CN110944672A - 用于改善载物分子向靶细胞的内溶酶体区室递送的内溶酶体靶向偶联物 - Google Patents

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Abstract

描述了内溶酶体靶向偶联物，其经工程化以递送载物分子，例如细胞毒性药物或成像标记物，对靶细胞如肿瘤细胞中的晚期内体和/或溶酶体具有改善的效率。内溶酶体靶向偶联物包括靶向组分和载物组分。靶向组分配置为结合靶细胞的细胞表面分子，并且载物组分包括载物分子。靶向组分和载物组分可以通过共价键融合或通过非共价键缔合。靶向组分可以在细胞外空间中以比靶细胞的内溶酶体区室中更高的亲和力结合细胞表面分子或载物组分。

Description

用于改善载物分子向靶细胞的内溶酶体区室递送的内溶酶体 靶向偶联物
发明领域
本文公开的发明一般涉及工程化蛋白质的产生，所述工程化蛋白质可用作将细胞毒性药物、成像标记物或其他载物分子递送至靶细胞(例如肿瘤细胞)的平台。这些蛋白质被设计成更有效地将载物分子递送至靶细胞中的晚期内体和溶酶体。
背景技术
抗体-药物偶联物(ADC)或蛋白质-药物偶联物(PDC)代表一类治疗剂，其将抗体、抗体片段或与癌细胞或其他不需要的细胞(例如炎性或病毒感染的细胞)结合的其他蛋白质的高特异性与高毒性药物的递送相结合。当前ADC或PDC的问题在于它们具有毒性，导致剂量限制。然而，允许更有效地将细胞毒性药物递送至肿瘤细胞的ADC和PDC的开发仍然具有挑战性。
另外，抗体、抗体片段或其他靶向蛋白可以用放射性标记物、荧光标记物或近红外标记物进行标记，用作诊断成像中的标记偶联物(LC)。然而，允许更有效地标记与背景组织具有更高对比度的肿瘤的LC的开发也仍然具有挑战性。
发明内容
本公开涉及工程化蛋白质，其在本文中称为内溶酶体靶向偶联物，其被配置为允许改善载物分子(例如细胞毒性药物(例如，在ADC或PDC中)或成像标记物(例如，在LC中)递送至靶细胞(例如癌细胞或其他细胞类型)中的内溶酶体途径。
根据第一方面，描述了内溶酶体靶向偶联物。内溶酶体靶向偶联物具有靶向组分，其包括抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白结构域，其中靶向组分被配置为与靶细胞的内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更低的解离常数结合靶细胞的细胞表面分子。内溶酶体靶向偶联物还具有载物组分，其包括与抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白结构域偶联的载物分子。靶向组分与载物组分直接或间接融合。在进入内溶酶体区室后，靶向组分被配置为与细胞表面分子解离。内溶酶体靶向偶联物被配置为将载物分子递送至靶细胞的内溶酶体区室。
根据第二方面，描述了内溶酶体靶向偶联物。内溶酶体靶向偶联物具有靶向组分，其包括抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白结构域，其中靶向组分被配置为结合靶细胞的细胞表面分子。内溶酶体靶向偶联物还具有载物组分，其包括与抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白结构域偶联的载物分子。靶向组分被配置为与靶细胞的内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更低的解离常数结合载物组分。在进入内溶酶体区室后，靶向组分被配置为与载物组分解离。内溶酶体靶向偶联物被配置为将载物分子递送至靶细胞的内溶酶体区室。
根据第三方面，描述了一种组合物。该组合物包括内溶酶体靶向偶联物和药学上可接受的运载体。
根据第四方面，描述了治疗癌症的方法。该方法包括给予对象有效剂量的内溶酶体靶向偶联物组合物，其中载物分子是细胞毒性药物，并且给予组合物可抑制对象中肿瘤的生长。
根据第五方面，描述了一种在对象中进行肿瘤成像的方法。该方法包括以下步骤：(1)给予对象有效剂量的内溶酶体靶向偶联物组合物，其中，载物分子是成像标记物；(2)执行适合于检测对象中的成像标记物的成像方法。给予组合物提供了通过成像方法可检测的足够浓度的成像标记物。
根据第六方面，描述了提供用于治疗癌症的内溶酶体靶向偶联物的方法。该方法包括以下步骤：(1)选择靶向组分，其中靶向组分包括被配置为选择性结合选定类型的肿瘤靶细胞上的细胞表面分子的抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白结构域，其中靶向组分被配置为与内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更低的解离常数结合细胞表面分子；(2)选择载物组分，其中载物组分包括与载物分子偶联的抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白结构域，其中载物分子是具有抑制所选类型的肿瘤靶细胞生长功效的细胞毒性药物；(3)提供包含与载物组分直接或间接融合的靶向组分的内溶酶体靶向偶联物。
根据第七方面，描述了提供用于治疗癌症的内溶酶体靶向偶联物的方法。该方法包括以下步骤：(1)选择靶向组分，其中靶向组分包括被配置为选择性结合选定类型的肿瘤靶细胞上的细胞表面分子的抗体、抗体片段、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白结构域；(2)选择载物组分，其中载物组分包括与载物分子偶联的抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白结构域，其中载物分子是具有抑制所选类型的肿瘤靶细胞生长功效的细胞毒性药物。在该方法中，靶向组分经工程化以进一步包括第一蛋白结构域；载物组分经工程化以进一步包括第二蛋白结构域；并且第一蛋白结构域被配置为与内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更低的解离常数与第二结构域结合。
上述内溶酶体靶向偶联物和方法可以进一步包括以下细节，除非明确相互排斥，否则它们可以彼此组合：
i)靶向组分可包括抗体、抗体片段或纳米抗体，其被配置为在细胞外空间中以小于500nM的解离常数结合细胞表面分子；
ii)靶向组分可包括抗体、抗体片段或纳米抗体，其被配置为与酸性内溶酶体pH相比在近中性的pH下以更低的解离常数结合细胞表面分子；
iii)近中性pH可大于约pH 6.8且小于约pH 7.5，酸性内溶酶体pH可大于约pH 5.0且小于约pH 6.5；
iv)靶向组分可包括抗体、抗体片段或纳米抗体，其被配置为与内溶酶体Ca2+浓度相比在细胞外Ca2+浓度下以更低的解离常数结合细胞表面分子；
v)细胞外Ca2+浓度可为约2mM，内溶酶体Ca2+浓度可为约2μM；
vi)靶向组分可包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为在细胞外空间中以小于500nM的解离常数结合细胞表面分子；
vii)靶向组分可包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为与酸性内溶酶体pH相比在近中性的pH下以更低的解离常数结合细胞表面分子；
viii)靶向组分可包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为与内体Ca2+浓度相比在细胞外Ca2+浓度下以更低的解离常数结合细胞表面分子；
ix)载物组分可包括抗体、抗体片段，其可以是抗体Fc区域或抗体Fc片段的结构域；
x)抗体Fc区域或抗体Fc片段的结构域可源自人IgG1；
xi)载物组分可包括白蛋白分子或白蛋白的结构域；
xii)靶向组分可包括HER2特异性抗体的Fab片段或scFv片段，其中Fab片段或scFv片段的重链可变结构域具有Ser55至组氨酸和Gly57至谷氨酸的突变；
xiii)靶向组分可包括HER2特异性抗体的Fab片段或scFv片段，其中Fab片段或scFv片段中重链可变结构域具有Ser103至组氨酸的突变，轻链可变结构域具有Tyr55至组氨酸的突变；
xiv)内溶酶体靶向偶联物可包括至少第一靶向组分和第二靶向组分，其中第一靶向组分被配置为与第二靶向组分结合不同的细胞表面分子；
xv)所述至少第一和第二靶向组分可与两个免疫球蛋白Fc片段的异二聚体融合；
xvi)靶向组分可包括磷脂酰丝氨酸结合蛋白，靶细胞可以是细胞表面上具有磷脂酰丝氨酸的细胞；
xvii)磷脂酰丝氨酸结合蛋白可选自AnxA1的核心结构域，Syt1的C2A结构域和PKCα的C2结构域；
xviii)磷脂酰丝氨酸结合蛋白可以是Syt1的C2A结构域；
xix)靶向组分可包括两个Syt1的C2A结构域；
xx)靶向组分可包括四个Syt1的C2A结构域；
xxi)靶向组分可包括超过四个Syt1的C2A结构域；
xxii)靶向组分可包括磷脂酰丝氨酸结合蛋白，载物组分可包括人IgG1的Fc部分，靶向组分可通过接头蛋白与载物组分共价融合；
xxiii)接头蛋白可以是Gly4Ser接头；
xxiv)载物分子可以是细胞毒性药物；
xxv)细胞毒性药物可以是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)；
xxvi)载物分子可以是成像标记物；
xxvii)靶向组分可被配置为与酸性内体pH相比在近中性pH下以更低的解离常数结合载物组分；
xxviii)靶向组分可被配置为与内体Ca2+浓度相比在细胞外Ca2+浓度下以更低的解离常数结合载物组分；
xxix)靶向组分可包括钙结合蛋白D9K结构域2，载物组分可包括钙结合蛋白D9K结构域1；
xxx)钙结合蛋白结构域1D9K可以通过接头肽与载物组分融合和/或钙结合蛋白D9K结构域2可以通过接头肽与靶向组分融合；
xxxi)组合物可包括至少一种内溶酶体靶向偶联物，其被配置为靶向一种或多种类型靶细胞的肿瘤；
xxxii)载物分子可通过多肽接头或通过化学偶联反应与抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域偶联；
xxxiii)成像标记物可以是放射性标记物、荧光标记物或近红外标记物；
xxxiv)靶向组分的N端可融合到载物组分的C端；
xxxv)靶向组分的C端可融合到载物组分的N端；
xxxvi)靶向组分可以在载物组分的非末端位置与载物组分融合；
xxxvii)载物组分可包括免疫球蛋白Fc片段，靶向组分可以在免疫球蛋白Fc片段的铰链-CH2-CH3结构域的N端或C端与载物组分的免疫球蛋白Fc片段融合；
xxxviii)靶向组分可包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为结合人表皮生长因子受体2；
xxxix)靶向组分可包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为结合前列腺特异性膜抗原；
xl)内溶酶体靶向偶联物可包括一种或多种具有以下至少一种的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQ IDNO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQ IDNO:48,或其同源物；
xli)内溶酶体靶向偶联物可包括具有以下氨基酸序列的蛋白质的异二聚体：SEQID NO:2加SEQ ID No:4,SEQ ID NO:6加SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:42加SEQ ID NO:44,或SEQ ID NO:46加SEQ ID NO:48,或其同源物；
xlii)内溶酶体靶向偶联物可包括具有以下氨基酸序列的蛋白质的异三聚体：SEQID NO:18加SEQ ID NO:20加SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:22加SEQ ID NO:24加SEQ ID NO:26,或其同源物；
xliii)靶向组分可包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为在酸性pH下以大于1.5μM的解离常数结合细胞表面分子；
xliv)靶向组分可包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为在酸性pH下以大于1.5μM的解离常数结合细胞表面分子；
xlv)酸性pH可为约5.8；
xlvi)靶向组分可包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为与pH值为约5.0至约6.5相比在pH值为约6.8至约7.5时以更低的解离常数结合细胞表面分子；
xlvii)靶向组分可包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为与Ca2+浓度为约2μM相比在Ca2+浓度为约2mM下以更低的解离常数结合细胞表面分子；
xlviii)靶向组分可包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为与pH值为约5.0至约6.5相比在pH值为约6.8至约7.5时以更低的解离常数结合细胞表面分子；
xlix)靶向组分可包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为与Ca2+浓度为约2μM相比在Ca2+浓度为约2mM下以更低的解离常数结合细胞表面分子；
xlx)靶向组分可被配置为与pH值为约5.0至约6.5相比在pH值为约6.8至约7.5时以更低的解离常数结合载物组分；
xlxi)靶向组分可被配置为与Ca2+浓度为约2μM相比在Ca2+浓度为约2mM下以更低的解离常数结合载物组分；
xlxii)载物分子可以是细胞毒性放射性标记物；
xlxiii)载物分子可以是改变靶细胞行为的药物或其他试剂。
附图说明
为了更完整地理解本发明及其特征和优点，现在结合附图参考以下描述，这些附图未按比例绘制，其中相同的数字表示相同的特征，并且其中：
图1是选择的细胞事件的示例性示意图，其显示通过内溶酶体靶向偶联物将载物分子递送到晚期内体和溶酶体中；
图2是选择的细胞事件的示例性示意图，其显示在内体中内溶酶体靶向偶联物中的载物组分和靶向组分发生解离，然后将载物组分递送到晚期内体和溶酶体中；
图3A是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体的抗体；
图3B是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体的抗体scFv-Fc融合蛋白；
图3C是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体的抗体可变结构域/抗体可变结构域片段-Fc融合蛋白；
图3D是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体的与免疫球蛋白铰链和CH3结构域的N端位置融合的Fab片段；
图3E是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体的与免疫球蛋白铰链和CH3结构域的N端位置融合的scFv片段；
图3F是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体的与免疫球蛋白铰链和CH3结构域的N端位置融合的抗体可变结构域/抗体可变结构域片段；
图3G是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体的与白蛋白融合的抗体可变结构域/抗体可变结构域片段；
图3H是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体的与白蛋白融合的抗体Fab片段；
图3I是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体的与白蛋白融合的抗体scFv片段；
图3J是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与Fc片段的N端位置融合的蛋白质、蛋白质结构域或片段。该蛋白质、蛋白质结构域或蛋白质片段与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体；
图3K是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与Fc片段的C端位置融合的蛋白质、蛋白质结构域或片段。该蛋白质、蛋白质结构域或蛋白质片段与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体；
图3L是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与Fc片段的N端和C端位置融合的蛋白质、蛋白质结构域或片段。该蛋白质、蛋白质结构域或蛋白质片段与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体；
图3M是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与Fc片段的N端和C端位置融合的蛋白质、蛋白质结构域或蛋白质片段，以形成每个Fc片段具有两个蛋白质结构域或片段分子的异二聚体。该蛋白质、蛋白质结构域或蛋白质片段与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体；
图3N是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括与Fc片段的C端位置融合的蛋白质、蛋白质结构域或蛋白质片段，以形成每个Fc片段具有一个蛋白质、蛋白质结构域或片段分子的异二聚体。该蛋白质、蛋白质结构域或蛋白质片段与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合细胞表面蛋白或细胞表面受体；
图3O是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括设计为与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)相互缔合的Fab-蛋白质(结构域)和蛋白质(结构域)-Fc融合体；
图3P是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括设计为与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)相互缔合的scFv片段-蛋白质(结构域)和蛋白质(结构域)-Fc融合体；
图3Q是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括设计为与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)相互缔合的抗体可变结构域-蛋白质(结构域)和蛋白质(结构域)-Fc融合体；
图3R是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括包含两个不同的Fab片段的抗体，这两个不同的Fab片段与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合两种或多种细胞表面受体或细胞表面分子；
图3S是示例性内溶酶体靶向偶联物的示意图，其包括包含两个不同的scFv片段的抗体，这两个不同的scFv片段与酸性内体pH(或在较低的内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力(更低的解离常数)结合两种或多种细胞表面受体或细胞表面分子；
图4A显示了在不同pH值下示例性HER2靶向内溶酶体靶向剂(没有偶联药物)与HER2的结合分析的示例性数据；
图4B显示了在不同pH值下示例性HER2靶向内溶酶体靶向剂(没有偶联药物)与HER2的解离常数的示例性数据；
图5A显示了不同肿瘤细胞系上HER2表达水平的流式细胞术分析的示例性数据的图；
图5B显示了不同肿瘤细胞系中示例性HER2靶向内溶酶体靶向偶联物的内化和积累的流式细胞术分析的示例性数据的图；
图5C显示了一系列示例性显微图像，其比较了示例性HER2靶向内溶酶体靶向偶联物在葡聚糖阳性溶酶体中的定位；
图6显示了报道HER2靶向内溶酶体靶向偶联物和对照MMAE偶联物对肿瘤细胞活力的影响的示例性数据的图；
图7A显示了报道小鼠中示例性HER2靶向内溶酶体靶向偶联物的示例性全身计数和血液计数随时间的变化的图；
图7B显示了报道示例性HER2靶向内溶酶体靶向偶联物和对照蛋白对小鼠中肿瘤生长(MDA-MB-453细胞)的影响的示例性数据的图；
图8A显示了示例性HER2靶向融合蛋白的相互作用的示例性结合数据，所述融合蛋白包含分别与抗体Fab(HER2特异性)和Fc片段融合的钙结合蛋白结构域2和1；
图8B显示了前列腺癌细胞中的示例性前列腺特异性膜抗原(PSMA)靶向抗体的内化和积累的流式细胞术分析的示例性数据的图，所述靶向抗体包含分别与抗体Fab(026，PSMA特异性)和Fc片段融合的钙结合蛋白结构域2和1；
图9显示了报道示例性PS靶向Fc融合蛋白的示例性凝胶过滤色谱分析的图；
图10A显示了示例性PS靶向剂(包含与PS靶向蛋白,AnxA1,突触结合蛋白1(Syt1)的C2A结构域和PKCα连接的人IgG1衍生的Fc的Fc融合体)的示意图和分析。填充的圆和矩形分别表示PS靶向结构域和IgG1铰链区。右图显示了内溶酶体靶向剂的SDS-PAGE分析，左侧以kDa表示分子量(MW)；
图10B显示了使用脂质包被的硝酸纤维素膜的示例性PS靶向剂的示例性脂质结合分布图；
图10C显示了报道使用流式细胞术分析示例性PS靶向剂与PS阳性2H11和MDA-MB-231细胞的示例性结合的图；
图10D显示了报道示例性PS靶向剂的示例性全身计数与时间的图；
图10E显示了报道示例性PS靶向剂在图10D中所示数据的示例性曲线下面积的图；
图10F显示了用具有近红外染料(IRDye800CW)标记的示例性PS靶向剂注射的荷瘤小鼠的示例性全身图像；
图10G显示了报道图10F中所示图像的具有近红外染料(IRDye800CW)标记的示例性PS靶向剂的示例性肿瘤相关荧光的图；
图10H显示了肿瘤的示例性图像以及报道在注射到荷瘤小鼠中48小时后具有近红外染料(IRDye800CW)标记的示例性PS靶向剂的平均染料强度的图；
图11A是示例性二价和四价PS靶向剂的示意图和分析，其中填充的圆代表Syt1C2A结构域(左图)。右图显示了Syt1-Fc融合体的SDS-PAGE分析，右侧以kDa显示分子量(MW)；
图11B显示了每个Fc片段含有四个Syt1分子的示例性PS靶向Fc融合蛋白的示例性凝胶过滤色谱分析；
图11C显示了示例性PS靶向剂与PS包被的硝酸纤维素膜上的PS和脂质包被的硝酸纤维素膜的示例性结合；
图11D显示了报道示例性PS靶向剂和对照蛋白与具有暴露的PS的细胞的示例性结合的图；
图11E显示了报道示例性PS靶向剂在具有暴露的PS的细胞中的示例性内化的图；
图11F显示了内皮细胞(2H11)中的示例性PS靶向剂和对照蛋白的一系列示例性显微图像，其中用LAMP-1特异性抗体标记细胞中的溶酶体；
图11G显示了肿瘤细胞(MDA-MB-231)中的示例性PS靶向剂和对照蛋白的一系列示例性显微图像，其中用LAMP-1特异性抗体标记细胞中的溶酶体；
图12A显示了示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物的示意图和分析(左图)，其中载物组分与MMAE(小的填充的圆)偶联。右图显示未偶联或MMAE-偶联的PS靶向剂的SDS-PAGE分析，左侧以kDa表示分子量(MW)；
图12B显示了示例性MMAE-偶联的PS靶向内溶酶体靶向偶联物的示例性质谱分析；
图12C显示了示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物的示例性凝胶过滤色谱分析；
图12D显示了在指定的Ca2+浓度(左图)或pH水平(右图)存在下，示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物与PS结合的示例性分析。使用免疫印迹分析珠相关蛋白；
图13A显示了肿瘤细胞(MDA-MB-231)中的示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照MMAE偶联物的一系列示例性显微图像，其中用EEA-1特异性抗体标记细胞中的早期内体。选取特定的内体并放大(标记为a和b)；
