CN110917333A - 神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的应用及其备制 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种神经干细胞活性因子(hNGF)、番茄红素油树脂复合而成的纳米脂质载体技术(NLC)，利用逆相蒸发－冷冻干燥法制备神经神经干细胞活性因子复合纳米微脂囊。微脂囊粒径为81.62±3.67纳米，成为透过血脑屏障转运的有效载体；基于纳米定向脑、脊髓组织渗透技术，实现将其复合物活性成份快速渗透至脑神经组织，达到显著的激活内源性神经干细胞再生、增值效果，有效提高神经干细胞活性因子复合物的稳定性、延长其作用时间、增强细胞抗氧化作用、维持神经细胞存在、促进神经细胞分化、决定轴突生长方向、诱导突起生长等作用。提供一种因多种原因引起的神经系统损害修复、再生生物制剂。

Description

神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的应用及其备制

技术领域

本发明涉及神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的应用及其制备方法。通过对神经干细胞的培养、鉴定，神经干细胞活性因子的获取，与番茄红素树脂合成复合物，利用纳米脂质载体技术(NLC)逆相蒸发-冷冻干燥法制备神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊，达到显著的激活内源性神经干细胞再生、增值效果，有提高神经干细胞活性因子复合物活性成份稳定性、延长其作用时间、增强细胞抗氧化作用、维持神经细胞存在、促进神经细胞分化、决定轴突生长方向、诱导突起生长等作用。利用其无毒安全、容易实现工业化生产等优点，提供一种因多种原因引起的神经系统损害修复、再生的生物制剂。

背景技术

人的神经元细胞是退出细胞周期的终末分化细胞，长期以来神经系统被认为缺乏再生能力。神经干细胞被广泛发现和证实后，使人们认识到，成体中枢神经系统的可塑性和再生性。神经干细胞活性因子(hNGF)是一类多种肽。主要包括神经生长因子(NGF)、脑性NF(BD-NF)、NFⅢ(NT-3)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经因子(CNTF)等。hNGF为水溶性，且相对分子量较大，在自然状态下几乎不能透过血脑屏障。采用乳化聚合法制备 hNGF-PBCA纳米粒，该纳米粒较hNGF更容易透过血脑屏障，达到显著的激活内源性神经干细胞再生、增值效果，和番茄红素树脂形成复合物后，可有提高神经干细胞活性因子复合物活性成份稳定性、延长其作用时间、增强细胞抗氧化作用、维持神经细胞存在、促进神经细胞分化、决定轴突生长方向、诱导突起生长等作用。大量的实验室数据和流行病学结果证明番茄红素是人类已知的自然界抗氧化能力最强的物质。具有强大拮抗氧化应激损伤，保护神经元，改善实验动物的学习、记忆功能；它具有维持交感神经和感觉神经细胞存在、促进神经细胞分化、决定轴突生长方向、促进周围神经再生、促进损伤的中枢神经和外周神经修复、维持生存及诱导突起生长的作用。还有改善神经退行性病变，与炎症、细胞凋亡、氧化应激和线粒体功能障碍等密切相关。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊，以解决上述技术问题中的至少一个方面。

本发明的第二个目的在于提供上述神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的制备方法，以解决上述技术问题中的至少一个方面。

本发明的第三个目的在于提供上述神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊应用，以解决上述技术问题中的至少一个方面。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊，主要利用逆相蒸发-冷冻干燥法制备神经干细胞活性因子复合柔性纳米微脂囊，微脂囊其平均粒径为(80.66±3.86)nm，Zeta电位为(61.22 ±7.62)mV，包覆率可以为78.2～90.0％，载药量可以为20.0～25.0％。

所述的神经干细胞活性因子复合物至少有以下一种成分组成：神经干细胞活性因子、番茄红素树脂复合而成：神经干细胞活性因子10μg/L 10～30份、 570mg/L番茄红素树脂的亚麻籽番茄油5～15份。

本发明的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊，具有以下的有益效果：

(1)神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊是一种用特殊的脂质体(黄豆卵磷脂)包裹着的多种活性成分的微粒，hNGF表面带有正电荷与血脑屏障内皮细胞基膜上的负电荷相吸，使其聚集于血脑屏障周围，能促进血脑屏障的开放；添加P糖蛋白抑制剂，抑制进入脑脊液中的NGF泵出。有效地延长了hNGF- 脂质体在神经系统中的作用时间；

