CN110950927A

CN110950927A - 一种促进软骨再生的肽ggs11及其应用

Info

Publication number: CN110950927A
Application number: CN201911230639.8A
Authority: CN
Inventors: 宋燕; 许元生; 张时群; 卢肖宇
Original assignee: Dr August Wolff GmbH and Co KG Arzneimittel
Current assignee: Dr August Wolff GmbH and Co KG Arzneimittel
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-12-04
Also published as: CN110950927B

Abstract

本发明公开了一种促进软骨再生的肽GGS11，其与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有9/11以上的序列一致性。本发明提供的一种来源于IGF‑1且能够显著促进软骨再生的多肽GGS11，其长度为11个氨基酸，具有效应强、易于合成、免疫原性低等优点，因此，本发明的多肽GGS11在软骨损伤和骨关节炎治疗中具有广阔的应用前景。

Description

一种促进软骨再生的肽GGS11及其应用

技术领域

本发明涉及多肽技术领域，尤其是一种促进软骨再生的肽GGS11及其在制备修复软骨和/或治疗骨关节炎的药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的关节疾病，表现为关节疼痛、僵硬，软骨损伤是导致骨关节炎的主要成因。本病在中年以后多发，女性多于男性，40岁人群的患病率为10％-17％，60岁以上为50％，而在75岁以上人群则高达80％。该病致残率可高达53％。而随着人口的日益老龄化，骨关节炎将成为影响人们生活质量的重要问题，骨关节炎药物市场需求将不断扩大。

目前，临床上对于骨关节炎的治疗药物分为特异性治疗药物与非特异性治疗药物。非特异性治疗药物以镇痛和控制症状为主，但对软骨没有保护作用，如非甾体抗炎药等。特异性治疗药物可保护关节软骨，延缓骨关节炎进展，如氨基葡萄糖、硫酸软骨素等，但一般起效较慢，需治疗数月才见效，而且对受损软骨的再生没有作用。因此，开发一种安全性好、疗效突出的新型骨关节炎治疗药物成为医学界的一大目标。

如上文所述，软骨损伤是导致骨关节炎的主要成因，关节软骨是由丰富的细胞外基质(ECM)和嵌于其中的少数软骨细胞所组成。软骨细胞的代谢受到许多细胞因子的调节，如胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)等。IGF-1是由肝脏分泌的、70个氨基酸残基组成的多肽，是软骨合成代谢的主要因子。IGF-1能够保持软骨细胞在正常软骨中的代谢动态平衡，刺激软骨细胞分裂增殖，并促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖，来维持软骨细胞表型(参见非专利文献1)。研究表明，IGF-1能定向诱导干细胞向软骨细胞方向分化(参见非专利文献2)，是比转化生长因子β2(transforming growthfactors β2，TGF-β2)和成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF-2)更强的效应分子。

参考文献：

非专利文献1：Langdahl BL,Kassem M,Moller MK,et al.The effects of IGF-1and IGF-11 on proliferation and differentiation of human osteoblasts andinteractions with growth hormone.Eur J Glin Invest,1998,28(3):176-183.

非专利文献2：付勤等.外源性TGF-β1及IGF-1诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究.中国骨质疏松杂志,2007,13(12):848-853.

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可促进软骨再生的肽GGS11，其用于治疗软骨损伤或骨关节炎效果显著，安全性高。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种促进软骨再生的肽GGS11，其与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有9/11以上的序列一致性。

优选地，肽GGS11的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中，促进软骨再生的肽包括但不限于与SEQ ID NO.1所示的氨基酸，还可以是与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比具有9/11、10/11或11/11序列一致性且能促进软骨再生的多肽。

优选地，肽GGS11的羧基端具有酰胺化或羰基化修饰，更优选酰胺化修饰。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供了上述肽GGS11在制备治疗软骨损伤或/和骨关节炎的药物中的应用。

作为本发明的又一个方面，本发明提供了一种治疗软骨损伤或/和骨关节炎的药物，其中含有上述的肽GGS11。需要说明的是，药物中肽GGS11还可以是肽的醋酸盐、盐酸盐或磷酸盐，优选为醋酸盐。

优选地，所述药物中还含有透明质酸或非甾体抗炎药。

优选地，所述药物的有效剂量为每次1～5mg。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体，载体优选为盐水溶液或胶体溶液。其中，药物可通过注射给药，优选膝关节腔注射或皮下注射。

