CN110898222A - 一种基于a-d-a型有机分子/双亲性高分子复合纳米粒子的制备方法及应用 - Google Patents
一种基于a-d-a型有机分子/双亲性高分子复合纳米粒子的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于A‑D‑A型有机分子/双亲性高分子复合纳米粒子的制备方法及应用,涉及有机分子在生物医药领域的应用。有机光伏领域广泛使用的A‑D‑A结构的非富勒烯受体具有结构易于调节,强烈的近红外光吸收能力,低的荧光量子效率等独特优势,具有作为光敏化剂用于光热/光动力联合治疗的巨大潜力。本发明利用两亲性高分子对A‑D‑A结构的有机分子进行包覆,形成水溶性复合纳米粒子,在一定波长的近红外激光照射下,复合纳米粒子表现出较高的光热转换效率和活性氧的生成能力,小鼠体内实验显示其对肿瘤具有明显的抑制作用。因此,本发明在新型肿瘤治疗领域具有重要的实用前景和社会价值。
Description
技术领域
本发明属于纳米医用材料技术领域,具体涉及一种受体-给体-受体(A-D-A) 结构的有机分子/聚合物复合纳米粒子的制备及在肿瘤光动力/光热联合治疗中的应用。
背景技术
目前,恶性肿瘤已经成为威胁人类健康和导致人类死亡的最严重疾病之一。与手术、放疗、化疗等传统肿瘤治疗手段相比,光学治疗由于具有操作方便、无侵入性、局部选择性、耐药性小、副作用小等特点而受到广泛关注。其中,光动力治疗(photodynamictherapy,PDT)和光热治疗(photothermal therapy,PTT) 是两种典型的光学治疗手段,它们的治疗原理是基于光敏剂和光热制剂的光化学反应,光敏剂或光热制剂经静脉注射后会优先被病灶组织吸收并富集其中,对于光动力治疗,利用特定波长的光源直接照射病灶部位来激发光敏剂并发生光化学反应,该过程将能量传递给组织中的氧分子,使其产生多种活性氧簇 (Reactive Oxygen Species,ROS,包括单线态氧、氧自由基、羟自由基等),进而对细胞内的蛋白质、核酸以及脂类等生物大分子产生破坏作用,使细胞结构和功能受到严重影响,从而导致肿瘤细胞凋亡和(或)死亡。光热治疗则是利用特定波长的光源照射病灶部位并激发光热制剂发生光化学反应,进而在病灶部位产生局部高温来诱导癌细胞凋亡或坏死。由于乏氧是肿瘤的一个显著特点,因此对于氧分子依赖的光动力治疗的治疗效率会受到影响,因此,近些年来,光热治疗和PTT/PDT联合治疗得到了迅速发展。光热制剂作为光热治疗的重要组成部分近些年来受到广泛关注,科研工作者们也开发了多种光热制剂,如金纳米棒、硫化铜、花菁染料,吡咯并吡咯二酮衍生物,卟啉衍生物、共轭聚合物、方酸衍生物、氟硼二吡咯染料(BODIPY)等,其中,部分光热制剂展现出双重的PDT和PTT效果。
最近,我们发现在有机光伏领域常用的非富勒烯受体分子,即具有受体-给体-受体(acceptor-donor-acceptor,A-D-A)结构的分子可能成为潜在的光热制剂或光敏剂用于肿瘤的光学治疗。通过调节给体和受体单元的结构,可以有效地调控这类分子的HOMO,LUMO能级分布。另外,这种推-拉电子结构的分子,由于高效的分子内电荷转移(ICT),使得其在近红外区域具有强烈吸收,且荧光量子效率低。这些特征使其具有作为光敏试剂用于光动力/光热联合治疗的巨大潜力。为了改善这类分子的水溶性,本发明利用两亲性高分子对其进行包覆形成水溶性复合纳米粒子,复合纳米粒子经近红外照射后表现出较高的光热转换效率及明显抑制肿瘤生长的作用。因此,本发明在新型肿瘤治疗领域具有重要的实用前景和社会价值。
发明内容
本发明的目的是发展用于PDT/PTT联合治疗的双功能光敏化剂,扩展现有光敏化剂的范围,提高肿瘤光疗疗效。利用两亲性高分子对双功能光敏化剂进行包覆形成水溶性复合纳米粒子,克服了有机小分子水溶性差,无法直接在生物医药领域应用缺点,改善其水溶性、组织分布,提高肿瘤光疗疗效。
