CN110950969A

CN110950969A - 一种具有免疫球蛋白结合能力的融合蛋白

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Publication number: CN110950969A
Application number: CN201911343538.1A
Authority: CN
Inventors: 曹洋; 柏清玉; 马新建; 马静; 辛文
Original assignee: BEIJING TRANSGEN BIOTECH CO LTD
Current assignee: Beijing quanshijin Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN110950969B

Abstract

本发明公开一种具有免疫球蛋白结合能力的融合蛋白。本发明公开的融合蛋白包括依次连接的Protein L的B1结构域、Protein A的D结构域及C结构域和Protein G的G3结构域，Protein L的B1结构域和Protein A的D结构域通过SEQ ID No.6‑11任一所示的短肽连接，Protein A的D结构域和C结构域通过SEQ ID No.4连接，Protein A的C结构域和Protein G的G3结构域通过短肽VSM连接。本发明融合蛋白对于不同种属、亚型的免疫球蛋白均具有较好亲和力和较快的结合效率，对pH的耐受性更宽，应用前景和应用范围更为广阔。

Description

一种具有免疫球蛋白结合能力的融合蛋白

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域。更具体地，涉及一种具有免疫球蛋白结合能力的融合蛋白。

背景技术

在长期的进化过程中，一些细菌表面的蛋白可以特异性的同多种哺乳动物免疫球蛋白相结合，如金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus protein A)、链球菌蛋白G(Streptococcal protein G)和大消化链球菌表面蛋白L(Peptostreptococcus magnusprotein L)等，形成细菌重要的致病因子。根据这些蛋白的特异性结合免疫球蛋白的特性，目前这些蛋白已经广泛应用于免疫球蛋白的纯化分离领域。

Protein A为金黄色葡萄球菌细胞壁的免疫球蛋白结合蛋白，它包含5个与免疫球蛋白G(IgG)特异性结构的串联的结构域，分别命名为E，D，A，B，C。Protein A除可以特异性的同IgG的Fc区域结合，还可以同IgG的Fab区域结合。Protein G为链球菌细胞壁的免疫球蛋白结合蛋白，它包含3个与IgG特异性结构的串联的结构域，分别命名为B1，B2，B3。同样，Protein G也具有部分结合Fab的CH1结构域的特性。Protein L为大消化链球菌细胞壁的免疫球蛋白结合蛋白，可以特异性结合IgG的Fab区域。Protein L包含B1，B2，B3，B4，B5共5个串联结构域，单一的结构域可以通过两个区域同时结合Fab中VL部分。

由于Protein A、G或L各自对IgG的识别区域不同，对于不同种属及免疫球蛋白亚型的亲和力差异较大，无法利用一种蛋白同时满足所有种属及免疫球蛋白亚型的分离或者纯化。基于Protein A、G或L各自特性及互补性，人们不断尝试不同的分子或结构域组合的融合蛋白，例如将Protein A与Protein G融合表达构建Protein AG(Eliasson，M.，Olsson，A.，Palmcrantz，E.，Wiberg，K.，

M.，Guss，B.，Lindberg，M.&Uhle′n，M.ChimericIgG-binding receptors engineered from staphylococcal protein A andstreptococcal protein G.1988.J.Biol.Chem.263，4323-4327.)，将Protein G与ProteinL融合表达构建Protein GL(Kihlberg，B.M.，

U.，Kastern，W.&

L.ProteinLG：a hybrid molecule with unique immunoglobulin bindingproperties.1992.J.Biol.Chem.267，25583-25 588.)，将Protein L与Protein A融合表达构建Protein LA(Svensson HG，Hoogenboom HR，

U.Protein LA，a novel hybridprotein with unique single-chain Fv antibody-and Fab-bindingproperties.1998.Eur J Biochem.258(2)：890-6.)，这些融合蛋白相比于单个蛋白，可以有效提升对各类型免疫球蛋白的亲和力，应用面更广。之后人们不断尝试进一步提升Protein A、G或L融合蛋白对于各类型免疫球蛋白和蛋白自身的稳定性。但目前，人们构建串联的融合蛋白都是选择单个的结构域或者完整蛋白进行直接连接，不同结构域之间存在空间位阻导致与IgG结合力受到影响。

因此，需要提供一种对于不同种属、亚型的免疫球蛋白亚型均有较好亲和力的蛋白，以解决上述问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种对不同种属、亚型的免疫球蛋白亚型均有较好亲和力的蛋白。