图13B显示了肿瘤细胞(MDA-MB-231)中的示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照MMAE偶联物的一系列示例性显微图像，其中用LAMP-1-特异性抗体标记细胞中的溶酶体；
图13C显示了示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照MMAE偶联物对内皮细胞(2H11)和肿瘤细胞(MDA-MB-231)中微管蛋白的作用的一系列示例性显微图像；
图14A显示了示例性流式细胞术数据的图，以指示肿瘤细胞上暴露的PS水平；
图14B显示了报道示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照MMAE偶联物对肿瘤细胞活力的影响的示例性数据的图；
图14C显示了示例性流式细胞术数据的图，以指示在孵育2小时后内化的示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物进入肿瘤细胞的水平；
图14D显示了示例性数据的图，表明示例性PS靶向Fc融合体(没有偶联的药物)不影响细胞活力；
图15A显示了报道示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物的示例性全身计数与时间的图；
图15B显示了报道示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物在图15A中所示数据的示例性曲线下面积的图；
图15C显示了报道示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照蛋白对小鼠中肿瘤生长(MDA-MB-231细胞)的影响的示例性数据的图；
图15D显示了报道示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照蛋白对荷瘤小鼠体重的影响的示例性数据的图；
图15E显示了报道示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照蛋白对小鼠中肿瘤生长(LNCaP细胞)的影响的示例性数据的图；
图16A显示了含有MMAE偶联和不含MMAE偶联的已被工程化以降低PS结合活性(使用DN突变)的对照内溶酶体靶向偶联物以及含有MMAE偶联和不含MMAE偶联的对照蛋白的SDS-PAGE分析；
图16B显示了结合PS的示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物或经工程化以低亲和力(DN)与PS结合的对照内溶酶体靶向偶联物与脂质包被的硝酸纤维素膜的示例性脂质结合谱；
图16C显示了报道使用流式细胞术分析，结合PS或经工程化以低亲和力(DN)与PS结合的示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物与PS阳性2H11细胞的示例性结合的图；
图16D显示了报道示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照蛋白对小鼠中肿瘤生长(LNCaP细胞)的影响的示例性数据的图；
图16E显示了用示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照蛋白处理的小鼠的分离肿瘤(LNCaP细胞)的示例性图像；
图17A显示了一系列示例性显微图像，其显示了关于肿瘤组织中CD31阳性内皮细胞的示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照(PBS载体)的位置；和
图17B显示了一系列示例性显微图像，其显示了关于肿瘤组织中F4/80-阳性巨噬细胞的示例性PS靶向内溶酶体靶向偶联物和对照(PBS载体)的位置。
具体实施方式
本公开涉及工程化的抗体或融合蛋白，其被配置为允许改善的载物分子(例如细胞毒性药物或成像标记物)递送至靶细胞中的晚期内体和溶酶体。如本文所用的术语“内溶酶体”和“内溶酶体区室”是指细胞的早期内体，晚期内体，溶酶体和相关的管状囊泡运输载体。因此，如本文所用的术语“内溶酶体靶向偶联物”是指工程化的抗体或融合蛋白，其被配置用于改善载物分子向靶细胞的内溶酶体区室的递送。
本文描述的抗体或融合蛋白包括靶向组分和载物组分。靶向组分可包括抗体，抗体片段，抗体结构域，纳米抗体，蛋白质，蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为结合细胞表面分子，例如可能存在于细胞质膜的细胞外表面上的细胞表面受体或其他细胞表面分子，其中所述分子至少部分地暴露于细胞外空间。载物组分可包括与载物分子(例如细胞毒性药物或成像标记物)偶联的抗体，抗体片段，抗体结构域，纳米抗体，蛋白质，蛋白质片段或蛋白质结构域。
如本文所用的术语“抗体-药物偶联物”或“ADC”是指配置为将药物递送至细胞的基于抗体的偶联物。特别地，如本文所用的术语“抗体-药物偶联物”或“ADC”是指包含靶向组分和载物组分的抗体。靶向组分可包括抗体Fab片段，抗体可变结构域或纳米抗体。靶向组分与载物组分连接，载物组分可包括抗体恒定区(Fc片段)或恒定区的结构域。一种或多种细胞毒性药物分子可以与ADC的载物组分的抗体恒定区(Fc片段)或恒定区的结构域偶联。
如本文所用的术语“蛋白-药物偶联物”或“PDC”是指配置为将药物递送至细胞的基于蛋白质的偶联物。特别地，如本文所用的术语“蛋白-药物偶联物”或“PDC”是指包含靶向组分和载物组分的蛋白质。靶向组分可包括结合细胞表面受体或细胞表面分子的蛋白质，或Fab片段，抗体可变结构域或纳米抗体。靶向组分与载物组分连接，载物组分可包括抗体恒定区(Fc片段)，恒定区的结构域，或蛋白质如白蛋白。一种或多种细胞毒性药物分子可以与PDC的载物组分的抗体恒定区(Fc片段)、恒定区的结构域、或蛋白质如白蛋白偶联。
如本文所用的术语“标记的偶联物”或“LC”是指包含与载物组分连接的靶向组分的抗体或蛋白质。因此，靶向组分可包括抗体Fab片段，抗体可变结构域，纳米抗体或结合细胞表面受体或细胞表面分子的蛋白质。载物组分可包括抗体恒定区(Fc片段)或恒定区的结构域，或蛋白质如白蛋白。载物组分的抗体恒定区(Fc片段)，或恒定区的结构域，或蛋白质可以与一种或多种成像标记物(例如放射性标记物，荧光分子或其他标记分子)偶联。
通常，为使ADC或PDC有效地将药物递送至细胞，它们应选择性地结合靶细胞，内化到细胞中，并进入称为晚期内体和溶酶体的降解区室。在进入溶酶体之前，ADC或PDC进入早期内体，其中分选到再循环或溶酶体途径中。改善向晚期内体和溶酶体的递送(内溶酶体途径)将导致更强效的ADC或PDC并且能够使用更低的剂量。
此外，允许改善的成像标记物递送至靶细胞中的晚期内体和溶酶体的LC将导致成像靶细胞相对于非靶向细胞或组织的背景的更高对比度。
因此，本发明一般涉及内溶酶体靶向偶联物，其经工程化以更有效地将载物分子递送至靶细胞的内溶酶体区室，由此本文所述的经工程化的偶联物被配置为响应内体或晚期内体中与细胞外环境中的化学组成的差异，从而实现更有效地将诸如细胞毒性药物或成像标记物的载物分子递送至靶细胞。本文所述的内溶酶体靶向偶联物的实例包括改善的ADC，PDC和LC，其被配置用于改善偶联的载物分子(例如药物或成像标记物)靶向至靶细胞的内溶酶体区室，从而产生更强效的ADC或PDC，或更高对比度的LC。
如本文所述的载物分子可包括具有可用于在靶细胞中产生作用的功能的任何分子。例如，除了细胞毒性药物或成像标记物之外，其他载物分子可以是通过放射损伤杀死细胞的放射性标记物，即可以用于治疗而不是用于成像。这种放射性标记物的实例是钇(Y)-90和碘(I)-131。在阅读本公开时，技术人员可以识别其他类型的载物分子。
除了肿瘤细胞之外，本公开意义上的靶细胞可以包括其他类型的不希望的细胞，例如炎性细胞，或病毒感染的细胞，以及技术人员在阅读本公开内容后可以识别的细胞。
如本文所用的术语“细胞表面分子”是指至少部分地暴露在细胞质膜的细胞外表面上的蛋白质或其他生物分子(例如磷脂，碳水化合物)。
图1和2显示了通过本公开的内溶酶体靶向偶联物改善载物分子递送的示例性机制的示意图。在靶向组分与细胞表面分子结合后，将内溶酶体靶向偶联物内化到细胞中(图1和2)。
如图1中的示例性示意图所示，由于将内体与细胞外空间区分开的较低(酸性)pH、较低Ca2+浓度、较低Cl-或Na+浓度，较高K+浓度或其他环境条件，内溶酶体靶向偶联物可在早期或晚期内体中从受体或细胞表面分子解离(例如，参见Scott,C.C.,Gruenberg,J.(2010)离子通量和内体和溶酶体的功能：pH只是一个开始(Ion flux and the function ofendosomes and lysosomes:pH is just the start).Bioessays 33,103-110)。因此，在本文所述的内溶酶体靶向偶联物的一些实例中，靶向组分对细胞表面分子的亲和力在细胞外空间中比在内溶酶体区室中更高。因此，靶向组分和细胞表面分子可以在细胞外空间中以较低的解离常数结合。将内溶酶体靶向偶联物递送至晚期内体或溶酶体，导致其药物或标记物的释放。
在另一个实例中，如图2中的示例性示意图所示，内溶酶体靶向偶联物的靶向和载物组分可以通过非共价相互作用彼此缔合，在近中性pH或细胞外Ca2+浓度下是稳定的，但在内体(酸性)pH或内体Ca2+浓度或将内体与细胞外空间区分开的其他环境条件下不稳定。载物组分在早期或晚期内体中释放并进入溶酶体，而靶向组分可以再循环并重新装载载物组分。因此，在本文所述的内溶酶体靶向偶联物的一些实例中，靶向组分对于载物组分的亲和力在细胞外空间中比在内溶酶体区室中更高。因此，靶向组分可以在细胞外空间中以较低的解离常数结合载物组分。
靶向组分和载物组分可以通过共价键连接或可以彼此非共价缔合。
本文所述的内溶酶体靶向偶联物的实例包括靶向组分，其被配置为结合细胞表面分子例如HER2或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。特别地，示例性的内溶酶体靶向偶联物可以在近中性pH下以小于500nM的亲和力与细胞表面分子例如HER2或PSMA结合。
本文描述的内溶酶体靶向偶联物的实例包括靶向组分，其被配置为结合细胞表面分子例如PS。特别地，示例性的PDC可以在近中性pH下以小于500nM的亲和力与细胞表面分子例如PS结合。
HER2和PSMA是在肿瘤上过表达的细胞表面受体，因此是充分表征的肿瘤靶标。本发明的这种内溶酶体靶向偶联物不限于靶向这些受体或细胞表面分子，例如前列腺干细胞相关抗原，EpCAM，c-MET，癌胚抗原(CEA)，CD19，CD20，CD20，CD33，CD38，表皮生长因子受体(EGFR)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，CD56，胰岛素样生长因子受体1，肿瘤内皮标记物-8(TEM-8)，CD46和许多其他靶标在本领域技术人员阅读本文公开内容后也是可识别的。
PS存在于正常细胞质膜的内部小叶中，但是响应于肿瘤微环境中的氧化应激和炎性因子，其暴露于癌内皮细胞膜的外部小叶上。基于啮齿动物模型的研究，PS的暴露被认为是肿瘤脉管系统的“通用”标记。通常，不到一半的肿瘤血管是PS阳性的，并且可以通过放射和化学疗法增加暴露。除肿瘤内皮外，还报道PS在许多非凋亡性癌细胞上暴露，包括黑素瘤，乳腺癌，前列腺癌和肾癌。
因此，靶向组分可包括任何类型的分子，其被配置为特异性结合细胞表面受体或其他细胞表面分子。此类分子可包括蛋白质，蛋白质片段，多核苷酸如核糖核酸或脱氧核糖核酸，多肽，多糖，脂质，氨基酸，肽，糖和/或技术人员通过阅读本发明可识别的其他小分子或大分子和/或聚合物。
如图1所示，内溶酶体靶向偶联物20包括靶向组分20T和载物组分20C。载物组分连接有药物或标记物，用黑色实心圆圈表示。偶联物可以可逆地结合细胞10表面上的细胞表面受体或其他分子30。结合通常发生在近中性的pH下，例如pH大于约6.8且小于约7.5，因为这是细胞外空间40的典型pH。与细胞表面受体或细胞表面分子的结合也可以在典型的细胞外Ca2+浓度(约2mM)下发生。具有连接的内溶酶体靶向偶联物20的细胞表面受体或分子30通过受体介导的摄取进入内体50而内化到细胞10中。在早期或晚期内体中，由于在这些区室中的酸性pH(从约pH5.0到约pH6.5)或低Ca2+浓度(约2μM)，内溶酶体靶向偶联物20和细胞表面受体或其他分子30的复合物与受体或其他分子30解离。因此，受体或细胞表面分子30可在再循环内体60中再循环回细胞表面并重新加载内溶酶体靶向偶联物20，而内体解离的内溶酶体靶向偶联物20进入溶酶体并降解成片段(70)。内溶酶体靶向偶联物被配置为在细胞外空间条件下与细胞表面受体或其他分子结合，内化到细胞内的至少10％的内溶酶体靶向偶联物在内体或晚期内体中解离。
如图2所示，包含靶向组分80和载物组分90(具有连接的药物或其他标记物，用实心圆圈表示)的内溶酶体靶向偶联物可以可逆地结合细胞10表面上的细胞表面受体或其他分子30。靶向组分80和载物组分90的缔合通常发生在近中性的pH下，例如pH大于6.8且小于7.5，因为这是细胞外空间40的典型pH。靶向组分80和载物组分90的缔合可以在细胞外Ca2+浓度(约2mM)下发生。具有连接的内溶酶体靶向偶联物的细胞表面受体或分子80通过受体介导的摄取进入内体50而内化到细胞10中。由于在这些区室中的酸性pH(通常小于pH 6.8)或低Ca2+浓度(约2μM)，在早期或晚期内体中，靶向组分80和载物组分90发生解离。因此，与受体或细胞表面分子结合的靶向组分80可在再循环内体60中再循环回细胞表面并重新加载载物组分90，而内体解离的载物组分90进入溶酶体并降解成片段(70)。内溶酶体靶向偶联物被配置为在细胞外空间条件下与细胞表面受体或其他分子结合，内化到细胞内的至少10％的载物组分在内体或晚期内体中解离。
根据本发明的内溶酶体靶向偶联物经配置以通过靶向组分在近中性pH或细胞外Ca2+浓度下特异性结合细胞表面受体/分子。如本文所用的术语“特异性结合”是指靶向组分和细胞表面受体/分子之间可检测的选择性分子间相互作用。例如，为了特异性结合，靶向组分需要显示与被靶向的细胞表面受体或细胞表面分子的可检测的相互作用，同时不显示与其他细胞表面受体或细胞表面分子的可检测的相互作用或低得多的亲和力相互作用。用于检测特异性结合的技术是本领域已知的，例如ELISA和技术人员可识别的其他方法。
因此，内溶酶体靶向偶联物允许连接的载物组分内化到表达所靶向的细胞表面受体或其他所靶向的细胞表面分子的细胞中，然后在细胞内降解。
内溶酶体靶向偶联物可包括至少第一靶向组分和第二靶向组分，其中第一靶向组分的抗体Fab片段、单链Fv(scFv)、纳米抗体、蛋白质或蛋白质片段与第二靶向组分的抗体Fab片段、单链Fv(scFv)、纳米抗体、蛋白质或蛋白质片段不同。因此，包含至少第一靶向组分和第二靶向组分的内溶酶体靶向偶联物可以结合两种不同的细胞表面受体或细胞表面分子。
此外，内溶酶体靶向偶联物可含有人或人源化蛋白质或蛋白质片段，以避免或降低当给予人时对内溶酶体靶向偶联物的免疫反应的可能性。靶向组分和载物组分优选是人蛋白质或蛋白质片段，用于将内溶酶体靶向偶联物给予人。靶向组分和载物组分优选是人蛋白质或蛋白质片段，例如人抗体、抗体片段或人白蛋白或白蛋白片段，或人源化抗体或人源化抗体片段，用于将内溶酶体靶向偶联物给予人。如果开发用于非人动物的内溶酶体靶向偶联物，则可以使用衍生自该动物或工程化以与该动物免疫相容的蛋白质或蛋白质片段。
图3A是示例性内溶酶体靶向偶联物(20a)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子的抗体的Fab片段(100)。Fc片段(110)是同源二聚体。如本领域技术人员所理解的，IgG的Fc片段是抗体Y形的所有下方碱基，包括巯基桥连的铰链区和CH2和CH3结构域。在该实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
图3B是示例性内溶酶体靶向偶联物(20b)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子的抗体的scFv片段(260)。Fc片段(110)是同源二聚体。在该实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
图3C是示例性内溶酶体靶向偶联物(20c)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子的抗体可变结构域或片段(130)。Fc片段(110)是同源二聚体。在该实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
抗体可变区130可以包括抗体的非可变区的部分，其被配置为结合细胞表面受体或细胞表面分子。例如，抗体可变区130可以是单结构域抗体(sdAb)或骆驼科动物来源的VHH结构域(通常也称为纳米抗体)。这些可变区具有免疫球蛋白结构域的整体折叠，包含两个反平行的β-折叠，并且还可以包括来自免疫球蛋白超家族的其他成员的结构域，例如T细胞受体可变结构域，抗体的恒定区结构域或共同受体的结构域，CD4，以及本领域技术人员可识别的其他结构域。抗体可变区还可以包括通过肽接头与轻链可变(VL)结构域连接以形成scFv片段(260)的重链可变(VH)结构域的异二聚体。用于连接VH和VL结构域的接头序列是本领域技术人员熟知的，包括连接VH结构域的C端和VL结构域的N端的GGGGSGGGGSGGGGS[(G4S)3]序列。VL结构域的C端可以用相似的接头序列连接到VH结构域的N端。可以使用噬菌体展示、酵母展示或其他抗体展示方法，从scFv文库中分离以pH依赖性、Ca2+依赖性等结合细胞表面受体或其他细胞表面分子的scFv。内溶酶体靶向偶联物的靶向组分可以包括抗体的Fab片段，其可以使用噬菌体展示或酵母展示以及技术人员已知的其他技术从Fab片段文库中分离。对于纳米抗体、scFv和Fab片段，通过随机突变互补决定区(CDR)中的残基，或通过使用易错聚合酶链式反应，以产生突变的纳米抗体或可变结构域的文库，然后选择，可以进一步改善对于所靶向的细胞表面受体或细胞表面分子的所需结合特性(pH依赖性，Ca2+依赖性)。将靶向的示例性CDR残基是轻链可变结构域的CDR3(残基89-97；Kabat编号)和重链可变结构域的CDR3(残基95-102；Kabat编号)中的那些。这些文库可以在噬菌体或酵母上展示，并且使用本领域技术人员已知的方法选择具有所需结合行为的变体。
图3D是示例性内溶酶体靶向偶联物(20d)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子的抗体的Fab片段(100)。Fab片段与免疫球蛋白CH3结构域(140)连接以形成同源二聚体。在该实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
图3E是示例性内溶酶体靶向偶联物(20e)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子的抗体的scFv片段(260)。scFv片段与免疫球蛋白CH3结构域(140)连接以形成同源二聚体。在该实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
图3F是示例性内溶酶体靶向偶联物(20f)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子的抗体可变结构域或片段(130)。蛋白质片段或结构域与免疫球蛋白CH3结构域(140)连接以形成同源二聚体。在该实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
图3G是示例性内溶酶体靶向偶联物(20g)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子的抗体可变结构域或片段(130)。抗体可变结构域或片段与白蛋白或白蛋白片段(150)连接，其可以被突变或修饰，使其与新生儿Fc受体(FcRn)结合的亲和力增加。例如，可以使用易错PCR将突变插入(人血清)白蛋白的FcRn结合结构域(DIII)中，然后在酵母或噬菌体上展示突变的白蛋白变体文库，并选择更高亲和力的变体。或者，可以通过突变白蛋白：FcRn界面处或附近的残基并选择或筛选具有增加的结合亲和力的白蛋白变体来产生更高亲和力的变体。尽管图3G示出了在白蛋白或白蛋白片段150的末端位置处的抗体可变结构域或片段(130)，但是它可以替代地位于非末端位置。抗体可变结构域或片段可以以任何合适的方式与白蛋白或白蛋白片段150融合，包括通过化学反应连接或通过肽接头连接。在该实施例中，载物分子(120)通过化学偶联与暴露的氨基酸如半胱氨酸或赖氨酸连接。
在图3H和图3I中所示的示例性示意图中，如图3G中所示的抗体可变结构域或片段130被Fab片段100(图3H)或scFv片段260(图3I)替代，其被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子。在该实施例中，载物分子(120)通过化学偶联与暴露的氨基酸如半胱氨酸或赖氨酸连接。
图3J是示例性内溶酶体靶向偶联物(20j)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子的蛋白质片段或结构域(160)。蛋白质片段或结构域与Fc片段(110)的N端连接以形成同源二聚体。在该实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
在图3K和图3L中所示的示例性示意图中，蛋白质片段或结构域(160)与Fc片段(110)的C端连接以形成同源二聚体(图3K)或与Fc片段(110)的N端和C端两者连接以形成同源二聚体(图3L)。在这些实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
图3M是示例性内溶酶体靶向偶联物(20m)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合细胞表面蛋白或细胞表面分子的蛋白质片段或结构域(160)。蛋白质片段或结构域与Fc片段(170)的N端和C端连接，其被配置为与缺少蛋白质片段或结构域的另一Fc片段180异二聚化，以产生异二聚体内溶酶体靶向偶联物20m，如图3M所示。图3N显示了示例性PDC或LC20n的示意图，其中蛋白质片段或结构域(160)与Fc片段(170)的C端融合。在图3M和3N所示的实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。为了避免Fc片段同源二聚体，其中两个Fc片段都具有融合的蛋白片段或结构域(160)，或者都没有融合的蛋白或蛋白结构域，可以设计具有旋钮进孔突变(例如，参见Moore,G.L.,Bautista,C.,Pong,E.,Nguyen,D.H.,Jacinto,J.,Eivazi,A.,Muchhal,U.S.,Karki,S.,Chu,S.Y.,Lazar,G.A.(2011)一种新的双特异性抗体形式能够同时产生不同靶抗原的二价和单价共同接合(Anovel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalentco-engagement of distinct target antigens).MAbs 3,546-557)和/或静电转向突变(例如，参见Gunasekaran,K.,Pentony,M.,Shen,M.,Garrett,L.,Forte,C.,Woodward,A.,Ng,S.B.,Born,T.,Retter,M.,Manchulenko,K.,Sweet,H.,Foltz,I.N.,Wittekind,M.,Yan,W.(2010)通过静电转向效应增强抗体Fc异二聚体形成：应用于双特异性分子和单价IgG(Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostaticsteering effects:applications to bispecific molecules and monovalent IgG).J.Biol.Chem.285,19637-19646)的内溶酶体靶向偶联物以促进异二聚体形成。其他方法也可用于产生异二聚体，例如在抗原-Fc融合体的C端和第二Fc片段的N端之间插入(G4S)13接头肽(例如，参见Zhou,L.,Wang,H-Y.,Tong,S.,Okamoto,C.T.,Shen,W-C.,Zaro,J.L.(2016)单链Fc-二聚体-人生长激素融合蛋白用于改善药物递送(Single chain Fc-dimer-human growth hormone fusion protein for improved drug delivery).Biomaterials,117,24-31)。实施例14中描述了包含旋钮进孔突变，静电转向突变和/或其他突变的内溶酶体靶向偶联物的实例的DNA和蛋白质序列。