为了达到上述目的,本发明采用的技术方案:1)A-D-A型有机分子(SM) 确定;2)两亲性高分子(AP)确定;3)通过纳米沉淀技术制备两亲性高分子 /A-D-A型有机小分子复合纳米粒子(NPs);4)体外光热、光动力活性评价;5) 动物体内光疗疗效评价。具体步骤如下:
1)A-D-A型有机小分子光热试剂的确定(SM)
本发明专利中所述的A-D-A型有机小分子光热试剂结构具有羰基和氰基等基团作为吸电子单元,以降低LUMO能级;分子中的推拉电子结构在红光范围内具有强而宽的吸收,并诱导分子内电荷转移;分子结构的中间部分为共轭主平面。
2)两亲性高分子的确定(AP)
本发明专利中用于修饰A-D-A型有机光敏化剂分子选择具有两亲性的高分子材料,包括但不限于FA-PEG-PBLA(叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸苄酯);FEG-PCL (聚乙二醇-聚己内酯);FEG-PLA(聚乙二醇-聚乳酸);PEG-PLGA(聚乙二醇- 聚乳酸/羟基乙酸共聚物)和DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇) 等两亲性聚合物。
3)纳米粒子的制备(NPs)
首先将步骤1)所得的有机分子溶于相应的良溶剂中,步骤2)所得的两亲性高分子溶于相应的良溶剂中,随后将溶解好的有机分子溶液缓慢均匀地滴加至两亲性高分子溶液中,随后通过通入惰性气体除去溶液中的低沸点溶剂,待低沸点溶剂完全除干净后,利用透析方式除掉高沸点溶剂,最终得到纳米粒子水溶液,经冷冻干燥后得到产品并进行相关测试表征。
本发明包括对步骤2)中的两亲性高分子进行改性的步骤,包括引入主动靶向配体叶酸、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子-α (TGF-α)、双调蛋白、β-纤维素、肝素结合性EGF(HB-EGF)。
4)体外光热、光动力活性评价
光热性质评价:将纳米粒子均匀分散在去离子水中,一定波长的激光照射下,利用红外热像仪观测纳米粒子溶液的温度变化情况。
光动力性质评价:将纳米粒子均匀分散在去离子水中,加入一定浓度的苯并呋喃作为活性氧检测探针,一定波长的激光照射下,利用UV-vis吸收光谱监测混合溶液的紫外吸收强度变化。
5)动物体内光疗疗效评价
以感染SK-OV-3肿瘤的小鼠为模型,将纳米粒子PBS溶液经尾部静脉注射到老鼠体内,24小时后利用一定波长的激光对肿瘤部位进行照射,然后定期测量老鼠体内肿瘤的体积变化。
A-D-A型有机分子在生物医药领域的拓展应用,可用于肿瘤诊断治疗剂的制备,并可用于肿瘤的PDT/PTT联合治疗。
与现有技术相比,本发明的优点和有益效果主要包括以下几个方面:
1)本发明发现了一类具有良好光热转化效率和光稳定性的双功能光敏化剂,单一近红外光激发下同时具有光热和光动力活性。
2)本发明利用两亲性高分子对新型光敏化剂进行包覆并形成水溶性复合纳米粒子,该纳米制剂表现良好的光化学性质和肿瘤选择性,并且在近红外光激光照射条件下表现良好的抑瘤效果,该发明作为新型的靶向抗肿瘤纳米药物具有良好的应用前景。
附图说明
图1示出了双功能光敏化剂/双亲高分子复合纳米粒子制备及在光热/光动力联合治疗中的应用示意图,利用两亲性高分子包覆A-D-A型有机分子的示意图及在肿瘤光学治疗中的应用。
图2示出了部分A-D-A型有机分子结构图。
图3示出了部分两亲性高分子结构图。
图4示出不同方法制备出(A)NPs-1;(B)NPs-2;(C)NPs-3和(D)NPs-4纳米粒子的DLS谱图。
图5示出了(A)NPs-1,(B)NPs-4的光热转换曲线。