为达到上述目的，本发明首先提供了一种融合蛋白，该融合蛋白对免疫球蛋白具有较好的亲和力。

本发明融合蛋白包括依次连接的Protein L的B1结构域(Protein L-B1)、ProteinA的D结构域(Protein A-D)、Protein A的C结构域(Protein A-C)和Protein G的G3结构域(Protein G-G3)，所述Protein L的B1结构域和Protein A的D结构域通过短肽连接，所述Protein A的D结构域和Protein A的C结构域通过SEQ ID No.4所示的氨基酸序列(即DAQAPK)连接，所述Protein A的C结构域和Protein G的G3结构域通过短肽VSM连接；所述短肽为如下任一种：

1)SEQ ID No.9所示的氨基酸序列(即TPETDSTPETDS)；

2)SEQ ID No.10所示的氨基酸序列(即GGGGSGGGGS)；

3)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列(即TPETDS)；

4)SEQ ID No.8所示的氨基酸序列(即GSGSGSGSGS)；

5)SEQ ID No.11所示的氨基酸序列(即GGGGSGGGGSGGGGS)；

6)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列(即GSGSGS)。

进一步，在上述融合蛋白的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。

在本发明中，为了便于纯化，在Protein G-G3结构域之后连接了类组氨酸标签(SEQ ID No.12所示的氨基酸序列，即KLAAALEHHHHHH)。

进一步，所述Protein L的B1结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述Protein A的D结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述Protein A的C结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述Protein G的G3结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明融合蛋白对于不同种属、亚型的免疫球蛋白均有较好亲和力，结合免疫球蛋白的效率更快，对pH的耐受性范围可达到5-9。

本发明进一步提供了一种DNA，所述DNA分子编码上述融合蛋白。

在本发明中，所述Protein L的B1结构域基因序列如SEQ ID No.13所示；所述Protein AG基因序列(SEQ ID No.14所示)由ProteinA的D结构域基因序列(SEQ ID No.14的第1-141位所示)、Protein A的C结构域基因序列(SEQ ID No.14第160-315位所示)与Protein G的G3结构域基因序列(SEQ ID No.14第325-489位所示)组成，Protein A的D结构域基因序列和Protein A的C结构域基因序列之间通过一段连接序列(SEQ ID No.14第142-159位所示，即SEQ ID No.4所示的短肽DAQAPK的基因序列)进行连接，Protein A-C结构域基因序列与Protein G-G3结构域基因序列之间通过连接序列(SEQ ID No.14第316-324位所示，即短肽VSM的基因序列)进行连接；Protein G-G3结构域基因序列与类组氨酸标签基因序列(SEQ ID No.14第490-528位所示，即SEQ ID No.12所示的KLAAALEHHHHHH的基因序列)直接连接。SEQ ID No.9所示的短肽的基因序列如SEQ ID No.24第17-52位所示；SEQ IDNo.10所示的短肽的基因序列如SEQ ID No.26第1-30位所示；SEQ ID No.7所示的短肽的基因序列如SEQ ID No.20第17-34位所示；SEQ ID No.8所示的短肽的基因序列如SEQ IDNo.22第1-30位所示；SEQ ID No.11所示的短肽的基因序列如SEQ ID No.28第1-45位所示；SEQ ID No.6所示的短肽的基因序列如SEQ ID No.17第17-34位所示。

包含上述DNA分子的重组载体也在本发明的保护范围之内。

在本发明具体的实施方式中，所述重组载体为pET28a-Protein LAG；即将pET28a载体的NcoI和HindIII酶切位点间的DNA片段替换为上述融合蛋白(Protein LAG)的基因序列，且保持pET28a载体的其它序列不变得到的重组载体；其中，所述pET28a-Protein LAG为pET28a-Protein LAG-1，pET28a-Protein LAG-2，pET28a-Protein LAG-3，pET28a-ProteinLAG-4，pET28a-Protein LAG-5，pET28a-Protein LAG-6和pET28a-Protein LAG-7。

包含上述DNA分子或重组载体的转化体也在本发明的保护范围之内。

本发明所述转化体通过重组载体转化宿主而得到。在本发明具体的实施方式中，所述转化体为将上述重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到。

本发明进一步还提供了上述融合蛋白的制备方法，所述方法包括对上述转化体进行培养，以产生所述融合蛋白。

本发明中融合蛋白是将所述转化体在培养基中进行培养，通过离心分离等方法而回收培养上清液或菌体，进一步经过纯化得到。

本发明还提供了上述融合蛋白在分离和/或纯化免疫球蛋白中的应用。

进一步，所述免疫球蛋白选自人IgG、牛IgG、马IgG、鼠IgG、兔IgG、人IgA、人IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG1中至少一种。