旋钮进孔突变的实例包括：Y349T/T394F:S364H/F405A和Y349T/F405F:S364H/T394F(例如，参见Moore,G.L.,Bautista,C.,Pong,E.,Nguyen,D.H.,Jacinto,J.,Eivazi,A.,Muchhal,U.S.,Karki,S.,Chu,S.Y.,Lazar,G.A.(2011)一种新的双特异性抗体形式能够同时产生不同靶抗原的二价和单价共同接合(A novel bispecific antibody formatenables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct targetantigens).MAbs 3,546-557)，T366W:T366S:L368A/Y407V(例如，参见Atwell,S.,Ridgway,J.B.B.,Wells,J.A.,Carter,P(1997)使用噬菌体展示文库重建同源二聚体的结构域界面的稳定的异二聚体(Stable heterodimers from remodeling the domain interface ofa homodimer using a phage display library).J.Mol.Biol.,270,26-35)以及本领域技术人员可鉴定的其他突变。如本领域技术人员所理解的，这些示例性旋钮进孔突变的残基编号是指EU抗体编号系统。
静电转向突变的实例包括：E356K/D399K:K392D/K409D和K409D/K370D:D357K/D399K(例如，参见Gunasekaran,K.,Pentony,M.,Shen,M.,Garrett,L.,Forte,C.,Woodward,A.,Ng,S.B.,Born,T.,Retter,M.,Manchulenko,K.,Sweet,H.,Foltz,I.N.,Wittekind,M.,Yan,W.(2010).通过静电转向效应增强抗体Fc异二聚体形成：应用于双特异性分子和单价IgG(Enhancing antibody Fc heterodimer formation throughelectrostatic steering effects:applications to bispecific molecules andmonovalent IgG).J Biol Chem 285,19637-19646.)以及本领域技术人员可鉴定的其他突变。如本领域技术人员所理解的，这些示例性静电转向突变的残基编号是指EU抗体编号系统。
图3O是示例性内溶酶体靶向偶联物(20o)的示意图，其包括与钙结合蛋白的结构域2(CalD2；190)融合的抗体的Fab片段(210)。Fc片段(110)与钙结合蛋白的结构域1(CalD1；200)融合。CalD1(200)和CalD2(190)相互缔合，在细胞外Ca2+浓度下的亲和力高于在较低的内体Ca2+浓度下的亲和力。其他实例可包括与Fab片段(210)或Fc(110)融合并以Ca2+或pH依赖性方式彼此缔合的蛋白质或蛋白质片段(190,200)。以Ca2+依赖性方式相互作用的蛋白质的其他实例是：钙调蛋白和钙调蛋白结合肽M13(例如，参见Miyawaki,A.,Llopis,J.,Heim,R.,McCaffery,J.M.,Adams,J.A.,Ikura,M.,Tsien,R.Y.(1997)基于绿色荧光蛋白和钙调蛋白的Ca2+荧光指示剂(Fluorescent indicators for Ca2+based ongreen fluorescent proteins and calmodulin).Nature,388,882-887)；S100C和膜联蛋白I的N端13残基(例如，参见Seeman,J.,Weber,K.,Gerke,V.(1996)膜联蛋白I-S100C复合物形成的结构要求(Structural requirements for annexin I-S100C complex-formation).Biochem.J.,319,123-129；Malliard,W.S.,Haigler,H.T.,Schlaepfer,D.D.(1995)S100C与膜联蛋白I的N端结构域的钙依赖性结合(Calcium-dependent binding ofS100C to the N-terminal domain of Annexin I).J.Biol.Chem.,2,719-725)；骨粘连蛋白和IV型胶原蛋白(例如，参见Maurer,P.,Hohenadl,C.,Hohenester,E.,Gohring,W.,Timpl,R.,Engel,J.(1995)BM-40的C端蛋白(SPARC/Osteonectin)是一种自主折叠和结晶的结构域，可结合钙和IV型胶原蛋白(The C-terminal protein of BM-40(SPARC/Osteonectin)is an autonomously folding and crystallizable domain that bindscalcium and collagen IV).J.Mol.Biol.,253,347-357)。在内溶酶体靶向偶联物的其他实例中，如图3O中所示的Fab片段被替换为如图3P中所示的scFv片段(220)，或者如图3Q中所示的抗体可变结构域、片段或纳米抗体(230)。在图3O，3P和3Q所示的实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
图3R是示例性内溶酶体靶向偶联物(20a)的示意图，其包括被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度)时相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合两个不同的细胞表面蛋白或细胞表面分子的两种抗体的Fab片段(100,240)。Fc片段(170,180)各自与不同的Fab片段(100,240)融合以形成异二聚体。异二聚体形成可以通过以下方式驱动：旋钮进孔突变(例如，参见Moore,G.L.,Bautista,C.,Pong,E.,Nguyen,D.H.,Jacinto,J.,Eivazi,A.,Muchhal,U.S.,Karki,S.,Chu,S.Y.,Lazar,G.A.(2011)一种新的双特异性抗体形式能够同时产生不同靶抗原的二价和单价共同接合(A novel bispecificantibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement ofdistinct target antigens).MAbs 3,546-557)，和/或静电转向突变(例如，参见Gunasekaran,K.,Pentony,M.,Shen,M.,Garrett,L.,Forte,C.,Woodward,A.,Ng,S.B.,Born,T.,Retter,M.,Manchulenko,K.,Sweet,H.,Foltz,I.N.,Wittekind,M.,Yan,W.(2010)通过静电转向效应增强抗体Fc异二聚体形成：应用于双特异性分子和单价IgG(Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steeringeffects:applications to bispecific molecules and monovalent IgG).J.Biol.Chem.285,19637-19646)。在图3S中所示的另一个实例中，如图3R中所示的Fab片段被两个scFv片段(250,260)替换，其被配置为与酸性内体pH(或在内体Ca2+浓度时)相比在近中性pH(或在细胞外Ca2+浓度)下以更高的亲和力结合两种不同的细胞表面蛋白或细胞表面分子。在图3R和3S所示的实施例中，载物分子(120)通过与半胱氨酸残基的化学偶联连接到铰链区。
在图3A-图3S所示的实施例中，内溶酶体靶向偶联物具有靶向组分和载物组分，靶向组分包括Fab片段，scFv或纳米抗体，载物组分包括与载物分子如细胞毒性药物或成像标记物分子如放射性标记物或荧光标记物连接的Fc片段、Fc的亚片段(例如CH2结构域)或白蛋白。图3A，3B，3C，3D，3E，3F，3J，3K，3L，3M，3N，3O，3P，3Q，3R和3S中所示的载物分子通过一个或多个半胱氨酸残基与铰链区连接。在其他实例中，一种或多种载物分子可通过本领域技术人员已知的不同化学物质连接到载物组分，例如：胺-胺(NHS酯)，巯基-巯基(马来酰亚胺)，胺-巯基(NHS酯/马来酰亚胺)，巯基-碳水化合物(马来酰亚胺/酰肼)，或通过具有所需化学反应性的非天然氨基酸连接，以及技术人员可识别的其他方法。可在重组产生靶向组分期间插入非天然氨基酸。在其他实例中，例如图3R和图3S中所示的那些，靶向组分可以结合两个或更多个不同的靶。每个靶向组分可以与具有旋钮进孔突变和/或静电转向突变的Fc片段融合，以驱动异二聚体形成。
在图3J，3K，3L，3M和3N所示的实施例中，内溶酶体靶向偶联物可包括，例如，通过将PS结合结构域与人IgG1的Fc片段或其他Fc片段融合而产生的PS靶向剂。例如，靶向组分可以与包含细胞毒性药物的载物组分偶联，以产生内溶酶体靶向偶联物PDC，或者靶向组分可以与包含成像标记物(例如放射性标记物，荧光标记物或近红外标记物)的载物组分偶联，以产生内溶酶体靶向偶联物LC。因此，本文所述的内溶酶体靶向偶联物可包括蛋白质或蛋白质片段或结构域，其被配置为在暴露于内体中Ca2+水平的显著降低时从靶细胞表面分子解离，例如通过利用以Ca2+依赖性方式与PS相互作用的PS结合结构域。例如，内溶酶体靶向偶联物PDC或LC可包括靶向组分，例如Fc-Syt1。包含Fc-Syt1的内溶酶体靶向偶联物PDC例如可以是二价(如图3J，3K所示)，或四价(如图3L所示)。
内溶酶体靶向偶联物可包括与Fc片段融合的一个靶向结构域，其与不具有融合蛋白的Fc片段形成异二聚体。为了促进异二聚体的形成，Fc片段可以用旋钮进孔突变和/或静电转向突变进行工程改造，如图3M和3N中的实施例所示。
在本文所述的一些实例中，靶向组分和载物组分不是共价连接的，而是被配置为通过与非共价地彼此缔合的工程化结构域的连接彼此缔合。具体说，与内溶酶体区室内的化学环境相比，非共价缔合在与细胞外空间中的化学环境接触时具有更强的亲和力。例如，经工程化的结构域可包括诸如钙结合蛋白结构域1(CalD1)和钙结合蛋白结构域2(CalD2)的那些。CalD1和CalD2，其在细胞外Ca2+浓度下彼此结合，但在内体Ca2+浓度下不结合(参见实施例6)。以Ca2+依赖性方式相互作用的蛋白质的其他实例是：钙调蛋白和钙调蛋白结合肽M13(例如，参见Miyawaki,A.,Llopis,J.,Heim,R.,McCaffery,J.M.,Adams,J.A.,Ikura,M.,Tsien,R.Y.(1997)基于绿色荧光蛋白和钙调蛋白的Ca2+荧光指示剂(Fluorescentindicators for Ca2+based on green fluorescent proteins and calmodulin).Nature,388,882-887)；S100C和膜联蛋白I的N端13残基(例如，参见Seeman,J.,Weber,K.,Gerke,V.(1996)膜联蛋白I-S100C复合物形成的结构要求(Structural requirements for annexinI-S100C complex-formation).Biochem.J.,319,123-129；Malliard,W.S.,Haigler,H.T.,Schlaepfer,D.D.(1995)S100C与膜联蛋白I的N端结构域的钙依赖性结合(Calcium-dependent binding of S100C to the N-terminal domain of Annexin I).J.Biol.Chem.,2,719-725)；骨粘连蛋白和IV型胶原蛋白(例如，参见Maurer,P.,Hohenadl,C.,Hohenester,E.,Gohring,W.,Timpl,R.,Engel,J.(1995)BM-40的C端蛋白(SPARC/Osteonectin)是一种自主折叠和结晶的结构域，可结合钙和IV型胶原蛋白(The C-terminal protein of BM-40(SPARC/Osteonectin)is an autonomously folding andcrystallizable domain that binds calcium and collagen IV).J.Mol.Biol.,253,347-357)。包含这些结构域的几种配置的示例在图3O，3P和3Q中示出，但是其他配置也是可能的。
内溶酶体靶向偶联物可包括不同数量的靶向组分和载物组分。图3A，3B，3C，3D，3E，3F，3G，3H，3I，3J，3K，3L，3M，3N，3O，3P，3Q，3R和3S中所示的配置是示例而非限制性的，因为在阅读本公开后，本领域技术人员可以识别出多种其他配置。
在本文所述的一些实例中，内溶酶体靶向偶联物可包括通过缬氨酸-瓜氨酸-PAB接头偶联的毒素，例如单甲基奥瑞他汀E(MMAE)。内溶酶体靶向偶联物可包括例如，与酸性内体pH相比在近中性pH下以更高的亲和力结合细胞表面分子如HER2的抗体(HER2-ADC；参见实施例2-5)。本文所述的工程化抗体和蛋白质可以高产率由哺乳动物细胞表达，并以高效率与药物偶联。在与HER2阳性细胞结合后，示例性HER2-ADC被内化到早期内体中，其中pH从近中性下降到约pH 5.5-6.5。pH的这种降低使得HER2-ADC从早期/分选内体膜解离，导致MMAE药物的有效溶酶体递送。特别地，例如(例如，参见图4B)，帕妥珠单抗变体SG和YS在pH5.8下具有大于1.5μM的解离常数，而WT帕妥珠单抗在相同pH下具有低得多的解离常数。因此，在表达HER2的乳腺癌的小鼠模型中，HER2-ADC可以有效地根除HER2阳性细胞，并且用HER2-ADC处理可以有效地抑制肿瘤生长而没有任何不利影响的迹象。
在本文所述的另一个实例中，内溶酶体靶向偶联物具有靶向组分，其包括PS结合域，例如突触结合蛋白1(Syt1)的C2A结构域，所述靶向组分融合至载物组分，例如抗体的Fc区，所述载物组分通过马来酰亚胺基己酰基缬氨酸-瓜氨酸-PAB接头偶联MMAE(PS-PDC；参见实施例7-13)。PS靶向蛋白也可以以高产率由哺乳动物细胞表达，并以高效率与药物偶联。示例性PS-PDC被配置为以钙依赖性方式特异性结合PS。在与PS阳性细胞结合后，PS-PDC被有效地内化到早期内体中，其中钙水平从2mM下降到小于2μM。钙浓度的这种降低使得PS-PDC从早期/分选的内体膜解离，导致MMAE药物的有效溶酶体递送。PS-PDC可以有效地根除PS阳性细胞，包括但不限于肿瘤内皮细胞，乳腺癌和前列腺癌细胞。在人三阴性乳腺癌以及前列腺癌的小鼠模型中，用PS-PDC治疗可以有效地抑制肿瘤生长而没有任何不利影响的迹象，而未偶联的蛋白质没有效力。由于PS是癌症内皮细胞以及应激肿瘤细胞的通用标志物，因此PDC可用于治疗大多数实体瘤。
使用噬菌体展示，酵母展示或其他具有技术水平的人所熟知的技术，以pH依赖性或Ca2+依赖性方式与靶细胞表面分子结合的本文所述的内溶酶体靶向偶联物的靶向组分可以从免疫球蛋白可变结构域文库、scFv(VH：VL异二聚体，其中VH和VL结构域通过接头肽如GGGGSGGGGSGGGGS彼此连接)或Fab片段的文库中分离。这些文库可以源自天然存在的抗体可变基因，可以使用产生“半合成”文库的方法产生，其中使用随机化的寡核苷酸序列产生互补决定区(CDR)，或者可以通过在CDR中插入随机突变从现有抗体的VH和VL结构域基因产生。可以使用易错PCR或对组氨酸残基的偏向(对于pH依赖性)插入CDR中的随机突变，然后使用噬菌体展示或酵母展示进行选择。将靶向的示例性CDR残基是轻链可变结构域的CDR3(残基89-97；Kabat编号)和重链可变结构域的CDR3(残基95-102；Kabat编号)中的那些。可以使用本领域技术人员已知的方法进行具有所需pH依赖性或Ca2+依赖性的scFv或Fab片段的选择。另外，为了分离pH依赖性结合物，可以将CDR残基系统地突变为组氨酸，使用例如表面等离振子共振或ELISA分析所得的Fab或scFv片段并分析其与靶标的结合。
本文所述的内溶酶体靶向偶联物可具有靶向组分(例如Fab片段或scFv片段)的数量的变化，其范围为1-4个靶向组分(图3)。这些靶向组分可以与免疫球蛋白Fc片段或其他蛋白质如白蛋白连接，并且包括在融合蛋白、结构域或片段之间长度和组成不同的接头序列，例如GGGGS或该接头的2-3次重复，以及技术人员可识别的其他接头序列。诸如CalD1或CalD2的结构域也可以使用类似的接头连接到靶向组件和载物组件。内溶酶体靶向偶联物的Fc片段也可具有突变，例如旋钮进孔和/或静电转向突变，从而形成具有和不具有连接的靶向组分的Fc片段的异二聚体。
靶向组分可以与抗体的Fc区融合，其保留由Fc区引发的治疗功能和体内持久性，同时减小蛋白的大小。在其他实例中，Fc区可以替换为白蛋白或白蛋白的结构域III，由于白蛋白(或DIII)与循环受体FcRn的相互作用而具有延长的体内持久性。
本文所述的示例性内溶酶体靶向偶联物ADC和PDC通过改善毒素的细胞内释放而显示出改善的杀死癌细胞的功效(参见实施例3-5,9-13)。除了示例性细胞毒性药物MMAE之外，可以使用其他细胞毒性药物，例如美登木素生物碱，微管蛋白裂解素，苯并二氮杂
Figure BDA0002203200080000291
多卡霉素，以及本领域技术人员可识别的其他药物。药物可以通过化学偶联与载物组分的抗体片段，抗体结构域，纳米抗体，蛋白质，蛋白质片段或蛋白质结构域偶联。可以使用的化学偶联的实例是：胺-胺(NHS酯)，巯基-巯基(马来酰亚胺)，胺-巯基(NHS酯/马来酰亚胺)，巯基-碳水化合物(马来酰亚胺/酰肼))，或通过具有所需化学反应性的非天然氨基酸连接，以及技术人员可识别的其他方法。可在重组产生靶向组分期间插入非天然氨基酸。聚乙二醇(PEG)间隔物可以插入化学偶联的蛋白质、蛋白质片段或其他分子之间。接头可以是可切割的，例如缬氨酸-瓜氨酸，以通过晚期内体或溶酶体中的常驻蛋白酶如组织蛋白酶释放细胞毒性药物。在接头不可切割的情况下，例如对于曲妥珠单抗-DM1，可以将抗体蛋白水解以释放药物。连接化学，连接位点和肽的选择可以通过分子建模来指导，并且可以设计为使ADC或PDC对细胞表面受体或其他细胞表面分子的结合活性的损失最小化，如本领域技术人员所理解的。
内溶酶体靶向偶联物LC的载物组分可以通过本领域技术人员可识别的成像标记物与载物组分的抗体片段，抗体结构域，蛋白质，蛋白质片段或蛋白质结构域的偶联产生。成像标记物的非限制性实例包括近红外染料，例如IRDye800CW，或放射性标记物，例如I-124，Cu-64或Zr-89。与Cu-64或Zr-89的偶联可以通过螯合1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)来实现，所DOTA螯合这些放射性标记物，以及本领域技术人员可识别的其他方法。
在进一步的实例中，内溶酶体靶向偶联物的载物组分可以是细胞毒性放射性标记物(例如钇-90，Y-90或碘-131，I-131)或改变靶细胞行为的药物或其他试剂。例如，药物可以是雄激素受体(AR)的拮抗配体，并且可以用于下调AR活性。
与靶细胞或其他细胞相关的术语“行为”可以指与靶细胞或其他细胞的表型或基因型有关的活性，功能，输出或任何其他属性或作用。通常，药物或其他试剂可用于产生关于靶细胞的效果，例如特定治疗效果，细胞毒性效果等，如本领域技术人员在阅读本公开时所理解的。
在本文所述的一些实施例中，内溶酶体靶向偶联物可包含以下氨基酸序列：SEQID NO:2加SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6加SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12；SEQID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18加SEQ ID NO:20加SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:22加SEQ ID NO:24加SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42加SEQ ID NO:44,SEQ IDNO:46加SEQ ID NO:48，或其同源物。
内溶酶体靶向偶联物可包含与以下具有至少50％相同性的氨基酸序列：SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:24,SEQ IDNO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,或SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36,SEQID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48。
如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列相同性”或“相同性”指的是当在指定的比较窗口上对齐以获得最大对应性时两个序列中的相同的核苷酸碱基或残基。当使用序列相同性或相似性的百分比指代蛋白质时，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似理化性质的氨基酸残基的功能等同残基取代，因此不会改变分子的功能特性。
本文使用的氨基酸的功能等同残基通常是指具有与原始氨基酸基本相似的理化和立体化学特征的其他氨基酸残基。理化性质包括水溶性(疏水性或亲水性)，介电和电化学性质，生理pH，侧链的部分电荷(正、负或中性)和本领域技术人员可识别的其他性质。立体化学特征包括氨基酸的空间和构象排列及其手性。例如，在本公开的意义上，谷氨酸被认为是天冬氨酸的功能等同残基。酪氨酸和色氨酸被认为是苯丙氨酸的功能等同残基。精氨酸被认为是赖氨酸的功能等同残基。
本领域技术人员将理解，序列之间的相似性通常通过包括以下步骤的过程来测量：将两个多肽或多核苷酸序列比对以形成比对序列，然后检测匹配的字符(即，两个比对的序列之间相似或相同的字符)的数量，并计算每个多肽或多核苷酸序列中的匹配的字符的总数除以比对的总字符数，包括缺口。相似性结果表示为相同性的百分比。
如本文所用，“序列相同性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列而确定的值，其中比较窗口中多核苷酸序列的部分与参考序列(不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)以最佳比对所述两种序列。该百分比如下计算：通过测定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数产生匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，得到的结果乘以100产生序列相同性百分比。
如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基础的确定序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，作为全长蛋白质或蛋白质片段的区段。参考序列可以是，例如，在例如GenBank和UniProt等数据库中可识别的序列，以及本领域技术人员可识别的其他序列。
如本领域技术人员所理解的，可以使用数学算法来确定任何两个序列之间的百分比相同性。合适的数学算法的计算机实施手段可用于比较序列来确定序列相同性。这类实施手段包括但不限于：CLUSTAL,ALIGN,GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA,以及技术人员可识别的其他实施手段。
