CN110954521A - 一种宽场超分辨显微成像方法及其系统 - Google Patents
一种宽场超分辨显微成像方法及其系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种宽场超分辨显微成像方法及其系统,所述方法包括步骤:将光源发出的激光通过空间光调制器进行相位调制,再经由傅里叶透镜得到强度调制的光;将所述强度调制的光依次经过管镜、激发滤光片、分束镜、物镜后激发样品发射信号光;通过所述物镜收集所述信号光,并由所述分束镜透射到探测器上;根据至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像。空间光调制器将激光调制成强度满足正弦次幂分布的激发光图案,激发出荧光图案,从而产生多级频谱混叠。通过对混叠频谱的解频和复位,获得更高频样本信息。在非饱和激发条件下,实现超分辨率结构光照明显微成像,空间分辨率由条纹结构光的谐波次数决定。
Description
技术领域
本发明涉及光学显微成像技术领域,尤其涉及的是一种宽场超分辨显微成像方法及其系统。
背景技术
荧光显微镜以其无损、非入侵、特异性标记及可以对活体细胞进行实时动态成像的优势,在生命科学研究中得到了广泛应用。但由于光学衍射极限的限制,一般成像最高分辨率仅能达到约200nm。为了突破衍射极限对荧光显微分辨率的限制,一系列新颖的超分辨显微成像方法被提出。
Hell课题组提出了受激辐射耗尽(stimulated emission depletion,STED)技术,分辨率可以大幅提高到远高于衍射极限分辨率的水平(几十纳米甚至更高)。但高功率的STED光对生物样品损伤较大,特别是活细胞,因此,不适合活细胞动态成像。且必须使用特殊STED染料,限制了样品的范围。Rust课题组提出了随机光学重建显微(stochasticoptical reconstruction microscopy,STORM)技术,分辨率可达到横向高于20nm、轴向高于50nm的水平。但重构一幅超分辨图像需要采集平均数千张原始图像,成像速度受限,同时需要具有开关效应的荧光探针,对染料的要求高,限制了其适用范围。
Gustafsson课题组提出了结构光照明显微(structured illuminationmicroscopy,SIM)技术,SIM基本原理是利用莫尔条纹将原本不能通过系统的高频信息平移到可观察的频率范围内来实现超分辨。由于线性SIM利用强度正弦调制的激发光图案照明样本,激发产生强度正弦调制的荧光结构图案,没有产生高次谐波结构光,因此,对比衍射极限,线性SIM的分辨率最多提高2倍。为了提高线性SIM的分辨率,Gustafsson课题组在线性SIM的基础上提出了饱和结构光照明显微(SSIM)技术,通过荧光饱和激发产生了等幅的高次谐波结构光,将分辨率提高到了几十纳米的水平。目前在SIM这项技术中,只有SSIM才能实现比线性SIM更高的分辨率,然而由于SSIM需要较高的光功率激发光对样品进行荧光饱和激发,导致大的光损伤,这种方法并不适用活细胞成像,无法发挥SIM的优势。
因此,现有SIM技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于,针对现有技术的上述缺陷,提供一种宽场超分辨显微成像方法及其系统,通过构建含有非等幅的高次谐波的结构光图案激发产生相应的信号光结构图案以及相应的重构算法,旨在解决现低功率激发条件下结构光超分辨显微成像的分辨率低的问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案如下:
一种宽场超分辨显微成像方法,其中,包括步骤:
将光源发出的激光进行扩束准直处理、偏振方向调整处理后,通过空间光调制器进行相位调制,再经由傅里叶透镜变换得到强度调制的光;