(2)通过微脂囊包覆技术将神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊活性成分包覆形成纳米级的微脂囊，一方面可以提高神经干细胞活性因子合物的稳定性，使其具有长效持久的缓释功能，维持神经细胞存在、促进神经细胞分化、决定轴突生长方向、诱导突起生长；另一方面，在确保不破坏神经干细胞活性因子复合物的前提下，将神经干细胞活性因子复合采用微脂囊包覆技术包覆形成微脂囊后，能提高神经干细胞活性因子复合物成分的相容性，使其更加方便地应用于制剂中。

(3)纳米微脂囊由于粒径处于纳米级范围，具有突出的纳米效应，即小尺寸效应和表面效应。小尺寸效应意味着其穿透生理组织、血脑屏障能力很强，渗透力增强，可有效携带神经干细胞活性因子活性物质轻易穿透结膜和虹膜，通过眼球后经视神经传递到视神经节细胞，系统性吸收或穿过血眼屏障。还可使番茄红素树脂转化成安全性极高的维生素A，深入基底层发挥功效作用。

(4)选择微脂囊混悬液、脂质体冻干粉和神经干细胞活性因子冻干粉。制备成脂质体或冻干粉末，都可提高其稳定性。

(5)在原料方面，所使用的亚麻籽油番茄红素树脂高抗氧化复合物活性成分均为纯天然植物提取物，保证了原料的高效、无毒安全；增加神经干细胞活性因子稳定性和互补性。

(6)在一些具体的实施方式中，微脂囊的包覆率可以为78.2～90.0％，载药量可以为20.0～25.0％。由此，可以使得微脂囊的神经元细胞再生效果更佳。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了上述神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)获取人神经干细胞-培养-鉴定-提纯-获取10μg/L神经干细胞活性因子；亚麻籽油番茄红素树脂：22％番茄固体物按1:1用微波萃取法制成570mg/L 番茄红素的亚麻籽番茄油；

(2)采用逆相蒸发－冷冻干燥法制备神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊；

(3)进行神经干细胞活性因子含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]；

(4)采用由Fry等提出的SephadexG－50微柱离心法分离柔性纳米脂囊和游离神经干细胞活性因子；

(7)精确观察其形态；

(8)精确测定变形性：

(9)严格稳定性鉴定：

本发明的制备神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的方法，采用特定的加入顺序，不仅可以保证神经干细胞活性因子复合物的复合结构，还可以使得绝大部分神经干细胞活性因子复合物被包裹，减少浪费高效利用。

根据本发明的又一方面，还提供了上述神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊在医疗上的应用。将本发明的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊添加多种医用生物制剂中，一般按生物制剂总质量的20％～30％来添加，可以制成注射剂(包括脑室、鞘内给药)、口服剂、外用喷剂(涂抹膏、霜剂)等类型的生物制剂。

Claims (12)

1.神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊，其特征在于，利用逆相蒸发-冷冻干燥法制备神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)的神经干细胞活性因子含量，电镜观察其形态，并考察其包封率或载药量、变形性及稳定性；神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊为多室脂质体。所述的微脂囊其平均粒径为(80.66±3.86)nm，Zeta电位为(61.22±7.62)mV，包覆率可以为78.2～90.0％，载药量可以为20.0～25.0％。神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊柔性纳米脂质体具有较高的稳定性。含量测定方法简单、可靠，稳定性和变形性高，可能成为透过血脑屏障转运的有效载体。所述的神经干细胞活性因子复合物由神经干细胞活性因子、番茄红素树脂复合而成：

神经干细胞活性因子10μg/L 10～30份、570mg/L番茄红素树脂的亚麻籽番茄油5～15份。

2.根据权利要求1所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊，其特征在于，神经干细胞活性因子复合物由以下质量份的物质复合而成：

神经干细胞活性因子35份、番茄红素树脂15份。

3.根据权利要求1～2中任一项所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊，其特征在于，所述的微脂囊的包覆率为80.0～90.0％，载药量为20.0～25.0％。

