CN110904042A - 一种神经细胞及其培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种神经细胞及其培养方法和应用，尤其涉及一种背根神经节细胞及其电刺激培养方法和在制备脊髓损伤治疗药物、医用材料或医疗器械中的应用，所述培养方法包括对神经细胞进行电刺激培养。本发明的方法以微电刺激技术干预培养背根神经节神经元，研究微电流对细胞形态、神经元轴突生长密切相关的c‑fos表达的影响，揭示微电流刺激神经元轴突生长的机制，为体外制备人工脊髓组织提供理论依据。

Description

一种神经细胞及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于神经电刺激技术领域，涉及一种神经细胞及其培养方法和应用，尤其涉及一种背根神经节细胞及其电刺激培养方法和在制备脊髓损伤治疗药物、医用材料或医疗器械中的应用。
背景技术
神经电刺激已经广泛应用于治疗疼痛、帕金森病、颅脑外伤昏迷促醒、癫痫及低氧后植物状态等疾病，但作用机制尚不明晰。常用的神经电刺激包括脊髓电刺激、正中神经电刺激、迷走神经电刺激、深部脑电刺激、舌下神经电刺激和骶神经电刺激等，每种神经电刺激各具特点，主要临床应用范围及相关机制有所不同。
其中，脊髓电刺激(SCS)是指将脊髓刺激器电极安放于椎管的硬膜外腔后部，通过电流刺激脊髓后柱的传导束和后角感觉神经元，从而达到治疗疾病的目的，其确切机制仍不清楚；正中神经电刺激(MNS)是将盘状电极置于双侧腕关节掌面近端10cm正中神经点处的一种刺激方法，主要用于各种昏迷促醒的治疗，MNS在昏迷促醒中有较好的疗效，但作用机制尚未明晰；迷走神经电刺激(VNS)通过神经外科手术将线圈放在左颈部内的迷走神经上，并且将刺激装置埋在胸前，再调整装置参数与模式，使刺激器自动刺激迷走神经达到治疗目的；深部脑电刺激(DBS)是通过立体定向手术，将刺激电极植入深部特定神经核团，对核团进行刺激，调节引起症状的异常电活动，从而消除或改善患者症状，以达到临床治疗目的，临床上常用的靶点有丘脑底核(STN)、苍白球内侧部(GPi)、丘脑腹内侧核(Vim)和脑桥核等，各种靶点的DBS在治疗帕金森病中获得了较好的疗效。
陈虹等(陈虹等，电刺激对大鼠脊髓损伤后神经生长因子表达的影响，2012，18(1)：33-36)研究了电刺激对成年大鼠脊髓损伤后脊髓灰质神经元神经生长因子(NGF)表达的影响，BBB评分结果显示大鼠脊髓损伤后有自行恢复功能，从第5天开始电刺激组与损伤对照组有显著性差异(P<0.05)；脊髓损伤后，电刺激组和损伤对照组的NGF表达均持续升高(P<0.05)，电刺激组表达多于损伤对照组(P<0.05)。
姚青等(姚青等，脉冲微交流电刺激促进体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌分化，第三军医大学学报，2008，30(5)：410-413)探讨了脉冲微交流电刺激对体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用，结果显示脉冲微交流电刺激组细胞较非刺激组细胞生长良好，更早出现心肌样细胞改变，诱导后1周可观察到胞内肌丝形成及a-actin、cTnT和Cx43的表达，且在随后的相同时相点(诱导后2、3、4周)，a-actin、cTnT和Cx43的表达水平明显高于非刺激组，胞内肌丝也由杂乱分布逐渐成束，部分细胞可观察到肌节。
李振鹏(李振鹏，微电流刺激治疗大鼠横断性脊髓损伤的机理研究，汕头大学，2006)通过观察电刺激治疗脊髓损伤前后脊髓组织中GAFP、Nogo和Gap-43的表达变化情况，发现大鼠正常脊髓组织中有微量GAFP、Nogo和Gap-43的表达，损伤后GAFP和Nogo明显升高，于损伤后2周达到顶峰，随后维持在比较高的水平，而Gap-43表达下降，于损伤后l周最明显，随后一直处于比较低的水平；通过微电流刺激治疗后，发现GAFP和Nogo的表达明显减少，但没有完全消失，而GPa-43的表达则显著升高，于治疗后l周达到顶峰，随后维持在比较高的水平。
在正常生理状态过程中，内源性电流、电场扮演了影响分化的重要角色，内源性的电场对于胚胎分化具有十分重要的作用。目前关于电刺激机制的研究大都停留在动物层面，而未深入到细胞层面。脊髓损伤的治疗是医学界的一项难题，人工脊髓是治疗脊髓损伤的潜在有效手段，但是神经细胞的刺激与控制机制尚未明确，人工脊髓的研究缺乏相关的理论依据。
因此，有必要研究电刺激对神经细胞生长机制的影响，为脊髓损伤治疗提供科学依据和新的治疗手段。
发明内容
