CN110898235B - 雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈用组合物及其合成方法、套组、成像方法及应用 - Google Patents

雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈用组合物及其合成方法、套组、成像方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种包含螯合剂及受体配体的雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈用组合物。本发明还提供一种合成所述组合物的方法，且所述组合物还可被制备成用于疗法或分子成像的药物配方或套组。

Description

雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈用组合物及其合成方法、套组、成像方法及应用
技术领域
本发明涉及一种组合物，尤其涉及一种雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈(cross talk)用组合物、合成所述组合物的方法、套组以及使用所述组合物的成像方法及治疗方法。
背景技术
目前疾病状况的评估依赖于电脑断层扫描(computed tomography，CT)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、x射线或超声波。这些模式提供形态学(大小、形状)及解剖学信息。除这些成像模式外，治疗终点几乎完全依赖于通过分子及组织病理学方法对活组织检查(biopsy)的分析，所述分子及组织病理学方法提供一般异质过程(heterogeneous process)的显微图片。然而，这些预后(prognostic)工具无法提供细胞目标信息，因此对疗法有效性的评估并不是最优的。
开发放射性标记的生化化合物来理解分子通路已扩展了核分子成像(nuclearmolecular imaging)研究在药品开发中的使用。正子放射断层扫描(positron emissiontomography，PET)及单光子放射电脑断层扫描(single photon emission computedtomography，SPECT)使用放射性药物对靶位点活性(例如，血管生成、新陈代谢、缺氧、细胞凋亡及增殖)进行成像、绘图及测量。PET及SPECT药剂也被称为微剂量给药(micro-dosing)药剂，这是因为存在无法检测的药理学效应。[18F]氟化去氧葡萄糖(Fluorodeoxyglucose，FDG)是PET的黄金标准，其与CT及MRI互补且允许检测未预料到的远处转移(distantmetastase)。尽管PET FDG在诊断各种肿瘤方面与CT及MRI的发现一致，但FDG也存在缺陷。例如，显著量(>95％)的FDG集中在线粒体部分中，且这会导致炎症/感染与肿瘤复发之间明显的假阳性病变。另外，FDG无法提供关于治疗反应预测的准确信息。因此，可开发能提供治疗适应症(therapeutic indication)超过FDG的放射性药物。
发明内容
本发明提供一种雌激素受体(estrogen receptor，ER)与大麻受体(cannabinoidreceptor，CBR)之间的相互交谈(cross talk)用组合物以及一种合成所述组合物的新颖方法。所述组合物还可被制备成用于疗法或分子成像的药物配方或套组。
本发明提供一种包含螯合剂(chelator)及受体配体(receptor ligand)的雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈用组合物。
在本发明的实施例中，螯合剂是含氮四氮杂环(tetraazacyclic ring)。
在本发明的实施例中，所述含氮四氮杂环是环拉胺(cyclam)、大环多胺(cyclen)、环拉胺-羧酸或大环多胺-羧酸。
在本发明的实施例中，所述受体配体是雌激素配体或抗雌激素配体。
在本发明的实施例中，所述雌激素配体包括雌二醇(estradiol)、雌酮(estrone)、雌三醇(estiol)及克罗米芬(clomiphene)。
在本发明的实施例中，所述抗雌激素配体包括非甾体他莫昔芬(non-steroidaltamoxifen)、托丽米芬(torimiphene)、雷洛昔芬(raloxifen)及氨鲁米特(aminoglutethimide)。
在本发明的实施例中，所述受体配体具有间隔羟基(spacer hydroxy group)。
在本发明的实施例中，所述组合物还包含金属离子。
在本发明的实施例中，所述金属离子是放射性核素、非放射性金属或其组合。
在本发明的实施例中，所述放射性核素是99mTc、67,68Ga、60,61,62,64,67Cu、111In、166Ho、186,188Re、90Y、177Lu、223Ra、225Ac、89Zr、117mSn、153Sm、89Sr、59Fe、212Bi、211At、45Ti或其组合。
在本发明的实施例中，所述非放射性金属是锝离子(Tc)、锡离子(Sn)、铜离子(Cu)、铟离子(In)、铊离子(Tl)、镓离子(Ga)、砷离子(As)、铼离子(Re)、钬离子(Ho)、钇离子(Y)、钐离子(Sm)、硒离子(Se)、锶离子(Sr)、钆离子(Gd)、铋离子(Bi)、铁离子(Fe)、锰离子(Mn)、镥离子(Lu)、钴离子(Co)、铂离子(Pt)、钙离子(Ca)、铑离子(Rh)、铕离子(Eu)及铽离子(Tb)或其组合。
在本发明的实施例中，所述组合物是99mTc-环拉胺-他莫昔芬类似物或99mTc-大环多胺-他莫昔芬类似物。
本发明还提供一种包含上述组合物的套组(kit)。
本发明还提供一种合成上述组合物的方法。
在本发明的实施例中，所述受体配体利用环氧化物(epoxide)共轭到四环(tetracyclic ring)。
在本发明的实施例中，环氧化物附连到受体配体的脂肪族链(aliphatic chain)。
本发明还提供一种用于癌症、类风湿性关节炎、骨质疏松症、动脉粥样硬化或子宫内膜组织的成像方法，所述方法包括施用上述组合物。
在本发明的实施例中，图像是γ图像、PET图像、PET/CT图像、SPECT图像、SPECT/CT图像、PET/MRI图像、SPECT/MRI图像或混合图像。
在本发明的实施例中，成像剂量被定义为套组。
本发明还提供一种用于癌症、类风湿性关节炎、骨质疏松症、动脉粥样硬化或子宫内膜组织的治疗方法，所述方法包括施用上述组合物。