本发明通过对融合蛋白与不同种属的免疫球蛋白G的亲和力测定表明，融合蛋白Protein LAG对于不同种属免疫球蛋白(即人IgG、牛IgG、马IgG、鼠IgG、兔IgG)均有极强的亲和力且Protein LAG-4远远高于其他Protein LAG；对融合蛋白Protein LAG与不同亚型的免疫球蛋白的亲和力测定表明，融合蛋白对于不同亚型免疫球蛋白(即人IgA、人IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG1)均具有较强的亲和力且Protein LAG-4优势更加明显；对融合蛋白不同种属的免疫球蛋白G结合速率和有效pH范围测定表明，本发明Protein LAG结合速率和对pH耐受范围均优于Protein AG且Protein LAG-4表现出明显的优势。

本发明的有益效果如下：

本发明利用不同的短肽将不同细菌来源Protein L的B1结构域、Protein A的D结构域及C结构域和Protein G的G3结构域进行融合表达，获得了一种或几种融合蛋白，这些融合蛋白对于不同种属、亚型的免疫球蛋白均具有较好亲和力和较快的结合效率，对pH的耐受性更宽，pH可达到5-9，有效提升融合蛋白在偏酸性及偏碱性环境中的稳定性，优势明显，使得其应用前景和应用范围上更为广阔，可广泛应用于科研探索、医疗诊断等。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为Protein LAG融合蛋白结构示意图。

图2为Protein LAG蛋白纯化SDS-PAGE结果。

图3为Protein LAG对于不同种属免疫球蛋白G的亲和力。

图4为Protein LAG对于不同亚型免疫球蛋白G的亲和力。

图5为Protein LAG对于不同种属免疫球蛋白G的结合时间。

图6为pH对于Protein LAG结合免疫球蛋白G的影响。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明下述实施例中各试剂的来源

EZ-Link^TM NHS-LC-Biotin(Thermo，21336)

HRP标记的链霉亲和素(SA-HRP)(Biolegend，405210，0.5mg/ml)

人IgG(Human IgG Isotype Control)(Thermo，02-7102)

鼠IgG(Mouse IgG Isotype Control)(Thermo，31903)

兔IgG(Rabbit IgG Isotype Control)(Thermo，02-6102)

牛IgG(Bovine IgG)(YEASEN，36107ES01)

马IgG(G-HORSE IgG whole molecule)(Rockland，008-0102-0010)

人IgA(Human IgA Isotype Control)(Thermo，31148)

鼠IgG1(Mouse IgG1 Isotype Control)(Thermo，02-6100)

鼠IgG2b(Mouse IgG2b Isotype Control)(Thermo，02-6300)

鼠IgG2a(Mouse IgG2a Isotype Control)(Thermo，02-6200)

人IgG1(Ultra-LEAF^TM Purified Human IgG1 Isotype Control RecombinantAntibody)(Biolegend，403502)

实施例1 Protein LAG序列设计及表达载体构建

本发明选择Protein L的B1结构域(Protein L-B1，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)、Protein A的D结构域及C结构域(Protein A-DC，Protein A的D结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，Protein A的C结构域氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；Protein A的D结构域和Protein A的C结构域之间通过氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的短肽连接)和Protein G的G3结构域(Protein G-G3，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示)，Protein G-G3与Protein A-DC之间通过短肽VSM连接得到Protein AG，为了便于纯化，在Protein G-G3之后连接了类组氨酸标签(KLAAALEHHHHHH，其氨基酸序列如SEQ ID No.12所示)。并且通过对Protein A，Protein G，Protein L的蛋白结构和序列进行分析，将甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的简单重复序列(如GS×3，GS×5或者GGGGS×2，GGGGS×3)等或Protein L中一段位于Loop区域的短肽TPETDS或TPETDSTPETDS作为连接短肽连接Protein L-B1与Protein AG或直接连接Protein L-B1与Protein AG，构建了7种不同的融合蛋白，分别命名为Protein LAG-1，Protein LAG-2，Protein LAG-3，Protein LAG-4，Protein LAG-5，Protein LAG-6，ProteinLAG-7，结构示意图如图1，其中前6个融合蛋白(即Protein LAG-1，Protein LAG-2，ProteinLAG-3，Protein LAG-4，Protein LAG-5，Protein LAG-6)的差异在于Protein L-B1和Protein AG之间通过不同的连接短肽，分别为GS×3(SEQ ID No.6)，TPETDS(SEQ IDNo.7)，GS×5(SEQ ID No.8)，TPETDSTPETDS(SEQ ID No.9)，GGGGS×2(SEQ ID No.10)，GGGGS×3(SEQ ID No.11)，而Protein LAG-7和其他融合蛋白的区别在于Protein L-B1与Protein AG直接连接。