针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供了一种神经细胞及其培养方法和应用，具体为一种背根神经节细胞及其电刺激培养方法和在制备脊髓损伤治疗药物、医用材料或医疗器械中的应用，所述方法以微电刺激技术干预培养背根神经节神经元(dorsalroot ganglion neuron，DRGn)，研究微电流对细胞形态、神经元轴突生长密切相关的c-fos表达的影响，揭示微电流刺激神经元轴突生长的机制，为体外制备人工脊髓组织提供理论依据。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种神经细胞的培养方法，所述培养方法包括对神经细胞进行电刺激培养。
本发明中，在神经细胞的生长过程中引入电刺激，观察细胞形态的变化、研究电刺激对细胞内c-fos表达的影响，有利于发现电刺激对神经细胞生长的控制机制。
优选地，所述电刺激培养的模式为双向电刺激和/或单项电刺激。
本发明中，双向电刺激为双向脉冲波电刺激，单项电刺激为方波电刺激。
优选地，所述电刺激培养的电压为1～10V，例如可以是1V、2V、3V、4V、5V、6V、7V、8V、9V或10V，优选为6V。
优选地，所述电刺激培养的频率为1～5Hz，例如可以是1Hz、2Hz、3Hz、4Hz或5Hz，优选为2Hz。
优选地，所述电刺激培养的温度为35～40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为36～37℃。
优选地，所述电刺激培养的时间为20～40min/次，例如可以是20min/次、21min/次、22min/次、23min/次、24min/次、25min/次、26min/次、27min/次、28min/次、29min/次、30min/次、31min/次、32min/次、33min/次、34min/次、35min/次、36min/次、37min/次、38min/次、39min/次或40min/次，保持1～3天，例如可以是1天、2天或3天。
本发明中，从双/单相电刺激、电刺激时间、电刺激电压和电刺激频率等方面对神经元进行电刺激干预，采用CCK-8法测定细胞存活率，免疫细胞化学染色观察细胞形态，计算神经突起细胞率、测量细胞轴突长度及积分光密度(IOD)值。
优选地，在所述电刺激培养之前还包括对神经细胞进行分离和培养的步骤。
优选地，所述神经细胞分离自大鼠脊髓。
优选地，所述大鼠为24小时内新生大鼠。
优选地，所述神经细胞包括背根神经节细胞。
根据本发明，背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)主要由感觉神经元组成，参与脊髓反射与感觉功能的调节，DRG因其细胞种类、生物学特性单一，越来越受到研究人员的重视，本发明采用新生大鼠的DRGn作为研究对象，分析电刺激对神经元突起再生的影响，进行轴突生长发育的研究。
优选地，所述培养的温度为35～40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为36～37℃；
优选地，所述培养的时间为2～4天，例如可以是2天、3天或4天。
优选地，所述培养采用的培养液中含有细胞分裂抑制剂。
优选地，所述细胞分裂抑制剂包括5-氟-2'-脱氧尿苷和/或尿苷。
本发明中，向培养液中加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷和尿苷，有利于抑制非神经细胞的增殖。
优选地，所述5-氟-2'-脱氧尿苷的浓度为10～20μg/mL，例如可以是10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL。
优选地，所述尿苷的浓度为30～50μg/mL，例如可以是30μg/mL、31μg/mL、32μg/mL、33μg/mL、34μg/mL、35μg/mL、36μg/mL、37μg/mL、38μg/mL、39μg/mL、40μg/mL、41μg/mL、42μg/mL、43μg/mL、44μg/mL、45μg/mL、46μg/mL、47μg/mL、48μg/mL、49μg/mL或50μg/mL。
作为优选技术方案，本发明提供了一种神经细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
(1)细胞的分离和培养：从24小时内新生大鼠的脊髓中分离背根神经节细胞，在35～40℃、5～10％CO2的细胞培养箱中培养1～2天，更换培养液为含有10～20μg/mL 5-氟-2'-脱氧尿苷和30～50μg/mL尿苷的培养液，继续培养1～2天；