基于上述，本发明提供雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈用组合物。羟基包含在制成品中。在本发明的组合物中，使用受保护的螯合剂来使环氧基化受体配体反应以形成螯合剂-受体配体共轭体。技术平台可利用共轭拮抗剂(antagonist)及激动剂(agonist)，并观察其在各种形式的疾病中的效果。此外，所述组合物还可使用技术人员所已知的化学程式而被制备成药物配方及套组。另外，还提供合成所述组合物的方法，且所述合成方法可不再需要向受体配体中添加保护基，且会提高制程效率并纯化最终产品。除此之外，可使用本发明的组合物对雌激素受体及大麻受体相关联的疾病进行成像或治疗。
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图作详细说明如下。
附图说明
图1A示出在本发明的实例1中合成的化合物1的氢谱核磁共振(1H-NuclearMagnetic Resonance，1H-NMR)光谱；
图1B示出在本发明的实例1中合成的化合物2的1H-NMR光谱；
图1C示出在本发明的实例1中合成的化合物3的1H-NMR光谱；
图1D示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的1H-NMR光谱；
图1E示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的13C-NMR光谱；
图1F示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的1H-,1H相关光谱学(Correlation Spectroscopy，COSY)NMR光谱；
图1G示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的1H-,13C异核单量子相关(heteronuclear singular quantum correlation，HSQC)NMR光谱；
图1H示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的1H-,13C异核多键相关(heteronuclear multiple bond correlation，HMBC)NMR光谱；
图1I示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的液相色谱-质谱(liquidchromatography-mass spectrometry，LC-MS)光谱；
图1J示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的高效液相色谱(highperformance liquid chromatography，HPLC)光谱；
图1K及图1L示出在本发明的实例2中合成的组合物99mTc-SC-05-K-1在两个不同的系统中的放射化学纯度(radiochemical purity)；
图1M示出在本发明的实例2中合成的组合物99mTc-SC-05-K-1的标记效率；
图2A示出在本发明的实例3中合成的化合物5的1H-NMR光谱；
图2B示出在本发明的实例3中合成的化合物6的1H-NMR光谱；
图2C示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的1H-NMR光谱；
图2D示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的13C-NMR光谱；
图2E示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的1H-,1H COSY NMR光谱；
图2F示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的1H-,13C HSQC NMR光谱；
图2G示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的1H-,13C HMBC NMR光谱；
图2H示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的LC-MS光谱；
图2I示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的HPLC光谱；
图2J及图2K示出在本发明的实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-L-1在两个不同的系统中的放射化学纯度；
图2L及图2M示出在本发明的实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-L-1在两个不同的系统中的标记效率；
图2N及图2O示出在本发明的实例2中合成的组合物99mTc-SC-05-L-1在两个不同的系统中的体外(in vitro)稳定性；
图3A及图3B示出在本发明的实例2及实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-K-1及组合物99mTc-SC-05-L-1的MCF-7细胞摄取(uptake)及阻断(blocking)研究；
图4A及图4B示出在本发明的实例2及实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-K-1及组合物99mTc-SC-05-L-1的OVCAR3细胞及TOV-112D细胞摄取研究；
图5示出在本发明的实例2中合成的组合物99mTc-SC-05-L-1的OVCAR3细胞及TOV-112D细胞摄取及阻断研究；
图6示出本发明的化合物SC-05-L-1及化合物SC-05-K-1抵抗淋巴瘤细胞(lymphoma cell)的效果；
图7A及图7B示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的体外抗癌研究；
图8A及图8B示出在本发明的实例1及实例3中合成的化合物SC-05-K-1及化合物SC-05-L-1的体外抗癌研究。
具体实施方式
现在将详细参照本发明的当前优选实施例，在附图中示出所述优选实施例的实例。尽可能地，在附图及说明中使用相同的参考编号指代相同或相似的部件。
