CN110951668B - 无血清培养液以及使用其分离和放大培养干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种无血清培养液，包含培养基、副甲状腺素、纤维母细胞生长因子‑2、表皮生长因子、人血清白蛋白、茴香霉素、运铁蛋白以及胰岛素。本申请进一步涉及使用该无血清培养液的方法。
Description
技术领域
本发明是关于一种细胞分离和放大培养的技术，特别是一种在体外的干细胞的分离和放大培养方法以及此方法中使用的无血清培养液。
背景技术
干细胞是一种原始未分化的细胞，具有分化成其它的功能性细胞与自我新生的新的干细胞的能力。常见的干细胞分为胚胎干细胞、成体干细胞与肿瘤干细胞。其中，成体干细胞的多分化性能对于再生医学以及干细胞疗法有很大的应用潜力。成体干细胞例如有脂肪间质干细胞，其具有取得容易、易于放大培养、分化能力强、可调控免疫的优点，因而目前在医学用途方面的干细胞培养多使用脂肪间质干细胞。
目前已知的体外放大干细胞的方法，主要是通过在培养基中添加各种不同物质，如细胞激素、血清及重组蛋白等营养物所组成的培养液来促使干细胞增生。然而，血清的成分过于复杂且容易有异源病毒及传染病的交叉感染，因此含有血清的培养液虽然在学术研究上被广泛使用，但对于预计制作成临床用制剂的干细胞来说是不适合的培养液。
此外，大部分干细胞的培养时间需长达7天甚至2周以上，并无法在短期间内获取临床上有效的干细胞族群。由于干细胞分离不易且极为脆弱，因此如何有效提升干细胞的回收率与产率，实为体外放大干细胞培养需要克服的课题。
发明内容
鉴于以上的问题，本发明揭露一种无血清培养液以及使用此无血清培养液进行干细胞分离及放大培养的方法，有助于解决含血清培养液不适用于培养临床用途的干细胞以及细胞放大速率较慢的问题。
本发明提供一种无血清培养液，其包含培养基、副甲状腺素(PTH)、纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白(Human serum albumin)、茴香霉素(Anisomycin)、运铁蛋白(Transferrin)以及胰岛素(Insulin)。
本发明提供一种在体外对干细胞进行放大培养的方法，包括将干细胞置入上述无血清培养液中进行初代培养或继代培养。
根据本发明所揭露的无血清培养液以及在体外对干细胞进行放大培养的方法，适合培养干细胞的无血清培养液能有效促进干细胞放大培养的效率以及存活率，且经继代培养后，干细胞仍保有需要的表面抗原特性和分化能力以作为临床医疗使用。
以上的关于本揭露内容的说明及以下的实施方式的说明是用以示范与解释本发明的精神与原理，并且提供本发明的专利申请范围更进一步的解释。
具体实施方式
以下在实施方式中详细叙述本发明的详细特征以及优点，其内容足以使任何熟习相关技艺者了解本发明的技术内容并据以实施，且根据本说明书所揭露的内容、权利要求书及附图，任何熟习相关技艺者可轻易地理解本发明相关的目的及优点。以下的实施例用于进一步详细说明本发明的观点，但非以任何观点限制本发明的范畴。
首先说明作为本发明的一种实施方式的无血清培养液，其包含培养基、副甲状腺素、纤维母细胞生长因子-2、表皮生长因子、人血清白蛋白、茴香霉素、运铁蛋白以及胰岛素。无血清培养液可用于将干细胞从脂肪组织中分离、初代培养以及继代培养，高效地扩增细胞数量，并且由此得到的数代后的干细胞仍保留有间质干细胞的表面抗原特性(CD34(-)、CD45(-)、CD90(+)、CD105(+)、CD73(+))及分化成脂肪、软骨和硬骨的能力。干细胞例如为脂肪来源的干细胞(Adipose-Derived Stem Cell，ADSC)、例如脂肪间质干细胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell，ADMSC)。