4.权利要求3所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征包括以下步骤：

(1)用公开的方法获取神经干细胞活性因子：小分子干细胞活性物质成为干细胞活性转移因子。大分子干细胞活性物质为大分子干细胞活性因子。分离培养神经干细胞；收获神经干细胞培养液：用相应的培养基和因子培养细胞生长到一定阶段，取上清液；可多次传代收获。神经干细胞活性因子获取后：

①透析提取小分子神经干细胞活性因子将干细胞裂解物适当处理后，装入透析袋或玻璃透析装置内，在一定温度下透析，12-30h收取透析液。

②中空纤维柱分离提取神经干细胞活性因子将神经干细胞裂解物，经处理后，用分子截留孔径(如0.2KD、5KD、10KD、15KD等)的中空纤维柱分离截取神经干细胞活性因子，按分子量不同区分转移因子和活性因子。

③离子交换器和层析提取神经干细胞活性因子。

(2)鉴定①蛋白质浓度鉴定；②核糖和多核苷酸的浓度鉴定；③蛋白质和核酸类物质鉴定；④神经干细胞活性物质生物活性鉴定。

(3)神经干细胞活性因子含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]：分别配制质量浓度为15，30，50，100，200，300，400，500ng/mL的神经干细胞活性因子系列溶液，以0.2％聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)破坏脂质膜的空白柔性纳米微脂囊做空白对照，按照ELISA检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品，以样品中神经干细胞活性因子的质量浓度(X)为横坐标、检测的OD值(Y)为纵坐标，采用四参数回归方法进行运算，得回归方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，以检测样品中神经干细胞活性因子的含量。

(4)亚麻籽油提取番茄红素树脂：22％番茄固体物按1:1用微波萃取法制成570mg/L番茄红素的亚麻籽番茄油；

(5)神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊(逆相蒸发－冷冻干燥法)制备：精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素E，置梨形瓶中，加入适量氯仿(含1％无水乙醇)，于4℃水浴中溶解脂质。取甘露醇、胆酸钠和神经干细胞活性因子溶解于4℃磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)溶液中。脂质溶解后，将PBS溶液倒入脂质溶液中，在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)，形成均匀乳液。室温下放置30min。将溶液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压0.07MPa，转速500r/min)，形成水相脂质体混悬液后，继续蒸发15min，以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中，高压均质3次，再通过0.1μm微孔滤膜挤出10次后，－40℃预冻24h后，于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。

(6)神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊分离采用由Fry等提出的交联葡聚糖-50(Sephadex G－50)微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离神经干细胞活性因子。将Sephadex G－50用适量PBS溶液浸泡24h后装柱，以3000r/min离心3min以去除其中多余的PBS，先用不含神经干细胞活性因子复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25mL过柱，然后向柱中加入0.25mL神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊混悬液，离心，收集离心液，微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。

(7)观察其形态；柔性纳米微脂囊径1.0％磷钨酸负染，将柔性纳米微脂囊用PBS缓冲液稀释10倍，在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位；包封率(EE)采用以下公式计算:EE(％)＝柔性纳米脂质体EGF含量/柔性纳米脂质体混悬液中EGF总含量×100％；载药量:取神经干细胞活性因子复合物冻干微脂囊1mg置5mL容量瓶中，加入0.2mL10％TritonX-100，加PBS至刻度，测定总神经干细胞活性因子复合物量；冻干微脂囊载药量＝神经干细胞活性因子复合物的量/1mg×100％。本方法所制备的神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径应为(80.66±3.86)nm，Zeta电位为(61.22±7.62)mV，平均包封率为(37.86±4.77)％；平均载药量为(6.58±1.27)％。变形性测定：取1mL一次性注射器，分别加入1mL蒸馏水、神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊及神经干细胞活性因子复合物普通脂质体，分别外加0.1，0.2，0.3，0.4和0.5MPa压力，计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间，计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比，以测定柔性纳米微脂囊的变形性，相比，神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。

(8)变形性测定：取1mL一次性注射器，分别加入1mL蒸馏水、神经干

(9)神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊及神经干细胞活性因子复合物普通脂质体，分别外加0.1，0.2，0.3，0.4和0.5MPa压力，计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间，计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比，以测定柔性纳米微脂囊的变形性，相比，神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。