图6示出了在(A)NPs-1,(B)NPs-4存在条件下经808nm激光照射后苯并呋喃紫外吸收强度的变化。
图7示出了NPs-1和NPs-2的生物相容性测试结果。
图8示出了NPs-1在体外进行细胞光毒性测试结果。
图9示出了NPs-1经尾部静脉注射到感染SK-OV-3肿瘤小鼠体内,在不同时间小鼠各器官内有机小分子的含量。
图10示出了感染肿瘤的小鼠经过不同手段处理后18天内肿瘤的增长曲线。
图11示出了感染肿瘤的小鼠经过不同手段处理18天后肿瘤的照片。
图12示出了实施例中SM-1的合成示意图。
图13示出了实施例中SM-2的合成示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述,将有助于对本发明的理解。但并不能以此来限制本发明的权利范围,而本发明的权利范围应以权利要求书阐述的为准。
本发明采用的技术方案如图1所示:1)A-D-A型有机分子(SM)确定;2) 两亲性高分子(AP)确定;3)通过纳米沉淀技术制备两亲性高分子/A-D-A型有机分子复合纳米粒子(NPs);4)体外光热、光动力活性评价;5)动物体内光疗疗效评价。具体步骤如下:
1)A-D-A型有机分子光热试剂的确定(SM):
本发明专利中所述的A-D-A型有机分子光热试剂多为在有机光伏领域中已经报道过的A-D-A型有机小分子(如:ACSAppl.Mater.Interfaces,2019,11, 6717;Adv.Sci.,2018,1800307;Adv.Mater.,2015,27,1170)及结构类似的分子。该A-D-A型有机分子具有如下特征:这类分子结构具有羰基和氰基等基团作为吸电子单元可以降低LUMO能级。分子中的推拉电子结构在红光范围内具有强而宽的吸收,并诱导分子内电荷转移。分子结构的中间部分为共轭主平面,结构如图2A所示。典型的分子结构如图2B至2E所示。
2)两亲性高分子的确定(AP):
本发明专利中用于修饰A-D-A型有机光敏化剂分子选择具有两亲性的高分子材料,如J.Biomater.Appl.,2013,28,434中报道的FA-PEG-PBLA(叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸苄酯)以及市面有售的FEG-PCL(聚乙二醇-聚己内酯); FEG-PLA(聚乙二醇-聚乳酸);PEG-PLGA(聚乙二醇-聚乳酸/羟基乙酸共聚物) 和DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)等两亲性聚合物。典型的分子结构如图3所示。
3)SM/AP复合纳米粒子(CNPs)的制备:
首先将步骤1)所得的有机分子溶于相应的良溶剂中,步骤2)所得的两亲性高分子溶于相应的良溶剂中,随后将溶解好的有机分子溶液缓慢均匀地滴加至两亲性高分子溶液中,随后通过通入惰性气体除去溶液中的低沸点溶剂,待低沸点溶剂完全除干净后,利用透析方式除掉高沸点溶剂,最终得到纳米粒子水溶液,经冷冻干燥后得到产品并进行相关测试表征。
实施例1:
1)SM-1的合成
SM-1的合成示意图如图12所示,首先在两口圆底烧瓶中分别加入(1)(6- 溴-4,4-双(2-乙基己基)-4H-环戊烷[2,1-b:3,4-b']二硫苯-2-卡醛)(0.2g,0.392 mmol),双(频哪醇合)二硼(0.12g,0.47mmol),醋酸钾(1.154g,11.759mmol) 和DMSO(4mL),通入氮气净化0.5小时后并在氮气氛围下加入1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(9.6mg,1.2×10- 2mmol)。将混合物加热至80℃搅拌反应8h,反应结束后自然冷却至室温并用水洗,然后水层用氯仿萃取、无水硫酸钠处理后进行浓缩。得到的初产品经柱层析(洗脱液PE:DCM=6:1,v/v)纯化后,得到暗红色固体产物(2)0.17g(85%)。
