CN110934849A - 聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊及其制备方法，将蛋白溶液和N‑(3‑氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体混合均匀后，再向上述溶液中加入羧基甜菜碱单体，在搅拌的条件下，加入交联剂，利用静电作用和氢键作用，使得N‑(3‑氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体、羧基甜菜碱单体和交联剂聚集在蛋白周围，再向上述溶液中加入催化剂和引发剂，通过原位聚合的方法，最终制备得到聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊。本发明利用羧基甜菜碱作涂层具有两大优势，既抑制了蛋白本身的蛋白吸附，又可进行功能化，可接入一些受体的配体，从而增加载体的靶向性，提高蛋白的治疗效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，更具体地说涉及一种聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊及其制备方法。
背景技术
纳米微粒的发展为显像和诊断治疗学提供了一个很好的平台，随着纳米技术的发展，生物医用领域纳米材料的应用越发丰富。然而，大多数的纳米微粒表面易吸附一些非特异性蛋白，从而引起随后的调理素作用，被人的网状内皮系统识别，接着被吞噬细胞吞噬、清除，这是大部分纳米微粒的命运，其中蛋白吸附是免疫反应的第一步。纳米微粒引起的免疫反应大大限制了纳米微粒在体内的应用与发展。
随着人们对分子生物领域技术发展的认知，寻找一种可以抗非特异性蛋白吸附的物质，便可以使得纳米微粒的应用得以发展。其中聚乙二醇由于高亲水作用，作为一种可以抗蛋白吸附的材料，在过去的几十年间得到了很好的发展。然而，随着进一步探索应用，人们发现聚乙二醇不太稳定，尤其是在有氧气和过渡金属粒子存在时，易发生自氧化作用，并且聚乙二醇使用过程中会产生免疫球蛋白抗体，因此限制了聚乙二醇的应用和发展。
近些年来，人们对两性离子的研究已经成为一大热点。由于正负电荷的同时存在，使得整体呈电中性的两性离子具有优异的抗蛋白吸附能力，正是电中性和亲水性的特质，使得其抑制非特异性蛋白吸附的能力大大提升。其中，羧基甜菜碱{3-[[2-(甲基丙烯酰氯)乙基]二甲基铵]丙酸酯}作为一种两性离子，具有优异的抗蛋白吸附能力，且含有的羧基可进一步功能化，可以增加药物递释过程中的靶向性，提高治疗效果。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊及其制备方法，利用羧基甜菜碱作涂层具有两大优势，既抑制了蛋白本身的蛋白吸附，又可进行功能化，使得纳米微囊可接入一些受体的配体，从而增加纳米微囊的靶向性，提高蛋白的治疗效率。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊及其制备方法，将蛋白溶液和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体混合均匀后，再向上述溶液中加入羧基甜菜碱单体，在搅拌的条件下，加入交联剂，利用静电作用和氢键作用，使得N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体、羧基甜菜碱单体和交联剂聚集在蛋白周围，再向上述溶液中加入催化剂和引发剂，在4-40℃，通过原位聚合的方法反应0.1-48h，最终制备得到聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊；其中，蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体和羧基甜菜碱单体的摩尔比为1：(50-200)：(1000-9000)，蛋白和交联剂的摩尔比为1：(50-3000)，蛋白、催化剂和引发剂的摩尔比分别为1：(50-6000)：(50-5000)，聚羧基甜菜碱壳层厚度为1-15nm，聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的直径为7-30nm。
蛋白溶液采用尼妥珠单抗，西妥昔单抗，PDL-1单抗和牛血清白蛋白中的一种。
蛋白溶液、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体和羧基甜菜碱单体的摩尔比为1：(100-200)：(2000-8000)。
交联剂为N,N’-亚甲双丙烯酰胺，蛋白溶液和交联剂的摩尔比为1：(100-2000)。
催化剂为N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，引发剂为过硫酸铵，蛋白溶液、催化剂和引发剂的摩尔比分别为1：(100-5000)：(100-4000)，在4-40℃下，通过原位聚合的方法反应2-24h。
聚羧基甜菜碱壳层厚度为3-12nm，聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的直径为15-25nm。
本发明的有益效果为：本发明通过原位自由基聚合方法制备了呈球形，粒径均一，具有抗蛋白吸附作用的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊。本发明利用羧基甜菜碱和N,N’-亚甲双丙烯酰胺聚合作为蛋白的保护层，可解决蛋白本身不稳定，易降解的问题。本发明利用羧基甜菜碱作涂层具有两大优势，既抑制了蛋白本身的蛋白吸附，又可进行功能化，可接入一些受体的配体，从而增加载体的靶向性，提高蛋白的治疗效率。本发明的制备方法简便，反应介质为水相，克服了传统本体聚合过程中散热慢的问题，可推广至大规模的产业生产中，推动生物医用材料的前进方向。
附图说明
图1是本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的透射电镜图；
图2是本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的粒径分布图；
图3是本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的凝胶电泳图；
图4是本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的蛋白吸附图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1