优选地，所述胶体溶液为透明质酸凝胶。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种来源于IGF-1且能够显著促进软骨再生的多肽GGS11，其长度为11个氨基酸，具有效应强、易于合成、免疫原性低等优点，因此，本发明的多肽GGS11在软骨损伤和骨关节炎治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为肽GGS11固相合成的HPLC检测结果图；

图2为肽GGS11对Ⅱ型胶原(COL2A1)mRNA表达的作用结果图，其中通过定量PCR检测COL2A1 mRNA的相对表达量，以PBS为阴性对照，人胰岛素样生长因子1(IGF-1)为阳性对照；

图3为肽GGS11对蛋白多糖(ACAN)mRNA表达的作用结果图，其中通过定量PCR检测ACAN mRNA的相对表达量，以PBS为阴性对照，IGF-1为阳性对照；

图4为肽GGS11对大鼠软骨细胞增殖的作用结果图，其中通过MTS法测量细胞增殖，以PBS为阴性对照，IGF-1为阳性对照；

图5为肽GGS11处理软骨细胞的COL2A1免疫组化结果图；

图6为肽GGS11对斑马鱼受损软骨的修复作用结果图；

图7为肽GGS11对斑马鱼受损软骨的修复作用的照片，其中A)为正常对照组；B)为模型对照组；C)为阳性对照组；D)为GGS11低剂量组；E)为GGS11中剂量组；F)为GGS11高剂量组；

图8为肽GGS11对治疗大鼠OA模型的病理评分结果图。

具体实施方式

在一些实施例中，本发明提供了一种肽GGS11，其是来源于胰岛素样生长因子1(IGF-1)的片段，肽GGS11具有促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞和促进软骨细胞增殖的活性，可以用于软骨修复和/或治疗骨关节炎。本发明促进软骨修复的肽GGS11的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应当指出的，对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做出许多变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。如无特别说明，本发明中的试剂、材料均可从市场上或其它公开渠道获得。

实施例1肽GGS11的固相合成

肽GGS11(SEQ ID NO.1)采用常规固相工艺合成，合成的肽纯度＞95％(见图1)，合成500mg。

实施例2肽GGS11体外对间充质干细胞分化的作用

1)人间充质干细胞的培养和传代：将人骨髓间质干细胞(BMSCs，购自广州赛业生物科技有限公司)复苏，加入完全培养基，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。复苏后的第二天，给复苏的细胞换用新鲜的完全培养基，每两天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80％-90％的汇合度，然后进行传代培养。

2)成软骨诱导：将肽GGS11用磷酸缓冲液(PBS)溶解。用含不同浓度的肽GGS11(0.1、1和10μM)的完全成软骨培养基重悬细胞，使得BMSCs的浓度为每毫升5.0×10⁵个细胞。并以PBS为阴性对照，1μM人胰岛素样生长因子1(IGF-1)为阳性对照。

处理的BMSCs置于37℃，5％CO₂饱和湿度条件下孵育。每2-3天更换培养基，每管加入0.5mL新鲜完全成软骨培养基。

3)qPCR检测：收集细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录得cDNA，反应条件为：30℃保温10分钟；42℃保温60分钟；85℃保温10分钟。

以cDNA为模板，利用下表1中引物，对II型胶原(Col2A1)和蛋白聚糖(Aggrecan，Acan)进行定量PCR，反应条件为：50℃2分钟；95℃2分钟；95℃15秒，60℃32秒读板，40个循环。

表1引物对

COL2A1-F1	CAAGAACAGCATTGCCTATC	SEQ ID NO.2
			COL2A1-R1	ATAACAGTCTTGCCCCACTT	SEQ ID NO.3
ACAN-F1	TGGGTCTGGAGTAGAAGTATCA	SEQ ID NO.4
			ACAN-R1	GTTAGCTTCGTGGAATGCA	SEQ ID NO.5
β-actin-F1	TGGATCAGCAAGCAGGAGTA	SEQ ID NO.6
			β-actin-R1	TCGGCCACATTGTGAACTTT	SEQ ID NO.7