将所述强度调制的光依次经过管镜、激发滤光片后得到激发光,通过分束镜反射激发光,并由物镜聚焦后激发样品发射信号光;其中,所述空间光调制器放置到所述傅里叶透镜的前焦面上,所述傅里叶透镜的后焦面和所述管镜的前焦面重合;
通过所述物镜收集所述信号光,并由所述分束镜透射到探测器上,所述探测器用于记录所述信号光的强度并得到信号光结构图案;
改变所述空间光调制器的调制函数,获得至少三个取向上不同相位的信号光结构图案;
根据所述至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像。
所述的宽场超分辨显微成像方法,其中,所述信号光的强度与所述激发光的强度存在线性关系;所述激发光的强度分布满足如下调制函数:
所述的宽场超分辨显微成像方法,其中,所述相位为:
所述的宽场超分辨显微成像方法,其中,所述至少三个取向包括:第一取向、第二取向、第三取向;所述第一取向、所述第二取向、所述第三取向中两两取向之间相差120°。
所述的宽场超分辨显微成像方法,其中,所述重构处理采用WS重构算法进行重构。
一种宽场超分辨显微成像系统,其中,包括:依次设置的光源、扩束准直装置、半波片、空间光调制器、傅里叶透镜、管镜、激发滤光片、分束镜;位于所述分束镜的反射方向的物镜;位于所述分束镜背离所述物镜一侧的探测器;与所述探测器、所述空间光调制器连接的计算机;所述空间光调制器放置到所述傅里叶透镜的前焦面上,所述傅里叶透镜的后焦面和所述管镜的前焦面重合;
所述扩束准直装置用于对所述光源发出的激光进行扩束准直处理得到扩束准直的光;所述半波片用于调整所述扩束准直的光的偏振方向得到已调整偏振方向的光;所述空间光调制器用于对所述已调整偏振方向的光进行相位调制得到相位调制的光,所述傅里叶透镜用于将所述相位调制的光进行傅里叶变换得到强度调制的光;所述激发滤光片用于过滤所述强度调制的光得到激发光;所述分束镜用于将所述激发光反射至所述物镜;所述物镜用于聚焦所述激发光以激发样品,并收集所述样品发射的信号光;所述探测器用于记录所述信号光的强度并得到信号光结构图案;所述计算机用于改变所述空间光调制器的周期和初始相位,获得至少三个取向上不同相位的信号光结构图案;并根据所述至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像。
所述的宽场超分辨显微成像系统,其中,所述信号光的强度与所述激发光的强度存在线性关系;所述激发光的强度分布满足如下调制函数:
所述的宽场超分辨显微成像系统,其中,所述相位为:
所述至少三个取向包括:第一取向、第二取向、第三取向;所述第一取向、所述第二取向、所述第三取向中两两取向之间相差120°;
所述重构处理采用WS重构算法进行重构。
所述的宽场超分辨显微成像系统,其中,所述扩束准直装置包括依次设置的第一透镜、第二透镜。
所述的宽场超分辨显微成像系统,其中,其还包括:位于所述半波片与所述空间光调制器之间的反射镜,位于所述分束镜与所述探测器之间的发射滤光片、第三透镜。
有益效果:空间光调制器将激光调制成强度满足正弦次幂分布的激发光图案,即包含有不等振幅的谐波图案,激发出荧光图案,从而产生多级频谱混叠。通过对混叠频谱的解频和复位,获得更高频样本信息。该方法不仅提高了分辨率,且相比起STED与SSIM,可以较低的光功率实现荧光分子的激发,避免对活细胞的损伤。
附图说明
图1是本发明中宽场超分辨显微成像系统的结构示意图。
图2是本发明中宽场超分辨显微成像方法的流程图。
图3是本发明中正弦平方条纹的强度曲线。
图4是本发明中正弦平方的激发光条纹图案。
图5是本发明中不同n值的点扩展函数曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确,以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
请同时参阅图1-图5,本发明提供了一种宽场超分辨显微成像系统的一些实施例。