中间产物(2)(0.3g,0.349mmol)和茚苯二酮双氰基(3)(0.407g,2.1mmol) 溶于45mL干燥CHCl3中,并加入2.4mL吡啶。混合物在氮气保护下回流反应 15h,反应结束后自然冷却到室温后用甲醇进行沉淀收集产物,经过滤后,将粗产品溶解在CHCl3中,通过柱色谱法纯化(洗脱液PE:DCM=1:2,v/v),得到一种深蓝色的固体最终产品(SM-1)0.28克(66.7%)。
2)带主动靶向配体的两亲性高子(AP-1)的合成
FA-PEG-NH2的制备:当叶酸(FA)(113mg;0.25mmol)完全溶解于DMSO(6 mL)后,依次向叶酸溶液中加入NHS(37mg;0.32mmol)中,N,N-二环己基卡二亚胺(66mg;0.32mmol)、PEG-双胺(714.8mg;0.21mmol)和TEA(170mL;2.1 mmol)。反应在室温、避光、氮气保护条件下搅拌24小时。反应结束后用18mL 去离子水稀释混合物并滤掉副产物。粗产品经透析后进行冷冻干燥。
BLA-NCA的制备:将8.6gL-天冬氨酸-β-苄基酯(BLA)加入圆底烧瓶中,随后将5.2g三光气溶于70mL无水THF中并缓慢加入到圆底烧瓶中。反应混合物在60℃、氮气保护条件下搅拌2小时。产物经浓缩后用四氢呋喃和正己烷混合溶剂进行重结晶纯化。真空干燥后得到白色粉状物质BLA-NCA。
AP-1的制备:在圆底烧瓶中加入150mgBLA-NCA和0.3mLDMF,待溶解后加入3mLFA-PEG-NH2的氯仿溶液(228mg),反应在40℃条件下进行48小时。反应结束后用过量的冰乙醚沉淀,经离心后得到产物。
3)NPs-1纳米粒子的制备
本发明采用纳米沉淀的方法制备NPs-1,首先将5mgSM-1溶解在1mLCHCl3中,然后将SM-1溶液缓慢均匀滴加至50mLAP-1的DMSO溶液中(0.5mg/mL)。然后在混合液中通入氮气除去CHCl3,待CHCl3完全除掉之后,将溶液转移至透析袋(截留分子量:MW3.5kDa)中透析除去DMSO随后进行冷冻干燥。
实施例2:
1)SM-1的合成
SM-1的合成如实施例1所示。
2)两亲性高子AP-2的合成
在圆底烧瓶中加入150mgBLA-NCA和0.3mLDMF,待溶解后加入3mL CH3-PEG-NH2的氯仿溶液(303mg),反应在40℃条件下进行48小时。反应结束后用过量的冰乙醚沉淀,经离心后得到产物。
3)NPs-2纳米粒子的制备
本发明采用纳米沉淀的方法制备NPs-2,首先将5mgSM-1溶解在1mLCHCl3中,然后将SM-1溶液缓慢均匀滴加至50mLAP-2的DMSO溶液中(0.5mg/mL)。然后在氮气气流下除去CHCl3,待CHCl3完全除掉之后,将溶液转移至透析袋(截留分子量:MW3.5kDa)中透析除去DMSO随后进行冷冻干燥。
实施例3:
1)SM-1的合成
SM-1的合成如实施例1所示。
2)NPs-3纳米粒子的制备
本发明采用纳米沉淀的方法制备NPs-3,首先将5mgSM-1溶解在1mLCHCl3中,然后将SM-1溶液缓慢均匀滴加至50mL二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(AP-3)的DMSO溶液中(0.5mg/mL)。然后在氮气气流下除去CHCl3,待 CHCl3完全除掉之后,将溶液转移至透析袋(截留分子量:MW3.5kDa)中透析除去DMSO随后进行冷冻干燥。
实施例4:
1)SM-2的合成
按照Adv.Sci.,2018,1800307报道的方法合成SM-2。SM-2的合成示意图如图13所示,具体方法如下:
在氩气氛围下,将1g(2.83mmol)(1),3.644g(8.49mmol)(2)和164mg (0.142mmol)Ph(PPh3)4加入到100mL两口圆底中烧瓶,用氩气脱气3次。然后将30mL无水甲苯注入混合物中,并回流反应过夜。将反应溶液冷却至室温,倒入100mL无水甲醇中沉淀并过滤,然后用大量石油醚、乙酸乙酯和甲醇进行洗涤。
在氩气氛围下,将1.2g(4.46mmol)2-乙基己基苯的无水THF(30mL)溶液加至-78℃反应体系中,然后将3mLn-BuLi(1.6M)溶液逐滴加至反应体系中。反应在-78℃条件下搅拌1h。然后将500mg(0.89mmol)的化合物(3)迅速加入反应体系中,并将反应在室温下再搅拌12h。反应结束后用盐水对反应物洗涤3 次,并用无水Na2SO4干燥。真空条件下除去溶剂后,将粗产物溶于30mL四氢呋喃,并加入0.3mL浓H2SO4作为催化剂。将反应在90℃下搅拌反应2小时,并用10mL冷水淬灭,反应物用水洗涤4次。真空除去溶剂,得到的初产品经柱层析(洗脱液PE:DCM=40:1,v/v)纯化后得到黄红色固体化合物(4)(62%)。
在氩气氛围下,加入无水DMF(5mL)。然后将无水三氯氧化磷(POCl3) (400μL)在冰水浴条下逐滴注入反应体系中。将反应在0℃下搅拌30分钟。然后,在室温下搅拌3小时以获得Vilsmerier试剂。将500mg(0.42mmol)(4)和 80mL1,2-二氯乙烷的反应混合物用氩气脱气15分钟,然后将Vilsmerier试剂缓慢添加到反应混合物中,并在室温下再搅拌1h。最后将反应物在85℃下再搅拌12小时后缓慢加入30mL饱和乙酸钠溶液淬灭反应。反应物用水洗涤三遍,并用无水Na2SO4干燥。真空除去溶剂,得到的初产品经柱层析(洗脱液PE:DCM=1:1,v/v)纯化后得到红色固体化合物(5)。
在氩气氛围下,将100mg(0.08mmol)化合物(5),92mg(0.4mmol)(6) 的氯仿溶液(20mL)混合。将反应物在室温条件下搅拌12小时。有机相用水洗涤3次,并用无水Na2SO4干燥。真空除去溶剂,得到的初产品经柱层析(洗脱液PE:CF=1:1,v/v)纯化后得到粗产物,然后使用CF/甲醇进一步重结晶,得到绿色固体SM-2。
2)两亲性高子(AP-1)的合成
AP-1的合成如实施例1所示。
3)NPs-4纳米粒子的制备
本发明采用纳米沉淀的方法制备NPs-4,首先将5mgSM-2溶解在1mLCHCl3中,然后将SM-2溶液缓慢均匀滴加至50mLAP-1的DMSO溶液中(0.5mg/mL)。然后在混合液中通入氮气除去CHCl3,待CHCl3完全除掉之后,将溶液转移至透析袋(截留分子量:MW3.5kDa)中透析除去DMSO随后进行冷冻干燥制得NPs-4。
效果对比:
本发明中以不同两亲性高分子和A-D-A结构有机分子经纳米沉淀方法制备的纳米粒子的水和直径由DLS进行表征,结果如图4所示。
为了显示本发明在肿瘤光学治疗领域中具有应用潜力,本发明中以实例1 中的NPs-1为例进行性质对比描述。
图5为(A)NPs-1和(B)NPs-4的光热转换曲线,如图所示,在808nm激光的照射下,NPs-1和NPs-4表现良好的光热转换性质,随着纳米粒子浓度的升高,温度升高速度越快。因此NPs-1和NPs-4可用于肿瘤的PTT治疗。
图6为在NPs-1存在条件下经808nm激光照射后苯并呋喃紫外吸收强度的变化。本发明以苯并呋喃为探针检测体系中活性氧的存在,结果显示在NPs-1 存在条件下经808nm激光照射后苯并呋喃紫外吸收光谱的吸收强度明显下降,这说明NPs-1在808nm激光照射条件下可产生活性氧,因此NPs-1可用于肿瘤的PDT治疗。