1、获得融合蛋白的基因序列

将Protein L-B1、Protein AG的基因序列分别进行密码子优化，人工合成密码子优化后的序列，其中Protein L-B1基因序列如SEQ ID No.13所示、Protein AG基因序列如SEQ ID No.14所示，Protein L-B1直接合成序列。按照图1中所示的蛋白结构将上述序列SEQ ID No.13、SEQ ID No.14通过不同连接短肽利用overlapping PCR的方法将基因序列进行连接，分别扩增Protein LAG-1，Protein LAG-2，Protein LAG-3，Protein LAG-4，Protein LAG-5，Protein LAG-6，Protein LAG-7，利用直接PCR的方法扩增Protein AG。

设计引物时，为使用pET28a载体NcoI酶切位点中的起始密码子ATG，并保证密码子翻译过程中不产生移码，在Protein L-B1基因序列的5’端NcoI酶切位点后引入2个碱基CG，形成ATGGCG，因此在Protein LAG蛋白的N端多出MA两个氨基酸。

以Protein LAG-1为例，具体overlapping PCR的方法如下：

以SEQ ID No.13所示的Protein L-B1的基因序列为模板，利用LDCG3-L-NcoI+和LDCG3-D-GS×3-L-为引物，以2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix(Transgen，AS231)作为反应液，配制PCR反应体系，进行PCR扩增，获得PCR产物1；

以SEQ ID No.14所示的Protein AG的基因序列为模板，利用LDCG3-L-GS×3-D+和LDCG3-G3-His-Stop-为引物，以2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix(Transgen，AS231)作为反应液，配制PCR反应体系，进行PCR扩增，获得PCR产物2；

以PCR产物1和PCR产物2为模板，以LDCG3-L-NcoI+和LDCG3-G3-His-Stop-为引物，以2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix(Transgen，AS231)作为反应液，进行overlapping PCR，得到PCR产物3，对PCR产物3进行测序，测序正确后，得到包含ProteinLAG-1的基因序列的产物。

同理，将上述引物LDCG3-D-GS×3-L-替换为LDCG3-D-TPETDS-L-，将LDCG3-L-GS×3-D+替换为LDCG3-L-TPETDS-D+，得到包含Protein LAG-2的基因序列的产物；

将上述引物LDCG3-D-GS×3-L-替换为LDCG3-GS×5-L-，将LDCG3-L-GS×3-D+替换为LDCG3-GS×5-DCG3+，得到包含Protein LAG-3的基因序列的产物；

将上述引物LDCG3-D-GS×3-L-替换为LDCG3-D-TPETDSTPETDS-L-，将LDCG3-L-GS×3-D+替换为LDCG3-L-TPETDSTPETDS-D+，得到包含Protein LAG-4的基因序列的产物；

将上述引物LDCG3-D-GS×3-L-替换为LDCG3-G4S×2-L-，将LDCG3-L-GS×3-D+替换为LDCG3-G4S×2-DCG3+，得到包含Protein LAG-5的基因序列的产物；

将上述引物LDCG3-D-GS×3-L-替换为LDCG3-G4S×3-L-，将LDCG3-L-GS×3-D+替换为LDCG3-G4S×3-D+，得到包含Protein LAG-6的基因序列的产物；

将上述引物LDCG3-D-GS×3-L-替换为LDCG3-D-L-，将LDCG3-L-GS×3-D+替换为LDCG3-L-D+，得到包含Protein LAG-7的基因序列的产物；

以SEQ ID No.14所示的Protein AG的基因序列为模板，利用DCG3-NcoI+和LDCG3-G3-His-Stop-为引物，以2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix(Transgen，AS231)作为反应液，配制PCR反应体系，进行PCR扩增，获得包含Protein LAG-6的基因序列的产物；