评估雌激素受体-阳性(ER+)通路启动系统是激素依赖性疾病管理(hormone-dependent disease management)的基础。ER+患者对内分泌疗法的反应更好，且其存活时间是阴性ER患者的存活时间的两倍长。然而，肿瘤对抗雌激素的抗性是无法预测的。抗药性可能是由于肿瘤对其的摄取不良或缓慢。选择性雌激素受体调节剂(selective estrogenreceptor modulator，SERM)可能会在雌激素受体(ER)与大麻受体(CBR)通路系统之间产生相互交谈。识别SERM系药品是否使用CBR作为主动输送策略可增强药品到雌激素受体结合口袋(drug to ER binding pocket)，且可克服抗药性。因此，本发明提供一种包含螯合剂及受体配体的雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈用组合物。
在一些实施例中，螯合剂可例如为含氮四氮杂环。具体来说，含氮四氮杂环可例如为环拉胺、大环多胺、环拉胺-羧酸或大环多胺-羧酸，但本发明并非仅限于此。
在一些实施例中，配体受体可例如为雌激素配体或抗雌激素配体。在一些实施例中，雌激素配体可包括例如雌二醇、雌酮、雌三醇及克罗米芬。在一些其他实施例中，抗雌激素配体可包括例如非甾体他莫昔芬、托丽米芬、雷洛昔芬及氨鲁米特。然而，本发明并非仅限于此。在一些实施例中，受体配体具有间隔羟基，所述间隔羟基将在以下进行详细阐述。
在一些实施例中，所述组合物还包含金属离子。具体来说，金属离子可例如为放射性核素、非放射性金属或其组合。在一些实施例中，所述放射性核素可例如为99mTc、67,68Ga、60,61,62,64,67Cu、111In、166Ho、186,188Re、90Y、177Lu、223Ra、225Ac、89Zr、117mSn、153Sm、89Sr、59Fe、212Bi、211At、45Ti或其组合。在一些其他实施例中，所述非放射性金属可例如为锝离子(Tc)、锡离子(Sn)、铜离子(Cu)、铟离子(In)、铊离子(Tl)、镓离子(Ga)、砷离子(As)、铼离子(Re)、钬离子(Ho)、钇离子(Y)、钐离子(Sm)、硒离子(Se)、锶离子(Sr)、钆离子(Gd)、铋离子(Bi)、铁离子(Fe)、锰离子(Mn)、镥离子(Lu)、钴离子(Co)、铂离子(Pt)、钙离子(Ca)、铑离子(Rh)、铕离子(Eu)及铽离子(Tb)或其组合。然而，本发明并非仅限于此。在本发明的一个具体实施例中，所述组合物可为99mTc-环拉胺-他莫昔芬类似物。在本发明的另一具体实施例中，所述组合物可为99mTc-大环多胺-他莫昔芬类似物。
应提到，可使用本发明的组合物来通过细胞表面CBR识别ER+通路。放射性标记的ER+配体不仅能够针对癌症阶段及再现阶段(stage and re-stage)对ER+组织摄取进行量化，且还能够针对最优疗法反应选择患者并且当出现抗性时中断治疗。换句话说，由于组合物的结构，组合物可通过主动输送策略来增强药品到雌激素受体结合口袋，从而克服抗药性。
本发明还提供一种合成所述组合物的方法。合成方法的步骤在以下详细阐述，但本发明并非仅限于此。
在一些实施例中，受体配体例如首先利用环氧化物共轭到四环。换句话说，环氧化物附连到受体配体的脂肪族链。在一些实施例中，受体配体可例如为雌激素激动剂、雌激素拮抗剂或芳香酶抑制剂，包括克罗米芬、他莫昔芬、雷洛昔芬、托丽米芬及氨鲁米特的非甾体衍生物。在本发明的一个具体实施例中，抗雌激素是他莫昔芬，但本发明并非仅限于此。具体来说，氯化环氧化物(间隔物)在有机溶剂中与脂族羟基化他莫昔芬反应，从而生成环氧化物-他莫昔芬。在这种情况下，受体配体是他莫昔芬，即选择性雌激素受体调节剂(SERM)，其可能会在雌激素受体与大麻受体通路系统之间产生相互交谈，但本发明并非仅限于此。然后，环氧化物-他莫昔芬与包括偶合剂的受保护的四氮杂环状螯合剂反应。因此，羟基位于制成品中的螯合剂-他莫昔芬共轭体处。在一些实施例中，四氮杂环状螯合剂可例如为环拉胺或大环多胺。然而，本发明并非仅限于此。应注意，羟基位于受体配体的脂肪族链处。为了清晰地理解，反应流程图1示出如下所示共轭到环拉胺或大环多胺的受体配体(R)的示意图：
Figure BDA0001979619540000051
反应流程图1：受体配体(R)共轭到环拉胺或大环多胺
在一些实施例中，可在例如二甲基甲酰胺(dimethylformamide)、二甲亚砜(dimethylsulfoxide)、二恶烷(dioxane)、甲醇、乙醇、己烷、二氯甲烷、乙腈(acetonitrile)、四氢呋喃(tetrahydrofuran)或其混合物等有机溶剂中施行掺和方法。在其他实施例中，可在水性溶剂中施行掺和方法。在一些实施例中，螯合剂的氮基中的一者、两者或三者可例如由叔丁基(tert-butyl group)或苯甲基(benzyl group)保护或者不受保护。
在一些实施例中，本发明的方法还可包括至少一个纯化步骤。可经由所属领域中的技术人员所已知的任何方法对本发明的任何化合物进行纯化。所属领域中的技术人员熟习这些方法，且当时可采用这些方法。举例来说，在旨在得到特定化合物的多步骤合成中，可在每一合成步骤之后、在几个步骤之后、在合成期间的各种时间点处和/或在合成末尾执行纯化步骤。在一些实施例中，一个或多个纯化步骤包括选自由硅胶柱色谱法(silica gelcolumn chromatography)、高效液相色谱法(HPLC)及液相色谱法(LC)组成的群组的技术。在某些实施例中，纯化方法具体来说不包括尺寸筛除色谱法(size exclusionchromatography)和/或透析。应注意，在有机溶剂中合成组合物的方法以及保护基的使用通常会改善化合物的纯化。保护基的设置允许保护合成期间的中间物的各种官能基，且有利于这些中间物的纯化。使用有机溶剂的各种纯化方式允许分离及隔离期望的化合物(例如成像剂)且具有非常少的杂质。因此，可开发有机合成技术以允许以更高效的方式获得更高纯度的位点特异性共轭体(site-specific conjugate)。
在本发明的一个具体实施例中，羟基化他莫昔芬使用以下反应流程图2及反应流程图3所示的合成路径在一个氮基处共轭到环拉胺及大环多胺。在这种情况下，羟基包含在制成品中。使用受保护的螯合剂来使环氧基化他莫昔芬反应以形成螯合剂-他莫昔芬共轭体。技术平台利用共轭拮抗剂及激动剂，并观察其在各种形式的疾病中的效果。换句话说，个性化的技术平台可基于与每一患者的疾病相关联的大麻受体及雌激素受体的个体基因构成来设计。在其他方面，这些合成方法可能不再需要向他莫昔芬类似物中添加保护基且提高制程效率并纯化最终产品。
Figure BDA0001979619540000061
反应流程图2：合成化合物SC-05-K-1的方法
Figure BDA0001979619540000062