取含1mg牛血清白蛋白的溶液，加入单体N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，以摩尔比为1:100的比例加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，再加入羧基甜菜碱，牛血清白蛋白与羧基甜菜碱的摩尔比是1:2000；然后以牛血清白蛋白与交联剂的摩尔比为1:100的比例加入N,N’-亚甲双丙烯酰胺，在持续搅拌作用下，通过静电作用和氢键作用，单体和交联剂将富集在牛血清白蛋白周围；最后，控制牛血清白蛋白：催化剂：引发剂摩尔比为1:100:400的比例，加入催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和引发剂过硫酸铵。在4℃下反应2h，制得聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊。
实施例2
取含1mg PDL-1单抗的溶液，加入单体N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，以摩尔比为1:50的比例加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，再加入羧基甜菜碱，PDL-1单抗与羧基甜菜碱的摩尔比是1:5000；然后以PDL-1单抗与交联剂的摩尔比为1:50的比例加入N,N’-亚甲双丙烯酰胺，在持续搅拌作用下，通过静电作用和氢键作用，单体和交联剂将富集在PDL-1单抗周围；最后，控制PDL-1单抗：催化剂：引发剂摩尔比为1:50:1000的比例，加入催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和引发剂过硫酸铵。在40℃下反应48h，制得聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊
实施例3
取含1mg西妥昔单抗的溶液，加入单体N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，以摩尔比为1:150的比例加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，再加入羧基甜菜碱，西妥昔单抗与羧基甜菜碱的摩尔比是1:8000；然后以西妥昔单抗与交联剂的摩尔比为1:2000的比例加入N,N’-亚甲双丙烯酰胺，在持续搅拌作用下，通过静电作用和氢键作用，单体和交联剂将富集在西妥昔单抗周围；最后，控制西妥昔单抗：催化剂：引发剂摩尔比为1:5000:4000的比例，加入催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和引发剂过硫酸铵。在30℃下反应0.1h，制得聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊。
实施例4
取含1mg尼妥珠单抗的溶液，加入单体N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，以摩尔比为1:200的比例加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，再加入羧基甜菜碱，尼妥珠单抗与羧基甜菜碱的摩尔比是1:9000；然后以尼妥珠单抗与交联剂的摩尔比为1:1000的比例加入N,N’-亚甲双丙烯酰胺，在持续搅拌作用下，通过静电作用和氢键作用，单体和交联剂将富集在尼妥珠单抗周围；最后，控制尼妥珠单抗：催化剂：引发剂摩尔比为1:6000:5000的比例，加入催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和引发剂过硫酸铵。在36℃下反应24h，制得聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊。
实施例5
取含1mg牛血清白蛋白的溶液，加入单体N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，控制西妥昔单抗与N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐摩尔比为1:120，再加入羧基甜菜碱，西妥昔单抗与羧基甜菜碱的摩尔比是1:1000；然后按照西妥昔单抗与交联剂的摩尔比为1:3000的比例加入N，N’-亚甲双丙烯酰胺，在持续搅拌作用下，利用静电作用和氢键作用将单体和交联剂富集在西妥昔单抗周围；最后，以西妥昔单抗：催化剂：引发剂摩尔比为1:2000:100的比例，加入催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和引发剂过硫酸铵。在28℃下反应36h，制得聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊。
图1是本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的透射电镜图。将样品滴至铜网上，用磷酸钨进行染色后，采用日本电子光学公司生产的透射电子显微镜进行形貌观察。观测结果如图1，纳米微囊呈球形，粒径较均一，为15-25nm。
图2是本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的粒径分布图。取100微升样品，采用美国Brookhaven仪器公司生产的激光粒度仪/zeta电位仪进行测试。结果显示，纳米微囊的粒径分布集中在20nm左右。
图3是本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的凝胶电泳图。采用1×TAE缓冲液配置琼脂糖凝胶，在电压为150V，电流为40mV下进行测试，之后在365nm紫外凝胶成像系统下观察图像。如图3所示，未包载的蛋白在电泳作用下，移向正极，条带偏离孔洞。而制得的纳米微囊由于呈微弱正电性，大部分条带留在孔洞中，略向负极移动。电镜、粒径分布及其凝胶电泳的结果表明成功制得了纳米微囊。
图4为本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的蛋白吸附图，采用美国Brookhaven仪器公司生产的激光粒度仪/zeta电位仪进行测试，结果显示，当牛血清白蛋白浓度增加至5mg/mL，粒径仍然没有明显的增加。
表1本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的蛋白吸附图