其中，Overlapping PCR引物序列(引物由GENEWIZ合成)为如表1所示：

表1引物序列

扩增PCR产物1和2的PCR反应的体系为：

扩增PCR产物3的PCR反应的体系为：

PCR反应程序为：

利用NcoI和HindIII双酶切方法将pET28a载体的NcoI和HindIII酶切位点之间的片段替换为Protein LAG-1，Protein LAG-2，Protein LAG-3，Protein LAG-4，ProteinLAG-5，Protein LAG-6和Protein LAG-7，Protein AG的基因序列，且保持pET28a载体的其他序列不变，最后构建得到含融合蛋白的基因序列的表达载体pET28a-Protein LAG-1，pET28a-Protein LAG-2，pET28a-Protein LAG-3，pET28a-Protein LAG-4，pET28a-ProteinLAG-5，pET28a-Protein LAG-6，pET28a-Protein LAG-7和pET28a-Protein AG。

实施例2 Protein LAG和Protein AG的表达及纯化

1、各试剂的成分及含量

洗涤液(Wash Buffer)：1×PBS，pH7.3-7.4；

连接缓冲液(Binding Buffer)：1×PBS，0.5M NaCl，pH7.3-7.4

洗脱液1(Elution Buffer 1)：1×PBS，20mM咪唑(Imidazole)

洗脱液2(Elution Buffer 2)：1×PBS，30mM咪唑(Imidazole)

洗脱液3(Elution Buffer 3)：1×PBS，150mM咪唑(Imidazole)

洗脱液4(Elution Buffer 4)：1×PBS，250mM咪唑(Imidazole)

洗脱液5(Elution Buffer 5)：1×PBS，500mM咪唑(Imidazole)

透析液(Storage Buffer)：1×PBS，pH 7.3-7.4

重力柱Ni-IDA Resin(Transgen，DP111)

2、融合蛋白Protein LAG和Protein AG的表达

以表达载体pET28a-Protein LAG-1为例进行实验：

将构建好的表达载体pET28a-Protein LAG-1转化至大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞(Transgen，CD601)中进行原核表达。挑取单克隆至5ml的LB(含Amp 50μg/ml)培养基中，37℃摇菌过夜，按照1％的接种比例接种到200ml LB(含Amp 50μg/ml)培养基中37℃摇床继续培养，约2h后开始测定菌液浓度，当菌液OD值在0.5-0.8之间时开始利用IPTG浓度为0.25mM进行诱导，37℃诱导培养4h。然后4℃，4500rpm离心20min收取菌液，离心后弃上清，获得菌体，向菌体加入大于30倍菌体重的洗涤液重悬菌体，之后再次4℃，4500rpm离心20min收集菌体，弃上清。对菌体进行称重。根据菌体重量，按洗涤液与菌体重量为6∶1的比例加入洗涤液重悬菌体，再加入10u/ml的核酸酶DNase I(RNase-free)(Transgen，GD201)，震荡混匀后，冰上放置10min，期间反复混匀使核酸酶充分降解核酸，再用超声破碎仪进行破碎(6号探头，200w，15min，3s开/6s关，冰浴)。破碎完后进行4℃，9000rpm离心30min，将上清转到另一干净管中，0.22μm滤膜过滤处理，得到过滤后的裂解液，即得到未纯化的融合蛋白Protein LAG-1，沉淀暂时保留。

同理，按照上述方法将表达载体pET28a-Protein LAG-1替换为表达载体pET28a-Protein LAG-2，pET28a-Protein LAG-3，pET28a-Protein LAG-4，pET28a-Protein LAG-5，pET28a-Protein LAG-6，pET28a-Protein LAG-7或pET28a-Protein AG同上述步骤，最终分别得到相应的过滤后的裂解液，即得到未纯化的融合蛋白Protein LAG-1，Protein LAG-2，Protein LAG-3，Protein LAG-4，Protein LAG-5，Protein LAG-6，Protein LAG-7和Protein AG。

3、融合蛋白Protein LAG和Protein AG的纯化：

以未纯化的融合蛋白Protein LAG-1为例进行实验：

1)上样前将3ml Ni-IDA Resin重力柱用ddH₂O洗10柱体积，再用洗涤液平衡5个柱体积后，得到处理后的Ni-IDA Resin重力柱，上样前准备完成。

2)将过滤后的裂解液(未纯化的融合蛋白Protein LAG-1)加入处理后的Ni-IDAResin重力柱中，直接靠重力上样，流速保持2ml/min左右，将流出液用干净的管接住。当样品上完后继续用洗涤液进行再平衡约20个柱体积，将流出液暂时保存。