如图1所示,本发明的一种宽场超分辨显微成像系统,包括:依次设置的光源1、扩束准直装置、半波片4、空间光调制器6、傅里叶透镜7、管镜8、激发滤光片9、分束镜10;位于所述分束镜10的反射方向的物镜11;位于所述分束镜10背离所述物镜11一侧的探测器15;与所述探测器15、所述空间光调制器6连接的计算机16;所述空间光调制器6放置到所述傅里叶透镜7的前焦面上,所述傅里叶透镜7的后焦面和所述管镜8的前焦面重合。
所述扩束准直装置用于对所述光源1发出的激光进行扩束准直处理得到扩束准直的光;所述半波片4用于调整所述扩束准直的光的偏振方向得到已调整偏振方向的光;所述空间光调制器6用于对所述已调整偏振方向的光进行相位调制得到相位调制的光,所述傅里叶透镜7用于将所述相位调制的光进行傅里叶变换得到强度调制的光;所述分束镜10用于将所述强度调制的光反射至所述物镜11;所述物镜11用于聚焦所述强度调制的光并作为激发光激发样品12,并收集所述样品12发射的信号光;所述探测器15用于记录所述信号光的强度并得到信号光结构图案;所述计算机16用于改变所述空间光调制器6的周期和初始相位,获得至少三个取向上不同相位的信号光结构图案;并根据所述至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像。
具体地,所述系统通过如下步骤成像:
S100、将光源1发出的激光进行扩束准直处理、偏振方向调整处理后,通过空间光调制器6进行相位调制,再经由傅里叶透镜变换得到强度调制的光。
光源1发出的激光可以采用非正弦结构光、正弦结构光或饱和结构光等等,为了避免损伤活细胞,可以采用光功率较低的光。光源1发出的激光经过扩束准直装置得到扩束和准直,扩束准直的光的直径增大,且形成平行光。本发明实施例中,扩束准直装置包括依次设置的第一透镜2、第二透镜3,其中,第一透镜2位于光源1与第二透镜3之间,第一透镜2的后焦面与第二透镜3的前焦面重合,第二透镜3的焦距大于第一透镜2的焦距。
半波片4调整扩束准直的光的偏振方向,根据需要调整光的偏振方向。在其它的实施例中,光源1发出的激光也可以不用进行扩束准直处理和调整偏振方向处理,那么可以不用设置扩束准直装置和半波片4。
在本发明较佳实施例中,为了减少系统占用的长度,优化系统的各部件的分布,所述系统还包括位于所述半波片4与所述空间光调制器6之间的反射镜5,利用反射镜5将已调整偏振方向的光发射至空间光调制器6。如图3所示,经空间光调制器6对光进行调制,并经过傅里叶透镜7进行傅里叶变换,使得到达样本的光(即激发光)的强度分布满足如下调制函数:
已调整偏振方向的光经过空间光调制器6进行调制后得到相位调制的光,相位调制的光经过傅里叶透镜7得到强度调制的光,强度调制的光再经过管镜8、激发滤光片9后,通过分束镜10反射,并由物镜11聚焦后,作为样品12的激发光打在样品12上,并使样品12中荧光分子激发后发射信号光。信号光的强度与激发光的强度存在线性关系,Iem(r)=kIex(r),其中,k为常系数,由于该常系数不影响超分辨图像的分辨率,则可以忽略,因此,信号光的强度分布为
其中,Iem(r)表示样品12发出的信号光的强度。
S200、将所述强度调制的光依次经过管镜8、激发滤光片9后得到激发光,通过分束镜10反射激发光,并由物镜11聚焦后激发样品12发射信号光。
S300、通过所述物镜11收集所述信号光,并由所述分束镜10透射到探测器15上,所述探测器15用于记录所述信号光的强度并得到信号光结构图案。
空间光调制器6将已调整偏振方向的光进行相位调制,然后相位调制的光经过傅里叶透镜7进行傅里叶变换得到强度调制的光,在傅立叶透镜后焦面可产生调制条纹图案(如图4所示)。强度调制的光经过管镜8变成平行光,接着由激发滤光片9将激发光以外的背景光过滤掉。激发光经过分束镜10反射到物镜11,物镜11将激发光聚焦并打在样品12上,激发光通常为紫外光或波长较短的可见光。样品12的荧光分子受到激发光激发后,呈激发态的分子。激发态的分子在回到基态时会释放信号光(实质上为荧光),信号光会透过分束镜10,并被探测器15接收。由于强度调制、探测同步进行,最终,探测器15记录形成一幅信号光结构图案,至此,得到一个取向上一个相位的信号光结构图案。