(10)稳定性鉴定：取3批神经干细胞活性因子微脂囊复合物混悬液、神经干细胞活性因子复合物冻干粉及神经干细胞活性因子复合物微脂囊冻干粉，分别置室温25℃、4℃条件下，于0,3m测定其包封率、载药量、pH、粒径和Zeta电位，并观察外观，以确定其稳定性。

5.根据权利要求4所述的神经干细胞活性因子复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)用公开的方法获取神经干细胞活性因子分离培养神经干细胞，收获神经干细胞培养液：神经干细胞活性因子分离备制、鉴定(①蛋白质浓度鉴定；②核糖和多核苷酸的浓度鉴定；③蛋白质和核酸类物质鉴定；④神经干细胞活性物质生物活性鉴定。

6.根据权利要求5所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的一种公开方法，神经干细胞活性因子合物纳米微脂囊(逆相蒸发-冷冻干燥法)制备：精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素E，置梨形瓶中，加入适量氯仿(含1％无水乙醇)，于4℃水浴中溶解脂质。取甘露醇、胆酸钠和神经干细胞活性因子溶解于4℃PBS(pH＝7.4)溶液中。脂质溶解后，将PBS溶液倒入脂质溶液中，在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)，形成均匀溶液。室温下放置30min。将溶液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压0.07MPa，转速500r/min)，形成水相脂质体混悬液后，继续蒸发15min，以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中，高压均质3次，再通过0.1μm微孔滤膜挤1次后，-40℃预冻24h后，于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。

7.权利要求6所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的神经干细胞活性因子复合物含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]：使其分别配制质量浓度为15，30，50，100，200，300，400，500ng/mL的神经干细胞活性因子复合物系列溶液，以0.2％TritonX-100破坏脂质膜的空白柔性纳米脂质体做空白对照，按照ELISA检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品，以样品中神经干细胞活性因子复合物的质量浓度(X)为横坐标、检测的OD值(Y)为纵坐标，采用四参数回归方法进行运算，得回归方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，以检测样品中神经干细胞活性因子复合物的含量。

8.权利要求7所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊分离采用交联葡聚糖-50(SephadexG–50)微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离神经干细胞活性因子。将SephadexG-50用适量PBS溶液浸24h后装柱，以3000r/min离心3min以去除其中多余的PBS，先用不含神经干细胞活性因子复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25mL过柱，然后向柱中加入0.25mL神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊混悬液，离心，收集离心液，微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。

9.权利要求8所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(7)所述的观察其形态；用柔性纳米微脂囊径1.0％磷钨酸负染，将柔性纳米微脂囊用PBS缓冲液稀释10倍，在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位；包封率(EE)采用以下公式计算:EE(％)＝柔性纳米脂质体EGF含量/柔性纳米脂质体混悬液中神经干细胞活性因子复合物总含量×100％；载药量:取神经干细胞活性因子复合物冻干微脂囊1mg置5mL容量瓶中，加入0.2mL10％TritonX-100，加PBS至刻度，测定总神经干细胞活性因子复合物量；冻干微脂囊载药量＝神经干细胞活性因子复合物的量/1mg×100％。本方法所制备的神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径应为(80.66±3.86)nm，Zeta电位为(61.22±7.62)mV，平均包封率为(37.86±4.77)％；平均载药量为(6.58±1.27)％。

10.权利要求9所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(8)所述的变形性测定：取1mL一次性注射器，分别加入1mL蒸馏水、神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊及神经干细胞活性因子复合物普通脂质体，分别外加0.1，0.2，0.3，0.4和0.5MPa压力，计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间，计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比，以测定柔性纳米微脂囊的变形性，相比，神经干细胞活性因子复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。

11.权利要求10所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊的制备方法其特征在于，步骤(9)的稳定性鉴定：取3批神经干细胞活性因子微脂囊复合物混悬液、神经干细胞活性因子复合物冻干粉及神经干细胞活性因子复合物微脂囊冻干粉，分别置室温25℃、4℃条件下，于0，3m测定其包封率、载药量、pH、粒径和Zeta电位，并观察外观，以确定其稳定性。

12.权利要求1所述的神经干细胞活性因子复合物纳米微脂囊制备神经干细胞活性因子在医疗中的应用。