3)利用Elution Buffer 1-5进行分步洗脱，10mM Imidazole洗20个柱体积，其余每个梯度洗3-5柱体积左右。将所有的洗脱液进行透析，透析液为1×PBS，pH7.3-7.4，透析过夜，最终得到纯化后融合蛋白Protein LAG-1。

按照上述步骤1)-3)所述的方法得到纯化后的融合蛋白Protein LAG-2，ProteinLAG-3，Protein LAG-4，Protein LAG-5，Protein LAG-6，Protein LAG-7和Protein AG。

4)将纯化的融合蛋白Protein LAG-1，Protein LAG-2，Protein LAG-3，ProteinLAG-4，Protein LAG-5，Protein LAG-6，Protein LAG-7和Protein AG进行SDS-PAGE电泳，结果如图2所示，结果显示8种融合蛋白的条带均较单一，纯度均较高，可以进行下一步检测。

实施例3不同融合蛋白Protein LAG和Protein AG与不同种属的免疫球蛋白G亲和力测定

为了测定不同融合蛋白Protein LAG与免疫球蛋白的亲和力，通过ELISA的方法，将不同类型的Protein LAG进行包被，利用生物素化的不同种属IgG来结合这些ProteinLAG，最后使用HRP标记的链霉亲和素(SA-HRP)进行检测。通过酶标仪检测OD450读值的高低来评判亲和力的强弱。

1、生物素化IgG的制备

1.1使用1×PBS对不同种属免疫球蛋白(即人IgG、牛IgG、马IgG、鼠IgG、兔IgG)进行超滤浓缩，BCA法测定蛋白浓度，然后均稀释至2mg/ml。

1.2取150μl稀释后的不同种属免疫球蛋白溶液，分别加入7.5μl EZ-Link^TM NHS-LC-Biotin(10mM)储存液，室温放置60min，每隔10min震荡混匀10s，分别得到相应的反应后的混合物。

1.3分别将反应后的混合物在1×PBS中透析4h(2h时换一次PBS，继续透析2h)，得到透析后的生物素化IgG。

1.4 BCA测定透析后的生物素化IgG浓度，-20℃保存。

2、ELISA检测方法的具体步骤如下：

2.1包板：用0.05M碳酸盐缓冲液将Protein LAG稀释成10μg/ml，取100μl加入到透明的酶标板中，4℃过夜，同时设置3组平行实验。

2.2洗涤：弃掉步骤2.1中的包被液，加入300μl PBST(1×PBS含0.5％Tween20)，静置10-15s，重复3次。

2.3封闭：吸取150μl封闭液(PBST含0.5％BSA)加入步骤2.2的酶标板中，37℃孵育2h。

2.4结合：弃去步骤2.3的封闭液，洗涤3次，利用PBST(1×PBS含0.5％Tween20)稀释生物素化IgG(稀释倍数如表2所示)，取100μl稀释液加入到酶标板中，37℃孵育1.5h。

表2利用PBST稀释生物素化IgG的稀释倍数

2.5链霉亲和素与生物素反应：待步骤2.4反应完成后，酶标板洗涤3次，利用PBST将SA-HRP(0.5mg/ml)稀释1000倍，吸取100μl稀释好的SA-HRP加入酶标板中，37℃孵育30min。

2.6 TMB显色反应：待步骤2.5反应完成后，酶标板洗涤3次，吸取50μl TMB显色液加入到酶标板中，37℃反应5min。

2.7终止反应：吸取50μl的0.5mM硫酸加入酶标板中，终止显色反应，用酶标仪检测450nm处吸光度。

对Protein LAG(即Protein LAG-1，Protein LAG-2，Protein LAG-3，ProteinLAG-4，Protein LAG-5，Protein LAG-6，Protein LAG-7)和Protein AG与不同种属免疫球蛋白(即人IgG、牛IgG、马IgG、鼠IgG、兔IgG)的亲和力测试，结果如图3，Protein LAG对于不同种属免疫球蛋白均有极强的亲和力且强于Protein AG，与免疫球蛋白的亲和力表现为三个明显阶梯：Protein LAG-4远远高于其他Protein LAG，第二阶梯的Protein LAG-5、Protein LAG-2、Protein LAG-3亲和力基本相当，Protein LAG-5略优于Protein LAG-2、Protein LAG-3，第三阶梯Protein LAG-6与免疫球蛋白的亲和力要强于ProteinLAG-1、ProteinLAG-7，ProteinLAG-1、ProteinLAG-7略优于Protein AG。