例如，根据本公开的内溶酶体靶向偶联物可具有与SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,或SEQ ID NO:8,或SEQ ID NO:10,或SEQ ID NO:12,或SEQ ID NO:14,或SEQID NO:16,或SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,或SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36,或SEQ IDNO:38,或SEQ ID NO:40,或SEQ ID NO:42,或SEQ ID NO:44,或SEQ ID NO:46,或SEQ IDNO:48相比至少50％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的序列相同性的氨基酸序列。
本文所述的内溶酶体靶向偶联物可以以包含内溶酶体靶向偶联物和药学上可接受的载体的组合物提供。
本文所述的内溶酶体靶向偶联物或其组合物可以使用任何合适的方法给予以将它们递送至对象，例如细胞，多个细胞或多细胞生物体，特别是动物或人，特别是可以具有一种或多种肿瘤的动物或人，例如通过注射，特别是静脉内，皮下或肌内注射，以及技术人员可识别的其他方法。
本文所述的内溶酶体靶向偶联物或其组合物可用于治疗癌症的方法中。该方法包括给予对象有效剂量的内溶酶体靶向偶联物或其组合物，其中载物分子是细胞毒性药物，并且给予组合物可抑制对象中肿瘤的生长。
本文所述的内溶酶体靶向偶联物或其组合物可用于对象中肿瘤成像的方法中。该方法包括以下步骤：给予对象有效剂量的内溶酶体靶向偶联物组合物，其中，载物分子是成像标记物；执行适合于检测对象中的成像标记物的成像方法。在该方法中，组合物的给予以有效剂量进行，以提供可通过成像方法检测的足够浓度的成像标记物，如技术人员可识别的。
本文所述的内溶酶体靶向偶联物或其组合物可以以合适的时间间隔给予，例如每周，每月或例如每当预期50％的对象显示肿瘤消退时。
在诊断/治疗诊断成像中，预期给予对象包含成像标记物(例如放射性标记物，近红外标记物或荧光标记物)的内溶酶体靶向偶联物LC，然后是1-7天的时间，以允许定位到对象的靶细胞中，例如对象肿瘤定位。在此期间之后，可以使用正电子发射断层摄影术或其他合适的成像模态(例如局部或全身成像)进行成像，以允许检测诸如肿瘤的靶细胞的位置。
本文所述的内溶酶体靶向偶联物可以设计成选择性地靶向特定细胞类型，从而将载物分子递送至选定的靶细胞。特别地，可以设计本文所述的内溶酶体靶向偶联物以靶向对象中的特定类型的肿瘤细胞。因此，提供本文所述的内溶酶体靶向偶联物的方法可包括以下步骤：(1)选择靶向组分，其中靶向组分包括被配置为选择性结合选定类型的细胞(例如肿瘤靶细胞)上的细胞表面分子的抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其中靶向组分被配置为与内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更高的亲和力结合靶细胞上表达的细胞表面分子；(2)选择载物组分，其中载物组分包括与载物分子偶联的抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其中载物分子可以是例如具有抑制所选类型的肿瘤靶细胞生长功效的细胞毒性药物或适于所选肿瘤细胞成像的成像标记物；(3)提供包含与载物组分直接或间接融合的靶向组分的内溶酶体靶向偶联物。
或者，提供用于对象中的癌症治疗和/或肿瘤成像的内溶酶体靶向偶联物的方法可包括以下步骤：(1)选择靶向组分，其中靶向组分包括被配置为选择性结合选定类型的肿瘤靶细胞上的细胞表面分子的抗体、抗体片段、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域；(2)选择载物组分，其中载物组分包括与载物分子偶联的抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其中载物分子是具有抑制所选类型的肿瘤靶细胞生长功效的细胞毒性药物或适于所选肿瘤细胞成像的成像标记物。具体说，在该方法中，靶向组分经工程化以进一步包括第一蛋白结构域；载物组分经工程化以进一步包括第二蛋白结构域；并且第一蛋白结构域被配置为与内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更高的亲和力与第二结构域结合，如本文所述。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步说明本文公开的内溶酶体靶向偶联物和方法。本领域的普通技术人员应理解，实施例中公开的是由发明人发现能够很好地实施本发明的以下代表性方案，并且因而可被视作组成其实践模式的示例。但是，本领域技术人员根据本公开应理解，在不偏离本发明精神和范围的前提下，可对所公开的具体实施方式进行许多变化，同时仍能获得相同或类似的结果。
实施例1.材料和方法
细胞系和培养条件。将小鼠内皮细胞系2H11(ATCC，CRL-2163)在补充有5％热灭活的胎牛血清(FBS)的达氏改良伊氏培养基(DMEM)中培养。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC，HTB-26)在补充有10％FBS的DMEM中培养。人乳腺癌细胞系T-47D(ATCC，HTB-133)，MDA-MB-453(ATCC，HTB-131)和MDA-MB-468(ATCC，HTB-132)在补充有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养。人乳腺癌细胞系SK-BR-3(ATCC，HTB-30)和人卵巢癌细胞系SK-OV-3(ATCC，HTB-77)在补充有10％FBS的McCoy's 5A培养基中培养。人前列腺癌细胞系LNCaP和22Rv1(分别为ATCC，CRL-1740和CRL-2505)在补充有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养。人乳腺癌细胞系HCC1954(Gazdar,A.F.,Kurvari,V.,Virmani,A.,Gollahon,L.,Sakaguchi,M.,Westerfield,M.,Kodagoda,D.,Stasny,V.,Cunningham,H.T.,Wistuba,I.I.,Tomlinson,G.,Tonk.,V,Ashfaq.,R.,Leitch,A.M.,Minna,J.D.,Shay,J.W.(1998)表征从乳腺癌患者建立的配对肿瘤和非肿瘤细胞系(Characterization of paired tumor and non-tumorcell lines established from patients with breast cancer).Int.J.Cancer.78,766-774)在补充有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养。所有癌细胞系均由亚利桑那大学遗传学中心(University of Arizona Genetics Core)(UAGC)用DNA指纹鉴定。将细胞在37℃，5％CO2下培养。用于蛋白质表达的Expi293F细胞(生命技术公司(Life Technologies)，目录号A14635)在Expi293表达培养基中于37℃，8％CO2和80％湿度下培养。
抗体、抗体-药物偶联物和葡聚糖。在该研究中使用以下抗体：大鼠抗小鼠LAMP1，小鼠抗人LAMP1和小鼠抗-β-微管蛋白抗体(杂交瘤发展研究库(Developmental StudiesHybridoma Bank)，克隆#1D4B，H4A3和E7)；小鼠抗人EEA1和大鼠抗小鼠CD31抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences)，目录号610456和557355)；与HRP偶联的山羊抗人IgG(H+L)抗体，与Alexa Fluor 488偶联的驴抗大鼠(H+L)抗体和与Cy3偶联的驴抗人IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch，目录号109-035-003,712-545-153和709-165-149)；与AlexaFluor 555偶联的山羊抗人IgG(H+L)抗体，与Alexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体和与Alexa Fluor 647偶联的山羊抗人IgG(H+L)抗体(生命技术公司(LifeTechnologies)，目录号A21433，A11029和A21445)；兔抗人Ki-67抗体(阿柏堪穆公司(Abcam)，目录号92742)。曲妥珠单抗-DM1(T-DM1，
Figure BDA0002203200080000351
)获自UT西南医学中心药房(UTSouthwestern Medical Center Pharmacy)(Dallas)。分子量为10kDa的Alexa Fluor 647标记的葡聚糖购自生命技术公司(目录号D22914)。
产生用于产生蛋白质-药物偶联物的表达构建体。用作对照，Fc区包括鸡蛋溶菌酶特异性人IgG1的铰链区(重链残基215-447；EU编号)，HuLys10(Foote,J.,Winter,G.(1992)抗体框架残基影响高变环的构象(Antibody framework residues affecting theconformation of the hypervariable loops).J.Mol.Biol.224,487-499)克隆到pcDNA3.4载体中，其中N端前导肽衍生自小鼠IgG重链(Foote,J.,Winter,G.(1992)抗体框架残基影响高变环的构象(Antibody framework residues affecting the conformationof the hypervariable loops)，J.Mol.Biol.224,487-499；Neuberger,M.S.(1983)转染淋巴细胞的免疫球蛋白重链基因的表达和调控(Expression and regulation ofimmunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells).EMBO J.2:1373-1378)。类似地，将编码HuLys10抗体的重链和轻链基因(cDNA)的基因克隆到pcDNA3.4中。对于对照IgG重链和轻链构建体，轻链中的Cys214(EU编号)，其在HuLys10的重链中与Cys220(EU编号)形成巯基桥，均使用QuikChange II位点导向的诱变试剂盒(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，目录号200523)突变为丝氨酸残基。
人膜联蛋白A1(AnxA1)，人突触结合蛋白1(Syt1)和人PKCα的cDNA克隆购自开放应用系统公司(Open Biosystems)(克隆ID：3459615，克隆ID：6187902和克隆ID：40028305)。编码AnxA1 PS结合核心结构域(氨基酸41-346)，Syt1 PS结合C2A结构域(氨基酸141-266)和PKCαPS结合C2结构域(氨基酸157-288)的基因通过Gly4Ser接头序列融合至人IgG1 Fc区的CH3结构域(残基215-447；EU编号)，其中前导肽衍生自小鼠IgG重链(Foote,J.,Winter,G.(1992)抗体框架残基影响高变环的构象(Antibody framework residues affectingthe conformation of the hypervariable loops).J.Mol.Biol.224,487-499；Neuberger,M.S.(1983)转染淋巴细胞的免疫球蛋白重链基因的表达和调控(Expressionand regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoidcells).EMBO J.2:1373-1378)。铰链区中的Cys220(EU编号)在所有Fc融合构建体中突变，使得每个铰链有两个半胱氨酸残基。将编码Fc融合体的基因克隆到pcDNA3.4载体(Invitrogen，目录号14308)中。
为了产生Syt1-Fc-Syt1，Syt1 PS结合C2A结构域(氨基酸141-266)通过Gly4Ser接头序列与Fc-Syt1构建体的铰链区的N端连接。源自小鼠IgG重链的前导肽(Foote,J.,Winter,G.(1992)抗体框架残基影响高变环的构象(Antibody framework residuesaffecting the conformation of the hypervariable loops).J.Mol.Biol.224,487-499；Neuberger,M.S.(1983)转染淋巴细胞的免疫球蛋白重链基因的表达和调控(Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfectedinto lymphoid cells).EMBO J.2:1373-1378)附连到铰链连接的Syt1 PS结合C2A结构域的N端，并将得到的Fc融合体克隆到pcDNA3.4载体中。减少Syt1 C2A结构域的突变(D173N，D179N，D231N，D233N和D239N)的PS结合(Striegel,A.R.,Biela,L.M.,Evans,C.S.,Wang,Z.,Delehoy,J.B.,Sutton,R.B.,Chapman,E.R.和Reist,N.E.2012.突触结合蛋白C2A结构域的钙结合是触发同步突触传递的静电转换的必要元素(Calcium binding bysynaptotagmin's C2A domain is an essential element of the electrostaticswitch that triggers synchronous synaptic transmission).J.Neurosci.32,1253-1260)被插入Syt1-Fc构建体中以产生Fc-Syt1(DN)并克隆到pcDNA3.4载体中。使用分子生物学的标准方法和设计的寡核苷酸产生所有构建体。
产生用于抗体-药物偶联物的表达构建体。编码HER2特异性抗体(帕妥珠单抗)的重链可变结构域和帕妥珠单抗轻链可变结构域的合成基因(Franklin,M.C.,Carey,K.D.,Vajdos,F.F.,Leahy,D.J.,de Vos,A.M.,Sliwkowski,M.X.(2004)从ErbB2-帕妥珠单抗复合物的结构深入了解ErbB信号(Insights into ErbB signaling from the structure ofthe ErbB2-pertuzumab complex).Cancer Cell,4,317-328)购自Genescript并克隆到用于产生Fab片段的表达载体中，其含有人重链恒定区结构域1(CH1)和人轻链恒定域(κ链，Cκ)。为了鉴定帕妥珠单抗重链和轻链可变结构域中的残基以靶向组氨酸扫描，在PyMOL中分析了与抗原HER2(蛋白质数据库登录号1N8Z)复合的帕妥珠单抗的晶体结构。与HER2的结构域II中的残基(His245,Val286,Ser288,Leu295,His296,和Lys311，参见Franklin,M.C.,Carey,K.D.,Vajdos,F.F.,Leahy,D.J.,de Vos,A.M.,Sliwkowski,M.X.(2004)从ErbB2-帕妥珠单抗复合物的结构深入了解Er bB信号(Insights into ErbB signaling from thestructure of the ErbB2-pertuzumab complex).Cancer Cell,4,317-328)相互作用的位于帕妥珠单抗的CDR中的残基(VH结构域：Asp31，Tyr32，Asn54，Tyr60，Leu100，Gly101，Pro102，Ser103，Tyr105，Asp107；VL结构域：Tyr55；氨基酸编号指的是帕妥珠单抗重链和轻链可变结构域的蛋白质序列中的那些，并且不涉及他编号惯例)，通过重叠延伸利用剪接系统地被组氨酸取代(Horton,R.M.,Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.,Pease,L.R.(1989)在不使用限制酶的情况下设计杂合基因：通过重叠延伸进行基因剪接(Engineering hybridgenes without the use of restriction enzymes:gene splicing by overlapextension).Gene 77,61-68)。克隆所得基因并在大肠杆菌中表达为周质分泌的Fab片段。
为了在噬菌体展示载体pHEN1中产生帕妥珠单抗scFv基因(Hoogenboom,H.R.,Griffiths,A.D.,Johnson,K.S.,Chiswell,D.J.,Hudson,P.,Winter,G.(1991)丝状噬菌体表面上的多亚基蛋白：展示抗体(Fab)重链和轻链的方法(Multi-subunit proteins onthe surface of filamentous phage:methodologies for displaying antibody(Fab)heavy and light chains).Nucl.Acids Res.19,4133-4137)，使用标准分子生物学方法修饰帕妥珠单抗的Fab片段表达载体以将接头肽[(Gly4Ser)3接头]插入重链和轻链可变结构域基因之间，然后将scFv基因重新克隆到pHEN1中。为了产生具有CDR中随机突变残基的突变帕妥珠单抗scFv的文库，使用以下寡核苷酸。对于每种寡核苷酸，DNA序列以5'至3'方向显示：CDRH1Back,GCTTCTGGATTCACATTCACANNBNNBNNBATGGATTGGGTGAGACAGG CT(SEQ IDNO:49)；CDRH1For,TGTGAATGTGAATCCAGAAGC(SEQ ID NO:50)；CDRH2Back,TGGGTGGCTGATGTGAATCCTNNBNNBNNBNNBTCTATCTACAATCAGA GATTC(SEQ ID NO:51)；CDRH2For,AGGATTCACATCAGCCACCCA(SEQ ID NO:52)；CDRH3Back,TACTACTGTGCTAGAAATCTGNNBCCTNNBTTCNNBTTCGATNNBTGGG GACAGGGAACACTG(SEQ ID NO:53)；CDRH3For,CAGATTTCTAGCACAGTAGTA(SEQ ID NO:54)；CDRL2-1Back,CCTAAGCTGCTGATCTACTCTNNBTCTNNBAGANNBACAGGAGTGCCTT CTAGA(SEQ ID NO:55)；CDRL2-1For,AGAGTAGATCAGCAGCTTAGG(SEQ ID NO:56)；CDRL2-2Back,GGAAAGGCTCCTAAGCTGCTGNNBNNBNNBGCTTCTTACAGATACACAGGA(SEQ ID NO:57)；和CDRL2-2For5,CAGCAGCTTAGGAGCCTTTCC(SEQ ID NO:58)。使用本领域技术人员已知的分子生物学方法产生scFv基因文库，并使用大肠杆菌TG1(Lucigen，目录号60502)的电穿孔针对每个所靶向的CDR产生约5×107个突变体的文库。
合并来自文库的克隆并用于在30℃下接种补充有M13KO7辅助噬菌体(NEB，目录号#N0315S)，100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的培养物过夜。通过用4％聚乙二醇8000,3％NaCl沉淀从上清液中收获挤出的噬菌体。使用4％脱脂乳/磷酸盐缓冲盐水(PBS)包被的Maxisorp 96孔微量滴定板(Thermofisher，目录号44-2404-21)预先淘选噬菌体(100μL的2×1012pfu/mL)，然后使用2μg/mL重组人HER2(细胞外结构域)-Fc融合蛋白(HER2-ECD-Fc；R&D Research，目录号#1129-ER-050)包被的Maxisorp 96细胞板进行淘选。将噬菌体与4％脱脂乳pH 7.4在96孔板中孵育2小时。用补充有0.1％Tween-20的PBS pH 7.4(PBST)然后用pH 7.4的PBS彻底洗涤平板。使用20mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)pH 5.8在室温下选择性洗脱具有pH依赖性结合的噬菌体10分钟。洗脱的噬菌体用于感染指数生长的大肠杆菌TG1。进行四轮淘选，并且筛选与pH 5.8相比在pH7.0下与HER2具有更高亲和力结合的分离的噬菌体。通过ELISA和/或表面等离振子共振分析由所选噬菌体编码的重组scFv与HER2的结合。
将与pH5.8相比在pH7.0下具有更高亲和力的帕妥珠单抗scFv或Fab片段的重链和轻链可变结构域基因克隆到盒载体中，使用pcDNA3.4作为主链载体分别表达人IgG1重链和轻链(Cκ)序列。铰链二硫键将Cκ结构域连接到铰链区，并且通过突变轻链半胱氨酸(Cys214；EU编号)和两个重链半胱氨酸(Cys220，Cys229；EU编号)为丝氨酸，从重链和轻链上除去一个将两个重链彼此连接的铰链二硫键。
为了产生编码与钙结合蛋白D9K结构域2(CalD2)融合的曲妥珠单抗的HER2特异性Fab片段的表达构建体，通过Genescript合成编码曲妥珠单抗重链和轻链可变结构域的基因(Carter,P.,Presta,L.,Gorman,C.M.,Ridgway,J.B.,Henner,D.,Wong,W.L.,Rowland,A.M.,Kotts,C.,Carver,M.E.,Shepard,H.M.(1992)用于人类癌症治疗的抗p185HER2抗体的人源化(Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy).Proc Natl Acad Sci USA,89,4285-4289)。钙结合蛋白D9K基因(Berggard,T.,Julenius,K.,Ogard,A.,Drakenberg,T.,Linse,S.(2001)通过疏水核心残基稳定蛋白质的片段互补研究(Fragment complementation studies of protein stabilization by hydrophobiccore residues).Biochemistry,5,1257-1264)通过Genescript和曲妥珠单抗Fab重链(包括铰链的一部分的VH-CH1-接头)合成，CalD2结构域基因通过重叠延伸利用剪接与Ser-Gly-Gly接头融合到一起(Horton,R.M.,Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.,Pease,L.R.(1989)在不使用限制酶的情况下设计杂合基因：通过重叠延伸进行基因剪接(Engineeringhybrid genes without the use of restriction enzymes:gene splicing by overlapextension).Gene 77,61-68)。将VH-CH1-CalD2融合蛋白基因和编码曲妥珠单抗轻链的基因(具有C端多组氨酸标签)分别克隆到pcDNA3.4载体中。
使用类似的方法产生编码与CalD2结构域融合的PSMA特异性(026)VH-CH1-接头肽的表达构建体。编码026重链和轻链可变结构域的基因(美国专利号7850971B2)由Genescript合成。通过重叠延伸利用剪接将CalD2结构域基因和026VH-CH1-接头融合在一起，并将得到的融合蛋白基因克隆到pcDNA3.4中。将编码具有C端多组氨酸标签的026轻链的基因克隆到单独的pcDNA3.4载体中。
为了产生编码与人IgG1衍生的Fc片段融合的钙结合蛋白D9K结构域1(CalD1)的表达构建体，通过重叠延伸利用剪接将Fc结构域(铰链-CH2-CH3，人IgG1衍生的)基因通过Gly-Ser-Ser接头融合至钙结合蛋白D9K结构域1基因(Horton,R.M.,Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.,Pease,L.R.(1989)在不使用限制酶的情况下设计杂合基因：通过重叠延伸进行基因剪接(Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes:gene splicing by overlap extension).Gene 77,61-68)并克隆到pcDNA3.4载体中。