4)结果与分析

结果如图2和3所示，肽GGS11对COL2A1和ACAN基因表达均具有显著的促进作用；0.1、1和10μM的肽GGS11均可显著促进COL2A1和ACAN的mRNA表达量增加，并表现出明显的量效关系和时效关系(见图2、图3)，说明肽GGS11促进间充质干细胞向软骨细胞的分化。

实施例3肽GGS11对软骨细胞增殖的作用

1)软骨细胞培养：无菌条件下切取2月龄新西兰大白兔关节软骨，剪成1mm大小，37℃下分别以2mg/ml透明质酸酶消化45分钟、2mg/ml胰蛋白酶消化45分钟、4mg/ml的Ⅱ型胶原酶消化3小时，冲洗离心(1500r/分钟)5分钟，将沉淀物置入含15％胎牛血清DMEM培养基中进行培养。

2)软骨细胞的鉴定：取少量原代软骨细胞涂片后用I型胶原抗体SABC免疫检测，染成棕黄色，说明分泌I型胶原，证实为软骨细胞。

3)MTS法测软骨细胞增殖：软骨细胞按照2×10⁴个/孔接种于96孔板，加入不同浓度肽GGS11(0.01、0.1、1和10μM)，并以PBS为阴性对照组，IGF-1(1μM)为阳性对照组，37℃、5％CO₂的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养5天。每孔加20μl MTS混合液，继续培养3-4小时显色。检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm处检测各孔的光吸收值(OD)。

4)免疫组化测COL2A1：软骨细胞以3.5×10⁵/ml接种于放置有盖玻片的6孔培养板中，加入不同浓度肽GGS11(0.01、0.1、1和10μM)，并以PBS为阴性对照组，IGF-1(1μM)为阳性对照组。37℃、5％CO₂的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养5天。处理的软骨细胞以4％多聚甲醛固定24～36小时，切成合适大小材料，进行石蜡包埋。蜡块切成5μm厚的切片，经二甲苯脱蜡后，PBS洗3次，每次5分钟。于微波炉中高火加热至沸腾，低火维持沸腾继续加热8分钟(柠檬酸抗原修复液)，待水温自然降至室温。PBS洗3次，每次5分钟；10％山羊血清室温封闭30分钟；一抗4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5分钟；二抗室温孵育30分钟，PBS洗3次，每次5分钟；DAB显色，PBS洗3次，每次5分钟；苏木素复染，水洗去多余染液，分化数秒。水洗，返蓝。50％、75％、85％、95％和100％乙醇梯度脱水各1次，二甲苯透明2次，每次5分钟。中性树胶封片。

5)结果与分析

5.1肽GGS11对软骨细胞增殖的促进作用

不同浓度的肽GGS11处理5天后，与PBS组相比，0.1、1和10μM的肽GGS11显著促进软骨细胞的增殖，且量效关系明显(见图4)。

5.2肽GGS11对COL2A1表达的促进作用

与PBS处理组相比，0.1、1和10μM的肽GGS11处理组的COL2A1免疫组化染色明显增加，表明COL2A1蛋白表达量显著提高，1μM时达到最高(见图5)。

综合以上结果，说明肽GGS11在体外可以促进软骨细胞增殖及II型胶原蛋白的表达。

实施例4肽GGS11对斑马鱼软骨损伤模型的修复作用

随机选取受精后2天的转基因软骨荧光斑马鱼于六孔板中，每孔(即每浓度组)30尾斑马鱼，水溶给予地塞米松建立斑马鱼软骨损伤模型。模型斑马鱼分别静脉注射给予生理盐水溶解的肽GGS11，剂量为20、100、500ng/尾，水溶给予阳性对照药硫酸软骨素1000μg/mL浓度，同时设置正常对照组(给予生理盐水)和模型对照组(给予生理盐水)，每孔容量为3mL，28℃培养箱孵育72小时。实验结束后，每组随机选取10尾斑马鱼在显微镜下观察、拍照并保存图片，用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件，测定斑马鱼软骨荧光强度、斑马鱼角舌骨和Meckel’s软骨的长度和角度。软骨再生作用计算公式如下：

用T检验进行统计学分析，统计学处理结果用

表示，p<0.05表明具有显著性差异。

结果与分析

与模型对照组相比，中、高剂量(分别为100、500ng/尾)的GGS11处理，均显示出明显的软骨修复作用，表现为GGS11中、高剂量组的斑马鱼的荧光明显强于模型对照组(**P＜0.01)，且量效关系明显(见图6、图7、表2)，提示肽GGS11有促进受损软骨再生的作用。