实施例4 Protein LAG和Protein AG与不同亚型的免疫球蛋白亲和力测定

检测Protein LAG与人IgA、人IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG1五种不同亚型IgG的亲和力，检测方法参考实施例3。

结果如图4所示，Protein LAG-4对于五种不同亚型IgG(即人IgA、人IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG1)均有极强的亲和力，其次是Protein LAG-5、Protein LAG-2和Protein LAG-3，Protein LAG-5结合鼠IgG2a的能力略弱于Protein LAG-4，Protein LAG-6、Protein LAG-1、Protein LAG-7与五种不同亚型IgG的亲和力差别不大，ProteinLAG-6稍强一些。Protein LAG均可以有效结合人IgA，Protein LAG-4对人IgA的结合力明显优于其他融合蛋白，Protein AG结合人IgA的亲和力较弱。对于不同亚型免疫球蛋白亲和力，各种不同类型的Protein LAG优于Protein AG，尤其是Protein LAG-4优势更加明显。

实施例5 Protein LAG和Protein AG与不同种属免疫球蛋白G结合速率

为了探究Protein LAG和Protein AG与IgG分子的作用时间与结合效率的关系，利用ELISA检测方法进行检测，具体方法参考实施例3，主要区别在于：将“实施例3中步骤2.4结合”中37℃孵育的时间分别设置5min、10min、15min、30min、60min、90min，显色后利用酶标仪进行检测。

检测结果如图5所示，亲和力最强的Protein LAG-4与IgG孵育5min左右，OD值就达到了最大值的75％，且10min就已经饱和，相对略弱的Protein LAG-5、Protein LAG-2、Protein LAG-3、Protein LAG-6、Protein LAG-1也在相互作用15min后达到了饱和，其中最弱的Protein LAG-7 30min才达到吸光度最大值，但是结合速率优于Protein AG。

实施例6 Protein LAG和Protein AG与不同种属免疫球蛋白G结合的有效pH范围

为了探究Protein LAG和Protein AG与不同种属免疫球蛋白(即人IgG、牛IgG、马IgG、鼠IgG、兔IgG)的结合能力与pH的关系，利用ELISA检测方法进行检测，具体方法参考实施例3，主要区别在于：将“实施例3中步骤2.4结合”中PBST(1×PBS含0.5％Tween20)替换为在原有PBST配方的基础上调整pH为3、4、5、6、7、8、9、10的含0.5％Tween20的磷酸盐溶液。

结果如图6所示，可以看出不同融合蛋白Protein LAG(即Protein LAG-1，ProteinLAG-2，Protein LAG-3，Protein LAG-4，Protein LAG-5，Protein LAG-6，Protein LAG-7)最适pH均为7左右，其中Protein LAG-4表现出了更广泛的pH耐受，显著优于其他ProteinLAG，在pH 5-9的范围内均能保持良好的结合能力。Protein AG在不同pH下对不同种属免疫球蛋白的结合能力均弱于Protein LAG。

综上所述，本发明构建表达的Protein LAG对于不同种属、亚型的IgG均有极强的亲和力，与传统的Protein AG相比，结合IgG的效率更快，对pH的耐受性更宽，优势明显，在应用前景和应用范围上更为广阔。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 北京全式金生物技术有限公司

<120> 一种具有免疫球蛋白结合能力的融合蛋白

<130> JLC19I0943E

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 73

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val Thr Ile Lys

1 5 10 15

Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys

20 25 30

Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala Asp Thr

35 40 45

Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly

50 55 60

Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly

65 70

<210> 2

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn

1 5 10 15

Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp

20 25 30

Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn

35 40 45

<210> 3

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn

50

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ala Gln Ala Pro Lys

1 5

<210> 5

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr

1 5 10 15

Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr

20 25 30

Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr

35 40 45

Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

50 55

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Thr Pro Glu Thr Asp Ser

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Thr Pro Glu Thr Asp Ser Thr Pro Glu Thr Asp Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