反应流程图3：合成化合物SC-05-L-1的方法
另外，在一些实施例中，提供包含上述组合物的药物配方或套组。在其他方面，所述组合物还可使用技术人员所已知的化学程式而被制备成药物配方或套组。在一些实施例中，药物配方或套组还可包含例如抗氧化剂(antioxidant)、稳定剂(stabilizing agent)、防腐剂(preservative)或盐。在一些实施例中，药物配方或套组可包含例如抗坏血酸(ascorbic acid)、甘露醇(mannitol)、氯化锡(II)及螯合剂-他莫昔芬共轭体。在一些方面，药物配方或套组可例如为水溶液或已被冷冻和/或冻干的溶液。本文中，“套组”在分子成像领域中也被称为“冷套组(cold kit)”。
此外，本发明准确地提供在给定受试者中的疾病位点处成像的方法，以执行每次治疗/治疗后评价，且只要所述受试者正在以抗雌激素进行治疗或在治疗中便能够监测所述受试者。在某些方面，所述方法包括：检测由各别受试者的疾病位点处的放射性核素标记的螯合剂-共轭体产生的信号，其中疾病位元点如果存在，则会产生比组织周围更强烈的信号。在一些方面，金属离子可为放射性核素及所属领域中的技术人员所已知的任何放射性核素。在一些实施例中，放射性核素包括例如99mTc、67,68Ga、60,61,62,64,67Cu、111In、166Ho、186, 188Re、90Y、177Lu、223Ra、225Ac、89Zr、117mSn、153Sm、89Sr、59Fe、212Bi、211At及45Ti，但本发明并非仅限于此。在其他方面，金属离子可为非放射性金属。在一些实施例中，将成像的位点可为肿瘤或ER富集的组织，例如卵巢及子宫组织。在一些实施例中，所述方法可被定义为用于癌症、类风湿性关节炎、骨质疏松症、动脉粥样硬化或子宫内膜组织的成像方法，其包括施用上述组合物。在一个具体实施例中，所述方法可被定义为对受试者内的位点进行成像的方法，其包括检测来自定位在所述位元点处的金属离子标记的螯合剂-受体配体共轭体的信号，但本发明并非仅限于此。在一些实施例中，可使用例如选自由PET、PET/CT、SPECT、SPECT/CT、PET/MRI、SPECT/MRI及具有核成像装置的光学成像混合型组成的群组的技术来检测。在其他实施例中，图像可例如为γ图像、PET图像、PET/CT图像、SPECT图像、SPECT/CT图像、PET/MRI图像、SPECT/MRI图像或混合图像。应注意，上述组合物可制成为用于成像的套组，且成像剂量被定义为套组。除此之外，所述方法还可被定义为治疗患有癌症或子宫内膜异位(endometriosis)的受试者的方法。在特定方面，癌症例如是乳癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌或子宫内膜癌(endometrial cancer)，但本发明并非仅限于此。在一些实施例中，所述方法可例如被定义为用于癌症、类风湿性关节炎、骨质疏松症、动脉粥样硬化或子宫内膜组织的治疗方法，其包括施用上述组合物。换句话说，提供一种在受试者体内对位点进行成像、诊断疾病或治疗疾病的方法，其包括对受试者施用金属离子标记的螯合剂-受体配体共轭体，其中对位点进行成像，对疾病进行诊断或对疾病进行治疗。
另一方面，应注意本发明的组合物可应用于分子成像及疗法。举例来说，可使用本发明的组合物作为分子核成像剂。具体来说，分子核成像剂能够全面表征治疗性干预(therapeutic intervention)，且可用于患者选择、药代动力学(pharmacokinetic)、剂量发现(dosage-finding)及概念验证(proof-of-concept)研究。在患者治疗反应的成果评估中，与仪器开发并行的受体图像指导的细胞治疗方法方面的努力将会更全面。更具体来说，使用螯合作用的分子成像剂在放射化学产率、纯度、生产成本及在常规临床实践中药剂的可用性的批次间重现性(batch-to-batch reproducibility)方面提供了优点。
另外，本发明技术平台将金属离子、螯合剂及受体配体集成在一起。可使用受体配体作为复位剂(homing agent)，其通过细胞表面受体与细胞内细胞溶质受体(intracellular cytosolic receptor)之间的相互交谈而发挥双重作用，因而会增强复位剂的细胞摄取。举例来说，CB1/CB2受体及ER通路在各种癌症中是重迭的。已知他莫昔芬提供ER与CBR之间的相互交谈。因此，理想的是，开发他莫昔芬系成像剂以经由CB1/CB2受体测量ER系统活性。这种他莫昔芬系成像将有助于监测CB1/CB2受体及ER通路引导的治疗反应并针对最优治疗反应预测患者的选择。在这种情况下，羟基包括在螯合剂-他莫昔芬共轭体中的脂族间隔物处以在利用创新工具进行诊断成像期间实现磷酸化，从而理解导致组织退化、炎症及增生性异常的通路启动的细胞受体的动态变化并改善患者诊断、治疗及预后(prognosis)。然而，本发明并非仅限于此。
为了证明本发明的组合物适用于成像且用于癌症疗法，本发明的组合物是使用在以下实例中所述的方法来合成及测试。
实例1
合成化合物SC-05-K-1
在此实例中，合成了4种具体化合物(化合物1到化合物4)以及本发明的化合物SC-05-K-1。
A.合成化合物1
在室温下将2N NaOH溶液(10mL)添加到克罗米芬柠檬酸盐(1g，1.69mmol)与乙酸乙酯(ethyl acetate，EA，10mL)的溶液中。将混合物剧烈搅拌了30分钟并以EA萃取了三次(10mL，8mL，6mL)。在减压下对有机层进行了浓缩以得到无色油(colorless oil)形式的游离碱式克罗米芬(化合物1，685.7mg，1.68mmol，99％)。
B.合成化合物2
在-40℃下将叔丁基锂(50mL，96mmol，在戊烷中为1.9M)逐滴添加到化合物1(1.95g，4.8mmol)在四氢呋喃(tetrahydrofuran，THF，50mL)中的溶液中。逐滴添加了1,3-环氧丙烷(trimethylene oxide)(6.26mL，96mmol)且将混合物在-40℃下搅拌了30分钟。使反应升温到室温并在室温下连续搅拌了18小时。向反应中小心地添加了水，且以EA将反应萃取了三次(50mL，30mL，20mL)。通过无水硫酸镁(anhydrous magnesium sulfate)对EA层进行了干燥。在过滤后，在减压下对EA溶剂进行了浓缩。通过柱色谱法(EA/己烷/TEA，1/3/0.1)对粗制产物进行了纯化以得到白色固体形式的(Z)-5-(4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)-4,5-二苯基戊-4-烯-1-醇((Z)-5-(4-(2-(diethylamino)ethoxy)phenyl)-4,5-diphenylpent-4-en-1-ol)(化合物2，671.5mg，1.6mmol，36％)。