培养基例如为MCDB-131培养基。MCDB-131培养基的配方为本领域所通晓，故在此不加以详述。在其它实施例中，培养基可以是MCDB-135或MCDB-138培养基。
副甲状腺素的浓度为0.1微克/升(μg/L)至0.2微克/升，较佳地为0.12微克/升至0.16微克/升。更佳地，副甲状腺素的浓度为0.14微克/升至0.15微克/升。
纤维母细胞生长因子-2的浓度为4纳克/升至12纳克/升，较佳地为6纳克/升至10纳克/升。更佳地，纤维母细胞生长因子-2的浓度为8纳克/升至10纳克/升。
表皮生长因子的浓度为2.5微克/升至7.5微克/升，较佳地为3.5微克/升至6微克/升。更佳地，表皮生长因子的浓度为5微克/升至6微克/升。
人血清白蛋白的浓度为0.25克/升至0.75克/升，较佳地为0.3克/升至0.6克/升。更佳地，人血清白蛋白的浓度为0.4克/升至0.5克/升。
茴香霉素的浓度为75微克/升至125微克/升，较佳地为90微克/升至115微克/升。更佳地，茴香霉素的浓度为100微克/升至110微克/升。
运铁蛋白的浓度为3.75毫克/升(mg/L)至5.75毫克/升，较佳地为4.5毫克/升至6毫克/升。更佳地，运铁蛋白的浓度为5.5至6毫克/升。
胰岛素的浓度为8毫克/升至12毫克/升，较佳地为8.5毫克/升至10.5毫克/升。在一实施例中，胰岛素的浓度为10毫克/升。
在一实施例中，无血清培养液还包含硒(Selenium)。较佳地，硒的浓度为3微克/升至7微克/升。在一实施例中，硒的浓度为5微克/升。
在一种实施方式中，本发明涉及无血清培养液在用于干细胞的初代培养以及继代培养中的用途。该干细胞可为脂肪来源的干细胞(Adipose-Derived Stem Cell，ADSC)、例如脂肪间质干细胞。
以下说明本发明的一种实施方式的在体外对干细胞进行放大培养的方法。
从供体的体内抽取适量的含有干细胞的人体组织。将人体组织用酶(enzyme)作用30min～1小时，之后以离心机分离干细胞与其它组织成分，以取得纯化的干细胞。在一实施例中，所述人体组织是从供体的体内抽取的脂肪组织，并将从脂肪组织中纯化出的脂肪间质干细胞作为P0代细胞。
取适量的干细胞置入培养皿，并以PBS冲洗数次后，注入培养液进行初代培养。初代培养的时间约为数十小时至数天。在一实施例中，采用本发明揭露的无血清培养液进行初代培养(P1代)，并且初代培养的时间约为4天。
初代培养完成后，移除培养液，并以酶(例如胰蛋白酶)使P1代细胞脱离培养皿。取适量的干细胞置入新的培养皿，并同样以本发明揭露的无血清培养液进行继代培养。在一实施例中，继代培养的时间约为5天。
以下提供本发明的具体实施例，以说明本发明所揭露的无血清培养液在干细胞的放大培养中的功效。
实施例
实施例一
提供一种无血清培养液，其包含25毫升的MCDB-131培养基、0.15微克/升的副甲状腺素、8纳克/升的纤维母细胞生长因子-2、5微克/升的表皮生长因子、0.5克/升的人血清白蛋白、100微克/升的茴香霉素、5.5毫克/升的运铁蛋白、10毫克/升的胰岛素以及5微克/升的硒。将脂肪间质干细胞置入填充有该无血清培养液的培养皿中，以进行初代培养与数次继代培养，进而依序得到P1代至P5代脂肪间质干细胞。培养皿为直径10cm的圆形培养皿。此外，进行初代培养与继代培养所使用的脂肪间质干细胞的细胞密度(即在每一代培养中置入无血清培养液的细胞密度)为400各细胞/平方厘米(cell/cm2)至1500个细胞/平方厘米。
比较例
提供熟知的MCDB-131培养基。将脂肪间质干细胞置入MCDB-131培养基进行初代培养与数次继代培养，依序得到P1代至P5代脂肪间质干细胞。进行初代培养与继代培养所使用的脂肪间质干细胞的细胞密度为2000个细胞/平方厘米。
