜仲叶提取物的体积比为 (1～30):3，更优选为(1～28):3，例如2:3、5:3、7:3、10:3、11:3、 13:3、16:3、17:3、20:3、22:3、23:3、25:3、26:3；
优选地，所述培养基为液体培养基，例如MRS液体培养基。
本发明第四方面涉及一种(非治疗目的的)体外抑菌方法，包括将有效量的本发明第二方面所述抑菌组合物与样品相接触的步骤。
本发明第四方面的一些实施方式中，所述样品为易被金黄色葡萄球菌污染的样品或已被金黄色葡萄球菌污染的样品。
本发明第五方面涉及本发明第二方面所述的抑菌组合物或者本发明第三方面所述的原料组合在制备抑菌剂中的应用。
本发明第五方面的一些实施方式中，所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌抑菌剂。
本发明第五方面的一些实施方式中，所述抑菌剂为用于体内或体外的抑菌剂。
本发明中，保加利亚乳杆菌制剂包括但不限于食品制剂、药物制剂。
本发明中，如无特别说明，其中：
术语“生药浓度”是指生药量除以制剂总体积得到的浓度参数，其中，生药量是指原料药材的总重量。
本发明取得了如下的至少一项有益效果：
1、本发明方法制备的抑菌组合物具有显著的抑菌效果，例如协同抑制金黄色葡萄球菌。
2、本发明方法制备的抑菌组合物稳定性高，保质期长。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1杜仲叶提取液的制备
取50g剪碎的杜仲叶，加入8倍重量的水，在100℃回流提取1.5 小时，过滤，得到滤液和滤渣，对滤渣重复上述提取操作，合并两次得到的滤液。将滤液在60℃下旋转蒸发成稠浸膏，将稠浸膏在60℃下真空干燥，得到干膏，干膏得率为33％(W/W)。
根据干膏得率称取适量干膏，加入灭菌水配制成生药浓度分别为 1000mg/mL、500mg/mL、100mg/mL、50mg/mL的药物储备液，置于 4℃下保存。在无菌条件下，取1mL药物储备液与9mL MRS培养基混合并立即倾注于无菌平皿中，冷却后备用，得到生药浓度分别为100mg/mL、50mg/mL、10mg/mL、5mg/mL的杜仲叶提取液。
实施例2保加利亚乳杆菌菌种液的制备和活菌数测定
(1)保加利亚乳杆菌菌种液的制备：
将活化的保加利亚乳杆菌菌种转至MRS液体培养基中，在37℃下静置培养16～18小时，得到保加利亚乳杆菌菌种液。
(2)保加利亚乳杆菌菌种液中活菌数的测定：
用灭菌水对制得的保加利亚乳杆菌菌种液进行105倍稀释，得到稀释液。将50μL稀释液涂布于MRS固体培养基平板上，在37℃下恒温培养24小时，对菌落数在30～300个的平板计数，平行测定3次，计算平板上的平均菌落数。然后，按照如下公式计算单位体积保加利亚乳杆菌菌种液含有的活菌数。
Z＝(C/V)×M
其中：
Z表示单位体积保加利亚乳杆菌菌种液含有的活菌数(CFU/mL)；
C表示平板上的平均菌落数(CFU)；
V表示涂布在平板上的稀释液体积(mL)；
M表示稀释液的稀释倍数。
结果表明：平板上的平均菌落数为36，1μL保加利亚乳杆菌菌种液中的活菌数为7.2×104CFU。
实施例3抑菌组合物1的制备
向2μL实施例2制得的保加利亚乳杆菌菌种液中加入25μL MRS 液体培养基以及3μL生药浓度为50mg·mL-1的杜仲叶提取液(由实施例1制备)，用移液枪轻微搅拌，得到混合物；混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为4.8×106CFU/mL，杜仲叶生药浓度为5mg·mL-1；将混合物在37℃下恒温培养24小时，得到抑菌组合物1。
实施例4抑菌组合物2的制备
向5μL实施例2制得的保加利亚乳杆菌菌种液中加入22μL MRS 液体培养基以及3μL生药浓度为50mg·mL-1杜仲叶提取液(由实施例1 制备)，用移液枪轻微搅拌，得到混合物；混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为1.2×107CFU/mL，杜仲叶生药浓度为5mg·mL-1；将混合物在 37℃下恒温培养24小时，得到抑菌组合物2。
实施例5抑菌组合物3的制备
向20μL实施例2制得的保加利亚乳杆菌菌种液中加入7μL MRS 液体培养基以及3μL生药浓度为50mg·mL-1杜仲叶提取液(由实施例1 制备)，用移液枪轻微搅拌，得到混合物；混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为4.8×107CFU/mL，杜仲叶生药浓度为5mg·mL-1；将混合物在 37℃下恒温培养24小时，得到抑菌组合物3。