1 5 10

<210> 13

<211> 219

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accccggaaa ccccggagac cgacagcgag gaagaggtta ccatcaaagc gaacctgatt 60

ttcgcgaacg gtagcaccca gaccgcggag ttcaagggca cctttgaaaa agcgaccagc 120

gaggcgtacg cgtatgcgga caccctgaag aaagataacg gcgagtacac cgtggacgtt 180

gcggataagg gttataccct gaacatcaaa tttgcgggc 219

<210> 14

<211> 528

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aacaaggacc agcaaagcgc gttttacgag atcctgaata tgccgaatct gaacgaagcg 60

cagcgtaacg gcttcattca aagcctgaaa gatgacccga gccagagcac caacgtgctg 120

ggcgaggcga agaaactgaa cgacgcgcag gcgccgaagg cggataataa gtttaataag 180

gagcaacaga atgcgttcta tgagattctg cacctgccga acctgaccga agagcaacgc 240

aatggtttca tccaaagcct gaaagacgat ccgagcgtga gcaaagagat tctggcggag 300

gcgaagaaac tgaatgtgag catgacctac aagctggtta ttaatggtaa aaccctgaag 360

ggtgaaacca ccaccaaggc ggtggatgcg gagaccgcgg aaaaggcgtt caagcaatat 420

gcgaatgaca acggcgtgga tggtgtttgg acctacgatg acgcgaccaa aacctttacc 480

gttaccgaga aactggcggc ggcgctggaa caccaccacc accaccac 528

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atatccatgg cgaccccgga aaccccggag accgacagc 39

<210> 16

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctttgctgg tccttgttgc taccgctgcc gctaccgccc gcaaatttga tgttcagg 58

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> GCTTT人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

catcaaattt gcgggcggta gcggcagcgg tagcaacaag gaccagcaaa gc 52

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tagcaagctt tcagtggtgg tgg 23

<210> 19

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctttgctgg tccttgttct ccggggtttc cggggtgccc gcaaatttga tgttcagg 58

<210> 20

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

catcaaattt gcgggcaccc cggaaacccc ggagaacaag gaccagcaaa gc 52

<210> 21

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gctaccgctg ccgctaccgc tgccgctacc gcccgcaaat ttgatgttca gg 52

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggtagcggca gcggtagcgg cagcggtagc aacaaggacc agcaaagc 48

<210> 23

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gctttgctgg tccttgttct ccggggtttc cggggtctcc ggggtttccg gggtgcccgc 60

aaatttgatg ttcagg 76

<210> 24

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

catcaaattt gcgggcaccc cggaaacccc ggagaccccg gaaaccccgg agaacaagga 60

ccagcaaagc 70

<210> 25

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gctaccaccg ccgccgcttc caccgccacc gcccgcaaat ttgatgttca gg 52

<210> 26

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggtggcggtg gaagcggcgg cggtggtagc aacaaggacc agcaaagc 48

<210> 27

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcttccaccg cctccgctgc caccgccgcc gcttccaccg ccaccgcccg caaatttgat 60

gttcagg 67

<210> 28

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggtggcggtg gaagcggcgg cggtggcagc ggaggcggtg gaagcaacaa ggaccagcaa 60

agc 63

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gctttgctgg tccttgttgc ccgcaaattt gatgttcagg 40

<210> 30

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

catcaaattt gcgggcaaca aggaccagca aagc 34

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atatccatgg cgaacaagga ccagcaa 27

Claims

1.一种具有免疫球蛋白结合能力的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包括依次连接的Protein L的B1结构域、Protein A的D结构域、Protein A的C结构域和Protein G的G3结构域，所述Protein L的B1结构域和Protein A的D结构域通过短肽连接，所述Protein A的D结构域和Protein A的C结构域通过SEQ ID No.4所示的氨基酸序列连接，所述ProteinA的C结构域和Protein G的G3结构域通过短肽VSM连接；所述短肽为如下任一种：

1)SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；

2)SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；

3)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；

4)SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；

5)SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；

6)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白还包括在所述融合蛋白的N端或/和C端连接的蛋白标签。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：

所述Protein L的B1结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述Protein A的D结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述Protein A的C结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述Protein G的G3结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.一种DNA，其特征在于：所述DNA分子编码权利要求1-3任一所述的融合蛋白。

5.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体含有权利要求4所述的DNA分子。

6.一种转化体，其特征在于：所述转化体含有权利要求4所述的DNA分子或权利要求5所示的重组载体。

7.一种制备权利要求1-3任一所述融合蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括培养权利要求6所述的转化体，以产生所述融合蛋白。

8.权利要求1-3任一所述融合蛋白在分离和/或纯化免疫球蛋白中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述免疫球蛋白选自人IgG、牛IgG、马IgG、鼠IgG、兔IgG、人IgA、人IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG1中至少一种。