C.合成化合物3
向化合物2(503.3mg，1.17mmol)在35％NaOH溶液(12mL)中的悬浮液中，添加了四丁基溴化铵(TBABr，113.3mg，0.35mmol)。剧烈搅拌了反应混合物。然后向反应中添加了表氯醇(epichlorohydrin)(758.7mg，8.2mmol)及几滴甲苯。将反应混合物在室温下搅拌了15小时。向反应中添加了EA(20mL)，且将反应萃取了三次(15mL，10mL)。通过硫酸镁对有机层进行了干燥。在过滤后，在减压下对溶剂进行了浓缩，且通过柱色谱法(EA/己烷/TEA，1/3/0.1)对粗制产物进行了纯化，以得到黄色油形式的(Z)-N,N-二乙基-2-(4-(5-(环氧乙烷-2-基甲氧基)-1,2-二苯基戊-1-烯-1-基)苯氧基)乙-1-胺((Z)-N,N-diethyl-2-(4-(5-(oxiran-2-ylmethoxy)-1,2-diphenylpent-1-en-1-yl)phenoxy)ethan-1-amine)(化合物3，432.1mg，0.89mmol，76％)。
D.合成化合物4
将1,4,7,10-四氮杂环十二烷(1,4,7,10-tetraazacyclododecane)(大环多胺，642.9mg，3.73mmol)及化合物3在甲苯(4mL)中的混合物加热到100℃，直到所有大环多胺溶解。将反应混合物在100℃下搅拌了16小时。将反应冷却到室温并在冰箱中保持3小时。接着通过过滤移除了过量大环多胺的沉淀物并以冷甲苯进行了洗涤。对甲苯滤液进行了组合及浓缩。通过柱色谱法(DCM/MeOH/NH4OH，1/1/0.1)对粗制产物进行了纯化以得到黄色油形式的(Z)-1-(1,4,7,10-四氮杂环十二-1-基)-3-((5-(4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)-4,5-二苯基戊-4-烯-1-基)氧基)丙-2-醇((Z)-1-(1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)-3-((5-(4-(2-(diethylamino)ethoxy)phenyl)-4,5-diphenylpent-4-en-1-yl)oxy)propan-2-ol)(化合物4，330mg，0.50mmol，67％)。
E.合成化合物SC-05-K-1
将1N HCl溶液添加到化合物4(330mg，0.50mmol)的混合物中，且逐滴添加了水(1mL)直到pH值为5到7。接着通过反相柱色谱法对混合物进行了纯化以得到白色固体形式的纯化合物SC-05-K-1(175mg)。
表征化合物1到化合物3以及化合物SC-05-K-1
从配备有5mm PFG三重1H-13C-15N探针、5mm PFG 1H-19C-15N-31P可切换探针及4mm1H-13C纳米探针的500MHz瓦里安伊诺瓦NMR光谱仪(500MHz Varian Inova NMRspectrometer)(加利福尼亚州的帕罗奥多(Palo Alto,CA))收集了NMR数据。从布鲁克索拉里克斯(Bruker Solarix)(德国)获得了质谱仪。从配备有磷酸胆碱(phosphorylcholine，PC)亲水相互作用液相色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)柱(5μm，2.0mm I.D.×150mm)的沃特世(Waters)2695分离模块(麻塞诸塞州的米尔福德(Milford,MA))收集了HPLC数据。
图1A示出在本发明的实例1中合成的化合物1的1H-NMR光谱。图1B示出在本发明的实例1中合成的化合物2的1H-NMR光谱。图1C示出在本发明的实例1中合成的化合物3的1H-NMR光谱。通过1H-NMR确认了化合物1到化合物3的结构，且分析结果分别呈现在图1A到图1C中。
图1D示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的1H-NMR光谱。图1E示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的13C-NMR光谱。图1F示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的1H-,1H COSY NMR光谱。图1G示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的1H-,13C HSQC NMR光谱。图1H示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的1H-,13C HMBC NMR光谱。图1I示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的LC-MS光谱。图1J示出在本发明的实例1中合成的化合物SC-05-K-1的HPLC光谱。通过1H-NMR、13C-NMR、1H-,1H COSY NMR、1H-,13C HSQC NMR及1H-,13C HMBC NMR确认了化合物SC-05-K-1的结构，且分析结果分别呈现在图1D到图1H中。此外，使用质谱对化合物SC-05-K-1进行了分析，且结果呈现在图1I及图1J中。如图1J所示，使用HILIC柱对化合物SC-05-K-1(pH 5到pH 7)的HPLC分析显示出大约6.5分钟的延迟时间(retention time)。
实例2
合成组合物99mTc-SC-05-K-1
从柯惠公司(Covidien)(德克萨斯州的休斯顿(Houston,TX))的99Mo/99mTc产生器获得了高锝酸钠(Na99mTcO4)。通过向化合物SC-05-K-1(5mg)及氯化锡(II)(SnCl2，100μg)的冻干残余物中添加99mTc-高锝酸盐(40mCi到50mCi)，实现了组合物99mTc-SC-05-K-1的放射合成。在pH 6.5下对化合物SC-05-K-1与99mTc进行了络合(complexation)。
表征组合物99mTc-SC-05-K-1