实施例6抑菌组合物4的制备
向25μL实施例2制得的保加利亚乳杆菌菌种液中加入2μL MRS 液体培养基以及3μL生药浓度为50mg·mL-1的杜仲叶提取液(由实施例1制备)，用移液枪轻微搅拌，得到混合物；混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为6.0×107CFU/mL，杜仲叶生药浓度为5mg·mL-1)；将混合物在37℃下恒温培养24小时，得到抑菌组合物4。
对比例1
将实施例3-6中的杜仲叶提取液替换为等体积的MRS液体培养基，其余分别与实施例3-6相同，相应得到抑菌组合物1-A、2-A、3-A、4-A。
对比例2
30μL实施例1制得的生药浓度为5mg·mL-1的杜仲叶提取液，在37℃下恒温培养24小时，作为抑菌组合物B。
对比例3
向2μL实施例2制得的保加利亚乳杆菌菌种液中加入25μL MRS 液体培养基以及3μL 100mg·mL-1杜仲叶提取液(由实施例1制备)，用移液枪轻微搅拌，得到混合物；混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为 4.8×106CFU/mL，杜仲叶生药浓度为10mg·mL-1；将混合物在37℃下恒温培养24小时，得到抑菌组合物C。
对比例4
30μL实施例1制得的生药浓度为10mg·mL-1的杜仲叶提取液，在 37℃下恒温培养24小时，作为抑菌组合物D。
实验例1抑菌实验
以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用平板牛津杯法进行体外抑菌实验。
金黄色葡萄球菌菌悬液的制备：将活化的金黄色葡萄球菌转种至 LB液体培养基中，在37℃下振荡(160r/min)培养16小时，OD600nm 为1.108；用灭菌水将金黄色葡萄球菌进行103倍稀释后，置于4℃下保存备用。
无菌条件下将15mL MRS固体培养基倾注于无菌平皿中，冷却后，在平皿中轻放无菌干燥的牛津杯，将千分之一接种量即10μL金黄色葡萄球菌菌悬液与40℃～50℃的10mLLB固体培养基混匀并倾注平皿中，冷却后备用，拔出牛津杯，向牛津杯形成的小孔内加药，以灭菌水为阴性对照，广谱抗生素庆大霉素为阳性对照，然后在37℃恒温培养24小时，测定抑菌圈直径，每组3个平行。其中，加药是指向小孔内加入阴性对照、阳性对照及将实施例3-6、对比例1-4中抑菌组合物的制备过程置于小孔中进行；每个分组包括孔1至孔3三个孔。各孔的加药情况及最终测得的抑菌圈直径见表1。
表1
Figure RE-GDA0001935505080000121
Figure RE-GDA0001935505080000131
*表示抑菌圈直径与对应孔1、孔3结果相比存在显著性差异(P<0.05)。
由表1可知，与其它组合物相比，本发明方法制备的抑菌组合物具有显著的协同抑菌效果。尽管阳性对照物庆大霉素也能抑制金黄色葡萄球菌，但作为广谱抗生素的庆大霉素对益生菌也有很强抑制性，不利于保持体内肠道微生态平衡。
实验例2活菌数测定
将实施例3-6、对比例1-4制备的抑菌组合物分别加灭菌水稀释105倍，将50μL稀释液分别涂布在平板上，通过平板计数法检测活菌数，平行测定3次，取平均值，结果见表2。
表2
Figure RE-GDA0001935505080000132
由表2可知，本发明方法制备的具有显著协同抑菌效果的抑菌组合物中的活菌数与对应的抑菌组合物1-A、2-A、3-A、4-A中活菌数相当，大于不具有协同抑菌效果的其它组合物中的活菌数。并且，本发明方法制备的抑菌组合物对益生菌的抑制作用较弱，有利于保持体内肠道微生态的平衡。
实验例3稳定性考察
将实验例1中加有抑菌组合物1-4的抑菌平皿在4℃下保存一周，结果发现，保存之后的抑菌圈直径没有变化。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (12)

1.一种制备抑菌组合物的方法，包括如下步骤：
(1)将保加利亚乳杆菌培养物与杜仲叶提取物混合，得到混合物；其中，所述混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为4.0×106～7.0×106CFU/mL或1.0×107～7.0×107CFU/mL，所述混合物中的杜仲叶生药浓度为1～9.6mg/mL；