本发明的较佳实施例中,在分束镜10与探测器15之间设置发射滤光片13、第三透镜14,发射滤光片13用于过滤信号光掉中的背景光,第三透镜14将经发射滤光片13过滤的信号光汇聚到探测器15上,由探测器15记录信号光的强度。
S400、改变所述空间光调制器6的调制函数,获得至少三个取向上不同相位的信号光结构图案。
S500、根据所述至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像。
通常需要获得多个取向上的信号光结构图案,且在每个取向上需要多个不同相位的信号光结构图案。本发明较佳实施例中,获得至少三个取向上不同相位的信号光结构图案。通过改变空间光调制器的调制函数的周期和初始相位,可以改变激发光图案的相位移动,进而可以获得不同相位的信号光结构图案。
为了获得各个方向的超分辨图像,理论上应该实现每个方向下的上述信号光结构图像。实际上,通常实现三个方向(彼此相差120度)的超分辨图像即可,也就是说,至少三个取向包括:第一取向、第二取向、第三取向;所述第一取向、所述第二取向、所述第三取向中两两取向之间相差120°。因此,通过改变调制函数,即可获得不同取向的信号光图案,然后再分别获取不同取向的上述不同相位的信号光结构图案,利用WS重构算法重构出对应取向的超分辨图像,最终将各方向的超分辨图像合成为一幅超分辨图像。如图5所示,该发明的超分辨技术的分辨率由调制函数中幂指数n决定,n越大,分辨率越高,n可以人为设置。
WS重构算法如下:
假设激发的结构光为:
信号光为:
经过所述系统之后,被探测器15记录形成的强度图像的傅立叶变化为
将上述各个频率分量分离,然后复位分离的频率分量并相加,最后转换到时域即可得到某一个方向的超分辨的图像。
WS算法专门是广义结构光超分辨重构算法,不但适用于非线性结构光超分辨图像重构,也适用于线性结构光和饱和激发结构光的超分辨图像重构。
该发明专利主要利用空间光调制器6生成任意形状的条纹,以非正弦条纹为例,可利用非正弦条纹包含的高阶谐波提取样品12的高阶频率信息,实现比线性SIM更高的分辨率。
本专利提出一种宽场结构光超分辨显微成像技术及装置,其分辨率可高于线性SIM,且不需要SSIM的饱和激发。利用空间光调制器6调制激发光强,激发出任意结构的荧光,从而产生多级频谱混叠。通过对混叠频谱的解频和复位,获得更高频样本信息。该方法不仅提高了分辨率,且相比起STED与SSIM,可以较低的光功率实现荧光分子的激发,避免对活细胞的损伤。与需要特殊染料的STED与STORM相比,该方法对染料没有特殊要求,可适用样品12范围更广。再者,该方法仅需要几幅原始图像即可重构超分辨图像,相比于需要采集成千上万幅原始图像的STORM,其成像速度要快得多。
基于上述任意一实施例所述宽场超分辨显微成像系统,本发明提供了一种宽场超分辨显微成像方法的一些实施例。
如图2所示,本发明的一种宽场超分辨显微成像方法,包括以下步骤:
步骤S100、将光源1发出的激光进行扩束准直处理、偏振方向调整处理后,通过空间光调制器6进行相位调制,再经由傅里叶透镜7变换得到强度调制的光,具体如上所述。
步骤S200、将所述强度调制的光依次经过管镜8、激发滤光片9后,通过分束镜10反射,并由物镜11聚焦激发样品12发射信号光;其中,所述空间光调制器6放置到所述傅里叶透镜7的前焦面上,所述傅里叶透镜7的后焦面和所述管镜8的前焦面重合,具体如上所述。
步骤S300、通过所述物镜11收集所述信号光,并由所述分束镜10透射到探测器15上,所述探测器15用于记录所述信号光的强度并得到信号光结构图案,具体如上所述。
步骤S400、改变所述空间光调制器6的调制函数,获得至少三个取向上不同相位的信号光结构图案,具体如上所述。