(2)对背根神经节细胞进行电刺激培养，其中，电刺激培养的模式为双向电刺激和/或单项电刺激，电刺激培养的电压为1～10V，频率为1～5Hz，温度为35～40℃，时间为20～40min/次，保持1～3天。
第二方面，本发明提供了一种神经细胞，所述神经细胞采用如第一方面所述的培养方法进行培养。
优选地，所述神经细胞的c-fos基因过表达。
优选地，所述神经细胞的形态发生改变。
优选地，所述神经细胞的轴突发生改变。
第三方面，本发明提供了一种人工脊髓，所述人工脊髓包括如第二方面所述的神经细胞。
优选地，所述人工脊髓还包括生物支架。
第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第二方面所述的神经细胞和/或如第三方面所述的人工脊髓。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供了一种如第二方面所述的神经细胞、如第三方面所述的人工脊髓或如第四方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物、医用材料或医疗器械中的应用。
优选地，所述疾病包括脊髓损伤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明以大鼠背根神经节神经元(dorsal root ganglion，DRG)为研究对象，在DRG的培养过程中引入微电流，实时观测细胞的生长形态变化，持续测定细胞存活率、神经突起细胞率、细胞轴突长度及积分光密度值，检测神经元中c-fos的表达，探索微电流对神经细胞生长的影响；
(2)本发明发现电刺激对神经细胞的生长具有引导作用，显著影响神经细胞内神经元中c-fos的表达，为电刺激治疗脊髓损伤提供了科学依据和新的技术手段。
附图说明
图1(A)为大鼠背根神经节神经元DRGn的形态，图1(B)为大鼠背根神经节神经元DRGn的生长状态；
图2(A)、图2(B)和图2(C)为不同视野下的神经元免疫荧光图片(600×)；
图3(A)为不同电刺激条件下c-fos mRNA的扩增曲线，图3(B)为对应的溶解曲线；
图4(A)为不同电刺激条件下内参基因β-Actin的扩增曲线，图4(B)为对应的溶解曲线；
图5(A)为12个样本中c-fos蛋白的表达水平，图5(B)为12个样本中β-Actin蛋白的表达水平。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1大鼠背根神经节神经元的分离和培养
本实施例选取大鼠背根神经节神经元(dorsal root ganglion neuron，DRGn)为研究对象，获取方法如下：
(1)原代培养DRGn
取24小时内的新生大鼠，先用75％酒精浸泡消毒，再用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤，剪取一段脊髓，背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上，在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨，暴露脊髓和神经节，用解剖镊分离出神经节；
剥除神经节被膜，用0.125％胰蛋白酶37℃消化30min，分散后用种植(Plating)培养液稀释成密度为0.2×105个细胞/mL的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中，每皿2mL细胞悬液；
将标本置于36℃、10％CO2培养箱中培养，24h后倾去培养皿内的种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养；
接种第3天，在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷(15μg/mL)和尿苷(35μg/mL)，以抑制非神经细胞的增殖，作用48h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次，每次更换一半新鲜饲养培养液。
实施例2大鼠背根神经节神经元的鉴定
(1)细胞形态的观察
将原代培养3天的DRGn置于倒置相差显微镜下进行形态学观察，于镜下随机选取100倍、200倍及400倍视野，观察DRGn的形态和生长状态；
将原代培养3天的DRGn从细胞培养箱中取出，用D-Hank’s液冲洗3次；加入2.5％戊二醛，4℃下固定2h，再以0.01M PBS漂洗3次、每次漂洗10min；将细胞置于1％四氧化锇中进行固定，4℃下固定1.5h；用0.01M PBS漂洗3次、每次漂洗10min；转入梯度乙醇中进行脱水后，进行醋酸异戊酯置换；CO2临界点干燥；导电玻璃种有细胞的表面喷金，扫描电镜下观察。