表2 GGS11对斑马鱼软骨损伤的治疗作用

正常对照组	899032±37936
		模型对照组	573260±51879
GGS11低剂量组	638424±42568
		GGS11中剂量组	760245±32442**
GGS11高剂量组	863569±62836**
		阳性对照组	878931±69391**

注：**代表与模型对照相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

实施例5肽GGS11对大鼠骨关节炎(OA)模型的作用

1)建模：采用手术切断前交叉韧带(ACLT)联合半月板切除(MMT)的方法，建立大鼠OA模型，具体操作如下：SD大鼠肌注一定剂量的抗生素(庆大霉素，20mg/kg)，皮下注射阿托品(0.05mg/kg)，1.5-3.0％异氟烷用于维持手术中麻醉。动物麻醉后，对一侧(右侧)膝关节进行备毛，并用碘伏清洁消毒，做好手术准备。股骨-胫骨关节内侧将被切开，通过钝性分离显露内侧半月板，并在半月板最窄的处进行全厚度切割，同时切断前交叉韧带，完成后关节复位，缝合膝关节肌肉、韧带及皮肤，并对术部消毒。所有动物术后连续3天给予一定量的镇痛剂痛立定(4％托芬那酸，0.1mg/kg，i.m.)，每日一次。所有动物手术结束后给予一定量的抗生素(庆大霉素，20mg/kg，i.m.)。麻醉恢复期动物允许自由的活动及完全负重，动物实验人员在麻醉恢复期须密切监控所有动物。

2)治疗：手术后两周，成模动物随机分为正常对照组、模型对照组、肽GGS11低、中、高剂量组，分别给予生理盐水、生理盐水、0.2mg、1mg、5mg的肽GGS11，给药方式为右后肢膝关节腔注射，给药体积为50μl。

3)检测：给药治疗28天后，动物安乐死，取所有组右膝关节及模型组左膝关节，10％NBF固定48小时以上，甲酸脱钙，石蜡包埋，冠状面切片，H&E和Safranin-O染色；由专业病理师对切片进行退行性改变评分(软骨退变，骨赘，软骨钙化和软骨下骨损伤的数量和程度，滑膜炎症的数量)，评分标准参考Osteoarthritis Research Society International(OARSI)scoring system。

4)统计分析：利用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.)或PASWStatistics18.0(SPSS Inc.)进行数据分析。当P<0.05认为有显著性差异。

5)结果与分析：与模型对照组相比，肽GGS11各治疗组OA评分均下降，且量效关系明显，其中的中、高剂量组有统计学意义(见图8、表2)，提示肽GGS11对大鼠OA模型有治疗作用。

表2 GGS11对大鼠OA的治疗作用(OARSI评分)

正常对照组	模型对照组	GGS11低剂量组	GGS11中剂量组	GGS11高剂量组
					2.8±0.5	32.1±6.6	26.8±4.5	16.3±4.3**	12.6±3.6**

注：**代表与模型对照相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州领晟医疗科技有限公司

<120> 一种促进软骨再生的肽GGS11及其应用

<130> 2019

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caagaacagc attgcctatc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ataacagtct tgccccactt 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgggtctgga gtagaagtat ca 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttagcttcg tggaatgca 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tggatcagca agcaggagta 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcggccacat tgtgaacttt 20

Claims

1.一种促进软骨再生的肽GGS11，其与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有9/11以上的序列一致性。

2.权利要求1所述的肽GGS11，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述的肽GGS11，其羧基端具有酰胺化或羰基化修饰，优选酰胺化修饰。

4.权利要求1或2所述的肽GGS11在制备治疗软骨损伤或/和骨关节炎的药物中的应用。

5.一种治疗软骨损伤或/和骨关节炎的药物，其中含有权利要求1或2的肽GGS11。

6.权利要求5所述的药物，其中还含有透明质酸或非甾体抗炎药。

7.权利要求5所述的药物，其有效剂量为每次1～5mg。

8.权利要求5所述的药物，其还包括药学上可接受的载体，载体为盐水溶液或胶体溶液。

9.权利要求5所述的药物，其中所述胶体溶液为透明质酸凝胶。