蛋白质表达和纯化。使用生命科技公司(Life Technologies)的Expi293表达系统按照制造商的说明书制备重组抗体和Fc融合蛋白。简而言之，用表达构建体(上文)转染细胞6-7天，并使用蛋白G-Sepharose从培养物上清液中纯化重组PDC或ADC。用50mM二乙胺和150mM NaCl洗脱结合的蛋白质。洗脱的蛋白质用2M Tris pH 7.0中和，用PBS透析，浓缩并上样到Hiload 16/600Superdex 200凝胶过滤柱(GE Healthcare)。将蛋白质的单体形式分离，浓缩并使用Superdex 200 5/150凝胶过滤柱(GE Healthcare)或Yarra3μmSEC-3000柱(Phenomenex)进行分析。
使用上述Expi293表达系统产生曲妥珠单抗Fab-CalD2,026Fab-CalD2和CalD1-Fc融合蛋白，并使用Ni2+-NTA-琼脂糖从培养上清液中纯化重组蛋白。
使用大肠杆菌作为宿主，将曲妥珠单抗scFv和Fab片段表达为重组蛋白。将scFv和Fab片段分泌到周质中，并使用Ni2+-NTA-琼脂糖从渗透冲击的大肠杆菌细胞中纯化。
与马来酰亚胺基己酰基-val-cit-PAB-MMAE的蛋白质偶联。通过在室温下加入16摩尔当量(8摩尔当量乘以铰链二硫化物的数量)TCEP 3小时来还原PBS中的Fc融合或对照抗体，以减少铰链二硫键。然后将马来酰亚胺基己酰基-val-cit-PAB-MMAE(MC-VC-PAB-MMAE；Levena Biopharma，目录号#SET0201)以8摩尔当量(4摩尔当量乘以游离半胱氨酸的数量)加入还原的Fc融合体中，并且在室温下孵育3小时。偶联反应后，通过用PBS彻底透析蛋白质除去游离的MMAE。将偶联的Fc融合体或对照抗体储存在4℃。
为了产生ADC，使用类似的方法，只是使用8摩尔当量的TCEP和4摩尔当量的MC-VC-PAB-MMAE，因为仅存在一个铰链二硫化物。另外，将抗体在37℃下还原2小时。
表面等离振子共振分析。使用BIAcore T200(GE Healthcare)进行结合分析。使用胺偶联化学，用重组HER2-ECD-Fc(HER2细胞外结构域与免疫球蛋白Fc片段的融合体)，野生型(WT)帕妥珠单抗，突变的帕妥珠单抗变体或偶联缓冲液(10mM乙酸钠pH4.8)作为对照，偶联CM5传感器芯片的流动池。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)加0.01％(v/v)吐温-20和0.05％(v/v)NaN3(pH 7.4,7.0,6.5和5.8)中，25℃，以5或10μL/分钟的流速，将抗体注射到固定的抗体上固定的HER2-ECD-Fc上，或将HER2-ECD-Fc注射到固定的抗体上。每次注射后使用0.15MNaCl/0.1M甘氨酸(pH 2.8)缓冲液再生流动池。为了确定平衡解离常数，将抗体注射到固定的HER2-ECD-Fc上，并使用定制编写的软件将相互作用建模为1:1相互作用(Ober,R.J.,Ward,E.S.(2002)补偿表面等离振子共振实验中配体活性的丧失(Compensation for lossof ligand activity in surface plasmon resonance experiments).Anal.Biochem.,306,228-236)，以产生表观解离常数(由于抗体与固定的HER2-ECD-Fc的二价结合)。
为了研究Fab-CalD2融合蛋白和CalD1-Fc融合蛋白相互作用的钙依赖性，注射Fab-CalD2，然后是共注射在含有不同钙浓度的缓冲液中的CalD1-Fc。具体地，在PBS,0.01％(v/v)吐温-20,0.05％(v/v)NaN3 pH 7.4(PBS+)加2mM CaCl2中，25℃，以10μL/分钟的流速，将100nM曲妥珠单抗Fab-CalD2融合体注射到固定的HER2-ECD-Fc上，然后是在PBS+加2mM CaCl2中，25℃，以10μL/分钟的流速，注射100nM CalD1-Fc融合体。在解离过程期间注入具有不同浓度的CaCl2或EDTA2Na的PBS+。使用BIA评价和定制编写的软件处理数据。
用于PS靶向蛋白的膜脂质条结合测定。首先用TBST(20mM Tris,150mM NaCl,0.1％吐温20,pH 7.5)水合脂质包被的膜条(Echelon，目录号P-6002)，然后与封闭溶液(溶解在TBST中的4％不含脂肪酸的BSA)在室温下孵育1小时。将蛋白质在封闭缓冲液中以2μg/ml稀释，并在室温下与膜一起孵育2小时。然后用TBST洗涤脂质条，并使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人IgG(H+L)抗体检测结合的蛋白质。
流式细胞术分析抗体-药物偶联物的内化。将癌细胞接种在48孔板中并在37℃下孵育过夜。用10nM Alexa 488标记的ADC处理细胞0.5,4和20小时。将处理过的细胞在冰上冷却，并用5μg/mL兔抗Alexa 488抗体在4℃下淬灭Alexa 488的表面信号30分钟。洗涤样品，通过胰蛋白酶消化收获，重悬浮于PBS中，使用FACS-Accuri分析并用FlowJo(FLOWJO，LLC)处理数据。
为了分析细胞内CalD1-Fc的积累，将LNCaP细胞接种在48孔板中并使其粘附。然后用100nM Alexa 647标记的CalD1-Fc或用100nM Alexa 647标记的CalD1-Fc加100nM026Fab-CalD2的混合物脉冲LNCaP细胞1或2小时。洗涤细胞，使用胰蛋白酶-EDTA(Gibco目录号25200056)进行胰蛋白酶消化以使细胞脱附并从细胞表面结合的026Fab-CalD2解离Alexa 647-标记的CalD1-Fc。收获细胞，洗涤并使用BD Accuri C6流式细胞仪分析。
PS和HER2靶向剂的荧光显微镜分析。为了研究PS靶向剂的亚细胞定位，将2H11或MDA-MB-231细胞在盖玻片上生长(Zeiss，ref#0109030091)并与在生长培养基中稀释的50nM对照IgG(HuLys10)或50nM PS靶向剂一起孵育3小时。然后用PBS洗涤细胞，并在室温下用冰冷的4％多聚甲醛(PFA)固定20分钟。固定后，将细胞用0.1％Triton X-100透化，并在室温下与封闭缓冲液(PBS，5％血清和0.1％吐温20)一起孵育30分钟。将特异于小鼠LAMP-1(克隆1D4B)，人LAMP-1(克隆H4A3)或小鼠EEA1的一抗在封闭缓冲液中稀释，并在室温下与细胞一起孵育2小时。然后用PBST(含有0.1％吐温20的PBS)洗涤细胞，并与在封闭缓冲液中稀释的荧光标记的二抗一起在室温下孵育1小时。为了检测内化的PS靶向剂，使用荧光标记的山羊或驴抗人IgG(H+L)抗体。孵育后，用PBST洗涤细胞，并用ProLong Gold抗褪色封固剂(生命科技公司(Life Technologies)，目录号P36930)固定。使用具有63X，1.4NA平面复消色差物镜(Carl Zeiss)和1.6X内部光学放大镜(optovar)的Zeiss Axiovert 200M倒置荧光显微镜获得荧光图像。使用显微镜图像分析工具(MIATool)软件处理获取的数据(www4.utsouthwestern.edu/wardlab/miatool.asp)。
为了研究内化的靶向HER2的ADC的亚细胞命运，将MDA-MB-453细胞接种在Mattek培养皿上。用5μM Alexa 647标记的葡聚糖预处理细胞(脉冲2小时，追踪3小时)，随后用10nM Alexa 488标记的与MMAE偶联的帕妥珠单抗突变变体(SG-MMAE，YS-MMAE)或T-DM1处理20小时。将与MMAE偶联的野生型(WT)帕妥珠单抗用作对照。将样品用33.3nM兔抗Alexa488抗体(Thermofisher，目录号A11094)在冰上处理30分钟以淬灭表面荧光。将细胞用补充有0.025％戊二醛的1.7％(w/v)多聚甲醛在室温下固定10分钟。如上所述对样品进行成像和数据处理。
用于PS靶向剂的PS下拉分析。为了研究PS靶向Fc融合体与PS结合的Ca2+依赖性，将蛋白质在结合缓冲液(10mM HEPES pH 7.4和150mM NaCl，含2mM或2μMCa2+)中以100nM稀释。加入50μl PS包被的珠(Echelon，目录号P-B0PS)并在室温下孵育2小时。然后用结合缓冲液洗涤珠，并通过用HRP偶联的山羊抗人IgG(H+L)抗体进行免疫印迹检测结合的蛋白质。为了检测与PS的pH依赖性结合，将蛋白质在PBS pH 7.4或6.0中以100nM稀释。加入50μl(床体积)PS包被的珠并在室温下孵育2小时。然后用PBS洗涤珠，并通过用HRP偶联的山羊抗人IgG(H+L)抗体进行免疫印迹检测结合的蛋白质。
膜联蛋白V结合试验分析细胞上暴露的PS水平。将100万个细胞悬浮于膜联蛋白V结合溶液(10mM HEPES pH 7.4，含150mM NaCl和2.5mM CaCl2)中。将与Alexa 488Fluor偶联的膜联蛋白V(生命科技公司(Life Technologies)，目录号A13201)以1：100稀释度加入细胞悬浮液中，并在室温下与细胞一起孵育10分钟。然后用膜联蛋白V结合溶液洗涤细胞一次，并通过流式细胞术(BD FACSCalibur)分析。使用FlowJo(FLOWJO，LLC)处理流式细胞术数据。
PS靶向剂的流式细胞术分析。将细胞用胰蛋白酶消化并用流式细胞术缓冲液(PBSw/Ca2+/Mg2+和1％BSA)重悬浮。根据测定，将50nM PS靶向Fc融合体与细胞在室温或冰上孵育30分钟。用流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并与荧光团偶联的二抗一起在冰上孵育30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术(BD FACSCalibur)分析。使用FlowJo(FLOWJO，LLC)处理流式细胞术数据。
细胞生长和存活测定。将癌细胞系(2H11，MCF-7，SK-BR-3，SK-OV-3，LNCaP，22Rv1，MDA-MB-231，MDA-MB-453，MDA-MB-468和HCC1954)接种于96孔板。使细胞生长过夜，然后加入靶向PS的PDC或靶向HER2的ADC。用细胞增殖AQ单一溶液细胞增殖测定试剂盒(CellProliferation AQ One Solution Cell Proliferation Assay kit)(Promega，目录号G3581)孵育3-5天后测量细胞生长和存活。使用GraphPad Prism软件绘制剂量-响应曲线。
小鼠的全身成像，药代动力学和治疗研究。所有小鼠研究中使用的动物程序均由德克萨斯大学西南医学中心和德克萨斯A&M大学的机构动物护理和使用委员会批准。BALB/c SCID小鼠购自杰克逊实验室公司(Jackson Laboratory)(储存号001803)并在内部饲养。如前所述(19)进行药代动力学研究。简言之，在实验前96小时将Lugol溶液加入饮用水中。使用氧气中的2％异氟烷麻醉SCID BALB/c雌性小鼠(8周龄；18-22g重量)，并注射(i.v.)125I标记的蛋白质(100-120μCi，10-12μg/小鼠)。使用剂量校准器(Capintec Inc.)在不同时间点进行全身计数。
对于具有PS靶向剂的全身、近红外成像(NIR)，使用雌性裸鼠(6-7周龄；购自Envigo，目录#6903F)或BALB/c SCID小鼠(6-8周龄)。为了植入MDA-MB-231肿瘤，用氧气中的2％异氟烷麻醉小鼠，并进行小手术切割以暴露乳腺脂肪垫。将MDA-MB-231细胞用胰蛋白酶消化并分散到PBS中的单细胞悬浮液中。使用25G针将5×106个细胞/小鼠以100μl注射到乳房脂肪垫中，然后用伤口夹密封伤口。在手术后立即给予和12小时后给予50μg/kg丁丙诺啡(s.c.)。每天监测小鼠并在手术后一周取出伤口夹。对于裸鼠的成像，当肿瘤达到约150mm3的大小时将小鼠分成3组(每组n＝3只小鼠)并用氧气中的2％异氟烷麻醉。麻醉的小鼠注射(i.v.)PBS中的1nmol IRDye800CW标记的PS特异性试剂。使用Caliper XenogenIVIS谱(Perkin Elmer)体内成像系统在0小时(注射前)和注射后3,24和48小时进行荧光成像(FLI)。使用745nm激发，800nm发射，聚类(binning)8，FOV12.9cm，f-终止(f-stop)2和自动曝光进行FLI。手动绘制以概括肿瘤的FLI信号，使用以ROI表示的绝对辐射效率(光子/秒)，使用Living成像软件对数据进行定量，并标准化为肿瘤体积。为了在BALB/c SCID小鼠中成像，当肿瘤达到约300mm3的大小时，将小鼠分成3组(每组n＝3只小鼠)，并注射(i.v.)在PBS中的1nmol IRDye800CW标记的PS特异性试剂。注射后48小时，解剖肿瘤并如上成像。手动绘制以概括肿瘤的FLI信号，以ROI表示的荧光被定量并标准化为肿瘤重量。
对于使用靶向PS的PDC的肿瘤治疗研究，如在全身成像实验中所述，在BALB/cSCID小鼠中植入MDA-MBA-231肿瘤异种移植物。对于LNCaP肿瘤的植入，将7-8周龄雄性BALB/c SCID小鼠(18-22g重量)用氧气中的2％异氟烷麻醉并注射(s.c.)悬浮在50％RPMI和50％Matrigel(BD Biosciences)中的5x 106LNCaP细胞。当MDA-MBA-231或LNCaP肿瘤达到～100mm3的大小时，在处理前48小时和72小时(i.p.)给小鼠注射5mg/kg多西他赛。然后每周两次给小鼠注射(i.v.)1nmol未偶联的蛋白质，PDC或PBS载体。每周测量两次肿瘤和体重。对于使用Fc-Syt1(DN)_MMAE的治疗实验(图16D)，将小鼠处理4周并再监测2.5周。当肿瘤大小在任何维度达到2cm时终止实验。
对于HER2特异性ADC的治疗，使用针对全身成像实验描述的方法，向6-8周龄雌性BALB/c SCID小鼠植入4-5×106个MDA-MB-453细胞。当肿瘤达到～60-100mm3的大小时，每3周(总共两次剂量)给小鼠注射(i.v.)2mg/kg ADC，T-DM1，未偶联的蛋白质或PBS运载体一次。
免疫组化分析。在给予(i.v.)PBS或1nmol与MMAE偶联的Fc-Syt1之前72小时和48小时，携带MDA-MB-231肿瘤的雌性BALB/c SCID小鼠用5mg/kg多西他赛处理(i.p.)。在不同时间点，用PBS灌注小鼠，然后灌注4％PFA。然后解剖肿瘤，包埋在OCT(Fisher Scientific，目录号23-730-571)中并储存在-80℃。切割10μm组织切片并在室温下用PBS水合，然后用4％PFA固定30分钟。然后用PBS洗涤肿瘤切片，并在室温下与透化/封闭溶液(PBS+0.5％Triton X-100和3％BSA)一起孵育1小时。将人Ki-67和小鼠CD31的一抗在封闭缓冲液(PBS+0.1％吐温20+5％血清)中稀释，并在4℃下与组织切片一起孵育过夜。第二天，用PBST(PBS+0.1％吐温20)洗涤组织切片，并与在封闭缓冲液中稀释的荧光团偶联的二抗一起在室温下孵育2小时。用PBST洗涤后，用ProLong Gold抗褪色封固剂固定组织切片。使用具有40X，1.3NA平面荧光物镜的Nikon A1R共聚焦显微镜获取共聚焦图像，并用NIS-Elements软件(Nikon)处理。
实施例2.具有pH依赖性HER2结合的HER2靶向剂的产生
图4A和4B显示了两种突变的帕妥珠单抗变体靶向HER2的结合分析：SG突变体；重链可变结构域中Ser55突变为组氨酸并且Gly57突变为谷氨酸(SEQ ID NO：4)；YS突变体，轻链可变结构域中Tyr55突变为组氨酸，重链可变结构域中Ser103突变为组氨酸(SEQ ID NO：6,8)。使用表面等离振子共振获得数据。图4A显示了pH7.0和5.8的代表性传感图，1μM HER-细胞外结构域(ECD)-Fc融合体与突变变体和野生型(WT)帕妥珠单抗的相互作用。对于图4A中所示的分析，将抗体固定在流动池上。图4B显示通过在固定的HER2-ECD-Fc上注射抗体获得的WT帕妥珠单抗，SG和YS的平衡解离常数(nM)。数据表明，帕妥珠单抗的SG和YS变体都具有比WT帕妥珠单抗更强的pH依赖性结合HER2。
实施例3.HER2靶向剂在HER2表达细胞中的内化和积累
帕妥珠单抗(WT)和突变变体SG和YS通过两个铰链半胱氨酸残基偶联至马来酰亚胺基己酰基-val-cit-PAB-MMAE(MC-VC-PAB-MMAE)，药物与抗体的比率(DAR)为每个抗体2个药物，然后分析一组不同HER2表达细胞系中HER2靶向ADC(HER2-ADC)的结合和积累。图5A显示了使用Alexa 647-标记的帕妥珠单抗(实线)或Alexa 647-标记的对照抗体(虚线)和流式细胞术检测的不同癌细胞系上HER2的表达水平。图5B显示孵育0.5，4和20小时后，内化的Alexa 488标记的WT帕妥珠单抗-MMAE(WT-MMAE)，SG-MMAE，YS-MMAE，对照抗体-MMAE(C-MMAE)或曲妥珠单抗-DM1(T-DM1)的水平。使用Alexa 488特异性抗体淬灭细胞表面结合的ADC。误差棒表示标准偏差，*表示统计学上显著的差异(斯氏t检验，p<0.05)。数据显示，对于所有测试的癌细胞系，SG-MMAE和YS-MMAE相对于WT-MMAE和T-DM1累积至更高水平。还使用荧光显微镜研究了将ADC递送至表达中间水平的HER2(图5A)的MDA-MB-453癌细胞中的溶酶体(图5C)。通过用Alexa 647标记的葡聚糖脉冲追踪标记MDA-MB-453细胞中的溶酶体。随后将细胞与10nM Alexa 488标记的ADC一起孵育20小时，洗涤并使用Alexa-488特异性抗体淬灭表面信号。显微镜图像(比例尺＝3μm)显示，与WT-MMAE或T-DM1相比，溶酶体中SG-MMAE和YS-MMAE的积累水平显著更高。
实施例4.HER2-ADC对HER2阳性细胞的生长和存活的抑制
分析HER2-ADC对HER2+乳腺癌细胞活力的影响表明，SG-MMAE和YS-MMAE在降低MDA-MBA-MB-453，SK-OV-3和JIMT-1细胞的活力方面比WT帕妥珠单抗偶联MMAE(WT-MMAE)或T-DM1更有效(图6)。误差棒表示标准偏差，*表示统计学上显著的差异(斯氏t检验，p<0.05)。
实施例5.在小鼠异种移植物模型中通过HER2-ADC抑制肿瘤生长
对HER2-ADC(WT-MMAE，SG-MMAE和YS-MMAE)的药代动力学的分析表明，BALB/cSCID小鼠中SG-MMAE和YS-MMAE的体内持久性与WT-MMAE相似(图7A；n＝5只小鼠/组)。将ADC用125-I放射性标记，注射到小鼠(5只小鼠/组)中并在血液中保持放射性，并在指定的时间点测定全身水平。在携带MDA-MB-453异种移植物(中间HER2表达水平)的BALB/cSCID小鼠中用ADC进行的治疗研究表明，SG-MMAE和YS-MMAE在治疗中比WT-MMAE或T-DM1更有效(图7B)。在第17和38天(实验1；用箭头指示)或第24和45天(实验2；用箭头指示)用两剂2mg/kg ADC处理小鼠。误差棒表示标准误差，治疗终点时SG-MMAE与WT-MMAE或T-DM1；YS-MMAE与WT-MMAE或T-DM1的差异具有统计学意义上的显著性，用*表示(斯氏t检验；p<0.05；n＝5-8只小鼠/组)。总的来说，数据表明SG-MMAE和YS-MMAE具有有利的药代动力学，并且比其亲本WT帕妥珠单抗和临床批准的HER2特异性ADC T-DM1在减少肿瘤生长方面也更有效。
实施例6.具有钙依赖性缔合的ADC的产生和表征
使用表面等离振子共振，通过铰链-SGG接头在CH1结构域的C端融合钙结合蛋白D9K的结构域2(CalD2)的HER2特异性Fab片段(源自曲妥珠单抗)(曲妥珠单抗Fab-CalD2；SEQ ID NO：18，与曲妥珠单抗轻链相关，SEQ ID NO：20)与融合钙结合蛋白D9K的结构域1的人IgG1衍生的Fc片段(CalD1-Fc；SEQ ID NO：22)的相互作用证明了Ca2+依赖性结合(图8A)。传感图显示100nM曲妥珠单抗Fab-CalD2与固定的HER2-ECD结合，然后注射100nM CalD1-Fc，然后是不同浓度的Ca2+的缓冲液，范围为0-2mM(方框区域，右图中放大显示)。数据显示代表性的传感图，证明随着Ca2+浓度降低，Fab-CalD2和CalD1-Fc的解离增加。在另外的实验中，还制备了在C端经由铰链-SGG接头与CalD2融合的包括PSMA特异性VH-CH1结构域的融合蛋白(PRGX1-XG1-029；缩写为026；Schülke,N.,Varlamova,O.A.,Donovan,G.P.,Ma.,D.,Gardner,J.P.,Morrissey,D.M.,Arrigale,R.R.,Zhan,C.,Chodera,A.J.,Surowitz,K.G.,Maddon,P.J.,Heston,W.D.W.,Olson,W.C.(2003)前列腺特异性膜抗原的同源二聚体是癌症治疗的功能靶标(The homodimer of prostate-specific membrane antigen is afunctional target for cancer therapy).Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,100,1259-12595)(026-CalD2；SEQ ID NO:24)。与026轻链(SEQ ID NO：26)缔合，该CalD2融合体形成Fab-CalD2。流式细胞术分析表明，与用100nM Alexa 647标记的CalD1-Fc而不添加026-CalD2(“无Fab”)处理相比，用026-CalD2和Alexa 647标记的CalD1-Fc的混合物(各100nM)处理细胞时，荧光标记的CalD1-Fc(SEQ ID NO：22)在表达PSMA的LNCaP细胞中的积累增强(图8B)。
实施例7.PS靶向剂的产生和表征
通过将人IgG1的Fc区融合至以下PS结合结构域来产生一组PS靶向剂：膜联蛋白A1的核心结构域(AnxA1)，突触结合蛋白1的C2A结构域(Syt1)和PKCα的C2结构域。得到的融合蛋白分别命名为Fc-AnxA1，Fc-Syt1和Fc-PKCα。将PS靶向剂纯化为同源二聚体(图9，图10A；使用SDS-PAGE和HPLC评估)，并使用脂质条在脂质结合测定中与PS结合(图10B)。它们还与心磷脂结合，心磷脂位于真核细胞的线粒体内膜上，因此与靶向无关。Fc-AnxA1表现出宽的脂质结合特征并且结合中性和带负电的脂质(图10B)。重要的是，没有PS结合剂结合磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂，它们是存在于质膜外叶中的脂质。
肿瘤内皮细胞系2H11用于研究PS结合剂与细胞表面上的脂质相互作用的能力。荧光膜联蛋白V的结合显示这些细胞暴露PS并且多西他赛处理后PS暴露增加。流式细胞术分析显示，所有PS结合剂与PS阳性细胞相互作用，Fc-Syt1显示较低水平的结合(图10C；仅二抗表示二抗对照，Fc表示没有PS靶向蛋白或结构域的Fc片段)。
评估三种PS结合剂在小鼠中的药代动力学行为和肿瘤定位，以确定哪种重组蛋白适合作为蛋白质-药物偶联物(PDC)进一步开发。PS结合剂的药代动力学研究表明，Fc-Syt1在小鼠中具有显著更长的半衰期(图10D，E)。将放射性碘标记的PS靶向融合蛋白注射到小鼠(n＝5只小鼠/组)后的全身计数显示在图10D中，图10E显示每种放射性标记的蛋白质相应的曲线下面积。另外，用残留染料IRDye800CW标记蛋白质，并注射(iv)到携带MDA-MB-231异种移植物(n＝3只小鼠/组)的雌性裸鼠中，在指定的时间点成像(图10F)，在注射后48小时在提取的肿瘤中定量肿瘤荧光(图10G)。在携带肿瘤的BALB/c SCID小鼠(n＝3只小鼠/组)中进行类似的实验，48小时后，切除肿瘤并测定染料水平(图10H)。在三种PS特异性试剂中，Fc-Syt1表现出最高水平的肿瘤定位。使用单向ANOVA然后Tukey事后检验分析图10E，10G和10H的统计学显著性差异(**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001)，误差条表示SEM。