脂肪间质干细胞的放大(增殖)状况如下表1所示。根据表1，于实施例一中，P1代至P5代脂肪间质干细胞的细胞数量倍增所需要的时间皆小于30小时，并且细胞倍增所需时间皆小于比较例，这表示实施例一的无血清培养液能有效加快脂肪间质干细胞的增殖。在表1中，以实施例一的无血清培养液培养脂肪间质干细胞得到两组实验结果，其中进行初代培养与继代培养所使用的脂肪间质干细胞的细胞密度相同。
脂肪间质干细胞的成长速率如下表2所示。根据表2，在相同的培养时间下，对于实施例一的每代而言，脂肪间质干细胞成长速率会高于比较例同代的成长速率，例如在第一组实验结果中培养P1代细胞时，实施例一的细胞增加倍数为116.4，代表P1代细胞培养完成后，取得的存活细胞数量是在培养P1代细胞的初始阶段置入无血清培养液的细胞数量的116.4倍。在第二组实验结果中培养P1代细胞时，实施例一的细胞增加倍数为107.0，代表P1代细胞培养完成后，取得的存活细胞数量是在培养P1代细胞的初始阶段置入无血清培养液的细胞数量的107倍。要说明的是，表2中存在部分比较例的细胞存活数量比实施例一的细胞存活数量多的情况，这是因为对于在初始阶段置入无血清培养液的细胞来说，实施例一的细胞数量少于比较例的细胞数量，而这也表示实施例一以少量干细胞便能成功培养。
每代脂肪间质干细胞的表面抗原分析结果如下表3所示。以流式细胞仪分析表面抗原，能得知实施例一中的脂肪间质干细胞符合CD34(-)、CD45(-)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)的表面抗原特性，因此可应用于诱导脂肪分化以及诱导硬骨/软骨细胞分化。
实施例一中，脂肪间质干细胞的存活率如下表4所示。于进行P2代培养时，在填充有无血清培养液的5个培养皿中分别置入相同细胞密度(400cell/cm2)的脂肪间质干细胞。根据表4，在P2代细胞培养完成后，每个培养皿中的细胞存活率(培养皿中存活细胞数量/培养皿中所有细胞数量)皆大于90％。
综上所述，本发明所揭露的无血清培养液以及在体外对干细胞进行放大培养的方法中，适合培养干细胞的无血清培养液能有效促进干细胞放大培养的效率以及存活率，且经继代培养后，干细胞仍保留有需要的表面抗原特性以作为临床医疗使用。
此外，采用本发明所揭露的无血清培养液时，只需要加入少量的干细胞便能成功培养，例如最少只需要400个细胞/平方厘米的细胞密度就能成功培养。
Claims (4)
1.一种无血清培养液，由如下组成：
MCDB-131培养基；
副甲状腺素，所述副甲状腺素的浓度为0.1微克/升至0.2微克/升；
纤维母细胞生长因子-2，所述纤维母细胞生长因子-2的浓度为4纳克/升至12纳克/升；
表皮生长因子，所述表皮生长因子的浓度为2.5微克/升至7.5微克/升；
人血清白蛋白，所述人血清白蛋白的浓度为0.25克/升至0.75克/升；
茴香霉素，所述茴香霉素的浓度为75微克/升至125微克/升；
运铁蛋白，所述运铁蛋白的浓度为3.75毫克/升至5.75毫克/升；
胰岛素，所述胰岛素的浓度为8毫克/升至12毫克/升；以及
硒，所述硒的浓度为3微克/升至7微克/升。
2.权利要求1所述的无血清培养液在用于干细胞的初代培养以及继代培养中的用途，其中进行所述初代培养与所述继代培养所使用的干细胞密度为400个细胞/平方厘米至1500个细胞/平方厘米，其中，所述干细胞为脂肪间质干细胞。
3.一种在体外对干细胞进行放大培养的方法，包括将干细胞置入如权利要求1所述的无血清培养液中进行初代培养或继代培养，其中进行所述初代培养与所述继代培养所使用的干细胞密度为400个细胞/平方厘米至1500个细胞/平方厘米，其中，所述干细胞为脂肪间质干细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述初代培养与所述继代培养中的细胞倍增时间皆小于等于30小时。
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