结果如图1(A)和图1(B)所示，大鼠背根神经节神经元DRGn贴壁生长，胞体周围生长细长的突起。
(2)免疫细胞化学染色
将原代培养5天的DRGn从细胞培养箱中取出，吸除培养液，采用0.01MPBS清洗3次、每次清洗5min；4％多聚甲醛室温固定30min；用PBS清洗3次，换入0.2％Triton室温作用10min，用0.01M PBS清洗3次、每次清洗5min，去除PBS；加入β-tubulinⅢ抗大鼠一抗(1:500，用0.01M PBS稀释抗体)，4℃过夜，0.01M PBS清洗3次、每次清洗5min，去除PBS；在暗处加入cy3荧光标记的抗鼠IgG二抗(1:500)，37℃温箱作用1h，0.01M PBS清洗3次、每次5min，去除PBS；在暗处加入DAPI染色液，室温下作用5min，0.01M PBS清洗3次、每次5min，去除PBS，甘油封片后于-20℃保存。
于荧光显微镜下观察免疫细胞的化学染色情况，如图2(A)、图2(B)和图2(C)所示为不同视野下的神经元免疫荧光图片(600×)，发出绿色荧光的为DRGn，发出蓝色荧光的为细胞核。
实施例3电刺激对神经细胞轴突生长的影响
本实施例从双/单相、电刺激时间、电刺激电压和电刺激频率这四个方面对神经元进行电刺激干预，采用CCK-8法测定细胞活性，免疫细胞化学染色后，利用Image-ProPlus6.0图像分析软件测量突起长度。
将培养1天的DRGn细胞分成四个实验组：正常组、电刺激组、双相(biphasic，BI)BI组和单相(monophasic，MO)MO组，调节双/单相、电刺激时间、电刺激电压和电刺激频率等电刺激参数，其中正常组不进行刺激；电刺激组采用直流电刺激，电场强度为6V/cm；单相(monophasic，MO)MO组采用方波电刺激，电场强度为6V/cm，频率为2Hz；双相(biphasic，BI)BI组采用双向脉冲波电刺激，电场强度为6V/cm，频率为2Hz。对DRGn细胞进行电刺激干预30min；干预后继续在细胞培养箱中培养，1天后将DRGn细胞置于倒置相差显微镜下进行细胞观察，分析细胞的形态和生长状态；分别于电刺激后的第1天、第3天和第5天，对DRGn细胞进行免疫细胞化学染色，CCK-8法测定细胞活性。
结果如表1所示，与正常组相比，电刺激组和双相BI组的细胞活力增加，但差异不明显；单相MO组的细胞活力降低，随着时间的延长细胞活力逐渐降低。
表1CCK-8检测电刺激后的1d、3d、5d的DRGn活性
Figure BDA0002315760750000101
Figure BDA0002315760750000111
实施例4电刺激对神经细胞c-fos表达的影响
本实施例阻断钙离子来源后，从分子水平观察电刺激过程中神经元突起再生和神经元c-fos的表达。
将DRGn细胞在培养皿中孵育1h后，开始实施电刺激；电刺激后，全量换液，将培养皿放入细胞培养箱中继续培养；电刺激后第1天、第3天和第5天，进行免疫细胞化学染色，提取细胞蛋白，进行Western blot和qPCR实验。
qPCR的具体实验设计为：
设置12个分组，每组3个样本，其中，1-1、1-2、1-3为正常组-1d，2-1、2-2、2-3为电刺激组-1d，3-1、3-2、3-3为双相BI组-1d，4-1、4-2、4-3为单相MO组-1d；5-1、5-2、5-3为正常组-3d，6-1、6-2、6-3为电刺激组-3d，7-1、7-2、7-3为双相BI组-3d，8-1、8-2、8-3为单相MO组-3d；9-1、9-2、9-3为正常组-5d，10-1、10-2、10-3为电刺激组-5d，11-1、11-2、11-3为双相BI组-5d，12-1、12-2、12-3为单相MO组-5d。
CT值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，△Ct＝目的基因Ct-内参基因Ct，相对表达量＝2-⊿Ct，相对比值＝目的基因相对拷贝数/内参基因相对拷贝数，相对表达量或者相对比值越高，表明mRNA表达越多。
由表2、图3(A)和图3(B)可知，与正常组比较，电刺激组和双相BI组的c-fos mRNA表达增加；单相MO组的c-fos mRNA表达降低；表3为内参基因β-Actin的Ct值，图4(A)和图4(B)为内参基因β-Actin的扩增曲线和溶解曲线。
表2qPCR检测电刺激后的1d、3d、5d的DRGn的c-fos表达水平
Figure BDA0002315760750000121
Figure BDA0002315760750000131