通过以丙酮及盐水洗脱的薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC，沃特曼(Waterman)No.1，奥德里奇-西格玛公司(Aldrich-Sigma)，密苏里州的圣路易斯(St.Louis,MO))确定了放射化学纯度。在0.5mL/min的流速下以乙腈(acetonitrile)/水(1:1V/V)洗脱的PC HILIC柱(2.0mm I.D.×150mm，安捷伦公司(Agilent)，(加利福尼亚州的圣克拉拉(Santa Clara,CA))上执行了配备有NaI检测器及紫外线(ultraviolet，UV)检测器(235nm)的高效液相色谱法(HPLC)。
图1K及图1L示出在本发明的实例2中合成的组合物99mTc-SC-05-K-1在两个不同的系统中的放射化学纯度。具体来说，图1K示出组合物99mTc-SC-05-K-1在丙酮系统中的放射化学纯度，且图1L示出组合物99mTc-SC-05-K-1在盐水系统中的放射化学纯度。如图1K及图1L所示，组合物99mTc-SC-05-K-1(停留在原点处)的放射化学纯度大于95％且至6小时的比移值(Rf value)为0.1，其中游离Na99mTcO4迁移到溶剂前沿。
图1M示出在本发明的实例2中合成的组合物99mTc-SC-05-K-1的标记效率。具体来说，向100μg氯化锡(II)(在100μL H2O中)然后是200μL Na99mTcO4 -(～5mCi)中添加了化合物SC-05-K-1(在100μL盐水中为5mg)。如图1M所示，组合物99mTc-SC-05-K-1的HPLC分析显示出大约6.5分钟的延迟时间。
实例3
合成化合物SC-05-L-1
在此实例中，合成了5种具体化合物(化合物1到化合物3、化合物5及化合物6)以及本发明的化合物SC-05-L-1。合成化合物1到化合物3相似于以上所述的合成化合物1到化合物3，且此处不再重复。
F.合成化合物5
在圆底烧瓶中，将化合物3(500mg，1.0295mmol)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane)(环拉胺，1040mg，5.140mmol)溶解在甲苯(5mL)中。将反应溶液加热到100℃并回流过夜。接着将反应混合物冷却到-20℃。通过过滤移除了沉淀物，且收集了滤液、通过硫酸镁进行了干燥、过滤，并且在真空下对溶剂进行了浓缩以得到粗制产物(Z)-1-(1,4,8,11-四氮杂环十四-1-基)-3-((5-(4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)-4,5-二苯基戊-4-烯-1-基)氧基)丙-2-醇((Z)-1-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)-3-((5-(4-(2-(diethylamino)ethoxy)phenyl)-4,5-diphenylpent-4-en-1-yl)oxy)propan-2-ol)(化合物5)。化合物5在下一步骤中直接使用而无需进一步纯化。
G.合成化合物6
室温下，向化合物5(600mg，0.8746mmol)在乙腈(10mL)中的悬浮液中，逐滴添加了二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)(1.53g，7.0103mmol)。将反应悬浮液搅拌过夜并逐渐变为均质的。当反应完成时，在真空下对溶液进行了浓缩，接着通过使用洗脱液己烷/乙酸乙酯/三乙胺＝4/1/0.1的柱色谱法进行了纯化，以得到黄色粘稠油形式的三-叔丁基(Z)-11-(3-((5-(4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)-4,5-二苯基戊-4-烯-1-基)氧基)-2-羟丙基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8-三羧酸酯(化合物6)(tri-tert-butyl(Z)-11-(3-((5-(4-(2-(diethylamino)ethoxy)phenyl)-4,5-diphenylpent-4-en-1-yl)oxy)-2-hydroxypropyl)-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-tricarboxylate)(两个步骤产率为70％)。
H.合成化合物SC-05-L-1
向化合物5(800mg，0.8111mmol)的圆底烧瓶中，添加了三乙基硅烷(triethylsilane)(1.3mL，8.139mmol)然后是在甲醇(10mL)中的HCL(10mL)。将反应溶液在室温下搅拌了4小时并通过TLC进行了监测。当反应完成时，在真空下对溶液进行了浓缩，通过使用从水到甲醇的洗脱液的反相柱色谱法进行了纯化，以得到浅黄色固体产物(Z)-1-(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1-基)-3-((5-(4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)-4,5-二苯基戊-4-烯-1-基)氧基)丙-2-醇盐酸盐((Z)-1-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)-3-((5-(4-(2-(diethylamino)ethoxy)phenyl)-4,5-diphenylpent-4-en-1-yl)oxy)propan-2-ol hydrochloride salt)(化合物SC-05-L-1，637mg)。
表征化合物5及化合物6以及化合物SC-05-L-1
从配备有5mm PFG三重1H-13C-15N探针、5mm PFG 1H-19C-15N-31P可切换探针及4mm1H-13C纳米探针的500MHz瓦里安伊诺瓦NMR光谱仪(加利福尼亚州的帕罗奥多)收集了NMR数据。从布鲁克索拉里克斯(德国)获得了质谱仪。从配备有PC HILIC柱(5μm，2.0mmI.D.×150mm)的沃特世2695分离模块(麻塞诸塞州的米尔福德)收集了HPLC数据。
图2A示出在本发明的实例3中合成的化合物5的1H-NMR光谱。图2B示出在本发明的实例3中合成的化合物6的1H-NMR光谱。通过1H-NMR确认了化合物5及化合物6的结构，且分析结果分别呈现在图2A及图2B中。