表1是本发明制备的聚羧基甜菜碱包载的蛋白吸附图，采用翱艺(上海)仪器有限公司生产的紫外分光光度计进行测试。与SD大鼠血清在37℃下孵育30min后，通过BCA试剂盒测试蛋白吸附量，结果显示，纳米微囊组比对照组PBS缓冲液吸附的蛋白量要低。粒径变化和蛋白测试结果表明，纳米微囊具有良好的抗蛋白吸附能力。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊，其特征在于：将蛋白溶液和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体混合均匀后，再向上述溶液中加入羧基甜菜碱单体，在搅拌的条件下，加入交联剂，利用静电作用和氢键作用，使得N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体、羧基甜菜碱单体和交联剂聚集在蛋白周围，再向上述溶液中加入催化剂和引发剂，在4-40℃，通过原位聚合的方法反应0.1-48h，最终制备得到聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊；其中，蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体和羧基甜菜碱单体的摩尔比为1：(50-200)：(1000-9000)，蛋白和交联剂的摩尔比为1：(50-3000)，蛋白、催化剂和引发剂的摩尔比分别为1：(50-6000)：(50-5000)，聚羧基甜菜碱壳层厚度为1-15nm，聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的直径为7-30nm。
2.根据权利要求1所述的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊，其特征在于：蛋白溶液采用尼妥珠单抗，西妥昔单抗，PDL-1单抗和牛血清白蛋白中的一种。
3.根据权利要求1所述的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊，其特征在于：蛋白溶液、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体和羧基甜菜碱单体的摩尔比为1：(100-200)：(2000-8000)。
4.根据权利要求1所述的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊，其特征在于：交联剂为N,N’-亚甲双丙烯酰胺，蛋白溶液和交联剂的摩尔比为1：(100-2000)。
5.根据权利要求1所述的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊，其特征在于：催化剂为N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，引发剂为过硫酸铵，蛋白溶液、催化剂和引发剂的摩尔比分别为1：(100-5000)：(100-4000)，在4-40℃下，通过原位聚合的方法反应2-24h，制备得到聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊，聚羧基甜菜碱壳层厚度为3-12nm，聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的直径为15-25nm。
6.根据权利要求1-5任一所述的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的制备方法，其特征在于：将蛋白溶液和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体混合均匀后，再向上述溶液中加入羧基甜菜碱单体，在搅拌的条件下，加入交联剂，利用静电作用和氢键作用，使得N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体、羧基甜菜碱单体和交联剂聚集在蛋白周围，再向上述溶液中加入催化剂和引发剂，在4-40℃，通过原位聚合的方法反应0.1-48h，最终制备得到聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊；其中，蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体和羧基甜菜碱单体的摩尔比为1：(50-200)：(1000-9000)，蛋白和交联剂的摩尔比为1：(50-3000)，蛋白、催化剂和引发剂的摩尔比分别为1：(50-6000)：(50-5000)，聚羧基甜菜碱壳层厚度为1-15nm，聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的直径为7-30nm。
7.根据权利要求6所述的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的制备方法，其特征在于：蛋白溶液采用尼妥珠单抗，西妥昔单抗，PDL-1单抗和牛血清白蛋白中的一种。
8.根据权利要求6所述的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的制备方法，其特征在于：蛋白溶液、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐单体和羧基甜菜碱单体的摩尔比为1：(100-200)：(2000-8000)。
9.根据权利要求6所述的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的制备方法，其特征在于：交联剂为N,N’-亚甲双丙烯酰胺，蛋白溶液和交联剂的摩尔比为1：(100-2000)。
10.根据权利要求6所述的聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的制备方法，其特征在于：催化剂为N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，引发剂为过硫酸铵，蛋白溶液、催化剂和引发剂的摩尔比分别为1：(100-5000)：(100-4000)，在4-40℃下，通过原位聚合的方法反应2-24h，制备得到聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊，聚羧基甜菜碱壳层厚度为3-12nm，聚羧基甜菜碱包载的蛋白纳米微囊的直径为15-25nm。
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