步骤S500、根据所述至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像,具体如上所述。
综上所述,本发明所提供的一种宽场超分辨显微成像方法及其系统,所述方法包括步骤:将光源发出的激光进行扩束准直处理、偏振方向调整处理后,通过空间光调制器进行相位调制,再经由傅里叶透镜7变换得到强度调制的光;将所述强度调制的光依次经过管镜、激发滤光片、分束镜、物镜后激发样品发射信号光;通过所述物镜收集所述信号光,并由所述分束镜透射到探测器上;根据所述至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像。利用空间光调制器调制激发光强,激发出任意结构的荧光,从而产生多级频谱混叠。通过对混叠频谱的解频和复位,获得更高频样本信息。调制函数中幂指数n越大,分辨率越高,与激发光功率大小无关。不仅提高了分辨率,且相比起STED与SSIM,可以较低的光功率实现荧光分子的激发,避免对活细胞的损伤。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种宽场超分辨显微成像方法,其特征在于,包括步骤:
将光源发出的激光进行扩束准直处理、偏振方向调整处理后,通过空间光调制器进行相位调制,再经由傅里叶透镜变换得到强度调制的光;
将所述强度调制的光依次经过管镜、激发滤光片后得到激发光,通过分束镜反射激发光,并由物镜聚焦后激发样品发射信号光;其中,所述空间光调制器放置到所述傅里叶透镜的前焦面上,所述傅里叶透镜的后焦面和所述管镜的前焦面重合;
通过所述物镜收集所述信号光,并由所述分束镜透射到探测器上,所述探测器用于记录所述信号光的强度并得到信号光结构图案;
改变所述空间光调制器的调制函数,获得至少三个取向上不同相位的信号光结构图案;
根据所述至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像。
4.根据权利要求1所述的宽场超分辨显微成像方法,其特征在于,所述至少三个取向包括:第一取向、第二取向、第三取向;所述第一取向、所述第二取向、所述第三取向中两两取向之间相差120°。
5.根据权利要求1所述的宽场超分辨显微成像方法,其特征在于,所述重构处理采用WS重构算法进行重构。
6.一种宽场超分辨显微成像系统,其特征在于,包括:依次设置的光源、扩束准直装置、半波片、空间光调制器、傅里叶透镜、管镜、激发滤光片、分束镜;位于所述分束镜的反射方向的物镜;位于所述分束镜背离所述物镜一侧的探测器;与所述探测器、所述空间光调制器连接的计算机;所述空间光调制器放置到所述傅里叶透镜的前焦面上,所述傅里叶透镜的后焦面和所述管镜的前焦面重合;
所述扩束准直装置用于对所述光源发出的激光进行扩束准直处理得到扩束准直的光;所述半波片用于调整所述扩束准直的光的偏振方向得到已调整偏振方向的光;所述空间光调制器用于对所述已调整偏振方向的光进行相位调制得到相位调制的光,所述傅里叶透镜用于将所述相位调制的光进行傅里叶变换得到强度调制的光;所述激发滤光片用于过滤所述强度调制的光得到激发光;所述分束镜用于将所述激发光反射至所述物镜;所述物镜用于聚焦所述激发光以激发样品,并收集所述样品发射的信号光;所述探测器用于记录所述信号光的强度并得到信号光结构图案;所述计算机用于改变所述空间光调制器的调制函数,获得至少三个取向上不同相位的信号光结构图案;并根据所述至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像。
9.根据权利要求6所述的宽场超分辨显微成像系统,其特征在于,所述扩束准直装置包括依次设置的第一透镜、第二透镜。
10.根据权利要求6所述的宽场超分辨显微成像系统,其特征在于,其还包括:位于所述半波片与所述空间光调制器之间的反射镜,位于所述分束镜与所述探测器之间的发射滤光片、第三透镜。
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