(2)将步骤(1)得到的混合物在20℃～38℃下培养20～30小时，得到抑菌组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述混合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为4.0×106～6.0×106CFU/mL或1.0×107～6.2×107CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述混合物中的杜仲叶生药浓度为3～8mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述杜仲叶提取物通过如下的步骤制备：
(a)用水浸提杜仲叶，固液分离，得到提取液；
(b)将步骤(a)得到的提取液与培养基混合，得到杜仲叶提取物；
优选地，其特征在于如下i)至ix)中的一项或多项：
i)步骤(a)中，在回流条件下浸提；
优选地，回流温度为70℃～160℃；
ii)步骤(a)中，浸提时间为0.5～5小时；
iii)步骤(a)中，浸提的料液重量比为1:(1～13)；
iv)步骤(a)中，在浸提之前，将杜仲叶破碎；
v)步骤(a)中，浸提次数为一次或多次；
vi)步骤(a)中，固液分离的方式为过滤；
vii)在步骤(a)和(b)之间，还包括步骤(a’)：将提取液进行干燥，得到干燥物；将干燥物与水混合，得到的混合物用于与步骤(b)中的培养基混合；
优选地，步骤(b)中，步骤(a’)得到的混合物与培养基的体积比为1:(4～15)；
viii)步骤(b)中，步骤(a)得到的提取液与培养基的体积比为1:(4～15)；
ix)所述杜仲叶提取物为杜仲叶提取液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于如下A至F中的一项或多项：
A.步骤(1)中，所述保加利亚乳杆菌培养物中的活菌数为5×107CFU/mL～9×107CFU/mL，优选为6×107CFU/mL～8×107CFU/mL；
B.步骤(1)中，所述保加利亚乳杆菌培养物通过如下的步骤制备：
将保加利亚乳杆菌接种于培养基中，培养10～20小时，得到保加利亚乳杆菌培养物；
优选地，所述培养基为液体培养基，例如MRS液体培养基；
优选地，培养温度为20℃～38℃；
优选地，所述保加利亚乳杆菌已活化；
C.步骤(1)中，所述保加利亚乳杆菌培养物为液态；
D.步骤(1)中，所述杜仲叶提取物的生药浓度为10～100mg/mL；
E.步骤(1)中，所述保加利亚乳杆菌培养物与杜仲叶提取物的体积比为(1～30):3；
F.步骤(1)中，采用移液器搅拌进行混合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，步骤(1)中，将培养基、保加利亚乳杆菌培养物和杜仲叶提取物混合；
优选地，所述培养基与杜仲叶提取物的体积比为(1～30):3；
优选地，所述培养基为液体培养基。
7.一种抑菌组合物，其由权利要求1至6中任一项所述方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的抑菌组合物，其中，所述抑菌组合物中的保加利亚乳杆菌活菌数为6×107～8×107CFU/mL。
9.根据权利要求7或8所述的抑菌组合物，其为用于体外或体内的抑菌组合物；
优选地，所述抑菌组合物为用于抑制金黄色葡萄球菌的组合物。
10.一种用于制备抑菌组合物的原料组合，其包含保加利亚乳杆菌培养物和杜仲叶提取物；其中，所述原料组合中的保加利亚乳杆菌活菌数为4.0×106～7.0×106CFU/mL或1.0×107～7.0×107CFU/mL，所述原料组合中的杜仲叶生药浓度为1～9.6mg/mL。
11.一种体外抑菌的方法，包括将有效量的权利要求7至9中任一项所述抑菌组合物与样品相接触的步骤；
优选地，所述样品为易被金黄色葡萄球菌污染的样品或已被金黄色葡萄球菌污染的样品。
12.权利要求7至9中任一项所述的抑菌组合物或者权利要求10所述的原料组合在制备抑菌剂中的应用；
优选地，所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌抑菌剂；
优选地，所述抑菌剂为用于体内或体外的抑菌剂。
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