图2C示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的1H-NMR光谱。图2D示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的13C-NMR光谱。图2E示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的1H-,1H COSY NMR光谱。图2F示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的1H-,13C HSQC NMR光谱。图2G示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的1H-,13C HMBC NMR光谱。图2H示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的LC-MS光谱。图2I示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的HPLC光谱。通过1H-NMR、13C-NMR、1H-,1H COSY NMR、1H-,13C HSQC NMR及1H-,13C HMBC NMR确认了化合物SC-05-L-1的结构，且分析结果呈现在图2C到图2G中。此外，使用质谱对化合物SC-05-L-1进行了分析，且结果呈现在图2H及图2I中。如图2I所示，化合物SC-05-L-1的HPLC分析显示出大约6.3分钟的延迟时间。
实例4
合成组合物99mTc-SC-05-L-1
从柯惠公司(德克萨斯州的休斯顿)的99Mo/99mTc产生器获得了高锝酸钠(Na99mTcO4)。通过向化合物SC-05-L-1(5mg)及氯化锡(II)(SnCl2，100μg)的冻干残余物中添加99mTc-高锝酸盐(40mCi到50mCi)，实现了组合物99mTc-SC-05-L-1的放射合成。在pH 6.5下对化合物SC-05-L-1与99mTc进行了络合。
表征组合物99mTc-SC-05-L-1
通过以丙酮及盐水洗脱的TLC(沃特曼No.1，奥德里奇-西格玛公司，密苏里州的圣路易斯)确定了放射化学纯度。在0.5mL/min的流速下以乙腈/水(1:1V/V)洗脱的PC HILIC柱(2.0mm I.D.×150mm，安捷伦公司，加利福尼亚州的圣克拉拉)上执行了配备有NaI检测器及紫外线检测器(280nm)的高效液相色谱法(HPLC)。组合物99mTc-SC-05-L-1在24小时处静置以进行延长的储存期稳定性(shelf-life stability)测定。
图2J及图2K示出在本发明的实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-L-1在两个不同的系统中的放射化学纯度。具体来说，图2J示出组合物99mTc-SC-05-L-1在丙酮系统中的放射化学纯度，且图2K示出组合物99mTc-SC-05-L-1在盐水系统中的放射化学纯度。如图2J及图2K所示，组合物99mTc-SC-05-L-1的放射化学纯度大于95％且Rf值为0.1。
图2L及图2M示出在本发明的实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-L-1在两个不同的系统中的标记效率。具体来说，向100μg氯化锡(II)(在100μL H2O中)然后是200μLNa99mTcO4 -(～5mCi)中添加了化合物SC-05-L-1(在100μL盐水中为5mg)。如图2L(280nm通道(channel))及图2M(射电星通道(radiostar channel))所示，组合物99mTc-SC-05-L-1的HPLC分析显示出大约7分钟的延迟时间。
图2N及图2O示出在本发明的实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-L-1在两个不同的系统中的体外稳定性。具体来说，在室温下温育24小时后，测量了组合物99mTc-SC-05-L-1的体外稳定性。如图2N(280nm通道)及图2O(射电星通道)所示，组合物99mTc-SC-05-L-1在24小时后在pH 6.5中是稳定的。
实例5
体外细胞摄取研究
实验1
将化合物SC-05-K-1及化合物SC-05-L-1(分别为5mg)溶解在pH 5到pH 6的0.3mL水中。添加了SnCL2(在0.1mL中为0.1mg)(从10mL水中的10mg锡(II)制备)，接着添加了Na99mTcO4(在0.1mL中为5mCi)。以水将总体积稀释到1mL。每一孔(well)的细胞摄取为5mg/5mCi/1mL(0.1mg/0.1mCi/20μL/孔)。每一孔含有10μg分子。使用多细胞株(multi-cellline)来进行细胞摄取测定。使用96孔板进行MCF-7ER(+)细胞摄取研究。在150μL无血清罗斯威尔派克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)培养基中，每一孔含有200,000个MCF-7细胞。将组合物99mTc-SC-05-K-1及组合物99mTc-SC-05-L-1以不同的间隔(1小时到4小时)添加到在培养基中含有细胞的每一孔中。为了查明细胞摄取是否经由ER介导的过程，向MCF-7细胞中添加了雌二醇(10次到100次)。细胞摄取是以总剂量的百分比来表达。
图3A及图3B示出在本发明的实例2及实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-K-1及组合物99mTc-SC-05-L-1的MCF-7细胞摄取及阻断研究。如图3A及图3B所示，组合物99mTc-SC-05-K-1及组合物99mTc-SC-05-L-1二者均显示出良好的细胞摄取。特别是，在组合物99mTc-SC-05-L-1中添加雌二醇之后，细胞摄取降低(30％到40％)，如图3A所示。
实验2