实施例8.PS靶向剂的四价性增加了靶细胞的结合和内化
在几种受体系统中，已经显示多价配体或交联配体的混合物如抗体促进受体内化和降解。为了研究亲合力在PS靶向PDC的行为中的作用，制备了含有四个Syt1 C2A结构域的四价Syt1-Fc-Syt1(在图11A中示意性地显示)。将四价蛋白质纯化为同源二聚体(图11A，B；使用SDS-PAGE和HPLC评估)。使用固定在硝酸纤维素上的脂质的结合分析证明，Syt1-Fc-Syt1对PS具有更高的亲和力/亲合力，并且具有与其二价亲本Fc-Syt1相同的脂质选择性(图11C)。与图11C中所示的结合数据一致，当使用流式细胞术分析时，四价Syt1-Fc-Syt1以显著更高的水平与2H11细胞结合(图11D)。
还研究了使用Alexa 647标记的蛋白质的Fc-Syt1和Syt1-Fc-Syt1的内化。将2H11细胞与标记的Fc-Syt1和Syt1-Fc-Syt1在冰上以不同浓度孵育以实现相似的表面结合，然后在37℃孵育以允许内化不同时间。用EDTA剥离表面结合的蛋白质(由于结合的Ca2+依赖性)，并通过流式细胞术测定内化水平(抗剥离)。这些研究表明尽管两种蛋白质都在细胞内有效积累，但四价Syt1-Fc-Syt1更快地内化(图11E)。对于图11D和11E，使用双向ANOVA然后Tukey事后检验分析统计学上显著的差异(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001)。图11D和11E中的误差条表示SEM。
荧光显微镜也用于研究Syt1-Fc融合蛋白的亚细胞运输行为。将2H11和MDA-MB-231细胞与50nM PS靶向剂或对照IgG一起孵育4小时，然后洗涤，固定并用Cy3/Alexa 555标记的抗人IgG(H+L)染色。使用LAMP-1特异性抗体，然后使用Alexa 488标记的二级偶联物检测溶酶体标记物LAMP-1。将Fc-Syt1和Syt1-Fc-Syt1内化并递送到2H11(图11F)和MDA-MB-231(图11G)细胞中的LAMP-1阳性溶酶体中。比例尺：10μm(F)和5μm(G)。
实施例9.PS-PDC的钙感受性和内体释放
Fc-Syt1和Syt1-Fc-Syt1的溶酶体运输和内化行为表明，它们可以作为偶联药物的递送载体有效。马来酰亚胺基己酰基-val-cit-PAB-MMAE与铰链半胱氨酸偶联(图12A，左图)。为了用作阴性对照，将马来酰亚胺基己酰基-val-cit-PAB-MMAE与鸡蛋溶菌酶特异性人IgG1偶联，其中轻/重链相互作用的半胱氨酸残基突变为丝氨酸。SDS-PAGE分析表明偶联已完成并导致药物与抗体的比率(DAR)为4(图12A，右图)。这通过用于Fc-Syt1_MMAE的MALDI-TOF质谱确认。由于完全偶联破坏了铰链区中的两个二硫键，使用质谱法获得了43.6kDa的分子量(图12B)。这与分别保留两个或一个二硫键的未偶联或部分偶联的蛋白质形成对比，导致表观分子量为约82kDa(图12B)。重要的是，HPLC分析证明偶联过程不会导致蛋白质聚集(图12C)。
Syt1 C2A结构域需要Ca2+用于PS结合。与细胞外Ca2+水平(1-2mM)相比，早期/分选内体中较低的Ca2+浓度(～2μM)表明，在内化后，PS靶向的PDC(PS-PDC)将从这些内体的限制膜解离。预计这种解离会导致溶酶体递送的改善。含有Syt1结构域的两种PS-PDC在含有2mMCa2+的缓冲液中与PS-珠结合，但当Ca2+浓度降低至2μM时未观察到可检测的相互作用(图12D)。此外，由于分选内体中的pH是酸性的(pH6.0-6.5)，因此分析了pH对PDC：PS相互作用的影响。两种PDC在pH范围6.0-7.4中以相似水平与PS结合(图12D)。对于图12D，使用与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG(H+L)进行免疫印迹和检测来分析珠相关蛋白质。
与证明Ca2+依赖性结合的体外结合分析一致，在MDA-MB-453细胞与100nM PS-PDC或MMAE偶联的对照孵育30分钟后，然后洗涤并用早期内体抗原1(EEA1)特异性抗体染色早期内体，进行荧光显微镜分析，显示PS-PDC存在于腔中，而不是在内化到细胞中后存在于分选内体的限制膜中(图13A)。在这些实验中使用Alexa 555标记的抗人IgG(H+L)抗体检测PS-PDC，并且在图的右侧显示已经获取和放大的早期内体的强度分析(标记为a和b)。另外，可以在递送后4小时内在溶酶体中检测到Fc-Syt1_MMAE和Syt1-Fc-Syt1_MMAE(使用LAMP-1特异性抗体检测)(图13B)。在将2H11或MDA-MB-453细胞与100nM或50nM PS-PDC分别孵育10或20小时后，两种PS-PDC均破坏2H11和MDA-MB-231细胞中的微管网络(图13C)。比例尺＝5μm(图13A)，10μm(图13B)，15μm(图13C，上图)和10μm(图13C，下图)。
实施例10.PS-PDC对PS阳性细胞的生长和存活的抑制
检测PS特异性PDC对多种细胞系生长的影响，包括肿瘤内皮细胞(2H11)，ER阳性乳腺癌(T-47D)，HER2阳性乳腺癌(SK-BR-3)，三阴性乳腺癌癌症(MDA-MB-231)，雄激素敏感性前列腺癌(LNCaP)和雄激素不敏感性前列腺癌(22Rv1)。用荧光标记的膜联蛋白V染色细胞，然后进行流式细胞术分析，结果显示所有这些细胞系都是PS阳性的(图14A)。用PS-PDC孵育细胞以剂量依赖性方式有效地抑制细胞的生长和存活(图14B)。显示了72小时(2H11)，96小时(SK-BR-3，MDA-MB-231和22Rv1)或120小时(T-47D)孵育后的细胞活力。尽管四价Syt1-Fc-Syt1_MMAE在抑制T-47D细胞生长方面比二价Fc-Syt1_MMAE更有效，但两种PDC对其他细胞系表现出相似的作用。相反，相对高浓度的与MMAE偶联的对照IgG(鸡蛋溶菌酶特异性人IgG1)导致细胞生长的抑制(图14B)，可能是由于药物的非特异性液相摄取。与PS-PDC的生长抑制作用一致，流式细胞术分析两种PDC在接近其相应的IC50的浓度下的内化，显示在孵育2小时后所有其他细胞系的行为相似，除了Syt1-Fc-Syt1_MMAE是在T-47D细胞中以更高水平内化(图14C)。对于图14C，使用双向ANOVA然后进行弗朗尼事后检验(Bonferroni posthoc test)分析统计学上显著的差异(n.s.，无显著性差异；*，p<0.05；***，p<0.001，误差条代表SEM)。此外，当以1μM的浓度添加至细胞96小时时，未偶联的PS靶向蛋白对细胞活力测定中的细胞生长没有显示出影响(图14D)。因此，数据表明基于Syt1的PDC是体外肿瘤内皮和癌细胞生长的强效抑制剂。
实施例11.在小鼠异种移植物模型中通过PS-PDC抑制肿瘤生长
研究了PS-PDC对BALB/c SCID小鼠中肿瘤异种移植物的治疗效果。在治疗之前，PS-PDC的药代动力学研究证明四价Syt1-Fc-Syt1_MMAE具有比二价Fc-Syt1_MMAE更短的半衰期(图15A，B)，可能是由于靶介导的摄取增加。图15A显示注射放射性碘标记的PS-PDC后BALB/c SCID小鼠(n＝5只小鼠/组)中的全身计数。图15B显示了图15A中所示的清除曲线的曲线下面积，使用未配对的斯氏t检验(****，p<0.0001)分析了统计学上显著的差异。为了研究它们的治疗效果，将PDC递送到携带原位MDA-MB-231乳腺肿瘤的雌性BALB/c SCID小鼠(n＝5-6只小鼠/组)中。用多西他赛预处理荷瘤小鼠，并且每周两次递送以下剂量(相当于1nmol蛋白质)的PDC或对照未偶联的蛋白质：4.1mg/kg的Fc-Syt1或Fc-Syt1_MMAE，5.6mg/kg的Syt1-Fc-Syt1或Syt1-Fc-Syt1_MMAE。在这些实验中，二价Fc-Syt1_MMAE有效地阻断了乳腺肿瘤的生长(图15C)。四价Syt1-Fc-Syt1_MMAE也抑制肿瘤生长，但不如二价Fc-Syt1_MMAE有效。未偶联的Fc-Syt1和Syt1-Fc-Syt1的处理对肿瘤生长没有影响(图15C)。重要的是，没有观察到任何治疗组的衰弱或体重减轻(图15D)，表明PS特异性PDC在体内具有良好的耐受性。
与乳腺肿瘤模型中的功效类似，二价Fc-Syt1_MMAE完全阻断已经用多西他赛预处理的携带前列腺癌LNCaP异种移植物的雄性BALB/c SCID小鼠中的肿瘤生长(图15E)。按照MDA-MB-231异种移植实验(上文)对荷瘤小鼠进行处理。与体外数据一致(图14D)，未偶联的PS靶向融合蛋白没有作用。然而，四价Syt1-Fc-Syt1_MMAE在LNCaP模型中没有显著抑制肿瘤生长。对这种差异最可能的解释是四价PDC的体内持久性较短。对于图15C和15E，使用单向ANOVA然后进行弗朗尼事后检验(*，p<0.05；***，p<0.001；****，p<0.0001)分析治疗终点的统计学分析。图15A，15C和15E中的误差棒表示SEM。
实施例12.通过Fc-Syt1_MMAE抑制肿瘤生长依赖于PS结合
为排除药物通过非特异性机制(例如增强的渗透性和保留(EPR)效应)在肿瘤中累积的可能性并显示体内功效依赖于PS结合，制备对于PS具有降低的亲和力的突触结合蛋白1C2A结构域的突变变体。突触结合蛋白1的C2A结构域通过在结构域环I和III中由五个天冬氨酸(D)螯合的三个Ca2+离子与PS相互作用(Striegel,A.R.,Biela,L.M.,Evans,C.S.,Wang,Z.,Delehoy,J.B.,Sutton,R.B.,Chapman,E.R.和Reist,N.E.2012.突触结合蛋白C2A结构域的钙结合是触发同步突触传递的静电转换的必要元素(Calcium binding bysynaptotagmin's C2A domain is an essential element of the electrostaticswitch that triggers synchronous synaptic transmission).J.Neurosci.32,1253-1260)。为了消除Ca2+结合，将所有五个天冬氨酸残基(D173N，D179N，D231N，D233N和D239N)突变为天冬酰胺(N)以产生Fc-Syt1(DN)。纯化Fc-Syt1(DN)并以DAR为4与MMAE偶联(图16A)，使用脂质包被的硝酸纤维素条在蛋白质-脂质叠加测定中以必要背景水平与PS相互作用(图16B)。此外，流式细胞术分析证明，与其野生型对应物相比，Fc-Syt1(DN)与PS阳性细胞的结合显著降低(图16C)。在图16C中，使用双向ANOVA然后Tukey事后检验分析统计学上显著的差异(***，p<0.001；****，p<0.0001)，误差条表示SEM。
带有原位MDA-MB-231肿瘤的BALB/c SCID小鼠(n＝6只小鼠/组)在用PS-PDC或对照处理4周之前用多西他赛预处理，直到对照(PBS)组中的小鼠由于肿瘤太大而被安乐死。小鼠每周处理两次，持续4周(第28-56天)，剂量如下(相对于1nmol蛋白质)：4.1mg/kg的Fc-Syt1_MMAE或Fc-Syt1(DN)_MMAE，2.6mg/kg的Fc-MMAE。用Fc-Syt1_MMAE处理MDA-MB-231肿瘤导致有效的生长抑制(图16D)。更重要的是，在4周时停止递送Fc-Syt1_MMAE后，肿瘤生长仍然受到抑制。治疗终点的Fc-Syt1_MMAE和Fc-Syt1(DN)_MMAE治疗组之间的统计学显著性差异使用单向ANOVA，然后进行弗朗尼事后检验(***，p<0.001)，误差条表示SEM。在实验结束时分离来自每组内小鼠的肿瘤，在Fc-Syt1_MMAE处理组中六只小鼠中的三只不能分离出肿瘤(图16E)。尽管Fc_MMAE或Fc-Syt1(DN)_MMAE的递送最初减缓肿瘤生长，但在治疗结束后观察到快速增殖(图16D)。总的来说，数据表明PS结合对于Fc-Syt1_MMAE的活性是必需的。
实施例13.Fc-Syt1_MMAE靶向多种细胞类型，包括肿瘤组织中的肿瘤内皮和癌细 胞
为了进一步证实Fc-Syt1_MMAE在多西他赛处理后结合肿瘤组织中的PS阳性细胞，在将该PDC递送至荷瘤小鼠后1小时(图17A)或24小时(图17B)进行免疫组织化学。注射PBS作为运载体对照，并使用Alexa 555标记的抗人IgG(H+L)检测Fc-Syt1_MMAE。Fc-Syt1_MMAE定位于CD31阳性血管(图17A)，肿瘤细胞和肿瘤浸润性F4/80阳性巨噬细胞(图17B)，它们能暴露PS。数据表明癌细胞不仅在体外暴露PS(图14A)，而且在体内保留了这种PS不对称性的丧失。
实施例14.示例性抗体-药物偶联物，蛋白质-药物偶联物的DNA和蛋白质序列
表1显示了编码本文所述的示例性蛋白质的多核苷酸的DNA序列，表2显示了由表1中所示的多核苷酸编码的示例性蛋白质的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的DNA序列编码SEQ ID NO:2的蛋白质，SEQ ID NO:3的DNA序列编码SEQ ID NO:4的蛋白质，SEQ ID NO:5的DNA序列编码SEQ ID NO:6的蛋白质，SEQ ID NO:7的DNA序列编码SEQ ID NO:8的蛋白质，SEQ ID NO:9的DNA序列编码SEQ ID NO:10的蛋白质，SEQ ID NO:11的DNA序列编码SEQ IDNO:12的蛋白质，SEQ ID NO:13的DNA序列编码SEQ ID NO:14的蛋白质，SEQ ID NO:15的DNA序列编码SEQ ID NO:16的蛋白质，SEQ ID NO:17的DNA序列编码SEQ ID NO:18的蛋白质，SEQ ID NO:19的DNA序列编码SEQ ID NO:20的蛋白质，SEQ ID NO:21的DNA序列编码SEQ IDNO:22的蛋白质，SEQ ID NO:23的DNA序列编码SEQ ID NO:24的蛋白质，SEQ ID NO:25的DNA序列编码SEQ ID NO:26的蛋白质，SEQ ID NO:27的DNA序列编码SEQ ID NO:28的蛋白质，SEQ ID NO:29的DNA序列编码SEQ ID NO:30的蛋白质，SEQ ID NO:31的DNA序列编码SEQ IDNO:32的蛋白质，SEQ ID NO:33的DNA序列编码SEQ ID NO:34的蛋白质，SEQ ID NO:35的DNA序列编码SEQ ID NO:36的蛋白质，SEQ ID NO:37的DNA序列编码SEQ ID NO:38的蛋白质，SEQ ID NO:39的DNA序列编码SEQ ID NO:40的蛋白质，SEQ ID NO:41的DNA序列编码SEQ IDNO:42的蛋白质，SEQ ID NO:42的DNA序列编码SEQ ID NO:44的蛋白质，SEQ ID NO:45的DNA序列编码SEQ ID NO:46的蛋白质，SEQ ID NO:47的DNA序列编码SEQ ID NO:48的蛋白质。
表1：编码示例性蛋白质的多核苷酸的DNA序列
Figure BDA0002203200080000571
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Figure BDA0002203200080000741
表2：示例性蛋白质的氨基酸序列
Figure BDA0002203200080000742
Figure BDA0002203200080000751
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Figure BDA0002203200080000791
Figure BDA0002203200080000801
SEQ ID NO：1的DNA序列是编码HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性轻链(SEQ IDNO：2)的多核苷酸，其中Cys214突变为丝氨酸，并且例如被配置用于与帕妥珠单抗的SG重链变体(SEQ ID NO：4)形成异二聚体。
具体说，HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性轻链(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-108处的HER2特异性VL结构域和残基109-214处的免疫球蛋白CL结构域(人Cκ)。通常与免疫球蛋白重链配对的半胱氨酸残基(214)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：2中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：3的DNA序列是编码HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性重链(SEQ IDNO：4)的多核苷酸，其中Cys222和Cys231突变为丝氨酸，并具有SG突变。编码的重链(SEQ IDNO：4)被配置为例如与帕妥珠单抗的轻链变体(SEQ ID NO：2)形成异二聚体，以产生帕妥珠单抗的SG变体。
具体说，SEQ ID NO：4的示例性抗体重链的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-119处的HER2特异性VH结构域，残基120-216处的免疫球蛋白CH1结构域(人IgG1衍生的)，残基217-232处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基233-342处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基343-449处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。SEQ ID NO：4的示例性HER2特异性抗体重链具有Ser55和Gly57分别突变为组氨酸和谷氨酸的突变(SG突变)。通常与免疫球蛋白轻链配对并形成铰链巯基桥的半胱氨酸残基(222和231)已突变为丝氨酸。SEQ ID NO：4中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：5的DNA序列是编码HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性轻链(SEQ IDNO：6)的多核苷酸，其中Cys214突变为丝氨酸和Tyr55突变为组氨酸。编码的轻链(SEQ IDNO：6)被配置为例如与帕妥珠单抗的YS重链变体(SEQ ID NO：8)形成异二聚体。
具体说，HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性轻链(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-108处的HER2特异性VL结构域和残基109-214处的免疫球蛋白CL结构域(人Cκ)。SEQ ID NO：6的示例性HER2特异性抗体轻链具有残基55至组氨酸的突变。通常与免疫球蛋白重链配对的半胱氨酸残基(214)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：6中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：7的DNA序列是编码HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性重链(SEQ IDNO：8)的多核苷酸，其中Cys222和Cys231突变为丝氨酸，Ser103突变为组氨酸。编码的重链(SEQ ID NO：8)被配置为例如与帕妥珠单抗的轻链变体(SEQ ID NO：6)形成异二聚体，以产生帕妥珠单抗的YS变体。
具体说，SEQ ID NO：8的示例性抗体重链的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-119处的HER2特异性VH结构域，残基120-216处的免疫球蛋白CH1结构域(人IgG1衍生的)，残基217-232处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基233-342处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基343-449处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。SEQ ID NO：8的示例性HER2特异性抗体重链具有残基103至组氨酸的突变。通常与免疫球蛋白轻链配对并形成铰链巯基桥的半胱氨酸残基(222和231)已突变为丝氨酸。SEQ ID NO：8中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：9的DNA序列是编码与免疫球蛋白Fc片段的N端融合的HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性单链Fv(SEQ ID NO：10)的多核苷酸，其中Cys251和Cys260突变为丝氨酸，并具有SG突变。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：10)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：10的示例性抗体重链的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-119处的HER2特异性VH结构域，残基120-134处的(G4S)3接头肽，残基135-242处的HER2特异性VL结构域，残基243-245处的GGS接头肽，残基246-261处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基262-371处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基372-478处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。SEQ ID NO：10的示例性HER2特异性抗体scFv-重链融合体具有Ser55和Gly57分别突变为组氨酸和谷氨酸的突变(SG突变)。通常与免疫球蛋白轻链配对并形成铰链巯基桥的半胱氨酸残基(251和260)已突变为丝氨酸。SEQ ID NO：10中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：11的DNA序列是编码与免疫球蛋白Fc片段的N端融合的HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性单链Fv(SEQ ID NO：12)的多核苷酸，其中Cys251和Cys260突变为丝氨酸，并具有YS突变。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：12)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：12的示例性抗体重链的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-119处的HER2特异性VH结构域，残基120-134处的(G4S)3接头肽，残基135-242处的HER2特异性VL结构域，残基243-245处的GGS接头肽，残基246-261处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基262-371处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基372-478处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。SEQ ID NO：12的示例性HER2特异性抗体scFv-重链融合体具有Ser103和Tyr189至组氨酸的突变(YS突变)。通常与免疫球蛋白轻链配对并形成铰链巯基桥的半胱氨酸残基(251和260)已突变为丝氨酸。