表3qPCR检测电刺激后的1d、3d、5d的DRGn的β-actin表达水平
Figure BDA0002315760750000132
Figure BDA0002315760750000141
Figure BDA0002315760750000151
图5(A)为Western blot试验中12个样本的c-fos蛋白(62kD)表达水平，图5(B)为Western blot试验中12个样本的β-Actin蛋白(42kD)表达水平。各泳道代表的含义分别为1：正常组-1d；2：电刺激组-1d；3：双相BI组-1d；4：单相MO组-1d；5：正常组-3d；6：电刺激组-3d；7：双相BI组-3d；8：单相MO组-3d；9：正常组-5d；10：电刺激组-5d；11：双相BI组-5d；12：单相MO组-5d。实验结果表明，与正常组比较，电刺激组和双相BI组的c-fos蛋白表达增加；单相MO组的c-fos蛋白表达降低。
综上所述，本发明以大鼠背根神经节神经元(dorsal root ganglion，DRG)为研究对象，在DRG的培养过程中引入微电流，实时观测细胞的生长形态变化，持续测定细胞存活率、神经突起细胞率、细胞轴突长度及积分光密度值，检测神经元中c-fos的表达，探索微电流对神经细胞生长的影响；发现电刺激对神经细胞的生长具有引导作用，显著影响神经细胞内神经元中c-fos的表达，为电刺激治疗脊髓损伤提供了科学依据和新的技术手段。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种神经细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括对神经细胞进行电刺激培养。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述电刺激培养的模式为双向电刺激和/或单项电刺激；
优选地，所述电刺激培养的电压为1～10V；
优选地，所述电刺激培养的频率为1～5Hz。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述电刺激培养的温度为35～40℃；
优选地，所述电刺激培养的时间为20～40min/次，保持1～3天。
4.根据权利要求1-3任一项所述的培养方法，其特征在于，在所述电刺激培养之前还包括对神经细胞进行分离和培养的步骤；
优选地，所述神经细胞分离自大鼠脊髓；
优选地，所述大鼠为24小时内新生大鼠；
优选地，所述神经细胞包括背根神经节细胞。
5.根据权利要求1-4任一项所述的培养方法，其特征在于，所述培养的温度为35～40℃，优选为36～37℃；
优选地，所述培养的时间为2～4天；
优选地，所述培养采用的培养液中含有细胞分裂抑制剂；
优选地，所述细胞分裂抑制剂包括5-氟-2'-脱氧尿苷和/或尿苷；
优选地，所述5-氟-2'-脱氧尿苷的浓度为10～20μg/mL；
优选地，所述尿苷的浓度为30～50μg/mL。
6.根据权利要求1-5任一项所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：
(1)细胞的分离和培养：从24小时内新生大鼠的脊髓中分离背根神经节细胞，在35～40℃、5～10％CO2的细胞培养箱中培养1～2天，更换培养液为含有10～20μg/mL 5-氟-2'-脱氧尿苷和30～50μg/mL尿苷的培养液，继续培养1～2天；
(2)对背根神经节细胞进行电刺激培养，其中，电刺激培养的模式为双向电刺激和/或单项电刺激，电刺激培养的电压为1～10V，频率为1～5Hz，温度为35～40℃，时间为20～40min/次，保持1～3天。
7.一种神经细胞，其特征在于，所述神经细胞采用如权利要求1-6任一项所述的培养方法进行培养；
优选地，所述神经细胞的c-fos基因过表达；
优选地，所述神经细胞的形态发生改变；
优选地，所述神经细胞的轴突发生改变。
8.一种人工脊髓，其特征在于，所述人工脊髓包括如权利要求7所述的神经细胞；
优选地，所述人工脊髓还包括生物支架。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求7所述的神经细胞和/或如权利要求8所述的人工脊髓；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种如权利要求7所述的神经细胞、如权利要求8所述的人工脊髓或如权利要求9所述的药物组合物在制备疾病治疗药物、医用材料或医疗器械中的应用；
优选地，所述疾病包括脊髓损伤。
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