使用6孔板进行OVCAR3ER(+)及TOV-112D ER(-)细胞摄取研究。每一孔在150μL无血清RPMI中含有100,000个细胞。将组合物99mTc-SC-05-K-1及组合物99mTc-SC-05-L-1以不同的间隔(0小时到2小时)添加到在培养基中含有细胞的每一孔中。为了查明组合物99mTc-SC-05-L-1的OVCAR3细胞摄取是否经由ER介导的过程，进行了阻断研究。为了进行阻断研究，所使用的雌酮的量为1μg/孔，其为组合物99mTC-SC-05-L-1剂量(0.1mg/0.1mCi/20μL/孔)的1％。将在培养基中含有细胞的孔温育不同的间隔(0小时到2小时)。随后，以冰冷的磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)将细胞洗涤了两次并以0.5mL胰蛋白酶(trypsin)溶液进行了胰蛋白酶化以分离肿瘤细胞。使用蛋白质浓度测定确定出每一孔中的蛋白质。在含有蛋白酶抑制剂(罗氏诊断公司(Roche Diagnostic)，德国的曼海姆(Mannheim,Germany))的裂解(lysis)缓冲液中对细胞进行了裂解。使用由制造商(伯乐公司(Bio-RAD)，美国加利福尼亚州的赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA))阐述的布拉德福德方法(Bradford Method)对细胞裂解物中的蛋白质浓度进行了量化。以蒸馏水对布拉德福德染料进行了稀释(1:4)并通过滤纸(数目1，沃特曼no.1，东京的爱多帮得科有限公司(Advantec Co.Ltd.,Tokyo))进行了过滤。使用浓度为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml的牛血清白蛋白(bovine serum albumin)构建了标准曲线。以1:9在裂解缓冲液中对蛋白质样本进行了稀释。将稀释的蛋白质样本或标准与96孔中的布拉德福德染料进行了混合，接着记录了在595nm下的吸光度。以γ计数器(康涅狄格州的帕卡德(Packard,CT))测量了细胞及培养基中的放射性浓度，且以细胞的cpm/g及培养基的cpm/g来表达放射性浓度。计算出蛋白质品质对培养基放射性浓度比率并绘制了随时间变化的图。
图4A及图4B示出在本发明的实例2及实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-K-1及组合物99mTc-SC-05-L-1的OVCAR3细胞及TOV-112D细胞摄取研究。如图4A及图4B所示，使用组合物99mTc-SC-05-L-1及组合物99mTc-SC-05-K-1进行的细胞摄取研究表明组合物99mTc-SC-05-L-1在ER(+)OVCAR3细胞中比在ER(-)TOV-112D细胞中具有更高的摄取。此外，组合物99mTc-SC-05-L-1具有比组合物99mTc-SC-05-K-1高的细胞/培养基比率。
图5示出在本发明的实例4中合成的组合物99mTc-SC-05-L-1的OVCAR3细胞及TOV-112D细胞摄取及阻断研究。如图5所示，组合物99mTc-SC-05-L-1的OVCAR3细胞摄取被雌酮阻断80％，表明发生了ER介导的过程。
实例6
体外抗癌研究
实验3
通过在代表性套细胞株(mantle cell line)及弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuselarge B-cell lymphoma，DLBCL)细胞株中使用细胞存活率(cell viability)测定，评估了化合物SC-05-K-1以及化合物SC-05-L-1抵抗淋巴瘤细胞的效果。
图6示出本发明的化合物SC-05-L-1及化合物SC-05-K-1抵抗淋巴瘤细胞的效果。如图6所示，这些细胞株通过大麻受体过度表达。
实验4
随着化合物SC-05-L-1及化合物SC-05-K-1的浓度增加，对细胞进行了治疗。比较了对化合物SC-05-L-1及化合物SC-05-K-1敏感或较不敏感的代表性DLBCL细胞株。
图7A及图7B示出在本发明的实例3中合成的化合物SC-05-L-1的体外抗癌研究。图8A及图8B示出在本发明的实例1及实例3中合成的化合物SC-05-K-1及化合物SC-05-L-1的体外抗癌研究。如图7A及图7B所示，体外抗癌研究表明化合物SC-05-L-1抵抗淋巴瘤细胞具有剂量依赖方式(dose-dependent manner)。如图8A及图8B所示，化合物SC-05-L-1及化合物SC-05-K-1二者显示出抵抗淋巴瘤细胞的相似的剂量依赖方式。然而，化合物SC-05-L-1的毒性低于化合物SC-05-K-1。换句话说，螯合剂环拉胺的毒性低于螯合剂大环多胺。
综上所述，本发明提供雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈用组合物。羟基包含在制成品中。在本发明的组合物中，使用受保护的螯合剂来使环氧基化受体配体反应以形成螯合剂-受体配体共轭体。技术平台可利用共轭拮抗剂及激动剂，并观察其在各种形式的疾病中的效果。此外，所述组合物还可使用技术人员所已知的化学程式而被制备成药物配方及套组。另外，还提供合成所述组合物的方法，且所述合成方法可不再需要向受体配体中添加保护基，且会提高制程效率并纯化最终产品。除此之外，可使用本发明的组合物对CBR及ER相关联的疾病进行成像或治疗。
虽然本发明已以实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更改与润饰，故本发明的保护范围当视权利要求所界定的为准。

Claims (5)

1.一种雌激素受体与大麻受体之间的相互交谈用组合物，包含螯合剂与受体配体的共轭体，以及金属离子，其中:
所述螯合剂是含氮四氮杂环，其中所述含氮四氮杂环是环拉胺或大环多胺；
共轭至所述螯合剂的所述受体配体是包含具有-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-的基团的非甾体他莫昔芬，其中于所述-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-的基团中，左侧末段的-CH2是与所述非甾体他莫昔芬中的三苯乙烯上的乙烯基直接连接，且右侧末段的CH2-是与所述含氮四氮杂环的氮基直接连接；以及
所述金属离子是99 mTc、67,68Ga、60,61,62,64,67Cu、111In、166Ho、186,188Re、90Y、177Lu、223Ra、225Ac、89Zr、117mSn、153Sm、89Sr、59Fe、212Bi、211At、45Ti、Tc、Sn、Cu、In、Tl、Ga、As、Re、Ho、Y、Sm、Se、Sr、Gd、Bi、Fe、Mn、Lu、Co、Pt、Ca、Rh、Eu、Tb或其组合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是99mTc-环拉胺-他莫昔芬类似物或99mTc-大环多胺-他莫昔芬类似物。
3.一种套组，包括如权利要求1或2所述的组合物。
4.一种合成如权利要求1或2所述的组合物的方法，其中所述受体配体利用环氧化物共轭到所述含氮四氮杂环，且所述环氧化物附连到所述受体配体的脂肪族链。
5.根据权利要求1或2所述的组合物在制备治疗癌症、类风湿性关节炎、骨质疏松症、动脉粥样硬化或子宫内膜组织药物的应用。
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