图7为NPs-1和NPs-2的生物相容性测试结果,如图所示,在无激光照射条件下,NPs-1和NPs-2表现良好生物相容性,无明显细胞毒性。
图8为NPs-1在体外进行细胞光毒性测试结果,如图所示,在808nm激光照射条件下NPs-1表现明显的细胞毒性,因此NPs-1有望可用于肿瘤的PDT/PTT 联合治疗。
图9为NPs-1经尾部静脉注射到感染SK-OV-3肿瘤小鼠体内在不同时间小鼠各器官内有机小分子的含量。如图所示,NPs-1经尾静脉注射后,有机小分子在肿瘤部位的浓度逐渐升高,并且在24小时后达到最高值,后期随着新陈代谢的进行,肿瘤内部有机小分子的浓度降低。
图10为感染肿瘤的小鼠经过不同手段处理后18天内肿瘤的增长曲线,如图所示,与其它组相比,经静脉注射NPs-1的小鼠,在808nm激光照射条件下表现明显的抑瘤效果。
图11为感染肿瘤的小鼠经过不同手段处理18天后的肿瘤照片,如图所示,与其它组相比,经静脉注射NPs-1的小鼠,在808nm激光照射条件下肿瘤的体积明显变小,这证明NPs-1在808nm激光照射条件下表现明显的抑瘤效果。
以上对本发明做了示例性的描述,应该说明的是,本发明与A-D-A型有机分子和两亲性高分子具体的结构和种类无关,本发明是发明一种用于PDT/PTT联合治疗的多功能光敏化剂,扩展现有光敏化剂的范围,提高肿瘤光疗疗效的新策略。在不脱离本发明的核心的情况下,任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于A-D-A型有机分子/双亲性高分子复合纳米粒子的制备方法,其特征是步骤如下:
1)A-D-A型有机分子光热试剂SM的确定,
所述的A-D-A型有机分子结构具有羰基和氰基等基团作为吸电子单元,以降低LUMO能级;分子中的推拉电子结构在红光范围内具有强而宽的吸收,并诱导分子内电荷转移;分子结构的中间部分为共轭主平面;
2)两亲性高分子AP的确定,
该两亲性高分子为用于修饰A-D-A型有机分子光热试剂的分子选择具有两亲性的高分子材料,包括但不限于叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸苄酯、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚乳酸/羟基乙酸共聚物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇两亲性聚合物;
3)SM/AP复合纳米粒子CNPs的制备,
首先将步骤1)的有机分子溶于相应的良溶剂中,步骤2)的两亲性高分子溶于相应的良溶剂中,随后将溶解好的有机分子溶液缓慢均匀地滴加至两亲性高分子溶液中,随后通过通入惰性气体除去溶液中的低沸点溶剂,待低沸点溶剂完全除干净后,将利用透析方式除掉高沸点溶剂,最终得到的纳米粒子水溶液,经冷冻干燥后得到产品并进行相关测试表征。
3.根据权利要求1所述的基于A-D-A型有机分子/双亲性高分子复合纳米粒子的制备方法,其特征是:包括对步骤2)中的两亲性高分子进行改性的步骤,包括引入主动靶向配体叶酸、表皮生长因子、转化生长因子-α,双调蛋白,β-纤维素,肝素结合性EGF。
4.权利要求1-3任一项所述的基于A-D-A型有机分子/双亲性高分子复合纳米粒子在生物医学领域的拓展应用。
5.根据权利要求4所述的基于A-D-A型有机分子/双亲性高分子复合纳米粒子的应用,其特征是:用于治疗肿瘤药物制造。
6.根据权利要求4所述的基于A-D-A型有机分子/双亲性高分子复合纳米粒子的应用,其特征是:在荧光成像、光声成像方面的应用。
7.根据权利要求4所述的基于A-D-A型有机分子/双亲性高分子复合纳米粒子的应用,其特征是:用于疾病诊断制剂制造。
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