SEQ ID NO：12中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：13的DNA序列是编码与免疫球蛋白Fc片段的C端融合的HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性单链Fv(SEQ ID NO：14)的多核苷酸，其中Cys6和Cys15突变为丝氨酸，并具有SG突变。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：14)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：14的示例性抗体重链的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-16处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基17-126处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基127-233处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)，残基234-236处的GGS接头肽，残基237-355处的HER2特异性VH结构域，残基356-370处的(G4S)3接头肽，残基371-478处的HER2特异性VL结构域。SEQ ID NO：14的示例性HER2特异性抗体scFv-重链融合体具有Ser291和Gly293分别突变为组氨酸和谷氨酸的突变(SG突变)。通常与免疫球蛋白轻链配对并形成铰链巯基桥的半胱氨酸残基(6和15)已突变为丝氨酸。SEQ ID NO：14中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：15的DNA序列是编码与免疫球蛋白Fc片段的C端融合的HER2特异性抗体帕妥珠单抗的示例性单链Fv(SEQ ID NO：16)的多核苷酸，其中Cys6和Cys15突变为丝氨酸，并具有YS突变。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：16)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：16的示例性抗体重链的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-16处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基17-126处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基127-233处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)，残基234-236处的GGS接头肽，残基237-355处的HER2特异性VH结构域，残基356-370处的(G4S)3接头肽，残基371-478处的HER2特异性VL结构域。SEQ ID NO：16的示例性HER2特异性抗体scFv-重链融合体具有Ser339和Tyr425至组氨酸的突变(YS突变)。通常与免疫球蛋白轻链配对并形成铰链巯基桥的半胱氨酸残基(6和15)已突变为丝氨酸。SEQ ID NO：16中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：17的DNA序列是编码示例性CalD2融合蛋白(SEQ ID NO：18)的多核苷酸，所述融合蛋白包括通过包括免疫球蛋白铰链的一部分(Cys223突变为丝氨酸)和SGG的接头肽与钙结合蛋白结构域2(CalD2)的N端融合的HER2特异性抗体曲妥珠单抗的VH结构域和CH1结构域。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：18)被配置为例如与曲妥珠单抗的轻链(SEQ IDNO：20)形成异二聚体，并以Ca2+依赖性方式与SEQ ID NO：22缔合。
具体说，SEQ ID NO：18的示例性CalD2融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-120处的HER2特异性VH结构域，残基121-217处的免疫球蛋白CH1结构域(人IgG1衍生的)，残基218-228处的包括重链铰链区的一部分然后是残基229-231处的SGG序列的接头序列和残基232-263处的CalD2结构域。通常与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(223)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：18中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：19的DNA序列是编码HER2特异性抗体曲妥珠单抗的示例性轻链(SEQID NO：20)的多核苷酸，其中Cys214突变为丝氨酸。编码的轻链(SEQ ID NO：20)被配置为例如与曲妥珠单抗VH-CH1:CalD2融合蛋白(SEQ ID NO：18)形成异二聚体。
具体说，HER2特异性抗体曲妥珠单抗的示例性轻链(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-108处的HER2特异性VL结构域和残基109-214处的免疫球蛋白CL结构域(人Cκ)然后是残基215-220处的六组氨酸肽标签。通常与免疫球蛋白重链配对的半胱氨酸残基(214)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：20中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：21的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的N端的钙结合蛋白结构域1(CalD1)的示例性CalD1融合蛋白(SEQ ID NO：22)的多核苷酸，其中Cys 52突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：22)被配置为例如以Ca2+-依赖性方式与曲妥珠单抗VH-CH1:CalD2融合蛋白(SEQ ID NO：18)或026VH-CH1:CalD2融合蛋白(SEQ ID NO:24)缔合。
具体说，SEQ ID NO：22的示例性CalD1融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-43处的CalD1结构域，残基44-46处的GSS接头肽，残基47-62处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基63-172处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基173-279处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。通常与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(52)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：22中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：23的DNA序列是编码示例性CalD2融合蛋白(SEQ ID NO:24)的多核苷酸，所述融合蛋白包括通过包括免疫球蛋白铰链的一部分(Cys227突变为丝氨酸)和SGG的接头肽与钙结合蛋白结构域2(CalD2)的N端融合的PSMA-特异性抗体026的VH结构域和CH1结构域。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：24)被配置为例如与026的轻链(SEQ ID NO：26)形成异二聚体，并以Ca2+依赖性方式与SEQ ID NO：22缔合。
具体说，SEQ ID NO：24的示例性CalD2融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-124处的PSMA-特异性VH结构域，残基125-221处的免疫球蛋白CH1结构域(人IgG1衍生的)，包括残基222-232处的重链铰链区的一部分然后是残基233-235处的SGG序列的接头序列和残基236-267处的CalD2结构域。通常与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(227)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：24中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：25的DNA序列是编码PSMA特异性抗体026的示例性轻链(SEQ ID NO：26)的多核苷酸，其中Cys214突变为丝氨酸。编码的轻链(SEQ ID NO：26)被配置为例如与026VH-CH1:CalD2融合蛋白(SEQ ID NO：24)形成异二聚体。
具体说，PSMA-特异性抗体026的示例性轻链(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-108处的HER2特异性VL结构域和残基109-214处的免疫球蛋白CL结构域(人Cκ)然后是残基215-220处的六组氨酸肽标签。通常与免疫球蛋白重链配对的半胱氨酸残基(214)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：26中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：27的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的C端的突触结合蛋白的Syt1 C2A结构域的示例性Fc融合蛋白(SEQ ID NO：28)的多核苷酸，其中Cys 6突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：28)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：28的示例性Fc-Syt1的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-16处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基17-126处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基127-233处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。突触结合蛋白(Syt1)的C2APS-结合结构域的残基141-266通过GGGGS接头肽(残基234-238)作为残基239-364融合至CH3结构域的C端。与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(6)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：28中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：29的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的N端和C端的突触结合蛋白的Syt1 C2A结构域的示例性Fc融合蛋白(SEQ ID NO：30)的多核苷酸，其中Cys137突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：30)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：30的示例性Syt1-Fc-Syt1的氨基酸序列从N端到C端具有残基132-147处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基148-257处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基258-364处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。突触结合蛋白(Syt1)的C2A PS-结合结构域的残基141-266通过GGGGS接头肽(残基127-131和365-369)分别作为残基1-126和370-495融合至铰链和CH3结构域的N端和C端。与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(137)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：30中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：31的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的C端的PKCα的C2结构域的示例性Fc融合蛋白(SEQ ID NO：32)的多核苷酸，其中Cys 6突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：32)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：32的示例性Fc-PKCα的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-16处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基17-126处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基127-233处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。PKCα的C2结构域的残基157-288通过GGGGS接头肽(残基234-238)作为残基239-370融合至CH3结构域的C端。与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(6)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：32中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：33的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的C端的AnxA1 PS-结合核心结构域的示例性Fc融合蛋白(SEQ ID NO：34)的多核苷酸，其中Cys 6突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：34)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：34的示例性Fc-AnxA1的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-16处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基17-126处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基127-233处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。AnxA1核心结构域的残基41-346通过GGGGS接头肽(残基234-238)作为残基239-544融合至CH3结构域的C端。与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(6)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：34中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：35的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的N端的突触结合蛋白的Syt1 C2A结构域的示例性Fc融合蛋白(SEQ ID NO：36)的多核苷酸，其中Cys 137突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：36)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：36的示例性Syt1-Fc的氨基酸序列从N端到C端具有突触结合蛋白(Syt1)的C2A PS-结合结构域的残基141-266作为残基1-126，残基127-131处的GGGGS接头肽，残基127-131处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基148-257处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基258-364的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(137)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：36中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：37的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的N端的PKCα的C2结构域的示例性Fc融合蛋白(SEQ ID NO：38)的多核苷酸，其中Cys 143突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：38)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：38的示例性PKCα-Fc的氨基酸序列从N端到C端具有PKCα的C2结构域的残基157-288作为残基1-132，残基133-137处的GGGGS接头肽，残基138-153处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基154-263处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基264-370的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(143)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：38中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：39的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的N端的AnxA1 PS-结合核心结构域的示例性Fc融合蛋白(SEQ ID NO：40)的多核苷酸，其中Cys 317突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO：40)被配置为形成同源二聚体。
具体说，SEQ ID NO：40的示例性AnxA1-Fc的氨基酸序列从N端到C端具有AnxA1核心结构域的残基41-346作为残基1-306，残基307-311处的GGGGS接头肽，残基312-327处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基328-437处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基438-544的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(317)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：40中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：41的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的N端和C端的突触结合蛋白的Syt1 C2A结构域的示例性Fc融合蛋白(SEQ ID NO：42)的多核苷酸，其具有旋钮进孔突变并且Cys 137突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO:42)被配置为例如与示例性Fc片段(SEQ ID NO:44)形成异二聚体。
具体说，SEQ ID NO：42的示例性Syt1-Fc-Syt1的氨基酸序列从N端到C端具有残基132-147处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基148-257处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基258-364处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。突触结合蛋白(Syt1)的C2A PS-结合结构域的残基141-266通过GGGGS接头肽(残基127-131和365-369)分别作为残基1-126和370-495融合至铰链和CH3结构域的N端和C端。SEQ ID NO：42的示例性Syt1-Fc-Syt1在残基266和311处具有“旋钮进孔”突变。与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(137)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：42中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：43的DNA序列是编码具有旋钮进孔突变并且Cys6突变为丝氨酸的示例性Fc片段(SEQ ID NO：44)的多核苷酸。SEQ ID NO:44的Fc片段被配置为例如与示例性Syt1-Fc-Syt1融合体(SEQ ID NO:42)形成异二聚体。
具体说，SEQ ID NO：44的示例性Fc片段的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-16处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基17-126处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基127-233处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。SEQ ID NO：44的示例性Fc片段在残基150和191处具有“旋钮进孔”突变。通常与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(6)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：44中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：45的DNA序列是编码包括融合至免疫球蛋白Fc片段的N端和C端的突触结合蛋白的Syt1 C2A结构域的示例性Fc融合蛋白(SEQ ID NO：46)的多核苷酸，其具有旋钮进孔突变、静电转向突变并且Cys 137突变为丝氨酸。编码的融合蛋白(SEQ ID NO:46)被配置为例如与示例性Fc片段(SEQ ID NO:48)形成异二聚体。
具体说，SEQ ID NO：46的示例性Syt1-Fc-Syt1的氨基酸序列从N端到C端具有残基132-147处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基148-257处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基258-364处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。突触结合蛋白(Syt1)的C2A PS-结合结构域的残基141-266通过GGGGS接头肽(残基127-131和365-369)分别作为残基1-126和370-495融合至铰链和CH3结构域的N端和C端。SEQ ID NO：46的示例性Syt1-Fc-Syt1在残基266和311处具有“旋钮进孔”突变并且在残基309和326处具有静电转向突变。与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(137)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：46中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
SEQ ID NO：47的DNA序列是编码具有旋钮进孔突变、静电转向突变并且Cys6突变为丝氨酸的示例性Fc片段(SEQ ID NO：48)的多核苷酸。SEQ ID NO:48的Fc片段被配置为例如与示例性Syt1-Fc-Syt1融合体(SEQ ID NO:46)形成异二聚体。
具体说，SEQ ID NO：48的示例性Fc片段的氨基酸序列从N端到C端具有残基1-16处的免疫球蛋白铰链(人IgG1衍生的)，残基17-126处的免疫球蛋白CH2结构域(人IgG1衍生的)，残基127-233处的免疫球蛋白CH3结构域(人IgG1衍生的)。SEQ ID NO：48的示例性Fc片段在残基150和191处具有旋钮进孔突变并且在残基143和185处具有静电转向突变。通常与免疫球蛋白轻链配对的半胱氨酸残基(6)突变成丝氨酸。SEQ ID NO：48中提到的氨基酸残基编号是蛋白质序列的编号，并不是指EU编号惯例。
以上公开的主题应被认为是说明性的,而非限制性的，并且所附权利要求旨在覆盖所有落入本公开的真正精神和范围内的这样的修改、改进和其它实施方式。因此，在法律允许的最大程度上，本公开的范围将由所附权利要求及其等同形式的可允许的最宽泛解释来确定，并且不应受前述详细描述的限制或约束。
上述各种方法和技术提供了许多方式来执行应用。当然，应该理解，根据本文描述的任何特定实施例，不一定能够实现所描述的所有目标或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，可以以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式执行所述方法，而不必实现本文所教导或建议的其他目的或优点。本文提到了各种替代方案。应当理解，一些优选实施例具体包括一个、另一个或几个特征，而其他优选实施例具体地排除一个、另一个或几个特征，同时其他优选实施例通过包括一个、另一个或几个有利特征来弱化特定特征。
此外，技术人员将认识到来自不同实施方式的各种特征的适用性。类似地，本领域普通技术人员可以以各种组合采用上面讨论的各种元件、特征和步骤，以及每个这样的元件、特征或步骤的其他已知等同物，以根据所描述的原理执行方法。在各种元件、特征和步骤中，将特别包括一些，并且在不同实施例中特别排除其他元件、特征和步骤。
尽管已经在某些实施例和示例的上下文中公开了本申请，但是本领域技术人员将理解，本申请的实施例超出了具体公开的实施例，延伸到其他替换实施例和/或其使用和修改及其等同物。
在一些实施方式中，用于描述和要求保护本申请某些实施方式的表示成分的量，性质如分子量，反应条件等的数字应理解为在某些情况下通过术语“约”修饰。因此，在一些实施方式中，书面说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方式试图获得的所需性质而变化。在一些实施方式中，数值参数应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本申请的一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中列出的数值尽可能精确地报告。
在一些实施方式中，在描述本申请的特定实施方式的背景中使用的术语“一”和“一个”和“该”和类似的参考文献(特别是在某些以下权利要求的上下文中)可以被解释为涵盖单数和复数。本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值被并入说明书中，如同其在本文中单独引用一样。本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非另有说明或者与上下文明显矛盾。关于本文的某些实施例提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本申请，而不是对要求保护的本申请的范围构成限制。说明书中的所有语言都不应解释为指示对本发明实践所必需的非权利要求的要素。
本文描述了本发明的优选实施方式，包括本发明人已知的实施本发明所需的最佳模式。首选体现的变化对阅读描述的本领域的专家来说是显而易见的。预期技术人员可以适当地采用这些变化，并且可以以不同于本文具体描述的方式实施本申请。因此，本申请的许多实施方式包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。而且，所有可能的变型中上述要素的任意组合包括在本发明范围内，除非另有说明或者清楚指出相反。
本文引用的所有专利，专利申请，专利申请的出版物和其他材料，例如文章，书籍，说明书，出版物，文件，物品和/或类似物，在此通过引用整体并入本文用于所有目的，除了与其相关的任何起诉文件历史，与本文件不一致或相冲突的任何相同的起诉文件历史，或者对于现在或以后与现在相关的权利要求的最宽范围可能具有限制性影响的任何相同的起诉文件历史文献之外。举例来说，如果与任何所结合的材料相关联的术语的描述，定义和/或使用与本文档相关的术语，描述，定义和/或之间存在任何不一致或冲突，使用本文件中的术语为准。
应理解，本文公开的申请的实施方式说明了本申请的实施方式的原理。可以采用的其他修改可以在本申请的范围内。因此，作为示例而非限制，可以根据本文的教导利用本申请的实施例的替代配置。因此，本申请的实施例不限于精确地如所示和所述的那些。

Claims (69)

1.一种内溶酶体靶向偶联物，包含：
靶向组分，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其中所述靶向组分被配置为与靶细胞的内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更低的解离常数结合靶细胞的细胞表面分子；和
载物组分，所述载物组分包括与抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域偶联的载物分子；
其中，
所述靶向组分与所述载物组分直接或间接融合；
在进入内溶酶体区室后，所述靶向组分被配置为从细胞表面分子解离；和
所述内溶酶体靶向偶联物被配置为将载物分子递送至靶细胞的内溶酶体区室。
2.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为在细胞外空间中以小于500nM的解离常数结合细胞表面分子。
3.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为与酸性内溶酶体pH相比在近中性的pH下以更低的解离常数结合细胞表面分子。
4.如权利要求3所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述近中性pH为约6.8至约7.5，所述酸性内溶酶体pH为约5.0至约6.5。
5.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为与内溶酶体Ca2+浓度相比在细胞外Ca2+浓度下以更低的解离常数结合细胞表面分子。
6.如权利要求5所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述细胞外Ca2+浓度为约2mM，所述内溶酶体Ca2+浓度为约2μM。
7.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为在细胞外空间中以小于500nM的解离常数结合细胞表面分子。
8.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分是蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为与酸性内溶酶体pH相比在近中性的pH下以更低的解离常数结合细胞表面分子。
9.如权利要求8所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述近中性pH为约6.8至约7.5，所述酸性内溶酶体pH为约5.0至约6.5。
10.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为与内溶酶体Ca2+浓度相比在细胞外Ca2+浓度下以更低的解离常数结合细胞表面分子。
11.如权利要求10所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述细胞外Ca2+浓度为约2mM，所述内溶酶体Ca2+浓度为约2μM。
12.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物组分包括抗体、抗体片段或抗体结构域，包括抗体Fc区或抗体Fc片段的结构域。
13.如权利要求12所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述抗体Fc区或抗体Fc片段的结构域源自人IgG1。
14.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物组分包括白蛋白分子或白蛋白的结构域。
15.如权利要求3所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括HER2特异性抗体的Fab片段或scFv片段，其中Fab片段或scFv片段的重链可变结构域包括Ser55至组氨酸和Gly57至谷氨酸的突变。
16.如权利要求3所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括HER2特异性抗体的Fab片段或scFv片段，其中Fab片段或scFv片段中重链可变结构域包括Ser103至组氨酸的突变并且轻链可变结构域包括Tyr55至组氨酸的突变。
17.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其包括至少第一靶向组分和第二靶向组分，其中第一靶向组分被配置为与第二靶向组分结合不同的细胞表面分子。
18.如权利要求17所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述第一和第二靶向组分融合至两个免疫球蛋白Fc片段的异二聚体。
19.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括磷脂酰丝氨酸结合蛋白，所述靶细胞是细胞表面上具有磷脂酰丝氨酸的细胞。
20.如权利要求19所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述磷脂酰丝氨酸结合蛋白选自：AnxA1的核心结构域，Syt1的C2A结构域和PKCα的C2结构域。
21.如权利要求20所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述磷脂酰丝氨酸结合蛋白是Syt1的C2A结构域。
22.如权利要求21所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括两个Syt1的C2A结构域。
23.如权利要求21所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括四个Syt1的C2A结构域。
24.如权利要求21所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括超过四个Syt1的C2A结构域。
25.如权利要求19所述的内溶酶体靶向偶联物，其中：
所述靶向组分包括磷脂酰丝氨酸结合蛋白；
所述载物组分包括人IgG1的Fc部分；和
所述靶向组分与所述载物组分通过接头蛋白共价融合。
26.如权利要求25所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述接头蛋白是Gly4Ser接头。
27.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物分子是细胞毒性药物。
28.如权利要求27所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述细胞毒性药物是MMAE。
29.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物分子是成像标记物。
30.一种内溶酶体靶向偶联物，其包括：
靶向组分，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其中靶向组分被配置为结合靶细胞的细胞表面分子；和
载物组分，所述载物组分包括与抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域偶联的载物分子；
其中，
所述靶向组分被配置为与靶细胞的内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更低的解离常数结合所述载物组分；
在进入内溶酶体区室后，所述靶向组分被配置为与所述载物组分解离；和
所述内溶酶体靶向偶联物被配置为将载物分子递送至靶细胞的内溶酶体区室。
31.如权利要求30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分被配置为与酸性内溶酶体pH相比在近中性的pH下以更低的解离常数结合载物组分。
32.如权利要求31所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述近中性pH为约6.8至约7.5，所述酸性内溶酶体pH为约5.0至约6.5。
33.如权利要求30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分被配置为与内溶酶体Ca2+浓度相比在细胞外Ca2+浓度下以更低的解离常数结合载物组分。
34.如权利要求33所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述细胞外Ca2+浓度为约2mM，所述内溶酶体Ca2+浓度为约2μM。
35.如权利要求33所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括钙结合蛋白D9K结构域2，所述载物组分包括钙结合蛋白D9K结构域1。
36.如权利要求35所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，钙结合蛋白D9K结构域1通过接头肽融合至载物组分和/或钙结合蛋白D9K结构域2通过接头肽融合至靶向组分。
37.如权利要求30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物分子是细胞毒性药物。
38.如权利要求37所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述细胞毒性药物是MMAE。
39.如权利要求30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物分子是成像标记物。
40.一种组合物，其包含如权利要求1或权利要求30所述的内溶酶体靶向偶联物以及药学上可接受的运载体。
41.一种治疗癌症的方法，其包括：
给予对象有效剂量的如权利要求40所述的组合物；
其中，
载物分子是细胞毒性药物；和
给予组合物抑制对象中肿瘤的生长。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述组合物包含至少一种内溶酶体靶向偶联物，其被配置为靶向包括一种或多种类型的靶细胞的肿瘤。
43.一种在对象中进行肿瘤成像的方法，包括：
给予对象有效剂量的如权利要求40所述的组合物，其中所述载物分子是成像标记物；和
执行适用于检测对象中的成像标记物的成像方法；
其中，
给予组合物提供通过成像方法可检测的足够浓度的成像标记物。
44.一种提供用于治疗癌症的内溶酶体靶向偶联物的方法，包括以下步骤：
选择如权利要求1所述的靶向组分，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为选择性地结合选定类型的肿瘤靶细胞上的细胞表面分子，所述靶向组分被配置为与内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更低的解离常数结合细胞表面分子；
选择如权利要求1所述的载物组分，所述载物分子包括细胞毒性药物，其具有抑制所选类型的肿瘤靶细胞的生长的功效；和
提供包含与载物组分直接或间接融合的靶向组分的内溶酶体靶向偶联物。
45.一种提供用于治疗癌症的内溶酶体靶向偶联物的方法，包括以下步骤：
选择如权利要求30所述的靶向组分，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为选择性地结合选定类型的肿瘤靶细胞上的细胞表面分子；
选择如权利要求30所述的载物组分，所述载物分子包括细胞毒性药物，其具有抑制所选类型的肿瘤靶细胞的生长的功效；
其中，
所述靶向组分经工程化以进一步包括第一蛋白结构域；
所述载物组分经工程化以进一步包括第二蛋白结构域；和
所述第一蛋白结构域被配置为与内溶酶体区室中相比在细胞外空间中以更低的解离常数结合所述第二结构域。
46.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物组分包括两个免疫球蛋白Fc片段的二聚体。
47.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物分子通过多肽接头或通过化学偶联反应偶联至抗体片段、抗体结构域、纳米抗体、蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域。
48.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述成像标记物是放射性标记物或荧光或近红外标记物。
49.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分的N端融合至所述载物组分的C端。
50.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分的C端融合至所述载物组分的N端。
51.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分在所述载物组分的非末端位置融合至所述载物组分。
52.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物组分包括免疫球蛋白Fc片段；和
所述靶向组分在所述免疫球蛋白Fc片段的铰链-CH2-CH3结构域的N端或C端融合至所述载物组分的免疫球蛋白Fc片段。
53.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括被配置为结合人表皮生长因子受体2的抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体。
54.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括被配置为结合前列腺特异性膜抗原的抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体。
55.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，包括具有以下至少一种的氨基酸序列的一种或多种蛋白质：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ IDNO:22,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:34,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,.SEQ ID NO:44,SEQID NO:46,SEQ ID NO:48,或其同源物。
56.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，包括具有以下氨基酸序列的蛋白质的异二聚体：SEQ ID NO:2加SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6加SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:42加SEQ ID NO:44,或SEQ ID NO:46加SEQ ID NO:48,或其同源物。
57.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，包括具有以下氨基酸序列的蛋白质的异三聚体：SEQ ID NO:18加SEQ ID NO:20加SEQ ID NO:22,或SEQ ID NO:22加SEQ IDNO:24加SEQ ID NO:26,或其同源物。
58.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为在酸性pH下以大于1.5μM的解离常数结合细胞表面分子。
59.如权利要求58所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述酸性pH为约5.8。
60.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为在酸性pH下以大于1.5μM的解离常数结合细胞表面分子。
61.如权利要求60所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述酸性pH为约5.8。
62.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为与pH值为约5.0至约6.5相比在pH值为约6.8至约7.5时以更低的解离常数结合细胞表面分子。
63.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括抗体、抗体片段、抗体结构域或纳米抗体，其被配置为与Ca2+浓度约2μM相比在Ca2+浓度约2mM下以更低的解离常数结合细胞表面分子。
64.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为与pH值为约5.0至约6.5相比在pH值为约6.8至约7.5时以更低的解离常数结合细胞表面分子。
65.如权利要求1所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分包括蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结构域，其被配置为与Ca2+浓度约2μM相比在Ca2+浓度约2mM下以更低的解离常数结合细胞表面分子。
66.如权利要求30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分被配置为与pH值为约5.0至约6.5相比在pH值为约6.8至约7.5时以更低的解离常数结合载物组分。
67.如权利要求30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述靶向组分被配置为与Ca2+浓度约2μM相比在Ca2+浓度约2mM下以更低的解离常数结合载物组分。
68.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物组分是细胞毒性放射性标记物。
69.如权利要求1或30所述的内溶酶体靶向偶联物，其中，所述载物分子是改变靶细胞行为的药物或其他试剂。
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